JP5331780B2 - 電子顕微鏡，電子顕微鏡用画像再構成システム、および電子顕微鏡用画像再構成方法 - Google Patents

Description

本発明は、電子顕微鏡により取得された二次元画像から三次元構造を再構成するシステムおよび方法に関する。

電子顕微鏡において、取得された二次元画像から三次元構造を再構成することによって観察対象となる構造をより直感的に観察し、さらに、再構成した画像から、任意の箇所を抽出し定量化するニーズが高まっている。このような観察を行うために、一般的には、観察対象を連続的に傾斜させて取得された各連続傾斜二次元画像を取得時の傾斜角度から逆投影させて、三次元画像を再構成する逆投影手法（非特許文献１のpp２２８−２３１参照）や、上記連続傾斜二次元画像を各投影方向における真値画像とし、未知なる三次元画像を各方向に投影した結果と該真値の誤差が最小となるよう代数的に再構成する手法（非特許文献１のpp２３１−２３４参照）が用いられている。

また、上記手法の問題点である情報欠落領域を低減する手法として、試料を異なる試料傾斜軸で傾斜し、撮影した傾斜画像を用いた複数の三次元再構成画像を重ね合わせる手法（非特許文献１のpp２２５−２２８，pp２６４参照）や、画像が点の集合体と考え、上記連続傾斜二次元画像を基に三次元画像の点配置を最適化するDots concentration reconstraction法（非特許文献２参照）や、基準となる再構成画像を代数的再構成法にて作成し、該再構成画像をある閾値で領域分けした後、該領域の情報を用いて再度代数的再構成を行うDiscrete algebraic reconstruction technique（ＤＡＲＴ）（非特許文献３参照）などが用いられている。

Jose-Maria Carazo et al., Algorithms for 3D reconstruction, Joachim Frank, ELECTRON TOMOGRAPHY 2(2005) Springer, New York, pp180-183, pp225-234, pp264. N.Baba, et al.,Anovel Method of Reconstructing a Tomogram by Convergence of an Innumerable Dots Map Without the "Missing-Wedge"Effect, Frontiers of Electron Microscopy in Materials, S-15, Session-1, 2October, 2009. K.J.Batenburg, et al., 3D imaging of nanomaterials by disctrete tomography, Ultramicroscopy 109(2009), pp730-740.

上記非特許文献１に記載の三次元再構成手法は、情報欠落領域を低減することができ、再構成画像の偽像や像の欠落を低減することができる。上記再構成手法は試料を異なる試料傾斜軸で傾斜し、撮影した傾斜画像を用いた複数の三次元再構成画像を重ね合わせることで、情報欠落領域によって発生する偽像や像の欠落が低減された三次元再構成画像を作成する手法である。このため、上記再構成手法を行うためには、異なる試料傾斜軸で傾斜し、撮影した傾斜画像を用いた複数の三次元再構成画像が必要となる。また、複数の三次元再構成画像を重ね合わせる際、相互の位置ずれ補正が必要となる。

従来は、異なる試料傾斜軸で傾斜し、撮影した傾斜画像を得るために、ピンセットなどを用いて直接試料を回転させるか、試料保持部が回転するホルダーを用い、遠隔操作にて試料を手動で回転させていた。このため、上記再構成手法に用いる各傾斜画像の取り込みが自動化されておらず、該画像の撮影がユーザーの大きな負担となっていた。

複数の三次元再構成画像を重ね合わせる際の位置ずれ補正に関しては、試料に金粒子などの標識を塗布し、これら標識の座標を一致させる手法が行われている。

図１５は、標識を塗布した試料の再構成画像の模式図を示す画面図である。上記手法はコントラストの強い標識を用いるため、図には、三次元再構成画像４０に標識４２から発生した多くのアーティファクト４３が現れ、観察対象物４１の構造を消してしまう。また、観察対象物に標識を塗布するため、該標識によって観察対象物を汚染してしまう可能性がある。更に、試料によっては、標識が局在してしまい、該標識を位置合わせに用いることができないものもある。

以上の様に、上記非特許文献１に記載の三次元再構成法は、アルゴリズムは確立していたものの、標識による位置合わせアルゴリズムを用いることによって、試料に制限がかかること、三次元再構成を行った際、標識によって発生するアーティファクトのコントラストが強く、観察対象の構造が消えてしまう、などの問題があり、実際に使用されることは少なかった。また、実際に使用する場合であっても、自動化がなされていないため、ユーザーに多くの負担がかかっていた。

本発明の目的は、試料を異なる試料傾斜軸で傾斜し、撮影した傾斜画像を得る工程を自動化し、更に標識を用いない位置合わせアルゴリズムを搭載することで、ユーザーの負担を軽減し、更に、標識を用いることによって生じていた、強いコントラストのアーティファクトや試料の汚染、適用試料の制約を排除した多軸再構成手法を実現可能とするシステムを提供することである。

上記課題は、試料を異なる試料傾斜軸で傾斜させて撮影した複数の傾斜画像を得、回転刻み角度毎に位置ずれ補正を行い、回転された観察対象物を異なる角度ステップで傾斜して撮像し、それぞれの傾斜画像群からそれぞれ作成した２つの再構成画像の位置ずれを補正した２つの再構成画像を作成し、該２つの再構成画像を重ね合わせてひとつの再構成画像を作成する。

詳しくは、観察対象物を異なる角度ステップで傾斜し、撮像装置によって得られた第一の傾斜画像群を格納する第一の格納手段，該観察対象物を回転刻み角度毎に位置ずれ補正を行い、指定した回転角度まで回転する回転手段，該回転手段によって回転された観察対象物を異なる角度ステップで傾斜し、撮像装置によって得られた第二の傾斜画像群を格納する第二の格納手段，上記第一と第二の傾斜画像群からそれぞれ作成した第一，第二の再構成画像の位置ずれを補正した第三，第四の再構成画像を作成する演算手段を有し、上記第三と第四の再構成画像を重ね合わせて第五の再構成画像を作成することで解決することができる。

本発明によれば、多軸再構成手法を行うために必要な複数の傾斜画像取得時にユーザーにかかっていた負担を大幅に低減できる。更に、標識を用いることによって画像に生じていた、強いコントラストのアーティファクトや試料の汚染，適用試料の制約を排除することができる。

電子顕微鏡を含むシステムの構成図である。 座標の定義を示す斜視図である。 出力装置に表示される本システムのＧＵＩの画面図である。 出力装置に表示される多軸再構成のＧＵＩの画面図である。 実施例１における三次元再構成画像ＤＡＴＩ（Ｘ，Ｙ，Ｚ）を作成する手順を示すフロー図である。 試料回転処理の手順を示すフロー図である。 試料ホルダー３２の試料を保持する部分の拡大図である。 三次元画像の位置ずれ補正処理の手順を示すフロー図である。 再構成結果の画像を示す画面図である。 実施例２における三次元再構成画像ＤＡＴＩ（Ｘ，Ｙ，Ｚ）を作成する手順を示すフロー図である。 位置ずれ補正処理の手順を示すフロー図である。 位置ずれ補正処理の手順を示すフロー図である。 特徴抽出画像ＣｈＲＩ１（Ｘ，Ｙ，Ｚ）及び位置ずれ補正画像ＦＳＲＩ２（Ｘ，Ｙ，Ｚ）を四つの領域に分割する概念を示す斜視図である。 領域ＣｈＲＩ１_１（Ｘ，Ｙ，Ｚ）内で特徴量が最大となるテンプレート領域ＣｈＲＩ１_１（Ｘ，Ｙ）を探索する方法を説明する斜視図である。 標識を塗布した試料の再構成画像の模式図を示す画面図である。

以下、図面を用いて本発明の実施例を説明する。

本発明の電子顕微鏡の構成、及び画像処理方法について説明する。上述した非特許文献１のpp２２５−２２８およびpp２６４に記載された再構成手法は、同一試料を異なる軸で傾斜させて取得した二つ以上の連続傾斜画像を用い、一つの再構成画像を作成することで、情報欠落領域によって発生する再構成画像の偽像や像の欠落の低減を図るものである。

本発明は、上記再構成手法に必要な各連続傾斜画像の撮影を自動化し、更に標識を用いない位置ずれ補正アルゴリズムを搭載することで、ユーザーの負担を低減し、適用する試料に制約を与えずに上記非特許文献１に記載された再構成手法を実現可能とするシステムの提供を図るものである。以下の実施例は、同一試料を異なる軸で傾斜させて取得した二つの連続傾斜画像を用い、一つの再構成画像を作成する例を記すが、二つ以上の傾斜軸を用いた場合は本例を複数回行ったものであり、原理は同一である。尚、本実施例は権利の範囲を限定するものではない。

図１は、本発明における電子顕微鏡を含むシステムの構成図である。本発明に係わる電子顕微鏡は、電子線を試料１に照射するための照射レンズ系２と、試料に焦点を合わせるための対物レンズ系３，試料を透過した電子線像を拡大する拡大レンズ系４，拡大した像を検出する第一の画像検出部５と、蛍光板６上に写しだされた像を検出する第二の画像検出部７，種々の演算制御処理を行うコンピュータ８とコンピュータ内部の演算装置９と、データを記憶する記憶装置１０と、コンピュータとマイクロプロセッサとの通信を行うコミュニケーションインターフェイス１１ａおよび１１ｂと、バス１２を介して制御信号を送るマイクロプロセッサ１３と、マイクロプロセッサ１３より出力された信号をデジタル信号からアナログ信号へ変換するＤＡＣ１４と、ＤＡＣ１４より出力された信号を増幅し、試料傾斜装置１６，試料回転装置１７及び試料移動装置１８へ出力する電源１５と、パラメータの入力を行うための入力装置１９と、画像を出力するための出力装置２０とを備えている。

図２は、本発明における座標の定義を示す斜視図である。電子線７０の照射方向をＺとし、第一の画像検出部５及び第二の画像検出部７を用いた撮影画像７１はＸＹ平面画像とする。また、各軸での回転角度は、Ｘ軸での回転角度をα、Ｙ軸での回転角度をβ、Ｚ軸での回転角度をγとする。図３は出力装置２０に表示される本システムのＧＵＩの画面図である。ＧＵＩのメインウィンドウ８０には、目標回転角度入力部８１，回転刻み角度入力部８２，設定傾斜角度入力部８４，傾斜刻み角度入力部８５、計４つの数値入力部と、現在の回転角度表示部８３及び現在の傾斜角度表示部８６、計２つの数値表示部がある。また、取得画像が表示される撮影画像表示部８７がある。処理の実行は、上記４つの数値入力部に任意のパラメータを入力した後、画像取り込み実行ボタン８８を押すことで行うことができる。

以上のＧＵＩに加え、本システムは次図に示すＧＵＩを有している。図４は出力装置２０に表示される多軸再構成のＧＵＩの画面図である。多軸再構成ＧＵＩのウィンドウ９０には、演算範囲Ｘ入力部９１，演算範囲Ｙ入力部９２，演算範囲Ｚ入力部９３，コモンライン探索角度入力部９４，テンプレート範囲入力部９５、計５つの入力部と、２つの画像表示部である再構成画像（１）表示部９６，再構成画像（２）表示部９７がある。本ＧＵＩで入力する５つの値は、後述する三次元画像の位置合わせ演算の中で使用される。尚、該位置合わせ演算に用いる上記値はデフォルト値が定められており、デフォルト値で演算を行う場合は、本ＧＵＩを表示しなくても良い。

図５は本発明の実施例１の三次元再構成画像ＤＡＴＩ（Ｘ，Ｙ，Ｚ）を作成する手順を示すフロー図である。ステップ５０１では入力装置１９で設定した傾斜角度範囲α、傾斜刻み角度Δαがコミニュケーションインターフェイス１１ａ，ｂからバス１２を介してマイクロプロセッサ１３に送られる。その後、マイクロプロセッサ１３からバス１２を介してＤＡＣ１４に入力され、電源１５で増幅された後、試料傾斜装置１６へと出力される。その後、試料１は試料傾斜装置１６にて連続的に上記傾斜角度範囲α内を上記傾斜刻み角度Δαで傾斜され、各々の傾斜角度で第一の画像検出部５により像を検出する。第一の画像検出部５により検出した各傾斜角度の画像は連続傾斜画像ＴＩ１（Ｘ，Ｙ）−１からＴＩ１（Ｘ，Ｙ）−Ｎの画像としてコンピュータ内部の記憶装置１０へ格納する。

ステップ５０２では入力装置１９で設定した回転角度γ、回転刻み角度Δγがコミニュケーションインターフェイス１１ａ，ｂからバス１２を介してマイクロプロセッサ１３に送られる。その後、マイクロプロセッサ１３からバス１２を介してＤＡＣ１４に入力され、電源１５で増幅された後、試料回転装置１７へと出力される。試料１は上記回転刻み角度Δγ毎に試料移動装置１８にて位置ずれ補正を行い、上記回転角度γまで回転される。

ステップ５０３は、上記ステップ５０１と同様に連続傾斜画像ＴＩ２（Ｘ，Ｙ）−１からＴＩ２（Ｘ，Ｙ）−Ｎの画像をコンピュータ内部の記憶装置１０へ格納する。

ステップ５０４とステップ５０５では、上記ステップ５０１と５０３で撮影した傾斜画像をそれぞれ用い、演算装置９にて三次元再構成を行い、三次元再構成画像ＲＩ１（Ｘ，Ｙ，Ｚ）とＲＩ２（Ｘ，Ｙ，Ｚ）を作成し、記憶装置１０へ格納する。

ステップ５０６は、上記三次元再構成画像ＲＩ１（Ｘ，Ｙ，Ｚ）とＲＩ２（Ｘ，Ｙ，Ｚ）の三次元的な位置ずれ量ΔＸ，ΔＹ，ΔＺ，Δα，Δβ，Δγを演算装置９にて算出する。その後、該三次元的な位置ずれを補正した三次元再構成画像ＣＲＩ１（Ｘ，Ｙ，Ｚ），ＣＲｅｓｕｌｔ（Ｘ，Ｙ，Ｚ）を作成し、記憶装置１０へ格納する。

最後にステップ５０７にて、上記三次元再構成画像ＣＲＩ１（Ｘ，Ｙ，Ｚ）と上記三次元再構成画像ＣＲｅｓｕｌｔ（Ｘ，Ｙ，Ｚ）を重ね合わすことにより、情報欠落領域によって発生する偽像や像の欠落が低減された三次元再構成画像ＤＡＴＩ（Ｘ，Ｙ，Ｚ）を作成することができる。

図５に於けるステップ５０２の試料回転処理の概略を以下に記す。はじめに、上記回転処理実行時の前提条件を示す。本処理は予め試料１が挿入されておらず、電子線の径が蛍光板６の直径以上となっている状態で、第二の画像検出部７にて画像を一枚撮影し、該画像から、蛍光板６に内接する四角形を導出し、該四角形をテンプレート範囲Ｔとして記憶してあるものとする。また、変数として、カウンタｉが定義されており、初期値に０が入力されているものとする。

図６は上記試料回転処理の手順を示すフロー図である。ステップ６０１は、試料傾斜装置１６にて試料の傾斜角度αを０度に設定する。ステップ６０２では、第一の画像検出部５を用いて、基準画像Ａ_ｂａｓｅ（Ｘ，Ｙ）を撮影し、記憶装置１０へ格納する。続いて、ステップ６０３では、演算装置９にて、電子線照射方向Ｚを回転軸として上記画像Ａ_ｂａｓｅ（Ｘ，Ｙ）をγ度回転させた回転画像Ａ_ｒｏｔ（Ｘ，Ｙ）を作成する。

ステップ６０４では、蛍光板６上の像を撮影する広域画像検出部７にて基準画像Ｂ_ｂａｓｅ（Ｘ，Ｙ）を撮影し、記憶装置１０へ格納する。ステップ６０５では、該画像Ｂ_ｂａｓｅ（Ｘ，Ｙ）を上記回転軸Ｚでγ′（＝回転刻み角度Δγ度×（カウンタｉ＋１））度回転させ、回転画像Ｂ_ｒｏｔ（Ｘ，Ｙ）を作成する。その後、ステップ６０６にて、該画像Ｂ_ｒｏｔ（Ｘ，Ｙ）を上記テンプレート範囲Ｔで切り出し、参照画像Ｂ_ｒｅｆｅｒ（Ｘ，Ｙ）として記憶装置１０へ格納する。

図７は、試料ホルダー３２の試料を保持する部分の拡大図である。図６のステップ６０７にて、図７に示すような、ワイヤー３０を介して試料メッシュ固定部３１を回転させる試料回転装置１７を有する試料ホルダー３２を用いて試料を回転刻み角度Δγ度回転させた後、ステップ６０８にて、広域画像検出部７を用いて画像Ｂ_Ｉ（Ｘ，Ｙ）を撮影する。

ステップ６０９では、上記参照画像Ｂ_ｒｅｆｅｒ（Ｘ，Ｙ）と同様に該画像Ｂ_Ｉ（Ｘ，Ｙ）をテンプレート範囲Ｔで切り出し、テンプレート画像Ｂ_Ｉ_ｔｅｍｐ（Ｘ，Ｙ）を作成する。その後、ステップ６１０にて、上記参照画像Ｂ_ｒｅｆｅｒ（Ｘ，Ｙ）と該テンプレート画像Ｂ_Ｉ_ｔｅｍｐ（Ｘ，Ｙ）を用い、演算装置９にて、上記参照画像Ｂ_ｒｅｆｅｒ（Ｘ，Ｙ）に対する該テンプレート画像Ｂ_Ｉ_ｔｅｍｐ（Ｘ，Ｙ）の位置ずれ量ΔＸ及びΔＹを導出する。ステップ６１１では、該位置ずれ量ΔＸ及びΔＹを試料移動装置１８の移動量に換算し、試料移動装置１８にて、試料１の位置ずれを補正する。

ステップ６１２及び６１３では、演算装置９にてカウンタｉをカウントアップし、試料回転終了（ｉ＝α／Δα）の判定を行う。該判定結果が“Ｎｏ”であった場合は、ステップ６０５の処理に移行し、“Ｙｅｓ”であった場合は、ステップ６１４の処理に移行する。該判定にてステップ６１４に移行した場合、ステップ６１５にて、第一の画像検出部５にて画像Ａ_γ（Ｘ，Ｙ）を撮影し、記憶装置１０に格納する。次に、上記回転画像Ａ_ｒｏｔ（Ｘ，Ｙ）と該画像Ａ_γ（Ｘ，Ｙ）を用い、演算装置９にて、上記回転画像Ａ_ｒｏｔ（Ｘ，Ｙ）に対する該画像Ａ_γ（Ｘ，Ｙ）の位置ずれ量ΔＸ及びΔＹを導出する。

最後にステップ６１６にて、該位置ずれ量ΔＸ及びΔＹを試料移動装置１８の移動量に換算し、試料移動装置１８を用いて試料１の位置ずれを補正する。以上の工程により、自動で試料１を任意の回転角度α度回転することができる。図５に於けるステップ５０４及び５０５は公知の技術であるため、説明を省く。

続いて、上記ステップ５０６における演算装置９にて行われる処理の詳細説明を記す。本処理は入力された二つの三次元再構成画像の平行移動位置ずれ量ΔＸ，ΔＹ，ΔＺ及び、回転移動位置ずれ量Δα，Δβ，Δγを算出し、上記位置ずれを補正するものである。尚、本処理で用いるパラメータはデフォルト値の他に上記図４にて入力した演算範囲Ｘ９１，演算範囲Ｙ９２，演算範囲Ｚ９３及びコモンライン探索角度９４の値を用いることもできる。

図８は、位置ずれ補正処理の手順を示すフロー図である。ステップ８０１，８０２にて、二つの三次元再構成画像ＲＩ１（Ｘ，Ｙ，Ｚ）とＲＩ２（Ｘ，Ｙ，Ｚ）を入力する。続いて、ステップ８０３で、ＲＩ１（Ｘ，Ｙ，Ｚ）とＲＩ２（Ｘ，Ｙ，Ｚ）の平行移動位置ずれを補正するため、それぞれの画像中心部にて三次元相互相関を行い、ＲＩ１（Ｘ，Ｙ，Ｚ）に対するＲＩ２（Ｘ，Ｙ，Ｚ）の各平行移動量ΔＸ，ΔＹ，ΔＺを算出し、ステップ８０４にてＲＩ２（Ｘ，Ｙ，Ｚ）の各平行移動位置ずれを補正したＳＲＩ２（Ｘ，Ｙ，Ｚ）を作成する。

ステップ８０５では、上記演算範囲Ｘ，Ｙ，Ｚ内にて、上記三次元再構成画像ＲＩ１（Ｘ，Ｙ，Ｚ）と該平行移動位置ずれを補正した三次元再構成画像ＳＲＩ２（Ｘ，Ｙ，Ｚ）の全ピクセルの濃度値をＺ方向へ加算し、それぞれの加算画像ＡＲＩ１（Ｘ，Ｙ）とＡＲＩ２（Ｘ，Ｙ）を作成する。

ステップ８０６では、該加算画像ＡＲＩ１（Ｘ，Ｙ）とＡＲＩ２（Ｘ，Ｙ）を用い、これら画像のコモンライン（上記文献１（pp１８０−１８３）記載）を導出する。その後、各加算画像における該コモンラインを一致させるための回転角度ΔＡ１，ΔＡ２を上記コモンライン探索角度の精度で探索する。

ステップ８０７にて上記三次元再構成画像ＲＩ（Ｘ，Ｙ，Ｚ）をＺ軸でΔＡ１回転させ、Ｚ軸を回転軸とした回転移動ずれΔγを補正した三次元画像ＣＲＩ１（Ｘ，Ｙ，Ｚ）を作成する。ステップ８０８も上記ステップ８０７と同様にＳＲＩ２（Ｘ，Ｙ，Ｚ）をＺ軸でΔＡ２回転させ、Ｚ軸を回転軸とした回転移動ずれΔγを補正した三次元画像ＣＲＩ２（Ｘ，Ｙ，Ｚ）を作成する。

ステップ８０９では、ＣＲＩ１（Ｘ，Ｙ，Ｚ）における上記コモンラインと垂直な平面から任意の平面ＣＲＩ１（ｉ，ｊ）を抽出し、ステップ８１０は、上記ＣＲＩ２（Ｘ，Ｙ，Ｚ）から、該平面ＣＲＩ１（ｉ，ｊ）と同座標の平面ＣＲＩ２（ｉ，ｊ）を抽出する。該二つの平面、ＣＲＩ１（ｉ，ｊ）とＣＲＩ２（ｉ，ｊ）はコモンラインを回転軸とし、回転移動ずれを起こしたものであるため、該回転移動ずれ量を算出し、補正することで、Ｘ軸及びＹ軸を回転軸とした回転移動ずれΔα，Δβを補正することができる。尚、本例では、ステップ８１１及びステップ８１２のように上記二つの平面を極座標変換してＺＣＲＩ１（ｉ，ｊ）とＺＣＲＩ２（ｉ，ｊ）を作成し、該二つの画像の二次元相互相関結果からＺＣＲＩ１（ｉ，ｊ）に対するＺＣＲＩ２（ｉ，ｊ）の回転移動量Δｃを導出している。

最後にステップ８１３にて、上記Ｚ軸を回転軸とした回転移動ずれΔγを補正した三次元画像ＣＲＩ２（Ｘ，Ｙ，Ｚ）の上記コモンラインを回転軸とし、上記回転移動ずれΔｃを補正することで、Ｘ軸及びＹ軸を回転軸とした回転移動ずれΔα，Δβを補正したＣＲｅｓｕｌｔ（Ｘ，Ｙ，Ｚ）を作成することができる。

以上の工程にて、ＲＩ１（Ｘ，Ｙ，Ｚ）とＲＩ２（Ｘ，Ｙ，Ｚ）の三次元的な位置ずれ量ΔＸ，ΔＹ，ΔＺ，Δα，Δβ，Δγの補正が終了する。ステップ８１４，８１５では、それぞれの補正結果画像ＣＲＩ１（Ｘ，Ｙ，Ｚ），ＣＲｅｓｕｌｔ（Ｘ，Ｙ，Ｚ）を出力する。以上の処理にて、三次元的な位置ずれ量を補正することが可能である。

図９は、標識無塗布試料を用いた本発明の再構成結果の画像と、位置ずれを起こした多軸再構成結果の画像を示す画面図である。図９（ａ）は、標識が塗布されていない試料を用いて作成した従来法による再構成画像ＣＲＩ１（Ｘ，Ｙ，Ｚ）の中間スライス画像（Ｘ，Ｙ）である。図９（ｂ）は、本発明の再構成結果、図９（ｃ）は、位置ずれを起こした多軸再構成結果の中間スライス画像（Ｘ，Ｙ）である。以上３つの画像上部にはそれぞれ矢印で示した部分の拡大図を示している。

図９（ａ）と図９（ｂ）とを比較すると、本発明の再構成結果は従来法の結果に比べ、構造が補間されていることが分かる。上記拡大図は、線毛のＡ細管，Ｂ細管とダイニン腕突起部を拡大したものである。上記２つの細管は、円状になっている。また、ダイニン腕突起は鉤爪状の形状をしている（［監訳］内山安男，組織細胞生物学（２００６），南江堂，pp２６参照）。図９（ａ）に示す従来法の結果画像では、各細管とダイニン腕突起の構造が分離してしまっている。これに対し、本発明の結果画像は上記構造が繋がっており、構造が補間されていることが分かる。

また、図９（ｂ）と図９（ｃ）の比較で、本発明の位置合わせ精度が十分であることが分かる。図９（ｃ）は、２つの画像の位置ずれ量がＸ及びＹ方向に２ｐｉＸｅｌ有る画像同士を重ね合わせたものである。位置がずれた２つの画像を重ね合わせると、図９（ｃ）に示すように、構造にボケやブレが見られ、本来の構造とは異なったものとなってしまう。これに対し、本発明の結果画像は図９（ａ）の従来法の画像と比較しても構造のボケやブレが見られない。つまり、本発明の位置合わせ方法は標識が塗布されていない試料に対しても三次元的な位置ずれ補正が可能であることが分かる。また、上記試料は標識を塗布していないため、標識のアーティファクトから発生する強いコントラストによって試料の構造が消される現象は発生しないことが分かる。

上記実施例には電子顕微鏡を用いた電子線コンピュータトモグラフィを例として記載したが、本発明はエックス線コンピュータトモグラフィにも適用可能である。上記実施例には連続傾斜画像を用いた場合を例として記載したが、本発明は不連続な傾斜画像に対しても適用可能である。

尚、本発明は、半導体デバイスの三次元形状の可視化，計測や、触媒粒子の粒径計測，分布状態の観察やナノ材料の正確な三次元材料解析を可能とし、材料解析分野での幅広い適用が期待できる。また、細胞や高分子材料においても、細胞内器官の形態の可視化，成分混合状態の観察などの適用が期待できる。

上述した非特許文献１のpp２２５−２２８、およびpp２６４に記載された再構成手法は、同一試料を異なる軸で傾斜させて取得した二つ以上の連続傾斜画像を用い、一つの再構成画像を作成することで、情報欠落領域によって発生する再構成画像の偽像や像の欠落の低減を図るものである。

これに対して本実施例は、上記再構成手法に必要な各連続傾斜画像の撮影を自動化し、更に標識を用いない位置ずれ補正アルゴリズムを搭載することで、ユーザーの負担を低減し、適用する試料に制約を与えずに上述した非特許文献１のpp２２５−２２８、およびpp２６４に記載された再構成手法を実現可能とするシステムの提供を図るものである。以下の実施例は同一試料を異なる軸で傾斜させて取得した二つの連続傾斜画像を用い、一つの再構成画像を作成する例を記すが、二つ以上の傾斜軸を用いた場合は本例を複数回行ったものであり、原理は同一である。尚、本実施例は権利の範囲を限定するものではない。

以下、本発明の電子顕微鏡及び画像処理方法の実施の形態について説明する。尚、本実施例の装置構成は上記実施例１と共通であるため、割愛する。図１０は、三次元再構成画像ＤＡＴＩ（Ｘ，Ｙ，Ｚ）を作成する手順を示すフロー図である。

ステップ１００１〜１００６及びステップ１００８に関しては上記実施例１と共通項目である。以下、ステップ１００７の詳細説明を記す。

図１１及び図１２は、ステップ１００７で行われる三次元画像の位置ずれ補正処理の手順を示すフロー図である。本処理は、ステップ１００６で位置ずれ補正を行った二つの三次元再構成画像に対し、該位置ずれ補正アルゴリズムとは異なったアルゴリズムを用いて更に位置ずれ補正を行うものである。尚、本位置ずれ補正処理では、平行移動位置ずれ量ΔＸ，ΔＹ，ΔＺ及び、回転移動位置ずれ量Δα，Δβを補正する。

初めに、ステップ１１０１及びステップ１１０２にて、ステップ１００６の位置ずれ補正結果画像ＣＲＩ１（Ｘ，Ｙ，Ｚ），ＣＲｅｓｕｌｔ（Ｘ，Ｙ，Ｚ）をそれぞれ入力する。ステップ１１０３にて、ＣＲＩ１（Ｘ，Ｙ，Ｚ）とＣＲｅｓｕｌｔ（Ｘ，Ｙ，Ｚ）の平行移動位置ずれを補正するため、それぞれの画像中心部にて三次元相互相関を行い、ＣＲＩ１（Ｘ，Ｙ，Ｚ）に対するＣＲｅｓｕｌｔ（Ｘ，Ｙ，Ｚ）の各平行移動量ΔＸ，ΔＹ，ΔＺを算出し、ステップ１１０４にてＣＲｅｓｕｌｔ（Ｘ，Ｙ，Ｚ）の各平行移動位置ずれを補正したＦＳＲＩ２（Ｘ，Ｙ，Ｚ）を作成する。ステップ１１０５では、ＣＲＩ１（Ｘ，Ｙ，Ｚ）の特徴量を抽出した特徴抽出画像ＣｈＲＩ１（Ｘ，Ｙ，Ｚ）を作成する。

図１３は、特徴抽出画像ＣｈＲＩ１（Ｘ，Ｙ，Ｚ）及び位置ずれ補正画像ＦＳＲＩ２（Ｘ，Ｙ，Ｚ）を四つの領域に分割する概念を示す斜視図である。上記領域の範囲はデフォルト値の他に上記図４にて入力したテンプレート範囲９５の値を用いることもできる。以下、Ｘ軸を回転軸とした回転移動ずれΔαを分割した領域（１）及び領域（２）から算出し、Ｙ軸を回転軸とした回転移動ずれΔβを分割した領域（３）及び領域（４）から算出する。

ステップ１１０６では、該特徴抽出画像ＣｈＲＩ１（Ｘ，Ｙ，Ｚ）を上記図１３に示すように四つの領域に分割し、それぞれ領域（１）ＣｈＲＩ１_１（Ｘ，Ｙ，Ｚ）５１，領域（２）ＣｈＲＩ１_２（Ｘ，Ｙ，Ｚ）５２，領域（３）ＣｈＲＩ１_３（Ｘ，Ｙ，Ｚ）５３，領域（４）ＣｈＲＩ１_４（Ｘ，Ｙ，Ｚ）５４を作成する。

ステップ１１０７では、平行移動位置ずれ補正画像ＦＳＲＩ２（Ｘ，Ｙ，Ｚ）を上記ステップ１１０６と同様に四つに分割し、領域（１）ＦＳＲＩ２_１（Ｘ，Ｙ，Ｚ）５１，領域（２）ＦＳＲＩ２_２（Ｘ，Ｙ，Ｚ）５２，領域（３）ＦＳＲＩ２_３（Ｘ，Ｙ，Ｚ）５３，領域（４）ＦＳＲＩ２_４（Ｘ，Ｙ，Ｚ）５４を作成する。

図１４は、領域（１）ＣｈＲＩ１_１（Ｘ，Ｙ，Ｚ）内で特徴量が最大となるテンプレート領域ＣｈＲＩ１_１（Ｘ，Ｙ）を探索する方法を説明する斜視図である。該方法にて探索された特徴量が最大となるテンプレート領域ＣｈＲＩ１_１（Ｘ，Ｙ），ＣｈＲＩ１_２（Ｘ，Ｙ），ＣｈＲＩ１_３（Ｘ，Ｙ），ＣｈＲＩ１_４（Ｘ，Ｙ）をテンプレートとし、テンプレートマッチングを行い、各回転位置ずれ量を算出する。

ステップ１１０８では、上記ステップ１１０６で分割した各領域に於いて、上記図１４に示す様に、テンプレート領域を１ピクセルずつシフトし、テンプレート領域内の濃度値の積算値Ａ１_i，Ａ２_i，Ａ３_i，Ａ４_iを算出し、それぞれを格納する。

ステップ１１０９では、上記各領域での積算値Ａ１_i，Ａ２_i，Ａ３_i，Ａ４_iが最大となるテンプレート領域ＣｈＲＩ１_１（Ｘ，Ｙ），ＣｈＲＩ１_２（Ｘ，Ｙ），ＣｈＲＩ１_３（Ｘ，Ｙ），ＣｈＲＩ１_４（Ｘ，Ｙ）を探索する。続いて、ステップ１１１０で上記位置ずれ補正結果画像ＣＲＩ１（Ｘ，Ｙ，Ｚ）の上記各テンプレート領域と同領域をテンプレート画像ＴＲＩ１_１（Ｘ，Ｙ），ＴＲＩ１_２（Ｘ，Ｙ），ＴＲＩ１_３（Ｘ，Ｙ），ＴＲＩ１_４（Ｘ，Ｙ）として格納する。

ステップ１１１１では、上記ステップ１１０７で分割した領域ＦＳＲＩ２_１（Ｘ，Ｙ，Ｚ），ＦＳＲＩ２_２（Ｘ，Ｙ，Ｚ），ＦＳＲＩ２_３（Ｘ，Ｙ，Ｚ），ＦＳＲＩ２_４（Ｘ，Ｙ，Ｚ）をそれぞれサーチ領域とし、また、これに対応するテンプレート画像ＴＲＩ１_１（Ｘ，Ｙ），ＴＲＩ１_２（Ｘ，Ｙ），ＴＲＩ１_３（Ｘ，Ｙ），ＴＲＩ１_４（Ｘ，Ｙ）をテンプレートとして、テンプレートマッチングを行い、各領域に於ける最大相関値ＭＥ１，ＭＥ２，ＭＥ３，ＭＥ４を算出する。

ステップ１１１２では、領域（１）及び領域（２）に於ける二つの最大相関値ＭＥ１，ＭＥ２を比較し、高い相関値を有するテンプレート画像及びサーチ結果画像の中心座標ＭＥＰＸ_Ｔ，ＭＥＰＸ_Ｓを記憶する。同様にステップ１１１３では、領域（３）及び領域（４）に於ける二つの最大相関値ＭＥ３，ＭＥ４を比較し、高い相関値を有するテンプレート画像及びサーチ結果画像の中心座標ＭＥＰＹ_Ｔ，ＭＥＰＹ_Ｓを記憶する。

ステップ１１１４では、上記中心座標ＭＥＰＸ_Ｔ，ＭＥＰＸ_Ｓより、Ｙ軸を回転軸としたときのＣＲＩ１（Ｘ，Ｙ，Ｚ）に対するＦＳＲＩ２（Ｘ，Ｙ，Ｚ）の回転移動ずれ量Δβを算出する。同様に、ステップ１１１５にて、上記中心座標ＭＥＰＹ_Ｔ，ＭＥＰＹ_Ｓより、Ｘ軸を回転軸としたときのＣＲＩ１（Ｘ，Ｙ，Ｚ）に対するＦＳＲＩ２（Ｘ，Ｙ，Ｚ）の回転移動ずれ量Δαを算出する。

ステップ１１１６では、ＦＳＲＩ２（Ｘ，Ｙ，Ｚ）を用いて、Ｘ軸とＹ軸を回転軸とした回転移動ずれΔα，Δβを補正したＦＲｅｓｕｌｔ（Ｘ，Ｙ，Ｚ）を作成する。最後に、ステップ１１１７，１１１８にてＣＲＩ１（Ｘ，Ｙ，Ｚ）とＦＲｅｓｕｌｔ（Ｘ，Ｙ，Ｚ）を出力する。

以上の処理によって、上記ステップ１００６にて位置ずれ補正を行った結果に対し、更に平行移動位置ずれΔＸ，ΔＹ，ΔＺ及び、回転移動位置ずれΔα，Δβを補正することができる。

上記ステップ１００７による位置ずれ補正アルゴリズムは、ステップ１００６のアルゴリズムと異なり、ＸＹ平面画像の情報を用いて回転移動位置ずれΔα，Δβを補正している。本発明で用いる二つの三次元再構成画像は、上記ステップ５０１またはステップ１００１、及びステップ５０３またはステップ１００３で撮影された連続傾斜画像を用いているため、ＸＹ平面像は情報の劣化が無い鮮明な画像である。このため、ＸＹ平面画像の情報を用いた回転移動位置ずれ補正処理を行っている本実施例２による方法は、上述の実施例１による方法よりも位置ずれ補正精度を向上することができ、より高精細な本発明の結果画像ＤＡＴＩ（Ｘ，Ｙ，Ｚ）を作成することができる。

５ 第一の画像検出部
７ 第二の画像検出部
８ コンピュータ
９ 演算装置
１０ 記憶装置
１１ａ，１１ｂ コミュニケーションインターフェイス
１３ マイクロプロセッサ
１９ 入力装置
２０ 出力装置
３２ 試料ホルダー
７１ 撮影画像
８０ メインウィンドウ
８１ 目標回転角度入力部
８２ 回転刻み角度入力部
８３ 現在の回転角度表示部
８４ 設定傾斜角度入力部
８５ 傾斜刻み角度入力部
８６ 現在の傾斜角度表示部
８７ 撮影画像表示部
８８ 画像取り込み実行ボタン
９０ ウィンドウ
９１ 演算範囲Ｘ入力部
９２ 演算範囲Ｙ入力部
９３ 演算範囲Ｚ入力部
９４ コモンライン探索角度入力部
９５ テンプレート範囲入力部
９６ 再構成画像（１）表示部
９７ 再構成画像（２）表示部

Claims (25)

1. 観察対象物に電子線を照射する照射装置と、観察対象物からの応答を検出する第一及び第二の検出装置と、観察対象物を保持し、移動させる移動装置と、観察対象物の傾斜角度を任意に設定できる傾斜装置と観察対象物の回転角度を任意に設定できる回転装置と、各種演算を行う演算装置を備える電子顕微鏡において、上記観察対象物を異なる角度ステップで傾斜し、撮像装置によって得られた第一の傾斜画像群を格納する第一の格納手段、該観察対象物を回転刻み角度毎に位置ずれ補正を行い、指定した回転角度まで回転する回転手段、該回転手段によって回転された観察対象物を異なる角度ステップで傾斜し、撮像装置によって得られた第二の傾斜画像群を格納する第二の格納手段、上記第一と第二の傾斜画像群からそれぞれ作成した第一，第二の再構成画像の位置ずれを補正した第三，第四の再構成画像を作成し、上記第三と第四の再構成画像を重ね合わせて第五の再構成画像を作成する演算手段を備えることを特徴とする電子顕微鏡。
2. 請求項１において、上記演算装置は上記回転手段を上記傾斜装置を用いて試料の傾斜角度を０度付近に設定し、第一の検出装置にて第一の基準画像を撮影し、該基準画像を目標回転角度回転した目標参照画像を作成し、第二の検出装置にて第二の基準画像を撮影し、該第二の基準画像を回転刻み角度回転した刻み参照画像を作成し、回転装置を用いて試料を刻み角度回転させて第二の検出装置にて刻み画像を撮影し、上記刻み参照画像と上記刻み画像を用いて、位置ずれ量を算出し、該位置ずれ量だけ上記移動装置を用いて観察対象物を移動して位置ずれ補正をし、上記刻み参照画像の作成と上記刻み画像の撮影、上記位置ずれ量の算出及び上記位置ずれ補正を上記目標回転角度まで繰り返し、第一の検出装置にて目標画像を撮影し、上記目標参照画像と上記目標画像を用いて、位置ずれ量を算出し、該位置ずれ量だけ上記移動装置を用いて観察対象物を移動させて位置ずれ補正をするように制御することを特徴とする電子顕微鏡。
3. 請求項１において、上記演算手段は、第一の再構成画像に対する第二の再構成画像の平行位置ずれ量を三次元相互相関を用いて算出し、第二の再構成画像を該平行位置ずれ量移動させた平行位置ずれ補正画像を作成し、上記第一の再構成画像と上記平行位置ずれ補正画像をそれぞれＺ方向に各ピクセルの濃度値を加算した第一の加算画像と第二の加算画像を作成し、該第一の加算画像と該第二の加算画像からコモンラインを導出し、該コモンラインを一致させるためのそれぞれの回転角度を算出し、上記第一の再構成画像と上記平行位置ずれ補正画像をそれぞれ該回転角度回転させてコモンラインを一致させた第一のコモンライン補正画像と第二のコモンライン補正画像を作成し、上記第一のコモンライン補正画像から上記コモンラインと垂直な平面より任意の平面を抽出して第一のスライス画像を作成し、上記第二のコモンライン補正画像から上記コモンラインと垂直な平面より上記第一のスライス画像と同座標の平面を抽出して第二のスライス画像を作成し、上記第一のスライス画像に対する上記第二のスライス画像の回転移動ずれ量を算出し、上記第二のコモンライン補正画像をコモンラインを回転軸として該回転移動ずれ量回転させた回転位置ずれ補正画像を作成し、上記第一のコモンライン補正画像を第三の再構成画像として出力し、上記回転位置ずれ補正画像を第四の再構成画像として出力するように演算することを特徴とする電子顕微鏡。
4. 請求項３において、上記演算手段は、上記回転位置ずれ補正画像を作成する工程の後に、第三の再構成画像に対する第四の再構成画像の平行位置ずれ量を三次元相互相関を用いて算出し、第四の再構成画像を該平行位置ずれ量移動させた平行位置ずれ補正画像を作成し、第三の再構成画像の特徴を抽出した特徴抽出画像を作成し、該特徴抽出画像を一つまたは、複数の領域に分割し、上記平行位置ずれ補正画像を一つまたは、複数の領域に分割し、上記特徴抽出画像の各領域でテンプレート領域を移動しながらテンプレート領域内の濃度値の積算値を各々算出し、各領域で該積算値が最大となるテンプレート領域を探索し、第三の再構成画像の該テンプレート領域を各領域のテンプレート画像とし、該各テンプレート画像と対応する上記平行位置ずれ補正画像の各領域を探索画像とし、それぞれ対応する該各探索画像と上記各テンプレート画像から最も類似度が高い領域を算出し、各テンプレート画像の座標と該最も類度が高い各領域の座標から上記第三の再構成画像に対する上記平行位置ずれ補正画像の回転移動ずれ量を算出し、上記平行位置ずれ補正画像を該回転移動ずれ量回転させた回転移動ずれ補正画像を作成し、該回転移動ずれ補正画像を第三の再構成画像として出力するように演算することを特徴とする電子顕微鏡。
5. 請求項４において、上記演算手段は特徴量算出を画像の微分によって行うことを特徴とする電子顕微鏡。
6. 請求項４において、上記演算手段は特徴量算出を画像二値化によって行うことを特徴とする電子顕微鏡。
7. 請求項４において、上記演算手段は特徴量算出を第四の再構成画像を用いて行うことを特徴とする電子顕微鏡。
8. 請求項４において、上記演算手段はテンプレート領域の大きさを任意に決定できることを特徴とする電子顕微鏡。
9. 観察対象物に電子線を照射する照射装置と、観察対象物からの応答を検出する第一及び第二の検出装置と、観察対象物を保持し、移動させる移動手段と、観察対象物の傾斜角度を任意に設定できる傾斜装置と観察対象物の回転角度を任意に設定できる回転装置と、各種演算を行う演算装置を備える測定装置を用いた電子顕微鏡用画像再構成システムにおいて、上記観察対象物を異なる角度ステップで傾斜し、撮像装置によって得られた第一の傾斜画像群を格納する第一の格納手段、該観察対象物を回転刻み角度毎に位置ずれ補正を行い、指定した回転角度まで回転する回転手段、該回転手段によって回転された観察対象物を異なる角度ステップで傾斜し、撮像装置によって得られた第二の傾斜画像群を格納する第二の格納手段、上記第一と第二の傾斜画像群からそれぞれ作成した第一，第二の再構成画像の位置ずれを補正した第三，第四の再構成画像を作成し、上記第三と第四の再構成画像を重ね合わせて第五の再構成画像を作成する演算手段を備えることを特徴とする電子顕微鏡用画像再構成システム。
10. 請求項９において、上記演算装置は上記回転手段を上記傾斜装置を用いて試料の傾斜角度を０度付近に設定し、第一の検出装置にて第一の基準画像を撮影し、該基準画像を目標回転角度回転した目標参照画像を作成し、第二の検出装置にて第二の基準画像を撮影し、該第二の基準画像を回転刻み角度回転した刻み参照画像を作成し、回転装置を用いて試料を刻み角度回転させて第二の検出装置にて刻み画像を撮影し、上記刻み参照画像と上記刻み画像を用いて、位置ずれ量を算出し、該位置ずれ量だけ上記移動装置を用いて観察対象物を移動して位置ずれ補正をし、上記刻み参照画像の作成と上記刻み画像の撮影、上記位置ずれ量の算出及び上記位置ずれ補正を上記目標回転角度まで繰り返し、第一の検出装置にて目標画像を撮影し、上記目標参照画像と上記目標画像を用いて、位置ずれ量を算出し、該位置ずれ量だけ上記移動装置を用いて観察対象物を移動させて位置ずれ補正をするように制御することを特徴とする画像再構成システム。
11. 請求項９において、上記演算手段は、第一の再構成画像に対する第二の再構成画像の平行位置ずれ量を三次元相互相関を用いて算出し、第二の再構成画像を該平行位置ずれ量移動させた平行位置ずれ補正画像を作成し、上記第一の再構成画像と上記平行位置ずれ補正画像をそれぞれＺ方向に各ピクセルの濃度値を加算した第一の加算画像と第二の加算画像を作成し、該第一の加算画像と該第二の加算画像からコモンラインを導出し、該コモンラインを一致させるためのそれぞれの回転角度を算出し、上記第一の再構成画像と上記平行位置ずれ補正画像をそれぞれ該回転角度回転させてコモンラインを一致させた第一のコモンライン補正画像と第二のコモンライン補正画像を作成し、上記第一のコモンライン補正画像から上記コモンラインと垂直な平面より任意の平面を抽出して第一のスライス画像を作成し、上記第二のコモンライン補正画像から上記コモンラインと垂直な平面より上記第一のスライス画像と同座標の平面を抽出して第二のスライス画像を作成し、上記第一のスライス画像に対する上記第二のスライス画像の回転移動ずれ量を算出し、上記第二のコモンライン補正画像をコモンラインを回転軸として該回転移動ずれ量回転させた回転位置ずれ補正画像を作成し、上記第一のコモンライン補正画像を第三の再構成画像として出力し、上記回転位置ずれ補正画像を第四の再構成画像として出力するように演算することを特徴とする電子顕微鏡用画像再構成システム。
12. 請求項１１において、上記演算手段は、上記回転位置ずれ補正画像を作成する工程の後に、第三の再構成画像に対する第四の再構成画像の平行位置ずれ量を三次元相互相関を用いて算出し、第四の再構成画像を該平行位置ずれ量移動させた平行位置ずれ補正画像を作成し、第三の再構成画像の特徴を抽出した特徴抽出画像を作成し、該特徴抽出画像を一つまたは、複数の領域に分割し、上記平行位置ずれ補正画像を一つまたは、複数の領域に分割し、上記特徴抽出画像の各領域でテンプレート領域を移動しながらテンプレート領域内の濃度値の積算値を各々算出し、各領域で該積算値が最大となるテンプレート領域を探索し、第三の再構成画像の該テンプレート領域を各領域のテンプレート画像とし、該各テンプレート画像と対応する上記平行位置ずれ補正画像の各領域を探索画像とし、それぞれ対応する該各探索画像と上記各テンプレート画像から最も類似度が高い領域を算出し、各テンプレート画像の座標と該最も類度が高い各領域の座標から上記第三の再構成画像に対する上記平行位置ずれ補正画像の回転移動ずれ量を算出し、上記平行位置ずれ補正画像を該回転移動ずれ量回転させた回転移動ずれ補正画像を作成し、該回転移動ずれ補正画像を第三の再構成画像として出力するように演算することを特徴とする電子顕微鏡用画像再構成システム。
13. 請求項１２において、上記演算手段は特徴量算出を画像の微分によって行うことを特徴とする電子顕微鏡用画像再構成システム。
14. 請求項１２において、上記演算手段は特徴量算出を画像二値化によって行うことを特徴とする電子顕微鏡用画像再構成システム。
15. 請求項１２において、上記演算手段は特徴量算出を第四の再構成画像を用いて行うことを特徴とする電子顕微鏡用画像再構成システム。
16. 請求項１２において、上記演算手段はテンプレート領域の大きさを任意に決定できることを特徴とする電子顕微鏡用画像再構成システム。
17. 観察対象物に電子線を照射する照射装置と、観察対象物からの応答を検出する第一及び第二の検出装置と、観察対象物を保持し、移動させる移動手段と、観察対象物の傾斜角度を任意に設定できる傾斜装置と観察対象物の回転角度を任意に設定できる回転装置と、各種演算を行う演算装置を備える測定装置を用いた電子顕微鏡用画像再構成方法において、上記観察対象物を異なる角度ステップで傾斜し、撮像装置によって得られた第一の傾斜画像群を格納し、該観察対象物を回転刻み角度毎に位置ずれ補正を行い、指定した回転角度まで回転し、該観察対象物を異なる角度ステップで傾斜し、撮像装置によって得られた第二の傾斜画像群を格納し、上記第一と第二の傾斜画像群からそれぞれ作成した第一，第二の再構成画像の位置ずれを補正した第三，第四の再構成画像を作成し、上記第三と第四の再構成画像を重ね合わせて第五の再構成画像を作成することを特徴とする電子顕微鏡用画像再構成方法。
18. 請求項１７において、上記回転工程は上記傾斜装置を用いて試料の傾斜角度を０度付近に設定し、第一の検出装置にて第一の基準画像を撮影し、該基準画像を目標回転角度回転した目標参照画像を作成し、第二の検出装置にて第二の基準画像を撮影し、該第二の基準画像を回転刻み角度回転した刻み参照画像を作成し、回転装置を用いて試料を刻み角度回転させて第二の検出装置にて刻み画像を撮影し、上記刻み参照画像と上記刻み画像を用いて、位置ずれ量を算出し、該位置ずれ量だけ上記移動装置を用いて観察対象物を移動して位置ずれ補正をし、上記刻み参照画像の作成と上記刻み画像の撮影、上記位置ずれ量の算出及び上記位置ずれ補正を上記目標回転角度まで繰り返し、第一の検出装置にて目標画像を撮影し、上記目標参照画像と上記目標画像を用いて、位置ずれ量を算出し、該位置ずれ量だけ上記移動装置を用いて観察対象物を移動させて位置ずれ補正することを特徴とする電子顕微鏡用画像再構成方法。
19. 請求項１７において、上記第三，第四の再構成画像を作成する工程は、第一の再構成画像に対する第二の再構成画像の平行位置ずれ量を三次元相互相関を用いて算出し、第二の再構成画像を該平行位置ずれ量移動させた平行位置ずれ補正画像を作成し、上記第一の再構成画像と上記平行位置ずれ補正画像をそれぞれＺ方向に各ピクセルの濃度値を加算した第一の加算画像と第二の加算画像を作成し、該第一の加算画像と該第二の加算画像からコモンラインを導出し、該コモンラインを一致させるためのそれぞれの回転角度を算出し、上記第一の再構成画像と上記平行位置ずれ補正画像をそれぞれ該回転角度回転させてコモンラインを一致させた第一のコモンライン補正画像と第二のコモンライン補正画像を作成し、上記第一のコモンライン補正画像から上記コモンラインと垂直な平面より任意の平面を抽出して第一のスライス画像を作成し、上記第二のコモンライン補正画像から上記コモンラインと垂直な平面より上記第一のスライス画像と同座標の平面を抽出して第二のスライス画像を作成し、上記第一のスライス画像に対する上記第二のスライス画像の回転移動ずれ量を算出し、上記第二のコモンライン補正画像をコモンラインを回転軸として該回転移動ずれ量回転させた回転位置ずれ補正画像を作成し、上記第一のコモンライン補正画像を第三の再構成画像として出力し、上記回転位置ずれ補正画像を第四の再構成画像として出力することを特徴とする電子顕微鏡用画像再構成方法。
20. 請求項１９において、上記回転位置ずれ補正画像を作成する工程の後に、第三の再構成画像に対する第四の再構成画像の平行位置ずれ量を三次元相互相関を用いて算出し、第四の再構成画像を該平行位置ずれ量移動させた平行位置ずれ補正画像を作成し、第三の再構成画像の特徴を抽出した特徴抽出画像を作成し、該特徴抽出画像を一つまたは、複数の領域に分割し、上記平行位置ずれ補正画像を一つまたは、複数の領域に分割し、上記特徴抽出画像の各領域でテンプレート領域を移動しながらテンプレート領域内の濃度値の積算値を各々算出し、各領域で該積算値が最大となるテンプレート領域を探索し、第三の再構成画像の該テンプレート領域を各領域のテンプレート画像とし、該各テンプレート画像と対応する上記平行位置ずれ補正画像の各領域を探索画像とし、それぞれ対応する該各探索画像と上記各テンプレート画像から最も類似度が高い領域を算出し、各テンプレート画像の座標と該最も類度が高い各領域の座標から上記第三の再構成画像に対する上記平行位置ずれ補正画像の回転移動ずれ量を算出し、上記平行位置ずれ補正画像を該回転移動ずれ量回転させた回転移動ずれ補正画像を作成し、該回転移動ずれ補正画像を第三の再構成画像として出力することを特徴とする電子顕微鏡用画像再構成方法。
21. 請求項２０において、特徴量算出工程は画像の微分によって行うことを特徴とする電子顕微鏡用画像再構成方法。
22. 請求項２０において、特徴量算出工程は画像二値化によって行うことを特徴とする電子顕微鏡用画像再構成方法。
23. 請求項２０において、特徴量算出工程は第四の再構成画像を用いて行うことを特徴とする電子顕微鏡用画像再構成方法。
24. 請求項２０において、テンプレート領域の大きさを任意に決定できることを特徴とする電子顕微鏡用画像再構成方法。
25. 試料を異なる試料傾斜軸で傾斜させて撮影した複数の傾斜画像を得、回転刻み角度毎に位置ずれ補正を行い、回転された観察対象物を異なる角度ステップで傾斜して撮像し、それぞれの傾斜画像群からそれぞれ作成した２つの再構成画像の位置ずれを補正した２つの再構成画像を作成し、該２つの再構成画像を重ね合わせてひとつの再構成画像を作成することを特徴とする電子顕微鏡用画像再構成方法。

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