JP5360855B2 - 心筋梗塞に関する遺伝子検出方法 - Google Patents
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また、心筋梗塞・冠動脈疾患といった心疾患と、核DNAの変異との関係に関する多くの報告がなされているものの、これらの結果については、現在も議論が行われている。その理由としては、遺伝子と疾患との関係が明確でないこと、研究対象のサイズが小さいこと、多型に影響については集団の相違が認められるために特定の集団において認められる関係が他の集団に応用できるか否かに議論があること、環境要因が複雑であるために多型と疾患との関係が明らかと成り難いこと等が挙げられる。
本研究者らの研究目的は、mtDNAのハプログループ分けに基づき、心筋梗塞の遺伝的リスクを予測し、それによって心筋梗塞の一次予防に役立てることにある。
そこで、本発明者らは、鋭意検討の結果、新たなmtSNPの検出法を開発し、日本人における主要な12個のハプログループ(F,B,A,N9a,N9b,M7a,M7b,M7c,G1,G2,D4及びD5)を迅速かつ的確に分類する検出法を開発した。
研究対象は、互いに血縁関係の無い40歳以上の日本人2137名(男性1442名、女性695名)であった。対象者は、2002年10月から2005年3月までに3つの参加病院(岐阜県立岐阜病院、岐阜県立多治見病院、岐阜県立下呂温泉病院)の一つを外来した受診者、或いは入院患者であった。
心筋梗塞を伴う1181名(男性920名、女性261名)の対象者は、全てが冠動脈造影と左室造影検査によって、病態が確認された。残りの956名(男性522名、女性434名)は、対照群とした。対照群は、研究参加病院に例年の健康チェックのために外来受診した者であった。対照群は、うっ血性心不全、末梢性動脈閉塞性疾患、動脈硬化性疾患、梗塞性・出血性脳卒中、他の脳疾患、および他の血栓・塞栓・出血性疾患の既往歴が無い者であった。
研究プロトコールは、ヘルシンキ宣言に従っており、三重大学医学部、岐阜県国際バイオ研究所、各参加病院の倫理委員会によって承認され、また各参加者からは個別に書面によるインフォームドコンセントを得た。
本発明者らが作製したヒトミトコンドリアゲノム多型データベース(http://www.giib.or.jp/mtsnp/index_e.shtml)および日本人の系統樹(非特許文献9)を使用して、ミトコンドリアハプログループの分類に有用である149個の多型部位を選択した。更に、本発明者らの鋭意検討に基づき、日本人集団において見出された12個の主要なハプログループ(F,B,A,N9a,N9b,M7a,M7b,M7c,G1,G2,D4,およびD5)を定義するmtSNPsを選択した。これらのmtSNPsを表1に示した。
本発明者らは、上記2137名の被験者について、これらハプログループと心筋梗塞との間の関係について研究を行った。
各参加者から50mmol/L EDTA(ジナトリウム塩)を含む試験管に、7mLの静脈血を採取し、市販のキット(Genomix, Talent, Trieste, Italy)を用いてDNAを分離した。
DNAをPCRにかけ、特定のDNAを増幅した。その際に使用したプライマーを表2および表3に示した。ミトコンドリアの多型は懸濁液アレイ技術(Luminex 100; Luminex, Austin, TX)を用い、シーケンス特異性オリゴヌクレオチド試験法(G&Gサイエンス株式会社、日本)で決定した。詳細な方法については、既報のもの(非特許文献10)を基本として、適宜に増幅条件を変えて行った。なお、条件については、後に詳述する。
表4〜表6については、第1のセット(プローブセットA)について、mtDNAにおける位置(Position)、目的(Purpose)、プローブの塩基配列(Sequence)を示している。また、目的の欄については、「a」が多型チェック用、「b」が野生型チェック用、「p」がPCR産物チェック用、「m」および「n」がマクロハプログループチェック用のものであることを示している。表7〜表9については、第2のセット(プローブセットB)について、上記と同じ意味である。
表4〜表9に示したプローブセットは、前述の12個のハプログループを分類するmtSNPに加えて、更に細かいサブハプログループを検出するためのプローブを含んでいる。
方法の詳細については、非特許文献10に記載の通りである。以下には、この方法の概要について説明する。
図1には、Luminex100フローサイトメトリーで検出するマイクロビーズ(本発明における固相に該当する)の微細構造と特徴を示した。マイクロビーズ(図中の符号(A))は、直径が約5.5μm程度であり、ポリスチレン製である。ビーズ表面にはカルボキシル基が存在している。このカルボキシル基と、アミノ修飾された核酸プローブとを結合することにより、ビーズ表面に核酸プローブが結合されている(本発明における核酸プローブの固相化に該当する)。各ビーズには、一種類の核酸プローブが結合されている。このマイクロビーズには、赤色色素と赤外色素との二種類の色素が割合を変化させつつ配されている(Multi-Analyte Microsphere Carboxylated: Luminex, オースチン社(Austin)、米国テキサス州)。こうして、図中の符号(B)に示すように、最大で100種類のものを混合した状態で、各ビーズの同定が行えるようになっている。
本実施例においては、表4〜表6に記載の100種類のプローブを第1セット(セットA)とし、表7〜表9に記載の86種類のプローブを第2セット(セットB)として、2セットを用いることで、合計186種類の多型を検出可能な検出系とした。これら186種類のプローブを用いることにより、ヒトミトコンドリアDNAを少なくとも12種類のハプログループ(F,B,A,N9a,N9b,M7a,M7b,M7c,G1,G2,D4およびD5)に分類することができる。
<増幅反応(Amplification)>
目的とするDNAフラグメントを増幅するPCR反応には、5’末端をビオチン化したプライマーを用いた。mtDNAフラグメントを増幅するために28−plex PCRを行った。2mM塩化マグネシウムを含む1xPCR溶液(30mM KCl、20mM Tris−HCl、pH8.3)、2.5%DMSO、0.2mM dNTPs、0.1μMずつのプライマーセットを混合し、Taq DNAポリメラーゼ(0.625U)と1ngのゲノムDNAを加えて25μLとした。PCR反応は、95℃で10分間処理の後、94℃で20秒間の変性、60℃で30秒間のアニーリング、及び72℃で30秒間の伸長を1サイクルとし、これを50サイクル繰り返した。最後に、72℃で7分間の伸長反応を行った。機器としてGeneAmp9700サーマルサイクラー(アプライドバイオシステムズ社製)を用いた。
増幅したDNAを変性した後、ビーズミックスとハイブリダイズさせた。96ウエルプレートの各ウエルに、5μLの増幅反応後のPCR増幅液、5μLのビーズミックス、および40μLのハイブリダイズ用緩衝液(1.5M TMAC、62.5mM TB(pH8.0)、0.5mM EDTA、0.125% N−ラウロイルザルコシン)を添加し、全量50μLとした。この混合液を添加した96ウエルプレートについて、95℃で2分間の変性、および52℃で30分間のハイブリダイゼーションを行った(GeneAmp9700サーマルサイクラーを用いた。)。
図2中には、増幅したDNAを認識するプローブを有するビーズ(1)のみが、DNAと結合する様子が示されている。
次に、上記ビーズミックス−DNAをSA−PEと反応させた。ハイブリッド工程の後、各ウエルに75μLのPBS−Tween(1xPBS(pH7.5)、0.01% Tween−20)を添加し、1000xgで5分間の遠心を行い、上清を取り去った後、再度100μLのPBS−Tweenを添加し、1000xgで5分間の遠心を行い、上清を取り去ることで、マイクロビーズを洗浄した。各ウエルに残ったマイクロビーズに、それぞれ70μLのSA−PE溶液(PBS−Tweenにより、市販品(G&Gサイエンス株式会社製)を100倍希釈したもの)を添加し混合した後、52℃で15分間の反応を行った(GeneAmp9700サーマルサイクラーを用いた。)。
図2中には、ビーズ(1)のプローブにのみビオチン化DNAが結合しているので、そのビオチンにSA−PEが結合する様子が示されている。
次に、反応後のサンプルはLuminex100を用いて、ビーズ種類の同定と、そのビーズにPEが結合しているか否かを判定した。測定は2種類のレーザを使用して行い、ビーズの種類は635nmレーザにより同定し、PE蛍光は532nmレーザを用いて定量した。オリゴビーズに結合したDNAは1測定あたり各々のビーズを最低50個ずつ測定し、定量されたPEの蛍光強度の中央値(MFI)を使用した。
図2中には、各ビーズ(1)〜(3)が同定され、かつビーズ(1)にのみPEが測定されたことから、ビーズ(1)に結合させたプローブが認識するDNAが増幅された様子が示されている。
数量的な臨床データは、心筋梗塞患者群と対照群との間で、対応のないスチューデントt検定、またはマン・ホイットニーU検定(the Mann−Whitney U test)を用いて比較した。質的なデータは、カイ二乗検定によって比較した。
心筋梗塞と関連する多型は、交絡因子を含む多項ロジスティック回帰分析法により解析した。このとき、交絡因子については、年齢(age)、性別(gender:0=女性、1=男性)、BMI、喫煙状態(smoker:0=非喫煙、1=喫煙)、高血圧、糖尿病、高コレステロール血症、高尿酸血症および各mtSNPの遺伝子型を独立変数とし、心筋梗塞を従属変数とした。P値、オッズ比(OR)、および95%信頼区間(CI)を計算した。特に説明しない限り、0.05未満のP値は統計上有意であると考えた。
<結果>
2137名の被験者に関する基礎的データを表10に示した。
年齢、性別、喫煙歴、BMI、糖尿病、高血圧、高コレステロール血症の有無を補正して多項ロジスティック回帰分析を行った結果を表11に示した。
表12には、ステップワイズ前向き選択法による解析結果を示した。
男性の場合には、高コレステロール血症、糖尿病とともに、ハプログループN9bは、心筋梗塞に対して独立した抵抗性の因子であった(P = 0.0005)。また、女性の場合には、心筋梗塞に関連したハプログループは認められなかった。
表13には、mtSNPsのうち、心筋梗塞に対する保護因子或いは危険因子として関連するものを示した。
年齢、性別、喫煙状態、BMI、2型糖尿病、高血圧、高コレステロール血症を補正した多項ロジスティック回帰分析の結果、ハプログループN9bを代表する2個のmtSNPである11016G>A(ND4:Ser86Asn)、14893A>G(Cytb:syn)、およびハプログループB4bを代表する4820G>A(ND2:syn)の3個のmtSNPsが、心筋梗塞に抵抗性を示すことがわかった(P < 0.005)。一方、ハプログループMを代表するmtSNPである10398A>G(ND3:Thr114Ala)と8701A>G(ATP6:Thr59Ala)の2個のmtSNPsが、心筋梗塞に感受性が有ることがわかった(P < 0.005)。
表14に示すように、ステップワイズ前向き選択法による解析結果を示した。
2個のmtSNP(11016G>A (N9a)、4820G>A (B4b))は、全対照者にとって心筋梗塞に抵抗性を示した(それぞれP = 0.0009, P = 0.0019)。10個のmtSNP(11016G>A, 4820G>A, 8793T>C, 856A>G,4850C>T, 9833T>C, 8200T>C, 10410T>C, 9296C>T and 15508C>T)の総合的な寄与は0.0197(上記10個の寄与率(R2)の総和)であった。
女性の場合には、ハプログループD4aを代表するmtSNPである10410T>Cは、心筋梗塞に対する危険因子であった(P = 0.0012)。5個のmtSNP(10410T>C, 9296C>T, 10398A>G, 856A>G, 9833T>C)の総合的な寄与は0.0320(上記5個の寄与率(R2)の総和)であった。
我々は、12種類の主要なミトコンドリアハプログループと心筋梗塞との関係に付いて、2137名の日本人を対象とした大規模な関連解析を行った。年齢、性別、喫煙履歴、BMI、糖尿病、高血圧、高コレステロール血症の有無で補正したところ、全対象者について、ハプログループN9bを持つ者は心筋梗塞の罹患率は有意に低値であった(P=0.0019)。特に、男性の場合には、ハプログループN9bは、心筋梗塞の罹患率は有意に低値であった(P=0.0007)。ハプログループN9bは、4カ所の多型(10607, 11016, 13183, 14893)で特徴付けられる。このハプログループは、東アジア全体で見ると、大変まれであり中国南部と韓国にはほとんど認められない。一方、土着の琉球人とアイヌ人を含めた日本人には最もよく認められる(非特許文献9)。
一般的に、女性が冠動脈疾患や心筋梗塞に罹患する危険性は男性の危険性に比べると10歳程度の遅れがあることから考えると、同世代の男性と女性が心臓疾患に罹患する理由は異なっているのかも知れない。性ホルモンであるエストロゲンは、血管壁や血管運動神経系に対して、NOやPGI2の生産、血管内皮細胞からのエンドセリン1の放出抑制などの好ましい影響を及ぼす(非特許文献20)。このため、エストロゲンなどの性ホルモン量が男女で異なることにより、心筋梗塞に関与するmtSNPが男性と女性とで異なるのかも知れない。
このように、本実施形態によれば、mtDNAのハプログループを検出することにより、心筋梗塞の遺伝的危険度を予測することができる。このことにより、心筋梗塞の予防が可能となり、高齢者の健康寿命延長・QOL向上・ねたきり防止ならびに今後の医療費削減など、医学的・社会的に大きく貢献できる。
Claims (2)
- 日本人被験者のヒトミトコンドリアDNAにおいて、11016A、14893Gを有するハプログループN9bと、709A、4833G、5108C、8200C、15497Aを有するハプログループG1と、4820Aを有するサブハプログループB4bと、10398G、8701G、10400Tを有するハプログループMと、6023Aを有するサブハプログループB4b1a1と、8793Cを有するサブハプログループM10と、10410C、15314Aを有するサブハプログループD4aと、856Gを有するサブハプログループD4d1bと、8856Aを有するサブハプログループB5b3と、15860Gを有するサブハプログループG1aと、9296Tを有するサブハプログループD4b2bと、2766Tを有するサブハプログループD4d1と、5147Aを有するサブハプログループYと、9833Cを有するサブハプログループD4k2または15508Tを有するサブハプログループB5bであるかを調べ、前記ハプログループN9bを有する日本人は心筋梗塞の危険性が低いこと、ハプログループG1を有する日本人男性は心筋梗塞の危険性が高いことを評価するための判断材料の一つとすることを特徴とする心筋梗塞に関する遺伝子検出方法。
- 前記ハプログループの検出方法が、PCR−SSOP−Luminex法であり、この方法の実施に用いるためのオリゴヌクレオチドのうち、
(1)ハプログループN9bを検出するために、11016A及び14893Gを限定して指標とし、
11016Aの検出については、PCR用プライマーの塩基配列が、配列番号35:tcacaatcat ggcaagccaa cgcと配列番号36:agtgagccta gggtgttgtg agであり、多型チェック用のプローブの塩基配列が、配列番号213:gatagtggtt cattggataであり、
14893Gの検出については、PCR用プライマーの塩基配列が、配列番号49:tccgcatgat gaaacttcgg ctと配列番号50:ggcccctcag aatgatattt ggcであり、多型チェック用のプローブの塩基配列が、配列番号138:tgcatggcta ggaacagtcc tと配列番号139:gcatggctag gaatagtccであり、
(2)ハプログループG1を検出するために、709A、4833G、5108C、8200C及び15497Aを限定して指標とし、
709Aの検出については、PCR用プライマーの塩基配列が、配列番号1:acatcacccc ataaacaaat aggttと、配列番号2:gcttctattg acttgggtta atcgであり、多型チェック用のプローブの塩基配列が、配列番号158:gaactcactg gaatggggatであり、
4833Gの検出については、PCR用プライマーの塩基配列が、配列番号15:tccacagaag ctgccatcaa gtaと、配列番号16:gagagtgagg agaaggctta cgtであり、多型チェック用のプローブの塩基配列が、配列番号83:aggttaccca aggcgcccctであり、
5108Cの検出については、PCR用プライマーの塩基配列が、配列番号17:cagctacgca aaatcttagc atacと、配列番号18:ttgggcaaaa agccggttag cgであり、多型チェック用のプローブの塩基配列が、配列番号86:ttatcctaac taccaccgcaであり、
8200Cの検出については、PCR用プライマーの塩基配列が、配列番号25:ggggtatact acggtcaatg ctcと、配列番号26:tcattttggt tctcagggtt tgttatであり、多型チェック用のプローブの塩基配列が、配列番号193:acgatgggca tgaagctgtgであり、
15497Aの検出については、PCR用プライマーの塩基配列が、配列番号51:gacagtccca ccctcacacg atと、配列番号52:gggacggatc ggagaattgt gtであり、多型チェック用のプローブの塩基配列が、配列番号147:ccagacctcc taagcgacであることを特徴とする請求項1に記載の遺伝子検出方法。
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