JP5360853B2 - メタボリック症候群に関する遺伝子検出方法 - Google Patents

Description

本発明は、メタボリック症候群に関する遺伝子検出方法に関し、特にヒトミトコンドリアＤＮＡのハプログループを分類することによりメタボリック症候群に関する遺伝子検出を行うものに関する。

メタボリックシンドローム（以下、「ＭＳ」と省略する）は、複雑な多因子性の疾患である。この疾患では、様々な遺伝及び環境の影響の相互作用が重要な役割を果たしている。ＭＳは、内臓性肥満、高脂血症、高血圧症及び高血糖を特徴とし、病理生理学的にはインスリン抵抗性に関係している。これらのＭＳの特徴が維持されると、やがてアテローム性動脈硬化症及び２型糖尿病が発症し、最終的には心不全や致死性の心臓血管或いは脳血管障害を惹き起こす。ミトコンドリアの機能障害は、骨格筋におけるインスリン抵抗性並びに膵臓のベータ細胞からのインスリン分泌障害の両者に関連していると考えられている（非特許文献１。なお、本案件については、文献は末尾にまとめて記載する。）。

ミトコンドリアゲノムにおける母系遺伝的な変異は、過去２０万年の間にホモサピエンスがアフリカからアジアへそしてヨーロッパへと拡散する間に、新らたな突然変異がそれに順次追加されて来た結果である（非特許文献２）。ミトコンドリアゲノムの突然変異の発生率は、核ゲノムの突然変異の発生率よりも約１０倍高いので、ホモサピエンスの比較的短い歴史の間に蓄積されて来た古代のミトコンドリア多型は、現代人の代謝特性の解明に貢献する可能性がある（非特許文献３）。世界の様々な地域で発見されたミトコンドリアのハプログループは、人類が寒冷な気候とその下での栄養条件に適応的に選択されて来た結果であると推測することができる（非特許文献３〜非特許文献５）。

ミトコンドリアハプログループ間で機能的な差が存在する事を示す証拠が、精子運動性（非特許文献６）、敗血症後の生存率（非特許文献７）、及びパーキンソン病に対する感受性（非特許文献８）の研究によって与えられている。初期の研究では、我々は、肥満（非特許文献１２）、るい痩（非特許文献１３）、２型糖尿病（非特許文献１２）、或いはアテローム性動脈硬化症といったエネルギー代謝に関与するものと同じく、例えば寿命（非特許文献９）、パーキンソン病（非特許文献１０、１１）及びアルツハイマー病といった年齢関連疾患に関与するミトコンドリア単一ヌクレオチド多型（ｍｔＳＮＰｓ）を同定することを目標としていた。

この目的のために、我々は７つの異なる集団に属する６７２名分の完全ミトコンドリアゲノムの全塩基配列を決定した。各集団はおのおの９６名から構成され、百寿者、パーキンソン病罹患者、アルツハイマー病罹患者、肥満者、非肥満者、重度の血管性病変を持つ２型糖尿病、血管性病変を持たない２型糖尿病罹患者の７群であった。
これらの調査結果から、我々は、ヒトのミトコンドリアゲノム多型データベース (http://www.giib.or.jp/mtsnp/index_e.shtml) を構築した。これらのｍｔＳＮＰデータに基づいて、我々は、蛍光ビーズ法を用いて包括的なｍｔＳＮＰ分析システムを開発した。
Ｗｅｎｇらは、中国人成人においてはミトコンドリアＤＮＡの非コード領域における変異の一つである１６１８９位の変異（Ｔ＞Ｃトランジション）がメタボリックシンドロームに関連すると報告している（非特許文献１５）。

しかし、ヨーロッパ人に関する研究のメタアナリシスの結果によれば、同様に非コード領域における変異の一つである１６１８４−１６１９３のｐｏｌｙ（Ｃ）ｔｒａｃｔの遺伝変異は、２型糖尿病発症においては主要な役割を有していないことが示されている（非特許文献１６）。従って、非コード領域のみにおける多型分析は、個々人の代謝特性とミトコンドリアゲノムにおける機能的多型との間の相互関係については、直接的な証拠とはならないと考えられる。
本発明は、上記した事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、ｍｔＤＮＡのハプログループに基づき、ＭＳの遺伝的危険度を予測する遺伝子検出方法等を提供すること、及びそれによってＭＳの発症を予防することにある。

本発明者らは、長年に亘ってヒトミトコンドリアゲノムに関する研究を行っている者である。ヒトミトコンドリアＤＮＡは、強固に連鎖した複数のｍｔＳＮＰを有するハプログループに分類することができる。図３〜図５には、ｍｔＳＮＰとハプログループ（及びサブハプログループ）との関係を示した。このハプログループの分布は、人種間において、かなり大きな隔たりがある。個々の日本人は、主要な１０個のハプログループによって、そのほとんど（約９０パーセント以上）を分類することができる。各ハプログループは、数個〜２０個程度のｍｔＳＮＰによって特徴付けられる。例えば、ハプログループＦは、８７０１、９５４０、１０３９８、１０８７３、１５３０１、１６５１９、１２７０５、１６２２３、１６１８３、１６５１９、３９７０、１３９２８、１６３０４、２４８、６３９２、１０３１０等の位置にｍｔＳＮＰを有している（その他のハプログループについても、同様の状況が存在する）。ハプログループ分類をするために、これら全てのｍｔＳＮＰを調べようとするのは、大変な労力が掛かるため大規模な研究には向きにくい。しかしながら、これらのうちのいずれのｍｔＳＮＰを選択・検出すれば、適切にハプログループを分類することが可能であるかについては明確には知られていなかったことに加え、選択したｍｔＳＮＰを迅速かつ的確に検出する方法については開発が十分に進んでいなかった。
そこで、本発明者らは、鋭意検討の結果、新たなｍｔＳＮＰの検出法を開発し、日本人における主要な１０個のハプログループ（Ｆ，Ｂ，Ａ，Ｎ９ａ，Ｍ７ａ，Ｍ７ｂ，Ｇ１，Ｇ２，Ｄ４及びＤ５）を迅速かつ的確に分類する検出法を開発した。
つまり、各ハプログループが持っている数個〜二十個程度のｍｔＳＮＰのうち、適当に１個〜５個のｍｔＳＮＰを選択することにより、表１に記載のｍｔＳＮＰｓを検出すれば、１０個のハプログループへの分類が可能であることを見出した。更に、この方法を用いて、本発明者らは、ミトコンドリアゲノムのコード領域における包括的な多型分析を基にして、日本人におけるＭＳと主要な１０個のハプログループ（Ｆ，Ｂ，Ａ，Ｎ９ａ，Ｍ７ａ，Ｍ７ｂ，Ｇ１，Ｇ２，Ｄ５及びＤ４）との関係を調べるために、１３３７名を対象とした大規模な関連解析を行った。その結果、特に女性の場合には、ハプログループＮ９ａ、Ｇ１及びＤ５において、ＭＳに対する抵抗性を有することを明らかとし、基本的には本発明を完成するに至った。

こうして、上記課題を解決するために、第一の発明に係るメタボリック症候群に関する遺伝子検出法は、ヒトミトコンドリアＤＮＡにおいて、５２３１Ａ、１２３５８Ｇ、１２３７２Ａを有するハプログループＮ９ａと、７０９Ａ、４８３３Ｇ、５１０８Ｃ、８２００Ｃ、１５４９７Ａを有するハプログループＧ１と、４８８３Ｔ、５１７８Ａ、１０３９７Ｇを有するハプログループＤ５と、１５３４６Ａを有するサブハプログループＢ４ｃと、１３８７９Ｃを有するサブハプログループＢ４ｃ１ｂ１と、１５３１４Ａを有するサブハプログループＤ４ａと、９２９６Ｔを有するサブハプログループＤ４ｂ２ｂと、８３８３Ｃを有するサブハプログループＤ４ｄ２と、１２４０６Ａを有するサブハプログループＦ１と、１５８６０Ｇを有するサブハプログループＧ１ａと、３７５９Ｇを有するサブハプログループＧ５ｂ１ｂと、１５０６７Ｃを有するサブハプログループＮ９ａ２ａ１と、５１４７Ａを有するサブハプログループＮ９ｂ１とを検出することを特徴とする。

本明細書中において、多型の記載方法は、次の通りである。原則として、各遺伝子について、「多型が生じている位置、データベースに登録されている塩基（Ａ：アデニン、Ｇ：グアニン、Ｃ：シトシン、Ｔ：チミン）＞多型塩基」の順で記載する。例えば、「５２３１Ｇ＞Ａ」は、５２３１位のＧがＡとなっている多型を意味している。また、その多型が生じている遺伝子（ｒＲＮＡまたはｍＲＮＡ）の位置について、カッコ書きで情報を示すことがある。例えば、「５２３１Ｇ＞Ａ（ＮＤ２：ｓｙｎ）」とは、上記多型について、ＮＤ２遺伝子において、アミノ酸の変異を伴わない多型（synonymous mutation）であることを意味している。但し、挿入あるいは欠失多型については、「多型が生じている位置（欠失または挿入に関する塩基情報）」の順で記載する。例えば、「８２７２（9-bp deletion in non-coding region）」とは、８２７２位の非コード領域における９個の塩基の欠失多型であることを意味している。また、順方向（forward strand）に読んでＡ／Ｇ多型としてデータベースに記録されている場合であっても、逆方向（reverse strand）で読むとＴ／Ｃ多型となる。多くの文献について、「Ｔ／Ｃ」多型として記載されている場合には、データベース中の記録であるＡ／Ｇ多型と異なることがある。

一般にミトコンドリアＤＮＡ多型（ｍｔＳＮＰｓ）或いはミトコンドリアＤＮＡハプログループは、対象となる集団（例えば、日本人・中国人・韓国人を含む東アジア人集団、西洋人集団など）が異なると、その種類・頻度が異なる。このため、日本人以外の集団において、ＭＳとの関係が指摘されているハプログループであっても、必ずしも日本人集団においてそのような関連が認められるわけではない。このため、従来の報告については、集団または疾患が異なる場合には、必ずしも日本人におけるハプログループおよびＭＳとの関連が裏付けられるわけではない。

本発明において、ｍｔＤＮＡのハプログループを検出する方法としては、従来公知の方法、例えばＤＮＡシークエンス、ＤＮＡチップ（或いはＤＮＡマイクロアレイ）、ＲＦＬＰ、ＰＣＲ−ＳＳＯＰ−Ｌｕｍｉｎｅｘ法などの方法を用いることができる。これらの中でも、ＰＣＲ−ＳＳＯＰ−Ｌｕｍｉｎｅｘ法を用いることが好ましい。ＰＣＲ−ＳＳＯＰ−Ｌｕｍｉｎｅｘ法を用いることにより、数百個程度の多型であれば迅速に測定することができる。なお、同方法の詳細については後に詳述する。

本発明によれば、ｍｔＤＮＡのハプログループを検出することにより、ＭＳの遺伝的危険度を予測することができる。この発明を用いることにより、ＭＳに対する予防が可能となり、高齢者の健康寿命延長・ＱＯＬ向上・ねたきり防止ならびに今後の医療費削減など、医学的・社会的に大きく貢献できる。

次に、本発明の実施形態について、図面を参照しつつ説明するが、本発明の技術的範囲は、これらの実施形態によって限定されるものではなく、発明の要旨を変更することなく様々な形態で実施することができる。また、本発明の技術的範囲は、均等の範囲にまで及ぶものである。

＜研究対象＞
研究対象は、互いに血縁関係の無い４０歳以上の日本人１３３７名（男性８８３名、女性４５４名）であった。対象者は、２００２年１０月から２００５年３月の間に、３つの研究参加病院（岐阜県立岐阜病院、多治見病院及び下呂温泉病院）の１つを外来した受診者、或いは入院者である。診断は、成人治療パネルIII（非特許文献１７）により提唱されたメタボリックシンドローム（ＭＳ）に関する修正定義に基づいて行った。この修正版は、スコットランド西部冠動脈疾患予防研究（非特許文献１８）及び女性の健康に関する研究（非特許文献１９）においても使用されたものである。但し、それらの研究では、ウエストサイズの代わりに体重指標（ＢＭＩ）が採用されている。日本人及び他のアジア人集団においては、肥満指標のためのＢＭＩ基準を改訂する必要性が最近認識されている（非特許文献２０）。このため、我々はこの改定基準を基にして、ＢＭＩ値が２５ｋｇ／ｍ^２以上の者を肥満者とした。

対象者が次の５つの因子の内の３つ以上を持っている場合にＭＳであると診断した。５つの因子とは、（１）２５ｋｇ／ｍ^２以上のＢＭＩ、（２）トリグリセリド血清濃度が１.６５ｍｍｏｌ／Ｌ（１５０ｍｇ／ｄＬ）以上、（３）ＨＤＬコレステロール血清濃度が、男性では１.０４ｍｍｏｌ／Ｌ（４０ｍｇ／ｄＬ）未満、女性では１.３０ｍｍｏｌ／Ｌ（５０ｍｇ／ｄＬ）未満、（４）収縮期血圧が１３０ｍｍＨｇ以上、かつ拡張期血圧が８５ｍｍＨｇ以上、及び（５）絶食時血漿グルコース濃度が６.０５ｍｍｏｌ／Ｌ（１１０ｍｇ／ｄＬ）以上の５個である。

これらの基準に基づき、８７１名（男性５８４名、女性２８７名）がＭＳ患者であると診断された。対照群は、総数４６６名（男性２９９名、女性１６７名）である。対照群者は、参加病院に年に一度の健康チェックのために外来受診した者達である。これらの者は、ＭＳの５つの基準のうちのいずれも有していなかった。また、肥満、高脂血症、異常脂血症、高血圧症、或いは糖尿病の既往歴も何ら有していなかった。代謝性もしくは内分泌性疾患の患者、或いは二次性の糖尿病を引き起こす薬剤を服用する者は、本研究の対象からは除外した。研究プロトコルは、岐阜県国際バイオ研究所のヒト研究に関する倫理委員会により承認され、また各参加者からは個別に書面によるインフォームドコンセントを得た。

＜ハプログループ分類のためのミトコンドリア多型の選択＞
本発明者らが作製したヒトミトコンドリアゲノム多型データベース (http://www.giib.or.jp/mtsnp/index_e.shtml) 及び日本人の系統樹（非特許文献１４）を使用して、ミトコンドリアハプログループの分類に有用である１６６個の多型部位を選択した。更に、本発明者らの鋭意検討に基づき、日本人集団において発見された１０個の主要なハプログループ（Ｆ，Ｂ，Ａ，Ｎ９ｂ，Ｍ７ａ，Ｍ７ｂ，Ｇ１，Ｇ２，Ｄ４，及びＤ５）を定義するｍｔＳＮＰｓを選択した。これらのｍｔＳＮＰｓを表１に示した。

表中、左欄より順に、ハプログループ（Haplogroup）、及び各ハプログループを代表する多型（Polymorphism）を示している。また表中、「＊」はアミノ酸の変異を伴わない多型（synonymous mutation）であることを示している。
本発明者らは、上記１３３７名の参加者について、これらハプログループとＭＳとの間の関係について研究を行った。
＜多型の遺伝子タイピング＞
各参加者から５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ（ジナトリウム塩）を含む試験管に、７ｍＬの静脈血を採取し、市販のキット(Genomix, Talent, Trieste, Italy)を用いてＤＮＡを分離した。
ＤＮＡをＰＣＲにかけ、特定のＤＮＡを増幅した。その際に使用したプライマーを表２及び表３に示した。ミトコンドリアの多型は懸濁液アレイ技術(Luminex 100; Luminex, Austin, TX)を用い、シーケンス特異性オリゴヌクレオチド試験法（Ｇ＆Ｇサイエンス株式会社、日本）で決定した。詳細な方法については、既報のもの（非特許文献２１）を基本として、適宜に増幅条件を変えて行った。なお、条件については、後に詳述する。
また、ハプロタイピングのために使用したプライマーは、表４〜表９に示した。今回のタイピングには、最大で１００種類の多型の判定が行えるものを用いた。１８６種類のプローブを用いるために、全体を１００種類のセット（プローブセットＡ）と８６種類のセット（プローブセットＢ）とに分けて、タイピングを行った。表４〜表６にはプローブセットＡの詳細を、表７〜表９にはプローブセットＢの詳細を示した。

表２及び表３については、左欄よりＰＣＲ法によって合成されるフラグメント番号（Fragment）、フォワードプライマー（Forward primer）のｍｔＤＮＡにおける位置（Position）と塩基配列（Sequence）、リバースプライマー（Reverse primer）のｍｔＤＮＡにおける位置（Position）と塩基配列、及び合成されるＤＮＡフラグメント長（Product）を示している。
表４〜表６については、第１のセット（プローブセットＡ）について、ｍｔＤＮＡにおける位置（Position）、目的（Purpose）、プローブの塩基配列（Sequence）を示している。また、目的の欄については、「ａ」が多型チェック用、「ｂ」が野生型チェック用、「ｐ」がＰＣＲ産物チェック用、「ｍ」及び「ｎ」がマクロハプログループチェック用のものであることを示している。表７〜表９については、第２のセット（プローブセットＢ）について、上記と同じ意味である。
表４〜表９に示したプローブセットは、前述の１０個のハプログループを分類するｍｔＳＮＰに加えて、更に細かいサブハプログループを検出するためのプローブを含んでいる。

ＰＣＲ−ＳＳＯＰ−Ｌｕｍｉｎｅｘ法
方法の基本的な考え方は、非特許文献２１に記載の通りである。以下には、この方法をｍｔＳＮＰに応用した本実施形態の方法について説明する。
図１には、Ｌｕｍｉｎｅｘ１００フローサイトメトリーで検出するマイクロビーズの微細構造と特徴を示した。マイクロビーズ（図中の符号（Ａ））は、直径が約５.５μｍ程度であり、ポリスチレン製である。ビーズ表面にはカルボキシル基が存在している。このカルボキシル基と、アミノ修飾された核酸プローブとを結合することにより、ビーズ表面に核酸プローブが結合されている。各ビーズには、一種類の核酸プローブが結合されている。このマイクロビーズには、赤色色素と赤外色素との二種類の色素が割合を変化させつつ配されている（Multi-Analyte Microsphere Carboxylated: Luminex, オースチン社（Austin）、米国テキサス州）。こうして、図中の符号（Ｂ）に示すように、最大で１００種類のものを混合した状態で、各ビーズの同定が行えるようになっている。

複数種類のプローブを備えたマイクロビーズ（但し、各マイクロビーズには一種類のプローブのみ）を適当な割合で混合し、１００ビーズ／μＬとなるようにしたビーズミックスを調製した（図中の符号（Ｃ））。
本実施例においては、表４〜表６に記載の１００種類のプローブを第１セット（セットＡ）とし、表７〜表９に記載の８６種類のプローブを第２セット（セットＢ）として、２セットを用いることで、合計１８６種類の多型を検出可能な検出系とした。これら１８６種類のプローブを用いることにより、ヒトミトコンドリアＤＮＡを少なくとも１０種類のハプログループ（Ｆ，Ｂ，Ａ，Ｎ９ａ，Ｍ７ａ，Ｍ７ｂ，Ｇ１，Ｇ２，Ｄ５及びＤ４）に分類することができる。

図２には、ＰＣＲ−ＳＳＯＰ−Ｌｕｍｉｎｅｘ法の手順を示した。
＜増幅反応（Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）＞
目的とするＤＮＡフラグメントを増幅するＰＣＲ反応には、５’末端をビオチン化したプライマーを用いた。ｍｔＤＮＡフラグメントを増幅するために２８−ｐｌｅｘ ＰＣＲを行った。２ｍＭ塩化マグネシウムを含む１ｘＰＣＲ溶液（３０ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８.３）、２.５％ＤＭＳＯ、０.２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、０.１μＭずつのプライマーセットを混合し、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（０.６２５Ｕ）と１ｎｇのゲノムＤＮＡを加えて２５μＬとした。ＰＣＲ反応は、９５℃で１０分間処理の後、９４℃で２０秒間の変性、６０℃で３０秒間のアニーリング、及び７２℃で３０秒間の伸長を１サイクルとし、これを５０サイクル繰り返した。最後に、７２℃で７分間の伸長反応を行った。機器としてＧｅｎｅＡｍｐ９７００サーマルサイクラー（アプライドバイオシステムズ社製）を用いた。

＜ハイブリダイゼーション（Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）＞
増幅したＤＮＡを変性した後、ビーズミックスとハイブリダイズさせた。９６ウエルプレートの各ウエルに、５μＬの増幅反応後のＰＣＲ増幅液、５μＬのビーズミックス、及び４０μＬのハイブリダイズ用緩衝液（１.５Ｍ ＴＭＡＣ、６２.５ｍＭ ＴＢ（ｐＨ８.０）、０.５ｍＭ ＥＤＴＡ、０.１２５％ Ｎ−ラウロイルザルコシン）を添加し、全量５０μＬとした。この混合液を添加した９６ウエルプレートについて、９５℃で２分間の変性、及び５２℃で３０分間のハイブリダイゼーションを行った（ＧｅｎｅＡｍｐ９７００サーマルサイクラーを用いた。）。
図２中には、増幅したＤＮＡを認識するプローブを有するビーズ（１）のみが、ＤＮＡと結合する様子が示されている。

＜ストレプトアビジン−フィコエリトリン反応（ＳＡ−ＰＥ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）＞
次に、上記ビーズミックス−ＤＮＡをＳＡ−ＰＥと反応させた。ハイブリッド工程の後、各ウエルに７５μＬのＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（１ｘＰＢＳ（ｐＨ７.５）、０.０１％ Ｔｗｅｅｎ−２０）を添加し、１０００ｘｇで５分間の遠心を行い、上清を取り去った後、再度１００μＬのＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎを添加し、１０００ｘｇで５分間の遠心を行い、上清を取り去ることで、マイクロビーズを洗浄した。各ウエルに残ったマイクロビーズに、それぞれ７０μＬのＳＡ−ＰＥ溶液（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎにより、市販品（Ｇ＆Ｇサイエンス株式会社製）を１００倍希釈したもの）を添加し混合した後、５２℃で１５分間の反応を行った（ＧｅｎｅＡｍｐ９７００サーマルサイクラーを用いた。）。
図２中には、ビーズ（１）のプローブにのみビオチン化ＤＮＡが結合しているので、そのビオチンにＳＡ−ＰＥが結合する様子が示されている。

＜測定（Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ）＞
次に、反応後のサンプルはＬｕｍｉｎｅｘ１００を用いて、ビーズ種類の同定と、そのビーズにＰＥが結合しているか否かを判定した。測定は２種類のレーザを使用して行い、ビーズの種類は６３５ｎｍレーザにより同定し、ＰＥ蛍光は５３２ｎｍレーザを用いて定量した。オリゴビーズに結合したＤＮＡは１測定あたり各々のビーズを最低５０個ずつ測定し、定量されたＰＥの蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）を使用した。
図２中には、各ビーズ（１）〜（３）が同定され、かつビーズ（１）にのみＰＥが測定されたことから、ビーズ（１）に結合させたプローブが認識するＤＮＡが増幅された様子が示されている。

この方法に拠る遺伝子タイピングの精度を確かめるために、９１個のＤＮＡサンプルを材料に使用した。これらのＤＮＡサンプルは、ミトコンドリアゲノムの全塩基配列が直接シーケンスによって既に決定されているものである。各例において、ルミネックスシーケンス特異性オリゴヌクレオチドハイブリッドアッセイシステム（ＰＣＲ−ＳＳＯＰ−Ｌｕｍｉｎｅｘ法）によって決定された遺伝子型は、直接シーケンスによって決定されたものと一致した。

＜統計的分析＞
量的な臨床データは、ＭＳ罹患群と対照群との間で、対応のないスチューデントｔ検定を用いて比較した。質的なデータは、カイ二乗検定によって比較した。
ＭＳと関連する多型は、交絡因子を含む多項ロジスティック回帰分析法により解析した。このとき、交絡因子については、年齢（age）、性別（gender：０＝女性、１＝男性）、喫煙状態（smoker：０＝非喫煙、１＝喫煙）、及び各ｍｔＳＮＰの遺伝子型を独立変数とし、ＭＳを従属変数とした。Ｐ値、オッズ比（OR）、及び９５％信頼区間（CI）を計算した。特に説明しない限り、０.０５未満のＰ値は統計上有意であると考えた。

ハプログループを多重比較するために、ボンフェローニ（Bonferroni）の補正を適用した。我々は、１０個のハプログループを調べたので、０.０５を１０で除して、０.００５とした。こうして、０.００５未満のＰ値を統計上有意であると見なした。
＜結果＞
１３３７名の被験者に関する基礎的データを表１０に示した。

表中において、最左欄は上段から順に、年齢（Age）、性別（女性／男性）（Gender）、ＢＭＩ（Body mass index）、喫煙率（Smoker）、高血圧（Hypertension）、収縮期血圧（Systolic blood pressure）、拡張期血圧（Diastolic blood pressure）、高脂血症（Hypercholesterolemia）、全コレステロール（Total cholesterol）、中性脂肪（Triglycerides）、ＨＤＬ−コレステロール（HDL-cholesterol）、糖尿病（Diabetes mellitus）、空腹時血糖値（Fasting blood glucose）、ヘモグロビンＡｌｃ（Glycosylated hemoglobin）を意味している。また、最上段は左から順に、被験者全員（All subjects）におけるＭＳ群（MS）の値と対照群（Controls）の値とＰ値（P value）、女性（Women）におけるＭＳ群の値と対照群の値とＰ値、男性（Men）におけるＭＳ群の値と対照群の値とＰ値とをそれぞれ示している。また、各値において、「±」が付してあるものは、平均値±ＳＤで示した。喫煙率については、１日あたり１０本以上の喫煙数がある者を喫煙者とした。高血圧については、収縮期血圧が１４０ｍｍＨｇ以上、または拡張期血圧が９０ｍｍＨｇ以上、或いは両基準を満たす者、または高血圧薬を服用している者とした。糖尿病については、絶食時血漿グルコース濃度が１２６ｍｇ／ｄＬ（６.９３ｍｍｏｌ／Ｌ）以上、またはヘモグロビンＡｌｃが６.５％以上、或いは両基準を満たす者、または抗糖尿病薬を服用している者とした。高脂血症については、全コレステロール値が２２０ｍｇ／ｄＬ（５.７２ｍｍｏｌ／Ｌ）以上、または高脂血症剤を服用している者とした。

年齢及び性別（女／男比率）については、いずれもＭＳ罹患群と対照群との間で統計的な差異は認められなかった。ＢＭＩ、トリグリセリド、絶食時血糖濃度、及びヘモグロビンＡｌｃ（HbA1c）比率は、対照群に比べるとＭＳ罹患群においては有意に高かった。ＨＤＬコレステロールはＭＳ罹患群では対照群に比べて有意に低かった。喫煙率、高血圧症、高コレステロール血症及び真性糖尿病は、対照群に比較してＭＳ罹患群では有意に高かった。
年齢、性別、喫煙状態を補正して多項ロジスティック回帰分析を行った結果、Ｐ値が０.０５未満で、ハプログループＮ９ａがＭＳに対する抵抗性に関連した。また、ハプログループＮ９ａ，Ｇ１，Ｄ５の３グループの女性は、ＭＳに対する抵抗性に関連することが明らかとなった（表１１）。

表中において、左欄より順に、変数（Variable）、Ｐ値（P value）、オッズ比（OR）、９５％信頼区間（95%CI）を示している。また、上段より被験者全員（All subjects）における従来の危険因子（Conventional risk factors）である年齢（Age）・性別（Gender）・喫煙率（Smoking）と遺伝的危険因子（Genetic risk factors）であるハプログループＮ９ａを、女性における従来の危険因子である年齢・喫煙率と遺伝的危険因子であるハプログループＮ９ａ、Ｇ１、Ｄ５を、男性における従来の危険因子である年齢・喫煙率と遺伝的危険因子（該当するハプログループなし）をそれぞれ意味している。
我々は、ハプログループの多重比較について、０.００５未満のＰ値が得られた場合に、その関連が有意であると考えた。この基準に基づくと、ハプログループＮ９ａは、女性ではＭＳに対する抵抗性に有意に関係していた。ステップワイズ前向き選択法の結果、女性については、ハプログループＮ９ａがＭＳに対する保護因子であることが明らかになった（表１２）。しかしながら、男性については、これらのハプログループのうちのいずれもＭＳとの関連は示されなかった。

女性の場合は、ステップワイズ前向き選択法の結果、年齢、ハプログループＮ９ａ，Ｇ１及びＤ５が、ＭＳに対して独立的な危険因子、或いは保護因子であることが明らかとなった。ハプログループＮ９ａ，Ｇ１及びＤ５のＭＳからの保護作用についての全体としての貢献度は、０.０３６１であった。これは女性の場合には、ミトコンドリアゲノム多型がＭＳに対する感受性に影響する重要な遺伝因子であることを示している。
表１３には、ｍｔＳＮＰｓのうち、ＭＳに対する保護因子或いは危険因子として関連するものを示した。なお、表中「＊」は、各ハプログループを示すマーカーとして使われたｍｔＳＮＰｓであることを示している。

表中、「＊」は表１において示すように、１０個のハプログループを代表させるために用いた多型マーカであることを示している。また、表中の太字で示したＰ値は、０.００５未満であることを示している。
年齢、性別及び喫煙状態を補正した多項ロジスティック回帰分析によれば、ハプログループＤ４ａを代表するｍｔＳＮＰである１５３１４Ｇ＞Ａ（Ｃｙｔｂ：Ａ１９０Ｔ）が、全対象者でＭＳへの抵抗性に関連することが明らかとなった（Ｐ＜０.０５）。
更に、ハプログループＮ９ａを代表する３個のｍｔＳＮＰｓである５２３１Ｇ＞Ａ、１２３７２Ｇ＞Ａ、及び１２３５８Ａ＞Ｇ、ハプログループＮ９ａ２ａ１を代表するｍｔＳＮＰである１５０６７Ｔ＞Ｃ、及びサブハプログループＧ５ｂ１ｂを代表するｍｔＳＮＰである３７５９Ａ＞Ｇは、ＭＳに対する抵抗性と関連があった。これと対照的に、３個のｍｔＳＮＰｓ、すなわちサブハプログループＦ１を代表する１２４０６Ｇ＞Ａ、サブハプログループＤ４ｂ２ｂを代表する９２９６Ｃ＞Ｔ、及びサブハプログループＢ４ｃを代表する１５３４６Ｇ＞Ａは、ＭＳへの感受性に関連があった（Ｐ＜０.０５）。

女性の場合には、年齢及び喫煙状態を補正した多項ロジスティック回帰分析の結果、ハプログループＮ９ａを代表する３個のｍｔＳＮＰｓである５２３１Ｇ＞Ａ、１２３７２Ｇ＞Ａ、及び１２３５８Ａ＞Ｇが、それぞれ危険率（Ｐ）が０.０００９、０.００４２、及び０.００４２で、ＭＳに対する抵抗性と関係することが明らかになった。更に、サブハプログループＮ９ａ２ａ１を代表するｍｔＳＮＰである１５０６７Ｔ＞Ｃも、ＭＳへの抵抗性と関係していた。
ハプログループＧ１を代表する２個のｍｔＳＮＰｓである８２００Ｔ＞Ｃ及び１５４９７Ｇ＞Ａ、サブハプログループＧ１ａを代表するｍｔＳＮＰである１５８６０Ａ＞Ｇ、サブハプログループＧ５ｂ１ｂを代表するｍｔＳＮＰである３７５９Ａ＞Ｇは、ＭＳに対する抵抗と関係があった。

対照的に、２つのｍｔＳＮＰｓ、即ちサブハプログループＦ１を代表する１２４０６Ｇ＞Ａ、及びサブハプログループＤ５を代表する１０３９７Ａ＞Ｇは、ＭＳへの感受性と関係があった（Ｐ＜０.０５）。
男性の場合は、ハプログループＮ９ｂ１を代表するｍｔＳＮＰである５１４７Ｇ＞ＡがＭＳへの感受性に関係があった（Ｐ＜０.０５）。
我々は１６６個の異なるｍｔＳＮＰｓに対して修正ボンフェローニ法を適用したが、これらのＰ値のうちのいずれも有意レベルが０.０００３以下を示さなかった。

表１４に示すように、ステップワイズ前向き選択法によれば、ハプログループＮ９ａを代表するｍｔＳＮＰである５２３１Ｇ＞Ａが、女性の場合にはＭＳに対する保護因子であることが明らかとなった（Ｐ＝０.０００３）。
４個のｍｔＳＮＰｓ、すなわち５２３１Ｇ＞Ａ、８２００Ｔ＞Ｃ、３７５９Ａ＞Ｇ、及び１５３１４Ｇ＞ＡのＭＳへの保護作用の全体としての貢献度は、０.０５５２であった。これは、女性の場合には、これらのｍｔＳＮＰｓがＭＳへの感受性に影響する重要な遺伝因子であることを示唆している。

＜考察＞
我々は１３３７名に基づく大規模な関連解析を行い、１０種類の主要なミトコンドリアハプログループのそれぞれとＭＳとの間の関係を調査した。これらのハプログループのうち、Ｎ９ａ、Ｇ１、及びＤ５の３つは、女性の場合には、ＭＳに対する抵抗性と有意に関係していた。ハプログループＮ９ａに特有なｍｔＳＮＰｓの大部分は、５２３１Ｇ＞Ａ及び１２３７２Ｇ＞Ａを含む同義変異であるが、これらは本研究の遺伝子タイピングを行うのに使用した。
このハプログループにおいて、機能的な多型としては、１５０Ｃ＞Ｔ及び３３８Ｃ＞Ｔが候補として挙げられる。これらはミトコンドリアゲノムの非コード領域にある。１５０Ｃ＞Ｔ置換はイタリアの百寿者で最初に報告された（非特許文献２２）。また、以前に我々は、この置換がフィンランド人と日本人共に健康な長寿と関連していることを報告した（非特許文献２３）。このように、１５０Ｃ＞Ｔは、女性ではＭＳに対する抵抗性を付与する可能性がある。

ハプログループＭ９ａに特異的なｍｔＳＮＰｓのうちで、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット５遺伝子産物（ＮＤ５）において、Ｔｈｒ８Ａｌａ置換を惹き起こす１２３５８Ａ＞Ｇは、機能的な多型の一つであるかも知れない。
ＮＤ５はｍｔＤＮＡにコードされたサブユニットの７個の内の一つであるが、これらのサブユニットは呼吸鎖複合体Ｉ（ＮＡＤＨ：ユビキノン酸化還元酵素、ＥＣ１．６．５．３）の約４１個のポリペプチドに含まれる。複合体Ｉは、ＮＡＤＨから電子を受け取り、それをユビキノン（補酵素Ｑ１０）に転送する。その際に得られたエネルギーを用いて、ミトコンドリア内膜を通してプロトンを輸送する。ＮＤ５は、おそらく疎水性蛋白質断片の構成成分である。このサブユニットは、複合体Ｉの機能には欠かすことができない。ＮＤ５遺伝子における各種のミスセンス変異（例えば、１２７０６Ｔ＞Ｃ（Ｆ２４Ｌ）、１２７７０Ａ＞Ｇ（Ｅ１４５Ｇ）、１３０４５Ａ＞Ｃ（Ｍ２３７Ｌ）、１３０８４Ａ＞Ｔ（Ｓ２５０Ｃ）、１３５１３Ｇ＞Ａ（Ｄ３９３Ｎ）、１３０４２Ｇ＞Ａ（Ａ２３６Ｔ）、１３７３０Ａ（Ｅ４６５Ｇ））が、レーバー遺伝性視神経萎縮症（ＬＨＯＮ）（非特許文献２４）、リー症候群（非特許文献２５）、或いはミトコンドリア性ミオパチー、脳症、乳酸アシドーシス及び脳卒中様症状を呈する症候群（ＭＥＬＡＳ）（非特許文献２６）の患者において報告されている。従って、１２３５８Ａ＞Ｇによって惹き起こされたＴｈｒ８Ａｌａ置換がＮＤ５サブユニット及び複合体Ｉの機能に影響を及ぼす可能性がある。１２３５８Ａ＞Ｇがミトコンドリアの機能に対して与える影響については、このハプログループを持つｍｔＤＮＡを導入した細胞を用いた実験により調査されるべきである。

１５０Ｃ＞Ｔと１２３５８Ａ＞Ｇの両ＳＮＰｓを持つハプログループＮ９ａを有する女性の代謝的特徴は、内臓肥満、インスリン抵抗性及び脂質代謝に影響を与え、それによってＭＳに対する抵抗性が与えられるものと考えられる。
ハプログループＧ１に特有のｍｔＳＮＰｓのなかでは、１５３２３Ｇ＞Ａ（Ｃｙｔｂ：Ａ１９３Ｔ）または１５４９７Ｇ＞Ａ（Ｃｙｔｂ：Ｇ２５１Ｓ）のいずれかは、機能的多型のようである。
国立長寿医療研究センターの加齢に関する縦断的研究（ＮＩＬＳ−ＬＳＡ）の一部としての我々の以前の調査によれば、１５４９７Ｇ＞Ａ（Ｃｙｔｂ：Ｇ２５１Ｓ）が、日本人集団の中年及び年配者層における肥満と関係していることが明らかとなった（非特許文献２７）。

年齢及び喫煙状態を補正した統計解析によれば、１５４９７Ｇを持つ女性に比較すると、１５４９７Ａを持つ女性では、体重、ＢＭＩ、ウエスト及びヒップ廻りのサイズ、脂肪量、脂肪以外の質量、腹腔内脂肪、及びトリグリセリドが有意に大きい事が分かった。また、血漿インスリン濃度は、１５４９７Ｇを持つ女性に比べると、１５４９７Ａを持つ女性の方が２０％高かった。ところが、絶食時血漿グルコース及びヘモグロビンＡｌｃは、２つの集団の間で有意差は見られなかった。これらの結果は、１５４９７Ａが、高血圧症、高血糖或いは高コレステロール血症（これらはＭＳを構成する因子である）を伴わない単純肥満に関係することを示唆している。こうして、１５４９７Ａを伴うハプログループＧ１がＭＳに対する抵抗性を獲得しているとの本研究の結果は、グルコース及びコレステロール代謝が１５４９７Ａ対立遺伝子を持つ女性では比較的正常であるとの我々の既報と一致するものである。ミトコンドリアの酸化的リン酸化系は、細胞活動のために必要な主要なエネルギー源である。上記の結果は、チトクロームｂｃ１複合体におけるミトコンドリアのエネルギー保存効率の上昇によって、結果としてエネルギー消費の減少を惹き起こしたということかも知れない（非特許文献１１）。別の可能性として、複合体IIIのユビキノン結合部位の一つであるＱ０部位でユビキノンの還元を抑制することが、結果として脂肪酸のベータ酸化を減少させ、脂肪を蓄積させるのかも知れない。アンドリューらは、２５１位のグリシンがアスパラギン酸に置換された場合に、Ｑｐ部位にある２７１位のグルタミン残基との間の電荷反撥を惹き起こすので、Ｍｔ１５４９８Ｇ＞Ａ突然変異に起因するＧ２５１Ｄ置換が病因であると主張している（非特許文献２８）。この置換は、Ｑｐ部位の構造を変え、ヒドロキノン結合を損なう可能性がある。２５１位のグリシンをセリンに置換しても、２７１位のグルタミン酸との間に電荷反発を惹き起こさないと考えられるが、この置換がＱｐ部位に対するユビキノンの親和性に影響を及ぼすことは推測し得る。

我々は、ハプログループＤ５に関しても、同様にｍｔＳＮＰデータベース(http://www.giib.or.jp/mtsnp/search_mtSNP_e.html)を用いて、ミトコンドリアゲノムにおける機能的なｍｔＳＮＰｓを探索した。ハプログループＤ５に属するサブハプログループの間で、サブハプログループＤ５ａ１、Ｄ５ａ２、及びＤ５ｂ２は、日本人集団においては高頻度に観察される。我々の以前の研究によれば、３名の日本人の百寿者（個体番号TCsq0012(女性、１００歳）、個体番号GCsq0022(男性、１０２歳)、個体番号TCsq0030(女性、１００歳））は、各々ハプログループＤ５ａ１、Ｄ５ａ２、及びＤ５ｂ２を持っていた(非特許文献１４、図１Ｂ）。また、我々は、５１７８Ｃ＞Ａ多型（ＮＤ２：Ｌ２３７Ｍ）を特徴とするハプログループＤが長寿に関係していること、及びこの多型が加齢に関連する疾患に対する抵抗性を与えるということを報告している（非特許文献９）。５１７８Ｃ＞Ａに加え、更にハプログループＤ５を持つ者は、ミトコンドリアゲノムの非コード領域に１５０Ｃ＞Ｔ塩基多型を持っている。１５０Ｃ＞Ｔ変異が、日本人百寿者とフィンランドの９０歳以上の高齢者の両者において、各々の対照群に比較してより頻繁に検出されることを我々は最近報告した（非特許文献２３）。今回の研究で明らかとなったように、ハプログループＤ５がＭＳに対して防御的効果を示すという結果は、１５０Ｃ＞Ｔが長寿と関係しているという以前の我々の報告に一致するものである。

ミトコンドリアには組換え機構が存在しないので、各ハプログループ或いはサブハプログループにおけるｍｔＳＮＰｓの全ては、相互に強固にリンクしている。従って、今回の研究において調査されたｍｔＳＮＰｓのあるものが、ＭＳに対する抵抗性を担っている他のミトコンドリア遺伝子の機能的多型と、連鎖不平衡の関係にあるということがあり得る。
女性の場合、ハプログループＮ９ａ、Ｇ１及びＤ５は、ＭＳに対する抵抗性と関連していた。一方、男性の場合には、このような関係は見出されなかった。遺伝的変異が肥満に関係する度合いが、男性に比して女性ではより高いとの考えを支持する他の証拠がある（非特許文献２９、３０）。クマジーらは、性相互作用により遺伝子型を導入し、脂肪重量をメンデル混合モデルにて分析したところ、男性では脂肪重量の分散値全体の３７％を主な遺伝子が担い、一方女性では４３％が担っていた（非特許文献）。しかしながら、我々の知る限りでは、ｍｔＤＮＡ多型とＭＳとの関係における性別の影響に関してほとんど報告がない。以前の関連解析には、核遺伝子多型とＭＳとの関係について調査がされている。

山田らは、アポリポ蛋白Ａ−Ｖ遺伝子プロモーター領域における単一ヌクレオチド多型がＭＳと関係することを示した（投稿中）。これらｍｔＳＮＰｓ及び核ＳＮＰｓの遺伝子タイピングは、ＭＳの遺伝的危険度を予測するのに有益であり、かつＭＳの一次予防に貢献できる。
このように、本実施形態によれば、ｍｔＤＮＡのハプログループを検出することにより、ＭＳの遺伝的危険度を予測することができる。このことにより、ＭＳに対する予防が可能となり、高齢者の健康寿命延長・ＱＯＬ向上・ねたきり防止ならびに今後の医療費削減など、医学的・社会的に大きく貢献できる。

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Ｌｕｍｉｎｅｘ１００で検出するマイクロビーズの微細構造と特徴を示す図である。 ＰＣＲ−ＳＳＯＰ−Ｌｕｍｉｎｅｘ法の手順の概要を示す図である。 ｍｔＳＮＰに基づくハプログループ分類を示す図（１）である。図の下端には、ハプログループ及びサブハプログループを示している（図４及び図４においても同じである）。 ｍｔＳＮＰに基づくハプログループ分類を示す図（２）である。 ｍｔＳＮＰに基づくハプログループ分類を示す図（３）である。

Claims (2)

1. 日本人女性被験者のヒトミトコンドリアＤＮＡにおいて、５２３１Ａ、１２３５８Ｇ、１２３７２Ａを有するハプログループＮ９ａと、７０９Ａ、４８３３Ｇ、５１０８Ｃ、８２００Ｃ、１５４９７Ａを有するハプログループＧ１と、４８８３Ｔ、５１７８Ａ、１０３９７Ｇを有するハプログループＤ５と、１５３４６Ａを有するサブハプログループＢ４ｃと、１３８７９Ｃを有するサブハプログループＢ４ｃ１ｂ１と、１５３１４Ａを有するサブハプログループＤ４ａと、９２９６Ｔを有するサブハプログループＤ４ｂ２ｂと、８３８３Ｃを有するサブハプログループＤ４ｄ２と、１２４０６Ａを有するサブハプログループＦ１と、１５８６０Ｇを有するサブハプログループＧ１ａと、３７５９Ｇを有するサブハプログループＧ５ｂ１ｂと、１５０６７Ｃを有するサブハプログループＮ９ａ２ａ１または５１４７Ａを有するサブハプログループＮ９ｂ１であるかを調べ、前記ハプログループＮ９ａ、ハプログループＧ１又はハプログループＤ５を有する場合に、該日本人女性被験者がメタボリック症候群に抵抗性を備えることを評価するための判断材料の一つとすることを特徴とするメタボリック症候群に関する遺伝子検出法。
2. 前記ハプログループの検出方法が、ＰＣＲ−ＳＳＯＰ−Ｌｕｍｉｎｅｘ法であり、この方法の実施に用いるためのオリゴヌクレオチドのうち、
   （１）ハプログループＮ９ａの５２３１Ａの検出については、ＰＣＲ用プライマーの塩基配列が、配列番号１７：cagctacgca aaatcttagc atacと配列番号１８：ttgggcaaaa agccggttag cgであり、多型チェック用のプローブの塩基配列が、配列番号９０：tccctaggag gcctacccccであり、
   １２３５８Ｇの検出については、ＰＣＲ用プライマーの塩基配列が、配列番号３９：aggataacag ctatccattg gtctと、配列番号４０：gtggctcagt gtcagttcga gatであり、多型チェック用のプローブの塩基配列が、配列番号２２１：gcacactact atagccaccc tであり、
   １２３７２Ａの検出については、ＰＣＲ用プライマーの塩基配列が、配列番号３９：aggataacag ctatccattg gtctと、配列番号４０：gtggctcagt gtcagttcga gatであり、多型チェック用のプローブの塩基配列が、配列番号２２２：agccacccta accctaactt ccであり、
   （２）ハプログループＧ１の７０９Ａの検出については、ＰＣＲ用プライマーの塩基配列が、配列番号１：acatcacccc ataaacaaat aggttと、配列番号２：gcttctattg acttgggtta atcgであり、多型チェック用のプローブの塩基配列が、配列番号１５８：gaactcactg gaatggggatであり、
   ４８３３Ｇの検出については、ＰＣＲ用プライマーの塩基配列が、配列番号１５：tccacagaag ctgccatcaa gtaと、配列番号１６：gagagtgagg agaaggctta cgtであり、多型チェック用のプローブの塩基配列が、配列番号８３：aggttaccca aggcgcccctであり、
   ５１０８Ｃの検出については、ＰＣＲ用プライマーの塩基配列が、配列番号１７：cagctacgca aaatcttagc atacと、配列番号１８：ttgggcaaaa agccggttag cgであり、多型チェック用のプローブの塩基配列が、配列番号８６：ttatcctaac taccaccgcaであり、
   ８２００Ｃの検出については、ＰＣＲ用プライマーの塩基配列が、配列番号２５：ggggtatact acggtcaatg ctcと、配列番号２６：tcattttggt tctcagggtt tgttatであり、多型チェック用のプローブの塩基配列が、配列番号１９３：acgatgggca tgaagctgtgであり、
   １５４９７Ａの検出については、ＰＣＲ用プライマーの塩基配列が、配列番号５１：gacagtccca ccctcacacg atと、配列番号５２：gggacggatc ggagaattgt gtであり、多型チェック用のプローブの塩基配列が、配列番号１４７：ccagacctcc taagcgacであり、
   （３）ハプログループＤ５の４８８３Ｔの検出については、ＰＣＲ用プライマーの塩基配列が、配列番号１５：tccacagaag ctgccatcaa gtaと、配列番号１６：gagagtgagg agaaggctta cgtであり、多型チェック用のプローブの塩基配列が、配列番号１８１：aactagcccc tatctcaatであり、
   ５１７８Ａの検出については、ＰＣＲ用プライマーの塩基配列が、配列番号１７：cagctacgca aaatcttagc atacと、配列番号１８：ttgggcaaaa agccggttag cgであり、多型チェック用のプローブの塩基配列が、配列番号８８：tgaaacaaga taacatgacであり、
   １０３９７Ｇの検出については、ＰＣＲ用プライマーの塩基配列が、配列番号３３：acccctacca tgagccctac aaと、配列番号３４：gtgagatggt aaatgctagt ataatatであり、多型チェック用のプローブの塩基配列が、配列番号１１６：taccaattca gcccagtcta atであることを特徴とする請求項１に記載の遺伝子検出方法。