JP5209424B2 - 消光剤前駆体組成物 - Google Patents
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Description
(関連出願)
本願は、2000年12月5日に出願された米国特許出願第09/731,323号の一部継続出願である。その全体を引用することにより、本願に援用する。
本発明は、水媒体又は有機媒体中のポリヒドロキシ置換有機分子の濃度を測定する改良光学的測定法及び/又はそれを測定する改良センサーに関する。一用途において、この測定法及びセンサーは、水溶液中の糖類、すなわちグルコース又はフルクトースの濃度をインビトロ(in vitro)でモニターするが、特に、この測定法及びセンサーは、水溶液中の糖類、すなわちグルコース又はフルクトースの濃度をインビボ(in vivo)でモニターする。液体中のグルコースをインビトロ及びインビボで測定することは重要である。インビボの検出装置は人間に埋め込むことができる。光学的測定法及び装置の新規の要素には、独立した発明と考えられるものもある。
何年もの間、体液中のポリヒドロキシ化合物(例えばグルコース)濃度の測定に蛍光技術を利用する努力が継続的になされてきた。本明細書では以下“グルコース”の用語を用いるが、溶液中の大部分のポリヒドロキシル基含有有機化合物(糖質、1,2ジオール、1,3ジオール等)の濃度を測定できると了解されよう。しかし、懸命な努力にもかかわらず、インビボモニターリングに関する実用的なシステムは未だ開発も商品化もされていない。様々な試みは、ボロン酸基を有する染料を使用した、蛍光によるグルコース検出に関してなされている。ボロン酸は糖と可逆的に結合するとして周知であり、ボロン酸官能性染料が糖と結合すると、その染料の特性が効果的に現れる。従来はこのような変化を利用して糖濃度を測定していた。
米国特許第5,137,833号(1992)
米国特許第5,503,770号(1996)
米国特許第5,512,246号(1996)
米国特許第6,002,954号(1999)
米国特許第6,011,984号(2000)
米国特許第4,586,518号(1986)
米国特許第4,659,817号(1989)
米国特許第4,798,738号(1989)
米国特許第4,886,338号(1989)
米国特許第5,039,491号(1991)
米国特許第5,114,676号(1992)
米国特許第5,232,858号(1993)
米国特許第5,517,313号(1996)
米国特許第5,631,364号(1997)
米国特許第5,763,238号(1998)
米国特許第5,711,915号(1998)
米国特許第5,852,126号(1998)
米国特許第5,894,351号(1999)
米国特許第5,922,612号(1999)
米国特許第6,063,637号(2000)
米国特許第6,046,312号(2000)
米国特許第6,139,799号(2000)
米国特許第6,040,194号(2000)
米国特許第6,256,522号(2001)
米国特許第6,285,807号(2001)
米国特許第6,304,266号(2001)
米国特許第6,319,540号(2001)
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本発明は、水媒体中のポリヒドロキシ化合物の濃度を測定する光学的測定法及び光学測定装置に関し、特にインビボで、生理的媒体中の糖類、特にグルコース又はフルクトース等の濃度を測定する光学的測定法及び光学測定装置に関する。これら化合物、すなわち検体を、光源と、センサーと、蛍光剤(fluorophore)D(蛍光染料)、消光剤、及び任意のポリマーマトリクスMを含む活性成分とからなる蛍光センサー装置を備えたシステム中に入れる。構成要素のいくらかは独立した発明である。蛍光剤は、適当な波長で励起されると光を放つ(蛍光を発する)。光強度は消光の程度に依存する。蛍光剤と消光剤Qは、好ましくは独立して存在しているが、任意的に、検出及び定量の対象化合物に浸透可能か又はそれと接触しているポリマーマトリックス中で固定されるか、又はそれと共有結合して存在している。
A.前記検体液に適合する蛍光剤(fluorophore)染料Dを得る段階と、
[前記Dは下記の(a)又は(b)から選択される:
(a) 下記I〜VIの性質を有する蛍光剤染料D1:
I.蛍光剤である
II.430nm〜600nmの範囲で励起を有する
III.分析条件下で光退色に対して耐久性を有する
IV.約30nmかそれ以上のストークスシフト(stock shift)を有する
V.前記検体液に適合する
VI.メチルビオロゲンにより消光され、実験による見かけ上のシュテルン-フォルマー(Stern-Volmer)消光定数の測定値(Ksv)が50かそれ以上である
(ここで、蛍光剤染料D1は中性又は負に帯電しており、下記の(I)又は(II)の何れか:
(I) 分子量が1000ダルトンか又はそれ以上の分離化合物(但し該染料が負に帯電した基
で置換される場合には、分子量が500ダルトン又はそれ以上である化合物)
(II) 分子量が約10000ダルトン以上の水溶性又は分散性ポリマー中のペンダント基 (pendant group)又は鎖状単位(chain unit)
であり、任意に前記ポリマーは水不溶性ポリマーマトリックスM1と非共有結合し、かつその中で物理的に固定されている。ここで前記ポリマーマトリックスM1は、前記検体液に浸透性を有するか又はそれと接触している。また、任意にD1が負に帯電しているか、ポリマーが陽性の水溶性ポリマーとの錯体として固定される場合には、形成された該錯体は前記検体液に対して浸透性を有するか又はそれに接触している。)
(b) 下記I〜VIの性質を有する蛍光剤染料D2:
I.蛍光剤である
II.430nm〜800nmの範囲で励起を有する
III.約30nmかそれ以上のストークスシフトを有する
IV.分析条件下で光退色に対して耐久性を有する
V.前記検体液に適合する
VI.メチルビオロゲンにより消光され、生成される見かけ上のシュテルン-フォルマー(Stern-Volmer)消光定数(Ksv)が50かそれ以上である
(ここで、D2が不溶性ポリマーマトリックスM1と共有結合している場合には、該ポリマーマトリックスM1は前記検体に浸透性を有するか又はそれと接触しており、D2が多官能性でありマトリックスM1に1、2又は3箇所で結合する場合には、前記蛍光剤染料D2はM1-L1-D2の構造の一部である。L1は、直接結合、炭素原子が1〜8の低アルキレン基からなる群から選択された加水分解に対して安定な共有結合基であって、スルホンアミド、アミド、エステル、エーテル、硫化物、スルホン、フェニレン、ウレタン、尿素及びアミンから選択された1又はそれ以上の2価の結合基を任意に端末基とするか又はそれを含む。)]
B.ボロン酸を含む消光剤(quencher)部分Qと結合する段階と、
[ここで、Qは、前記検体液中で適合するという特性を有する共役窒素含有複素環式芳香族ビスオニウム塩を含み、前記検体の存在下で染料の発光時に検出可能な変化を生じさせ、かつ下記の(I)又は(II)から選択される:
(I) 分子量が約400ダルトン又はそれ以上の分離化合物か、又は分子量が10000ダルトン
以上の水溶性又は水分散性ポリマー中のペンダント基又は鎖状単位であり、該ポリ
マーが任意のポリマーマトリックスM1の存在時に該M1と任意に非共有結合して該ポ
リマーマトリックス中で物理的に固定されているか、又は該ポリマーが負に帯電し
た水溶性ポリマーとの錯体として任意に固定されていることを特徴とする消光剤Q1
(II)結合基L2を介してM1と共有結合しているか、又は第二の不溶性ポリマーマトリック
スM2と共有結合してM2-L2-Q2を形成しており、L2は直接結合炭素原子1〜8の低ア
ルキレンから選択されたものであって、スルホンアミド、アミド、第4級アンモニ
ウム、ピリジニウム、エステル、エーテル、硫化物、スルホン、フェニレン、尿素
、チオ尿素及びウレタン又はアミンから選択された1又はそれ以上の2価の結合基
を任意に端末基とすることを特徴とする消光剤Q2
(Q2において多官能性が1又は2箇所でマトリックスM2と結合しているならば、前記消光剤Q1又はQ2は前記蛍光剤染料D1又はD2と分子レベルで混ざり合う)]
C.インビボで検体、染料及び消光剤を含む生理的溶液に、検出器と連結した励
起光源を接触させる段階と、
D.約430〜600nmの範囲で検出可能かつ定量可能な信号を発生する段階と、
E.前記生理的溶液中の前記ポリヒドロキシ置換検体の濃度を求める段階からなることを特徴とする検出方法である。
(定義)
本明細書中に使用される“ボロン酸”の用語は、B(OH)2の構造を意味する。本発明の消光剤合成の各段階で、ボロン酸はボロン酸エステルとして存在すると当業者には認識されているが、ボロン酸はかかるエステル類を含む。
本発明において、グルコース認識部分は芳香族ボロン酸である。より詳細には、本発明のボロン酸は、例えばビオロゲンのような共役窒素含有複素環芳香族ビスオニウム骨格と共有結合しており(例えば図3A〜Iを参照)、そこでボロン酸は約7以下のpKaを有し、水性媒体中のグルコースと可逆的に反応してボロン酸エステルを形成する。反応の程度は、媒体中のグルコース濃度に関連する。
a) 第1の芳香族部分上にある重合可能な基が窒素原子の1つと結合し、少なくとも1つの-B(OH)2基を有する第2の芳香族基が第2の窒素と結合したもの、
b) 1又はそれ以上のボロン酸が窒素原子1つとボロン酸1つを有する第1の芳香族部分に結合し、かつ重合可能な基が第2の窒素原子を有する第2の芳香族基に結合したもの、及び
c) 1つのボロン酸基と重合可能な基が窒素原子と結合した第1の芳香族の部分と結合し、ボロン酸基1つと重合可能な基1つが第2の窒素原子と結合した第2の芳香族部分と結合したものである。
本発明において有用な染料(図1A、1B及び1Cを参照)は、約430nm又はそれ以上の波長の光で励起し、励起波長及び発光波長が分離可能な程十分な長さ、すなわち少なくとも10nm、好ましくは約30nm又はそれ以上のストークスシフトを有するものである。そのような染料は、ビオロゲンのような電子受容体分子によって消光され易く、光退色に対して耐性があり、かつ光酸化、加水分解及び微生物分解に対して安定である。本発明の有用な染料は、メチルビオロゲンを用いて試験した場合に、約50かそれ以上、好ましくは100以上の見かけ上のスタン・ボルマー消光定数を有する。このスタン・ボルマー試験の概要は、下記の手順Aに示す。好ましい染料には、ヒドロキシピレントリスルホン酸のポリマー誘導体が含まれる。一部の例において、染料はスルホンアミド官能基を介してポリマーに結合している。そのポリマー染料は、水溶性であるか、あるいは不溶性であるけれども水中で膨潤又は分散するか、あるいは架橋しているかもしれない。ポリマーとして好ましい染料は、例えば8-ヒドロキシピレン-1,3,6-N,N’,N’’-トリス(メトキシポリエトキシルエチル(n〜125)スルホンアミド) の水溶性PEG付加物であり、アセトキシピレン トリスルホニル クロライドをアミノエチルPEGモノメチルエーテルと反応させて形成する。結果として生じる染料ポリマーは、少なくとも約10,000の分子量を有するため、ヒドロゲル又はネットワークポリマーマトリックス中で捕捉されると、そのマトリックスから周囲の水媒体へ拡散できない。
インビボの用途で、センサーは、1か又はそれ以上のポリヒドロキシル有機化合物を含む生理的溶液の流れの中で用いられるか、又はその化合物を含む筋肉のような組織中に移植される。従って、そのセンサーの集合体から検出部が漏れることがないことが必要であり、インビボで使用する場合の検出成分は、有機ポリマーの検出集合体の一部である。水溶性の染料及び消光剤は、検体は通すけれども検出部を通さない半浸透性膜で隔離することができる。これは、検体分子よりも実質的に大きな水溶性分子(分子量が検体の分子量の少なくとも2倍か、又は1000より大きく、好ましくは5000より大きい分子)を検出部として用いること、そして透析膜や限外濾過膜のような選択的半浸透膜を用いて特定の分子量で2部に分けることによって実現することができ、それによって検出部を定量的に保持することができる。
任意的に、本発明のポリマーは分子刷り込みされたものである。一実施例において、測定用消光剤の陽イオンと測定用染料の陰イオンから有機塩を形成する。その後その有機塩を、イオン対が少なくとも部分的に結合しているような状況下で共重合させると、巨大ヒドロゲルマトリックスが形成する。あるいは、消光剤モノマーを重合させると第1のポリマーが形成し、後にそのポリマーをイオン交換すると、陰イオン染料に対応する多価電解質が得られる。後者をその後適当なモノマーで共重合させると、消光剤ポリマーとのイオン結合で結合した相互貫入染料ポリマーが形成する。その組み合わせは、IPNポリマーか又は半-IPNポリマーのいずれかである。他の実施例において、まず重合可能なビオロゲンボロン酸を用いてグルコースのビスボロン酸エステルを形成させることにより、本発明のポリマーを分子刷り込みすると、フルクトースのような他のポリヒドロキシ化合物以上にグルコースに対する選択性が高まる。このエステルを、その後共重合及び加水分解すると、グルコースを刷り込んだポリマーが得られる。このポリマーを後に用いて、染料ポリマーを含むIPNを形成させる。
他の実施例において、本発明は蛍光剤に共有結合したボロン酸置換ビオロゲンである。分離化合物としての一成分ビオロゲンセンサーの一例は、実施例39に示すとおりである。好ましくは、付加物は重合可能な化合物か、又はポリマー中の単位体である。かかる付加物は、まず窒素の1つにベンジル-3-ボロン酸基を結合させ、他の窒素にはアミノエチル基を結合させて、4,4’-ジピリジルから非対称ビオロゲンを形成させることにより作成する。まず1:1のモル比で8-アセトキシ-ピレン-1,3,6-トリスルホニル クロライドと連続的にビオロゲンを縮合させ、その後に過剰のPEGジアミンと反応させると、プレポリマー混合体が得られる。副産物の酸を除去するために、両段階で酸受容体を入れておく。そのプレポリマー混合体を、ポリイソシアネートと共に反応させ架橋させると、ヒドロゲルが得られる。その生成物を塩基で処理して保護基を除去する。さらに使用する前に、不完全反応による生成物及び未反応の出発材料を純水で完全に抽出することにより、そのヒドロゲルから浸出させる。本明細書に記載のように検出成分として使用すると、その生成物はグルコースに反応性を示す。
測定は、従来の発光分光計で行う。本発明の染料及び消光剤を含むpH7.4の緩衝溶液を作成し、キュベットに入れる。使用している染料に適した波長の光によりその試料を励起させ、その蛍光強度を測定する。溶液に含まれる未知のグルコースを一定量その溶液に添加し、測定を繰り返し行う。一連の標準グルコース溶液を測定してその結果を濃度の関数である強度変化としてプロットすることで別に定めた校正曲線を参照して、強度の変化からグルコース濃度を算出する。この方法においては、検出成分が試験中に不変であることが必要なだけで、グルコースとの反応が可逆的である必要はない。
蛍光分光計用のフローセルを作成する。検出ポリマーをそのセルに入れ、一面で励起光にあたり、他の一面でプロセスストリームにあたるようにする。グルコースを含まないセルにプロセスストリームを通して、定常状態の蛍光を測定することにより、ベースラインを設定する。その後、セルにプロセスストリームを通して、時間の関数として蛍光強度をモニーターする。グルコース濃度は、上記の校正曲線を参照して求める。この方法において、センサーは作動時を通して不変でなければならず、グルコースとの反応は可逆的でなければならない。さらに、検出部はプロセスストリームに固定されていなければならず、その中に浸出してはならない。
図8は、糖、すなわちグルコースを1回又は連続的にモニーターする際に用いる装置の略図である。染料及び消光剤を含む検出ポリマー81を、任意の支持材82に結合させることもできる。いくらかの実施例においては、任意の半浸透ポリマー膜83Aを使用する。他の用途においては、生体適合性が最適な被覆材83Bを使用して、その集合体を被覆すると実用的である。光源84を光フィルター85、光ファイバー86、検出ポリマー81へとつなげる。検出器87を光フィルター88、光ファイバー89へとつなぎ、それを検出ポリマー81へとつなぐ。光源84及び検出器87は、共に電子制御器90につなぐ。従って、このシステムにより、生理的溶液中のグルコース含量に基づく検出ポリマー中の変化を検出することができる。インビボでの移植及びモニーターに有用なプロセスストリーム中の装置を、図9及び10に示す。図9は、光学的装置を示しており、図10は、測定用電極の断面図を示している。図9において、光源11は(可視)光ファイバー12を介して活動セル13につながれている。半浸透膜14により、検体をセル13から出し入れし易くなる。光ファイバー15によりフィルター16と任意の光電子増倍管17に変化した光が伝達されると、分析に必要な検体スペクトルがつくられる。
試薬及び溶媒は、特に断りがない限り、市販で業者から入手したものを使用した。(年刊のChem Sources USAを参照。)
蛍光染料を用いてメチルビオロゲンのみかけ上のスタン・ボルマー消光定数(THE APPARENT STERN-VOLMER QUENCHING CONSTANT)を求める蛍光分光分析方法
みかけのスタン・ボルマー消光定数は、消光剤濃度(M)に対する相対蛍光強度(F。/F)のスタン・ボルマープロットの傾斜から算出する。ジェイ・アール・ラコヴィクス(J.R.Lakowicz)の(1999)蛍光分光の原理第2版(Principle of Fluorescence Spectroscopy Second Edition),クルワーアカデミック/プレナム出版社(Kluwer Academic/Plenum Publishers),ニューヨーク,pp.237-289を参照。当業者であれば大概は、特に対象とする溶剤中で任意の蛍光染料/消光剤の組合わせについてこの分析を行うことができる。この通常のスタン・ボルマー分析を用いて、イオン強度0.1、H7.4のリン酸緩衝液中で、スタン・ボルマー消光定数を測定する。
ジメチル-(4-ブロモメチル)-ベンゼンボロナートの合成
乾燥器で乾燥させた100mL丸底フラスコをアルゴン下で冷却し、マグネットスターラーを入れて、(4-ブロモメチル)-ベンゼンボロン酸(12.49mmols、2.684g)を加えた。そのフラスコにペンタン(55mL)を入れてセプタムで密栓した。その懸濁液を室温で攪拌し、新たに蒸留したCH3OH(3.16g、4mL、97mmls)を加えたところ、その溶液は即座に透明になった。20分間攪拌した後に、その溶液を(過剰なCH3OHを除去するために)MgSO4で、その後にはCaCl2で乾燥させた。アルゴン下、上清をカニューレでガラス製漏斗に(溶剤)入れて濾過し、その後減圧下でペンタンを除去した。残余の黄色油を減圧下(0.1トール、1時間)でさらに乾燥させた。収率は1.6g、6.59mmols(56%)であった。1H-NMR(CD3OD、ppm)測定の結果は、4.5(s、2H)、7.4(d、2H)、7.55(d、2H)であり、11B-NMR(CH3OH、ppm)測定の結果は、29(s)であった。これに対応する2位置及び3位置の異性体も同様の処理方法を用いて作成した。この生成物は、実施例1〜3、5及び6でボロン酸-ビオロゲン化合物を作成する際に用いた。
8-アセトキシ-ピレン-1,3,6-トリスルホニルクロライドの合成
塩化チオニル30mLにジメチルホルムアミド5滴を加え、その中に8-アセトキシ-ピレン-1,3,6-トリスルホン酸3ナトリウム(アセトキシ-HPTS、11.33g、20mmol)を懸濁させた。この懸濁液を3時間還流すると、その間に懸濁液は茶色溶液へと変化した。その後、その溶液をアルゴンガス下で25℃まで冷却した。その後、塩化チオニルを減圧下(2トール)で蒸留すると、黄色残留物が残った。その黄色残留物にジクロロメタン60mLを加えて、それと共に異なる3本の遠心分離管に移した。その後、その懸濁液を遠心分離し、上清を乾燥した丸底フラスコに移した。遠心分離管に残った残留物を、各回10mLのジクロロメタンでさらに4回洗浄した。上清を混ぜ合わせてアルゴンガス下で1晩放置すると、いくらかの沈殿が認められた。そのジクロロメタン溶液をペンタン250mLに加えると、大量の黄色固体の沈殿物が生じた。上清を両頭針で除去し、その黄色固体を高真空(0.2トール)で乾燥させた。収率は8.62g、15.5mmols(78%)であった。1H-NMR(500MHz、CDCl3、ppm)測定の結果は、2.682(s、3H)、8.833(d、J=10Hz、1H)、8.915(s、1H)、9.458(d、J=10Hz、1H)、9.509(d、J=10Hz、1H)、9.630(s、1H)、9.685(d、J=10Hz、1H)であった。この生成物は、実施例7、9、13、14及び15で用いた。
4-(4-ピリジル)-N-(ベンジル-4-エテニル)-ピリジニウムクロライドの合成
乾燥器で乾燥させた100mL丸底フラスコをアルゴン下で冷却し、マグネットスターラーを入れて、4-4’-ジピリジル(12.50g、 80mmols)を加えた。そのフラスコにCH3OH(20mL)を入れてセプタムで密栓した。その均質溶液を室温で攪拌しながら、シリンジで4-(クロロメチル)スチレン(2.82mL、20mmols)を滴下した。その溶液を室温で48時間攪拌後、減圧して溶媒を除去した。カニューレを用いて乾燥テトラヒドロフラン(50mL)を反応フラスコに入れ、その混合物を3日間放置した。その時には攪拌は止め、固体を沈降させて、カニューレで溶媒を可能な限り除去した。この処理はさらに2回繰り返し行ったが、その時の混合時間はそれぞれ24時間に減らした。3回目の微粒子化後、その混合物を窒素下で濾過し、乾燥ジエチルエーテル(200mL)をカニューレで加えて洗浄した。その固まりに、加圧下で1時間乾燥窒素を流して、最後に減圧(0.1トール、1時間)することにより乾燥させた。収率は5.56g、18mmols(90%)であった。1H-NMR(D2O、ppm)測定の結果は、9.12(d、2H)、8.86(d、2H)、8.48(d、2H)、7.98(d、2H)、7.67(d、2H)、7.57(d、2H)、6.87(dd、1H)、5.92(s、2H)、5.45(d、1H)であった。この化合物は、実施例5及び6で用いた。
N-ベンジル-4-エテニル-4,7-フェナントロリニウム クロライド(4,7-PHEN SV)の合成
炎光中で乾燥させた100mL枝付丸底フラスコにマグネットスターラーを入れてアルゴン下で冷却し、4,7-フェナントロリン(2.14g、11.86mmols)を加えた。そのフラスコを、アルゴン(ガス)管を備えた還流冷却器に設置して、枝を介して4-(クロロメチル)スチレン(0.905g、0.836mL、5.93mmols)及び無水CH3CN(20mL)を入れた。その溶液を加熱して、アルゴン(ガス)下で17時間還流し、その後室温まで冷却してジエチルエーテル(30mL)で沈殿させた。懸濁液を静置し、上清をカニューレで除去した。残留物に溶媒15mLを加えて、それと共にカニューレで遠心分離管に入れ、アセトン(20mL)で微粒子化してから遠心分離を行った(この処理は4回繰り返した)。茶/ピンク色固体をジメチルエーテルで微粒子化(3×20mL)し、減圧下で乾燥させた。収率は0.376g、1.13mmols(19%)であった。1H-NMR(250MHz、CD3OD、ppm)測定の結果は、5.226(d、1H、11Hz)、5.80(d、1H、J=17.75Hz)、6.482(s、2H)、6.708(dd、1H、J1=11Hz、J2=17.75Hz)、7.374(d、1H、J=8Hz)、7.496(d、1H、J=8Hz)、8.00(dd、1H、J1=4Hz、J2=8.5Hz)、8.453(dd、1H、J1=6Hz、J2=8.5Hz)、8.60(d、1H、J=10Hz)、8.697(d、1H、J=10Hz)、9.20(d、1H、J=4Hz)、9.50(d、1H、J=8.25Hz)、9.65(d、1H、J=5.75Hz)、10.188(d、1H、J=8.5Hz)であり、13C NMR(62.5MHz、CD3OD)測定の結果は、62.40、121.344、124.899、126.023、128.454、129.031、130.778、132.161、133.893、134.242、137.205、139.848、140.410、140.699、144.041、147.976、149.541、154.661であった。この化合物は、実施例25で使用した。
4-4’-N,N’-ビス-(ベンジル-3-ボロン酸)ジピリジニウム ジブロミドの合成
乾燥器で乾燥させた50mLの遠心分離管をアルゴン下で冷却し、マグネットスターラーを入れて、4,4’-ビピリジル(0.469g、3mmols)を入れた。その管にCH3OH(7mL)を入れ、セプタムで密栓した。その均質溶液を室温で攪拌しながら、新たに作成したジメチル-(3-ブロモメチル)-ベンゼンボロナート(1.82g、7.5mmols)をシリンジで加えた。その溶液を15時間攪拌した後、反応容器を遠心分離機にかけ(3200RPMで4分間)、別のフラスコにはCH3OHをカニューレで入れた。残存する黄色固体をアセトン:水の混液(24:1、V/V、25mL)で微粒子化し、ボルテックス・ミキサーで強力に攪拌して、遠心分離を行った。カニューレでアセトン溶液を除去し、微粒子化処理をさらに2回繰り返し行った。その後同処理を行って、その固体をジエチルエーテルで微粒子化した。その後、遠心分離管内の黄白色の固体を高真空(0.6トール、2時間)で乾燥させた。収率は0.956g、1.63mmols(54%)であった。融点(分解点)は230℃より高温であった。1H-NMR(D2O、ppm)測定の結果は、6.093(s、4H)、7.715(dd、2H、J1=7.5Hz、J2=7.5Hz)、7.788(d、1H、J=7.5Hz)、7.984(s、1H)、8.002(d、1H、J=7.5Hz)、8.662(d、4H、J=7Hz)、9.293(d、4H、J=7Hz)であり、11B-NMR(CH3OH、ppm)測定の結果は、29(s)であった。この化合物は、下記の実施例16〜18及び図6で使用した。
4,4’-N,N’-ビス-(ベンジル-4-ボロン酸)ジピリジニウム ジブロミドの合成
乾燥器で乾燥させた50mLの遠心分離管をアルゴン下で冷却し、マグネットスターラーを入れて、4,4’-ジピリジル(0.234g、1.5mmols)を加えた。その管に無水CH3OH(7mL)を入れ、セプタムで密栓した。その均質溶液を室温で攪拌しながら、新たに作成したジメチル-(4-ブロモメチル)-ベンゼンボロナート(1.09g、4.5mmols)をシリンジで加えた。その溶液を15時間攪拌した後、反応容器を遠心分離機にかけ(3200RPMで4分間)、別のフラスコにはCH3OHをカニューレで入れた。残存する黄色固体をアセトン:水の混液(24:1、V/V、25mL)で微粒子化し、ボルテックス・ミキサーで激しく攪拌してから遠心分離を行った。アセトン溶液をカニューレで除去し、その微粒子化処理をさらに2回繰り返し行った。その後同処理により、その固体をジエチルエーテルで微粒子化した。その後、遠心分離管内の黄白色の固体を減圧下(0.6トール、2時間)で乾燥させた。収率は0.723g、1.63mmols(82%)であった。融点(分解点)は230℃より高温であった。1H-NMR(D2O、ppm)測定の結果は、6.116(s、4H)、7.670(d、4H、J=8.25Hz)、8.017(d、4H、J=8.25Hz)、8.698(d、4H、J=6.5Hz)、9.325(d、4H、J=6.5Hz)であり、11B-NMR(CH3OH、ppm)測定の結果は、29(s)であった。実施例17及び18、並びに図6を参照。
4,4’-N,N’-ビス-(ベンジル-2-ボロン酸)ジピリジニウム ジブロミドの合成
乾燥器で乾燥させた50mLの遠心分離管をアルゴン下で冷却し、マグネットスターラーを入れた。4,4’-ビピリジル(1.5mmol、0.234g)を管に量り入れ、その後その管にCH3OH(7mL)を入れ、セプタムで密栓した。その均質溶液の混合は、室温で攪拌しながら行った。新たに作成したジメチル-(2-ブロモメチル)ベンゼンボロナート(4.5mmols、1.2mL、1.09g)をシリンジで反応管に加え、その結果生じた茶/オレンジ色の溶液を室温(周囲温度)で15時間攪拌した。その後、その反応容器を遠心分離し(3200RPMで4分間)、別のフラスコにはカニューレでCH3OHを入れた。残余の黄色固体をジエチルエーテル(25mL)で微粒子化し、ボルテックス・ミキサーで激しく攪拌してから、遠心分離を行った。そのエーテル溶液をカニューレで除去し、その微粒子化処理をさらに3回繰り返し行った。その後、遠心分離管内の黄白色の固体を減圧下(0.6トール、2時間)で乾燥させた。収率は70%であった。1H-NMR(D2O、ppm)測定の結果は、6.21(s、2H)、7.72(m、3H)、7.91(d、1H)、8.60(d、2H)、9.18(d、2H)であり、11B-NMR(CH3OH、ppm)測定の結果は、30.2(broads、s)であった。この化合物は、実施例8の染料の蛍光を消光し、かつグルコースに反応性を有すると認められた。実施例17を参照。
1,7-N,N’-ビス(ベンジル-3-ボロン酸)-フェナントロリニウム ジブロミドの合成
乾燥器で乾燥させた50mLの遠心分離管をアルゴン下で冷却し、マグネットスターラーを入れて、1,7-フェナントロリン(0.288g、1.6mmols)を加えた。その後その管にCH3OH(4mL)を入れ、セプタムで密栓し、新たに作成したジメチル-(3-ブロモメチル)-ベンゼンボロナート(0.972g、4mmols)をシリンジで加えた。その均質溶液を室温で15時間攪拌し、その後2時間還流した。その反応混合物をアルゴン下で室温まで冷却し、減圧してCH3OHを除去した。その黄/オレンジ色の固体をアセトン:水の混液(40mL、24:1、V/V)で、その後にジエチルエーテル(2×40mL)で一晩微粒子化した。その懸濁液をガラス製漏斗で濾過し(溶媒を)、固体をアルゴン下で分離した。収率は0.495g、0.812mmols(51%)であった。融点は230℃より高温であった。1H-NMR(D2O、ppm)測定の結果は、6.504(1H)、7.638(1H)、8.025(m、2H)、8.2505(d、1H、8.5Hz)、8.483(in、6H)、8.738(d、1H、J=8.5Hz)、9.315(d、1H、J=5.75Hz)、9.605(d、1H、J=5.75Hz)、10.098(d、1H、J=8.5Hz)、10.269(d、111、J=8.5Hz)であり、11B-NMR(CH3OH、ppm)測定の結果は、28(s)であった。この化合物は、実施例8の染料の蛍光を消光し、かつグルコースに反応性を有すると認められた。
4-N-(ベンジル-4-ボロン酸)-4’-N’-(ベンジル-4-エテニル)ジピリジニウム ブロミド クロライド(p-SBBV)の合成
乾燥器で乾燥させた50mLの遠心分離管をアルゴン下で冷却し、マグネットスターラーを入れて、4-(4-ピリジル)-N-(ベンジル-4-エテニル)-ピリジニウム クロライド(0.463g、1.5mmols)を加えた。その管にアセトニトリル(6mL)を入れて、セプタムで密栓した。その結果生じたピンク/オレンジ色の懸濁液を室温で攪拌しながら、新たに作成したジメチル-(4-ブロモメチル)-ベンゼンボロナート(0.486g、2mmols)をシリンジで加えた。その懸濁液を23時間攪拌した後、その反応容器を遠心分離機にかけ(3200RPMで4分間)、別のフラスコにはアセトニトリルをカニューレで入れた。残余の黄色固体をアセトン:水の混液(25mL、24:1、V/V)で微粒子化し、ボルテックス・ミキサーで激しく攪拌してから、遠心分離を行った。アセトン溶液をカニューレで除去し、その微粒子化処理をさらに2回繰り返し行った。その後同処理により、その固体をジエチルエーテルで微粒子化した。その後、遠心分離管内の鮮黄色の固体を減圧下(0.5トール、1時間)で乾燥させた。収率は0.431g、0.824mmols(55%)であった。融点は200℃より高温であった。1H-NMR(D2O、ppm)測定の結果は、5.405(d、1H、J=11.5Hz)、5.929(d、2H、J=17.5Hz)、5.934(s、2H)、5.981(s、2H)、6.832(dd、2H、J1=17.5Hz、J2=11Hz)、7.523(d、2H、J=9Hz)、7.562(d、2H、J=8Hz)、7.626(d、2H、J=8Hz)、7.8815(d、2H、J=8.5Hz)、8.566(dd、4H、J1=3.6Hz、J2=1.5Hz)、9.1855(dd、4H、J1=6.5Hz、J2=6Hz)であり、11B-NMR(CH3OH、ppm)測定の結果は、28(s)であった。この化合物は、実施例8の染料の蛍光を消光し、かつグルコースに反応性を有すると認められた。
4-N-(ベンジル-3-ボロン酸)-4’-N’-(ベンジル-4-エテニル)-ジピリジ二ウム ブロミド クロライド(m-SBBV)の合成
乾燥器で乾燥させた50mLの遠心分離管をアルゴン下で冷却し、マグネットスターラーを入れて、4-(4-ピリジル)-N-(ベンジル-4-エテニル)-ピリジニウム クロライド(0.463g、1.5mmols)を加えた。その管にアセトニトリル(6mL)を入れ、セプタムで密栓した。その結果生じたピンク/オレンジ色の懸濁液を室温で攪拌しながら、新たに作成したジメチル-(3-ブロモメチル)-ベンゼンボロナート(0.486g、2mmols)をシリンジで加えた。その懸濁液を23時間攪拌した後、反応容器を遠心分離機にかけ(3200RPMで4分間)、別のフラスコにはアセトニトリルをカニューレで入れた。残余の黄色固体をアセトン:水の混液(25mL、24:1、V/V)で微粒子化し、ボルテックス・ミキサーで激しく攪拌し、一晩放置した。アセトン溶液をカニューレで除去し、固体をジエチルエーテル(3×25mL)で微粒子化し、微粒子が生じる毎にそれをカニューレで取り除いた。その後、遠心分離管内に残った鮮黄色の固体を減圧下(0.015トール、3時間)で乾燥させた。収率は0.584g、1.12mmols(74%)であった。融点(分解点)は150℃より高温であった。1H-NMR(D2O、ppm)測定の結果は、5.5165(d、1H、J=10.75Hz)、6.0435ppm(d、1H、J=17.8Hz)、6.095(s、2H)、6.049(s、2H)、6.9433(dd、1H、J1=11.5Hz、J2=17.9Hz)、7.626(m、4H)、7.724(m、2H)、7.979(s、1H)、7.994(d、1H、J=7.5Hz)、8.648(d、4H)、9.280(d、4H)であり、11B-NMR(CH3OH、ppm)測定の結果は、28(s)であった。この化合物は、実施例10、11、12及び14のポリマー作成の際に用いた。
8-アセトキシピレン-1,3,6-N,N’,N’’-トリス-(メトキシポリエトキシエチル(n〜125)スルホンアミドの合成
250mLの丸底フラスコにマグネットスターラーを入れて、乾燥テトラヒドロフラン(THF)170mLを加えた。メトキシ-ポリエチレングリコール(PEG)-アミン(5.65g、5630g/mol、1mmol)を粒状CaH20.5gと合わせて、そのフラスコに入れた。その混合物を攪拌しながら、24時間加熱して30℃にした。ジイソプロピルエチルアミン(0.6mL、129.24MW、0.742g/mL、3.4mmol)をそのフラスコに加えて、その混合物をさらに1時間攪拌した。フラスコを室温まで冷却し、空気に敏感なガラス製濾過装置で濾過して、過剰なCaH2及びCa(OH)2を除去した。そのTHF溶液をマグネティックスターラーと共に250mL丸底フラスコに戻して、攪拌しながら30℃まで加熱した。この温THF溶液に8-アセトキシ-ピレン-1,3,6-トリスルホニル クロライド(0.185g、624.8g/mol、0.3mmol)を添加したところ、その溶液は直ぐに藍色に変わり、15分間以上経過すると、その色は赤ワイン色まで薄くなった。この反応溶液を30℃で24時間攪拌した。ロータリー・エバポレータで溶媒を取り除き、1MHCl100mL中で残留物を溶解させた。その水溶液をメチレンクロライドで抽出した(3×100mL)。メチレンクロライドの各分画を混合して、エバポレータで減圧して溶媒を除去すると、赤色固体である化合物が得られた。収率は約5.5g(〜97%)であった。FTIR(KBrペレット、cm-1)測定の結果は、842、963、1060、1114、1150、1242、1280、1343、1360、1468、1732、2525、2665、2891.1であった。この生成物は、実施例8及び11、16及び17で使用した。
8-ヒドロキシピレン-1,3,6-N,N’,N’’-トリス-メトキシポリエトキシエチル(n〜125)スルホンアミド
8-アセトキシピレン-1,3,6-N,N’,N’’-トリス-(メトキシポリエトキシエチル(n〜125)スルホンアミド(5.5g、0.32mmols)を1MのNaOH100mLに溶かし、2時間攪拌した。水溶液を中和してpH7にし、メチレンクロライドで抽出した(3×100mL)。メチレンクロライドの各分画を混合して、ロータリー・エバポレータで約10mLになるまで濃縮した。その後、三角フラスコにジエチルエーテル400mLを入れて激しく攪拌しながら、そこに濃縮したメチレンクロライド溶液を滴下した。ブフナー漏斗でそのジエチルエーテルを濾過した。オレンジ色粉末である生成物を分離した。収率は5.425g、0.31mmol(94%)であった。フーリエ変換赤外分光(FTIR)(KBrペレット、cm-1)測定の結果は、842、963、1060、1110、1150、1242、1281、1343、1360、1468、2888であった。このFTIRから、この化合物が三置換体のスルホンアミド誘導体であると同定した。スルホン酸のIRピークは1195.7cm-1で生じるが、この化合物のFTIRピークは1195.7cm-1では生じない。その代わり、スルホンアミドを表す1110cm-1のピークが認められる。pH7.4の緩衝液中に溶かすと、この化合物の蛍光は、みかけのスタン・ボルマー消光定数が319M-1であるメチルビオロゲンにより消光される。この化合物は実施例1、2及び3の生成物に消光されるものだが、実施例11、16、17、18及び19ではこれを用いた。
8-アセトキシピレン-1,3,6-N,N’,N’’-トリス(メタクリルアミドプロピルスルホンアミド)(アセトキシ-HPTS-MA)
100mLの丸底フラスコにアミノプロピル-3-メタクリルアミド-HCl塩(2.68g、15mmol)及びアセト二トリル50mLを入れると、白色の懸濁液が生じた。その白色懸濁液の色が全て消え2層に分かれるまで、攪拌しながら水を滴下した。炭酸カリウムを添加し、その懸濁液を15分間攪拌した。上清を500mL丸底フラスコに移し、炭酸カリウムの洗浄に用いたアセト二トリル50mLを、500mLの丸底フラスコ内で混合した。アルゴン下で、遊離アミン含有アセトニトリルの入った500mLの丸底フラスコに、アセトキシ-HPTS-Cl(1.03g、1.8mmol)、アセトニトリル200mL、及びジクロロメタン20mLの黄色溶液を添加すると、その溶液は沈殿を形成して濃紅色に変わった。その溶液を1時間攪拌して、上清を移し減圧下で濃縮すると、黒っぽい残留物が生じた。その残留物を水(1000mL)及び50:50アセトニトリル/エチルアセテート溶液(700mL)で抽出した。その有機抽出物をさらに1000mLの水で洗浄した。その有機抽出物を硫酸マグネシウムで乾燥させ、ロータリー・エバポレータで濃縮して得られた赤色の残留物をメタノールに溶かした。そのメタノール溶液を濃縮し、その結果生じた赤色の残留物を高真空下で乾燥させると、赤色の固体が生じたが、それは保護基を有さないHPTS-MAであった。収率は420mg、0.5mmol(28%)であった。1H-NMR(500MHz、D4-メタノール、ppm)測定の結果は、1.617(p、J=6.5Hz、8H)、1.781(s、3H)、1.767(s、6H)、2.934(p、J=6.5Hz、9H)、3.158(mult、8H)、5.211(t、J=1.5Hz)、5.229(t、J=1.5Hz)、5.488(s、1H)、5.510(s、2H)、8.290(s、1H)、8.837(d、J=9.5Hz、1H)、8.913(d、J=9.5Hz、1H)、8.988(d、J=1.5Hz、1H)、9.201(d、J=9.5Hz、111)、9.222(s、1H)であった。その後、保護基を有さないHPTS-MA(100mg、0.1mmol)を無水酢酸10mLに懸濁させて、触媒量の酢酸ナトリウムを添加し、その懸濁液を2時間還流した。減圧下で無水酢酸及び酢酸を除去し、その結果生じた茶色の残留物をアセトニトリル20mLで抽出した。その抽出物を150mLのジエチルエーテルに滴下すると、茶色固体の沈殿物が生じた。収率は、75mg、0.09mmol(86%)であった。このモノマーは、実施例13、14及び15で使用した。
水溶性ポリマー中における4-N-(ベンジル-3-ボロン酸)-4’-N’-(ベンジル-4-エテニル)-ジピリジニウム ブロミド クロライドの共重合
50mLの円錐形丸底フラスコに、2-ヒドロキシエチルメタクリレート(1.5g、11.5mmol)、4-N-(ベンジル-3-ボロン酸)-4’-N’-(ベンジル-4-エテニル)-ジピリジニウム ブロミド クロライド(0.1g、0.191mmols)、及び3-((メタクリロイルアミノ)プロピル))トリメチルアンモニウム クロライド(0.5g、2.27mmols)を入れた。そのフラスコをセプタムで密栓した後に、溶液をボルテックス・ミキサーで激しく攪拌した。その後、その容器にイソプロピルアルコール:水の混液(8mL、1:1、V/V)を入れ、1時間アルゴンで脱酸素した。平行して、別の100mL枝付丸底フラスコ内で、2.2’-アゾビスイソブチロ二トリル(AIBN、100mg、0.609mmols)のイソプロピルアルコール:水(5mL)の混合溶液を作成した。そのフラスコにマグネットスターラーを入れて濃縮器を備えつけ、1時間アルゴンで脱酸素した。その測定溶液の全てをシリンジで採り、1mLを枝からAIBN溶液に添加した。その後、そのAIBNの反応容器を70℃の油浴に入れ、6時間以上(1.5mL/hr)かけて残りの測定混合物をシリンジポンプで添加した。その結果生じたオレンジ色溶液をアルゴン下で室温まで冷却し、減圧下で溶媒を慎重に除去した。その無定形固体をCH3OH(20mL)に溶かし、適量をカニューレで遠心分離管に移した。ジエチルエーテル(20mL)を添加して白色の沈殿物が形成した後、その生成物を遠心分離(3200RPMで4分間)で分離した。それをジエチルエーテル(30mL)で洗浄し、減圧下(0.5トール、3時間)で乾燥させ、アルゴンの不活性雰囲気下で分離した。収率は1.345g(67Wt%)であった。UV吸光度を用いて、ポリマーに取りこまれたビオロゲン部分の量を求めたところ、予測値の99%以上であった。この生成物は、実施例19で使用した。
半相互貫入ポリマーネットワーク:
HPTS-PEGを用いた4-N-(ベンジル-3-ボロン酸)-4’-N-(ベンジル-4-エテニル)-ジピリジニウム ブロミド クロライドの共重合体薄膜
10mLの容量フラスコに、2-ヒドロキシエチルメタクリレート(3.525g、27.08mmols)、4-N-(ベンジル-3-ボロン酸)-4’-N’-(ベンジル-4-エテニル)-ジピリジニウム ブロミド クロライド(0.039g、0.075mmols)、3-((メタクリロイルアミノ)プロピル)トリエチルアンモニウム クロライド(0.3g、1.36mmols)、ポリエチレングリコール ジメタクリレート(1.11g、1.11mmols)、2,2’-アゾビス(2-(2-イミダゾリン-2-イル)プロパン)ジヒドロクロライド(0.025g、0.077mmols)、及び8-ヒドロキシピレン-1,3,6-N-N’,N’’-トリス(メトキシポリエトキシエチル(n〜125)スルホンアミド)(0.013g、7.5×10-4mmols)を入れ、それにイソプロピルアルコール:水の混液(1:1、V/V)を10mL線まで加えた。その溶液をボルテックス・ミキサーで激しく攪拌した後に、ピペットで50mLの円錐形丸底フラスコに移して、1時間アルゴンで脱酸素した。そのモノマー溶液をシリンジで採り、そのシリンジを重合槽に設置した。その後、アルゴン下でその溶液をセルに注入し、全てのセル穴を満たした。その槽にテフロン栓で封をし、ZIPLOC(登録商標)冷凍用バッグ2枚で包装した。そのバッグ全体を40℃の水槽に沈め、17時間加熱した。その重合槽を水槽及びバッグから取り出し、次に分解して緑色のポリマー薄膜を得た。そのポリマー膜を濾過して、pH7.4のリン酸緩衝液中で保存した。この生成物は、実施例12で使用した。
HPTS-PEGを用いた4-N-(ベンジル-3-ボロン酸)-4’-N’-(ベンジル-4-エテニル)-ジピリジニウム ブロミド クロライド(m-SBBV)を含む半相互貫入ポリマーネットワーク共重合体の蛍光分光分析
光路長10mmの5mLガラスキュベットの開口した両端に、使い捨てポリエチレン製キュベットキャップ2個で栓をした。10/32標準糸、1/8インチ円径ホース端アダプターの細糸をはめ込めるように、そのキャップに穴を開けた。その後、プラスティックの薄板を35×9mmの長方形となるように切り、その中央部から6×15mmの窓を切り取った。小さなセプタムから結合部2つをつくり、キュベット内でポリマーを保持できるように、それを用いてプラスティック製マスクに圧力をかけた。セプタムの高さは9mmとした。その後、そのポリマー膜をキュベットとその真上のプラスティック製マスクの中央部に置き、実質的にポリマー膜が窓に囲まれるようにして、フローセルを設置した。その後、ピンセットを用いて圧力結合部を1つはセルの底部に、そしてもう1つは上部に設置した。キュベットの内側にあるキュベットキャップの外壁に真空グリースを塗り、それをキュベットに挿入してセルに栓をした。そのセルを、前面部にアダプターを有するパーキンエルマー社製分光光度計LS50Bに入れた。ポリマーと接触しているセルの側面部が光度計の励起ビームに面するように、そのセルの方向を合わせた(face-first in the front surface adapter)。1/8インチTYGON(登録商標)PTFEチュービングをフローセルのホースアダプターに接続した。前面のアダプターを最適な向きにして、発光検出器がポリマーの表面のみを検出するようにした。ぺリスタリックポンプを使用して、pH7.4(イオン強度0.1)のリン酸緩衝液を、1分間に30mLの速さでセルに循環させた。パーキンエルマー社製LS50Bソフトウエアの時間駆動機能を用いて、2秒の積分時間に対して10秒毎の読み取り値として蛍光強度を得た。励起周波数は475nmのところに設定し、発光スリット幅は536nmに設定した。この励起と発光のスリット幅は、2.5mnに設定した。緩衝溶液を用いてベースライン値である358(蛍光強度)を設定した。ぺリスタリックポンプを止め、ポンピング溶液をグルコース1800mg/dlのpH7.4リン酸緩衝液に変えた。
8-ヒドロキシピレン-1,3,6-N,N’,N’’-トリス(メタクリルアミドプロピルスルホンアミド) ヒドロゲルポリマー
14/20粉末ガラス製の雌結合部を有する16mmのNMR試料管に、イソプロピルアルコール/水の混液(1:1、1.5mL)、HEMA(750mg)、ポリエチレングリコールジメタクリレート(PEGDMA、n〜25)(200mg)、3-(メタクリルアミド)プロピルトリメチルアンモニウム クロライド(TMAC)(50mg)、8-アセトキシピレン-1,3,6-N-N’-N’’-トリス(メタクリルアミドプロピルスルホンアミド)(アセトキシ-HPTS-MA)(1mg、1.2×10-6mols)、及び(2,2’-アゾビス-2(イミダゾリン-2-イル)プロパン)ヒドロクロライド(VA-044フリーラジカル開始剤)(5mg)の混合物を入れた。固体のものは全て、ボルテックスミキサーを用いて溶かした。その後、14/20粉末ガラス製の雄結合部であるTEFLON(登録商標)止水栓を用いて、そのNMR試料管を真空アダプターに取りつけた。その後、その混合物を冷凍/ポンプ/解凍サイクル4回(-78℃、1トール、5分間)で脱酸素し、窒素下で解凍した。その後、そのNMR試料管を40℃の水槽で加熱した(±0.5℃、12時間)。ガラス製NMR試料管を慎重に砕いてポリマー栓を取出した。そのポリマーを、トリエチルアミン(5滴)を含む(7日間、純粋とアミンの溶液は24時間ごとに替えた)200mLの純水中で透析し、アセトキシ-HPTS-MAのアセトキシ保護基を取り除いた。その結果生じたポリマープラグを1枚約5mmで薄切りにし、蛍光分光法を用いて分析した。
相互貫入ポリマーネットワーク:
HPTS-MAポリマーを用いた4-N-(ベンジル-3-ボロン酸)-4’-N’-(ベンジル-4-エテニル)-ジピリジニウム ブロミド クロライド(m-SBBV)の共重合
測定用消光剤溶液(Manometric quenched solution):10mLの容量フラスコに2-ヒドロキシエチルメタクリレート(27.08mmols、3.525g)、4-N-(ベンジル-3-ボロン酸)-4’-N’-(ベンジル-4-エテニル)-ジピリジニウム・ブロミド・クロライド(0.197mmols、0.103g)、3-((メタクリロイルアミノ)プロピル)トリメチルアンモニウムクロライド(1.36mmols、0.30g)、ポリエチレングリコールジメタクリレート(1.11mmols、1.11g)、及び2-2’-アゾビス(2-(2-イミダゾリン-2-イル)プロパン)ジヒドロクロライド(0.077mmols、0.025g)を入れ、イソプロピルアルコール:水の混液(1:1、V/V)を10mL線まで加えた。その溶液を均質になるまでボルテックス・ミキサーで激しく攪拌した。
ニ成分システム:
HPTS−MAを用いた4-N(ベンジル-3-ボロン酸)-4’-N-(ベンジル-4-エテニル)-ジピリジニウム・ブロミド・クロライド(m-SBBV)の共重合体薄膜
10mLの容量フラスコに、2-ヒドロキシエチルメタクリレート(3.525g、27.08mmols)、4-N-(ベンジル-3-ボロン酸)-4’-N’-(ベンジル-4-エテニル)-ジピリジニウム ブロミド クロライド(0.039g、0.075mmols)、3-((メタクリロイルアミノ)プロピル)トリメチルアンモニウムクロライド(0.3g、1.36mmols)、ポリエチレングリコールジメタクリレート(1.11g、1.11mmols)、2-2’-アゾビス(2-(2-イミダゾリン-2-イル)プロパン)ジヒドロクロライド(0.025g、0.077mmols)及び8-アセトキシピレン-1,3,6-N-N’-N’’-トリス(メタクリルアミドプロピルスルホンアミド)(6.6×10-4g 、7.5×10-4nmols)を入れ、イソプロピルアルコール:水の混液(1:1、V/V)を10mL線まで加えた。その溶液をボルテックス・ミキサーで激しく攪拌した後、ピペットで50mL円錐形丸底フラスコに移し、そのフラスコをゴム製のセプタムで密栓した。アルゴンでそれを30分間脱酸素した。測定溶液をシリンジで吸い上げ、その針にゴム栓をかぶせた。その後、それを重合槽(実施例11参照)と共にアルゴンを充填したグラブ・ボックスに移した。シリンジを重合槽に取りつけて、アルゴン下で溶液をセルに注ぎ、全てのセル穴を満たした。その槽をTEFLON(登録商標)栓で塞ぎ、ZIPLOC(登録商標)冷凍用バッグに包んだ。そのバッグ全体を40℃の水槽に入れ、12時間加熱した。その重合槽を水槽及びバッグから取り出し、続いて分解して薄い緑色の重合膜を得た。そのポリマー膜をpH8のNaOH溶液中に12時間浸し、その後濾過してpH7.4のリン酸緩衝液中で保存した。この生成物は、実施例21で使用した。
8-ヒドロキシピレン-1,3,6-N,N’,N’’-トリス(メトキシポリエトキシエチル(N〜125)スルホンアミド) HPTS-PEGを用いた4,4’-N,N’-ビス(ベンジル-2/3/4-ボロン酸)-ビピリジニウム ブロミド クロライドの蛍光分光分析
10mLの容量フラスコに、pH7.4のリン酸緩衝液(0.1イオン強度)を用いてHPTS-PEGの保存溶液(10mL、5×10-5M)を作成した。同様に、m-BBV溶液(25mL、0.0025M)を作成した。その後、pH7.4のリン酸緩衝液中にHPTS-PEG及びm-BBVを含む7種の異なる溶液を、下記の表2に示すように作成した。
蛍光分光法の分析による8-ヒドロキシピレン-1,3,6-N,N’,N’’-トリス(メトキシポリエトキシエチル(N〜125)スルホンアミド)(HPTS-PEG)を用いた場合の4,4’-N,N’-ビス(ベンジル-2/3/4-ボロン酸)-ビピリジニウム ジブロミドのグルコース感光能
(a) 10mLの容量フラスコに、pH7.4のリン酸緩衝液(0.1イオン強度)でHPTS-PEGの保存溶液(10mL、5×10-5M)を作成した。同様に、m-BBV溶液(25mL、0.0025M)及びα-D-グルコース溶液(10mL、0.250M)を作成した。その後、下記の表3に示すようなHPTS-PEG、m-BBV及びα-D-グルコースをpH7.4リン酸緩衝液に含む、異なる7種の溶液を作成した。
HPTS-PEGを用いたベンジルビオロゲンと4,4’-N,N’-ビス(ベンジル-3-ボロン酸)-ビピリジニウム ジブロミドのグルコース感度の比較
HPTS-PEG染料の存在下で、ベンジルビオロゲンのグルコース感度を4,4’-N,N’-ビス(ベンジル-3-ボロン酸)-ビピリジニウム ジブロミドのグルコース感度と比較した。方法Aに記載のように、HPTS-PEGを用いた場合のベンジルビオロゲンのみかけのスタン・ボルマー消光定数を測定したところ、559M-1であった。HPTS-PEGの存在下におけるベンジルビオロゲンのグルコース感度を、実施例17に記載の方法で測定した。ベンジルビオロゲン/HPTS-PEG溶液からの信号は、グルコース濃度の変化に反応を示さなかった。実施例17と同様に、4,4’-N,N’-ビス(ベンジル-3-ボロン酸)-ビピリジニウム ジブロミドのグルコース感度とベンジルビオロゲンのグルコース感度を共に図5に示す。
4-N-(ベンジル-3-ボロン酸)-4’-N’-(ベンジル-4エテニル)-ジピリジニウム ブロミド クロライド(m-SBBV)の水溶性コポリマーの蛍光分光分析
実施例10のm-SBBV(50mL、2.5mM)のコポリマーをpH7.4リン酸緩衝液中で作成し、NaOH溶液でpHの調整(±0.02pH)を行った。その後、HPTS-PEG(染料、1×10-5)を含む異なる6種のポリm-SBBV(検体、0、0.10、0.15、0.25、0.50、0.75、1.0mM)溶液を作成し、分光計で分析を行った。その検体/染料の溶液を標準光路長10mmの石英キュベットに入れ、励起周波数及び発光周波数をそれぞれ473と533となるようにその分光計を設定した。励起スリット幅及び発光スリット幅は、0nmに設定した。上記溶液の蛍光スペクトルを得た後、グルコース及びフルクトースの存在下と非存在下において、さらに検体/染料のスペクトルを得た。スペクトルの相違が曲線下の面積として明らかに現れた。その後、面積の相違をグルコース又はフルクトースに対するポリマー反応の相当値とした。例えば、グルコース又はフルクトースの不存在下における曲線の下領域の相当値は、26479.45であった。異なる濃度のグルコースを添加するに従い、表4に示すように領域は変化した。
IPNの蛍光分光分析:
分散HPTS-MAヒドロゲルを用いた4-N-(ベンジル-3-ボロン酸)-4’-N’-(ベンジル-4-エテニル)-ジピリジニウム・ブロミド クロライド(m-SBBV)のコポリマーの蛍光分光分析
手順は実施例12を参照。ぺリスタリックポンプを使用して、pH7.4(イオン強度0.1)のリン酸緩衝液を、1分間に30mLの速さでセルに循環させた。
二成分システムの蛍光分光分析:
アセトキシ-HPTS-MAを用いた4-N-(ベンジル-3-ボロン酸)-4’-N’-(ベンジル-4-エテニル)-ジピリジニウム・ブロミド・クロライド(m-SBBV)の薄膜コポリマーヒドロゲルの蛍光分光分析
分析手順は、実施例12を参照。ぺリスタリックポンプを使用して、pH7.4(イオン強度0.1)のリン酸緩衝液を、1分間に30mLの速さでセルに循環させた。パーキンエルマー社製LS50Bソフトウエアの時間駆動機能を用いて、2秒の積分時間に対して10秒毎の読み取り値として蛍光強度を得た。励起周波数は475nmのところに設定し、発光スリット幅は536nmに設定した。この励起と発光のスリット幅は、7mnに設定した。緩衝溶液を用いてベースライン値である490(蛍光強度)を設定した。ぺリスタリックポンプを止め、ポンピング溶液をグルコース400mg/dlの pH7.4リン酸緩衝液に入れた。
4,4’-N,N’-ビス(ベンジル-3-ボロン酸)-ビピリジニウム・ジブロミド(m-BBV)及び8-ヒドロキシピレン-1,3,6-N,N’,N’’-トリス-(メトキシポリエトキシエチル(N〜125)スルホンアミド)(HPTS-PEG)を用いた水性試料中のグルコース濃度の蛍光分光計測
10mLの容量フラスコに、pH7.4のリン酸緩衝液(0.1イオン強度)でHPTS-PEGの保存溶液(10mL、5×10-5M)を作成した。同様に、m-BBV溶液(25mL、0.0025M)及びα-D-グルコース(10mL、0.250M)溶液を作成した。その後、下記の表5に示すように、HPTS-PEG、m-BBV及びα-D-グルコースを含む異なる7種の溶液をpH7.4リン酸緩衝液中で作成した。
HPTS-PEGを用いた4-N-(ベンジル-3-ボロン酸)-4’-N’-(ベンジル-4-エテニル)ジピリジニウム ブロミド クロライドの薄膜コポリマー(半-IPN薄膜)の水溶性試料中におけるグルコース濃度の蛍光分光測定
実施例11に記載したように薄膜コポリマーを作成し、実施例12に記載したようにそれを蛍光分光器にのせた。その後、pH7.4リン酸緩衝液で、7種のα-グルコース保存溶液(0、18、36、180、360、900、及び1800mL/dL)100mLを作成した。その溶液をフローセルに順次循環させ、実施例13に記載のように蛍光発光強度を分析した。各ケースにおいて、溶液を替える前に蛍光発光強度を安定化させた。安定化した蛍光強度に対してそれに相当するグルコース濃度をプロットして校正曲線を作図した。濃度不明の水性グルコース試料のpH値をpHメーターで測定し、濃縮酸又は塩基でpH7.4±0.02に調整した。未知の試料をセルに循環させ、蛍光発光強度が安定するまでそれを測定する。濃度不明のグルコース試料をセルに循環させ、蛍光発光強度が安定する前にそれを測定した。未知のグルコース濃度は、Y軸上の校正曲線に対して安定化した蛍光発光強度に関する算出値と、それに相当するX軸上のグルコース濃度の読み取り値を比較することにより測定することができる。未知の試料に対するグルコース濃度の最終測定値を、その試料をpH調整したことにより生じた希釈係数に関して修正した。
4-N-(ベンジル-3-ボロン酸)-4,7-フェナントロリ二ウム ブロミド(4,7-Phen-m-BV)の合成
乾燥機で乾燥させた250mL丸底フラスコにマグネットスターラーを入れて、アルゴン下で冷却し、4,7-フェナントロリン(6.16g、34.2mmols)を加えた。そのフラスコをアルゴン管に接続した還流冷却器に備えつけ、N,N-ジメチルホルムアミド(80mL)を入れた。その懸濁液を加熱して溶解させ、90℃に保ったままで、新たに調整したジメチル-(3-ブロモメチル)-ベンゼンボロナート(5.562g、22.8mmols)をシリンジで添加した。その反応をTLCで調べたところ、3時間後に、ボロン酸エステルが消失したことが明らかになった。その反応混合物をアルゴン(ガス)下で室温まで冷却し、カニューレを用いてオレンジ色の懸濁液を水分に感度が高いガラス製漏斗に移した。鮭肉色の固体を回収し、アセトン(4×50mL)で洗浄して、減圧下で一晩乾燥させた。収率は3.652g、17.7mmols(78%)であった。1H-NMR(500MHz、CD3OD、ppm)測定の結果は、3.31(s、6H)、6.487(s、2H)、7.427(mult.、2H)、8.002(dd、1H、J=10Hz)、8.451(dd、1H、J1=6Hz、J2=8.5Hz)であり、13C-NMR(125MHz、CD3OD)は61.48、119.825、123.258、124.429、124.493、128.279、128.472、129.194、132.161、132.707、133.990、138.161、139.107、142.428、146.358、147.947、153.080、163.379であり、11B-NMR(80MHz、MeOH、ppm)測定の結果は、27.4(s、broad)であった。この化合物は、実施例31で用いた。
4-N-(ベンジル-3-ボロン酸)-N-7-(ベンジル-4-エテニル)-4,7-フェナントロリニウム ブロミド クロライド(4,7-Phen-m-SBBV)の合成
炎光中で乾燥させた25mLの枝付丸底フラスコにCH3CN(2mL)を入れ、それにN-ベンジル-4-エテニル-4,7-フェナントロリニウム・クロライド(0.243g、0.730mmols)を懸濁させ、そのフラスコにマグネティックスターラーを入れて還流冷却器に取り付けた。シリンジでジメチル-(3-ブロモメチル)-ベンゼンボロナート(2.8g、11.5mmols)を側部から添加し、アルゴン(ガス)下で64時間その懸濁液を加熱して還流した。その溶液を室温まで冷却し、ジエチルエーテル(10mL)で沈殿させた。その懸濁液を沈降させて、カニューレで上清を除去した。残余の残留物を溶媒3mLと共にカニューレで遠心分離管に入れ、アセトン水(50/50、V/V、20mL)で微粒子化し、遠心分離した(この工程を4回繰り返した)。ベージュ/黄色の固体をジエチルエーテル(3×20mL)で微粒子化し、減圧下で乾燥させた。収率は0.354g、0.615mmols(84%)であった。1H-NMR(250MHz、D2O、ppm)測定の結果は、5.223(d、1H、11.25Hz)、5.715(d、1H、J=17.75Hz)、6.434(d、4H)、6.605(dd、1H、J1=11.25Hz、J2=17.75Hz)、7.446(mult.、8H)、8.604(mult.、1H)、8.92(d、2H、J=3.5Hz)、9.698(d、2H、J=5.75Hz)、10.214(d、2H、J=9Hz)であり、11B-NMR(80MHz、CH3OH、ppm)は29.5(s、broad)であった。この化合物は、実施例26で用いた。
二成分システム:
4-N-(ベンジル-3-ボロン酸)-7-N’-(ベンジル-4-エテニル)-4,7-フェナントロリニウム ブロミド クロライド(4,7-PHEN-m-SBBV)とセトキシ-HPTS-MAの薄膜共重合
10mLの容量フラスコに、2-ヒドロキシエチルメタクリレート(3.525g、27.08mmols)、4,7-フェナントロリニウム-(ベンジル-3-ボロン酸)-N’-(ベンジル-4-エテニル)ブロミド クロライド(m-SBBV)(0.086g、0.15mmols)、3-((メタクリロイルアミノ)プロピル)トリメチルアンモニウムクロライド(0.3g、1.36mmols)、ポリエチレングリコールジメタクリレート(1.11g、1.11mmols)、2-2’-アゾビス(2-(2-イミダゾリン-2-イル)プロパン)ジヒドロクロライド(0.025g、0.077mmols)及び8-アセトキシピレン-1,3,6-N-N’-N’’-トリス(メタクリルアミドプロピルスルホンアミド)(6.6×10-4g 、7.5×10-4mmols)を入れ、それにイソプロピルアルコール:水の混液(1:1、V/V)を10mL線まで加えた。その溶液をボルテックス・ミキサーで激しく攪拌した後、重合槽(実施例11参照)と共にアルゴンの充填したグラブ・ボックスに移した。その重合槽にシリンジを取りつけて、その溶液をアルゴン下でセル中に入れ、全てのセル穴を満たした。その槽をLUER-LOC(登録商標)栓で塞ぎ、ZIPLOC(登録商標)冷凍用バッグ2枚に包んだ。そのバッグ全体を40℃のオーブンに入れ、18時間加熱した。その重合槽をオーブンから取り出し、室温まで放熱させた。それを分解して、オレンジ色膜をpH8のNaOH溶液中に7時間浸し、効果的にそれを緑色に変えた。その緑色膜をpH7.4のリン酸緩衝液中で14時間保存した。このポリマーの性質は、実施例32で示す。
8-アセトキシ-1,3,6-ピレン-トリスカルボキシプロピル-スルホンアミド(HPTS-CO2)ジナトリウム塩の調整
100mLの丸底フラスコにマグネットスターラーを入れてゴム製セプタムで密栓し、それに1-アセトキシ-3,6,8-ピレントリスルホニルクロライド(0.5mmols、272.91mg)及びTHF40mLを入れた。ナトリウム-4-アミノ-ブチレート(1mmol、125.10mg)をTHF2mL及び純水0.26mLと共に小試験管に入れた。その懸濁液をボルテックスで短時間攪拌し、3mLのプラスティック製シリンジで吸い取った。N-(3-アミノプロピル)メタクリルアミドHClをTHF5mL及び1Mの水性NaOH0.55mLと共に小試験管に入れた。その懸濁液をボルテックスで短時間攪拌し、10mLのプラスティック製シリンジで吸い取った。100mL丸底フラスコに入ったその溶液に、ナトリウム4-アミノ-ブチレート懸濁液を滴下して、鮮赤色の溶液を作成した後に、それを素早く攪拌して純水5.2mLを加えると、10分間の攪拌後には色が消失して黄色となった。その後、そのフラスコにN-(3-アミノプロピル)メタクリルアミドHCl懸濁液を再度滴下して赤色溶液を作成すると、それは色が消失して黄色となった。その溶液を4時間攪拌した。その後、ロータリー・エバポレーションと、その後に高真空で溶媒を除去した。フラスコに残存する固体を少量のメタノール中に入れ、ジエチルエーテルで沈殿させた。その沈殿を遠心分離により回収すると、その沈殿物は繰り返し最終生成物を生成した。1H-NMR(500MHz、CD3ODppm)測定の結果は、1.601(M、J=8Hz)、1.829(Q、J=5Hz)、2.392(T、J=2.5Hz)、2.584(S)、2.890(T、J=7.5Hz)、2.933(T、MHz)、5.519(1、J=176.5Hz)、8.306(S)、8.526(S)、8.616(1、J=9.5Hz)、9.062(13、J=9.5Hz)、9.130(13、J=9.5Hz)、9.225(1、J=10Hz)、9.305(S)、9.317(S)、9.338(S)、9.358(S)、9.440(S)であった。これらは特定の異性体の混合体であった。この生成物は、実施例37で用いた。
8-アセトキシ-1,3,6-ピレントリカルボキシプロピルスルホンアミド(アセトキシ-HPTS-CO2)の調整
丸底フラスコに4-アミノ酪酸(5.156g、50mmols)を入れた。水酸化ナトリウム(2g、50mmols)を添加し、その後メタノール(50mL)を添加した。その溶液を均質化するまで攪拌し、均質化したところでロータリー・エバポレーターでメタノールを除去した。アセトニトリルを加えて同時蒸着により黄褐色の固体をさらに乾燥させ、水を除去した。
乾燥機で乾燥させた丸底フラスコをアルゴン下で冷却し、マグネットスターラーを入れて、8-アセトキシ-1,3,6-ピレントリスルホニルクロライド(460mg、 0.83mmols)を加え、セプタムで密栓した。DMSO(20mL)を添加し、均質化した黄色の溶液を作成した。乾燥機で乾燥させた第2の丸底フラスコをアルゴン下で冷却し、マグネットスターラーを入れて、4-アミノナトリウムブチラート(415mg、3.32mmols)を入れ、セプタムで密栓した。両頭針でDMSO(20mL)を添加し、数分間攪拌した後に、8-アセトキシ-1,3,6-ピレントリスルホニルクロライドを含む第1のDMSO溶液をカニューレで滴下して、濃赤色の均質な溶液を作成した。6時間後、その溶液の約3分の1を除去し、DMSOを真空下で蒸留した。その結果生じた茶色の物質を、少量のアセトニトリルで洗浄し、それを綿で濾過してEt2O中に滴下すると、少量(48mg)の茶/赤色の吸湿性固体が沈殿した。1H-NMR(250MHz、D2O、ppm)測定の結果は、2(d、6H)、2.4(t、6H)、2.61(s、3H)、3(t、6H)、8.2(d、1H)、8.4(s、1H)、8.6(d、1H)、9.2(d、1H)、9.4(s、1H)であった。
2-(3,5-ビス-ブロモメチル-フェニル)-(1,3,2)-ジオキサボロナートの調整
ボロン酸エステルの調整:
乾燥機で乾燥させた枝付丸底フラスコを窒素下で冷却し、マグネットスターラーを入れて、ペンタンを加え、その後に3,5-ジメチルフェニルボロン酸(5g、 33mmols)を加えて、0.5Mの均質な溶液を作成した。その後、そのフラスコに乾燥機で乾燥させた還流冷却器を設置し、セプタムで密栓して、窒素でパージした。その溶液を攪拌しながら、両頭針で1,3-プロパンジオール(14.5mL)を添加し、その後、その溶液を均質化するまで加熱して還流した(約20分)。その溶液を窒素雰囲気下で室温まで冷却した。硫化マグネシウム及び塩化カルシウムを即座に添加して装置を窒素でパージし、その溶液を1時間緩やかに加熱した。その後、その溶液を窒素下で室温まで冷却し、攪拌を止めた。乾燥機で乾燥させた別の丸底フラスコに上清を移し、それを窒素下で冷却してセプタムで密栓した。残余の固体を1時間加熱した。その後、その溶液を窒素下で室温まで冷却し、攪拌を止めた。乾燥機で乾燥させた別の丸底フラスコに上清を移し、それを窒素下で冷却してセプタムで密栓した。残余の固体をペンタンで洗浄し、これを最初のペンタン層に混ぜ合わせた。アルゴンを通気しながらロータリー・エバポレーターで減圧してペンタンを除去すると、黄色の固体が生じた。融点は58〜60℃であった。
乾燥機で乾燥させた枝付丸底フラスコを窒素下で冷却し、マグネットスターラーを入れて、N-ブロモスクシニミド(13.4g、73.26mmol)及びAIBN(1.094g、6.66mmol)を入れて、還流冷却器を取りつけて、セプタムで密栓し、窒素で数分間パージした。ボロン酸エステルをクロロホルム(250mL、CaH2で蒸留)に溶かして、N-ブロモスクシニミド及びAIBNの入った丸底フラスコにカニューレで入れた。その装置は、Br弁に設置された窒素気泡管で通気して、その溶液を加熱して、攪拌しながら激しく還流した。3.5時間後、黄白色の溶液の加熱を止め、窒素下で室温まで冷却した。アルゴンを通気しながらロータリー・エバポレーターで減圧してその溶液を濃縮するとオレンジ色の溶液が生じ、アルゴン下で濾過して、その溶液からスクシニミドの副生成物を除去した。アルゴンを通気しながらロータリー・エバポレーターで濾液をさらに濃縮すると、粘性のある濃オレンジ色の液体が生じた。攪拌しながら、この粘性のある液体にペンタン(〜250mL)をゆっくりと添加すると、粗生成物が沈殿した。上清のペンタンを濾過し、アルゴン雰囲気下で中位のガラス製漏斗で固体を回収した。その固体を60ミリトールまで減圧して乾燥させた。収率は71%であり、融点は124〜125℃であった。1H-NMR(500MHz、CDCl3)測定の結果は、2.059〜2.081(quint、2H、J=5.5Hz)、4.163〜4.185(t、4H、J=5.5Hz)、4.5(s、4H)、7.479(t、1H)、7.721〜7.725(d、2H、J=2Hz)であり、13C-NMR(500MHz、CDCl3、ppm)測定の結果は、27.476、33.262、62.162、131.845、134.459、137.694であり、11B-NMR(250MHz、CDCl3、ppm)測定の結果は、25.52であった。この化合物は実施例30及び35で用いた。
3-(3-ブロモメチル-5-(1,3,2)ジオキサボリナン-2-イル-ベンジルオキシ)-プロパン-1-オールの合成
乾燥機で乾燥させた250mLの丸底フラスコにマグネットスターラーを入れて還流冷却器に設置し、アルゴン下で冷却して、NaH(60%ミネラルオイル中0.800g、20mmols)を入れた。その粉末をペンタン(3×100mL)で洗浄し、減圧して乾燥させた。アセトニトリル(50mL)をシリンジで添加し、その混合物を室温で攪拌した。1,3-プロパンジオール(10mL)を10分以上滴下したところ、白色の不溶性沈殿物を形成した。その懸濁液を1時間激しく攪拌し、その最中に20mLをシリンジで取り、2-(3,5-ビス-ブロモメチル-フェニル)-(1,3,2)ジオキサボリナン(2.865g、8.2mmols)及びアセトニトリル(50mL)を入れた250mL丸底フラスコに滴下した。その混合物を12時間室温で攪拌した。還流冷却器をバキュームアダプタに接続して、その反応混合物を加熱して、アルゴン下で2時間還流した。減圧してアセトニトリルを除去し、残留物をフラッシュ・クロマトグラフィー(EtOAc:ヘキサン、2:1)で清浄化した。溶媒の除去により、黄色油中に白色固体の懸濁液が得られ、それを薄層クロマトグラフィーで分析した場合に、出発物質は現れなかった。1,3-プロパンジオールを含む粗混合物は、さらに精製せずに用いた。この化合物は実施例31で用いた。
4-N-(ベンジル-3-(ジメチル)ボロナート)-7-N-(ベンジル-3-(1,3,2))ジオキサボリナン-2-イル〕-5-メチレノキシ-プロパノール-4,7-フェナントロリニウム ジブロミド(4,7-PHEN-m-BBVOH)の合成
実施例30で得た物質を100mLの枝付丸底フラスコに入れておき、そのフラスコにマグネットスターラーを入れて、還流冷却器を設置した。そのフラスコに4-N-(ベンジル-3-(ジメチル)ボロナート)-4,7-フェナントロリニウム ブロミド(4,7-Phen-m-BV)(0.797g、1.88mmols)、DMF(4mL)及びCH3OH(3mL)を入れた。その懸濁液を48時間100℃まで加熱して、反応中、アルゴン層下に保った。その反応混合物をアルゴン下で室温まで冷却し、連続的に攪拌した。その懸濁液を氷冷ジエチルエーテル(100mL)にカニューレで入れ、1時間以上おいて沈殿させた。その上清をカニューレで別の容器に分け、ベージュ/赤色の残留物をTHF(50mL)で微粒子化した。その混合物を40℃で120分間超音波処理により分解し、その結果生じた微粉末をジエチルエーテル(3×50mL)で洗浄した。アルゴン下その固体をガラス製漏斗で回収して、減圧下で乾燥させた(0.929g、収率49.4%)。この化合物は実施例34で用いた。
HPTS-MAを用いたニ成分システムの蛍光分光分析:
4-N-(ベンジル-3-ボロン酸)-7-N-(ベンジル-4-エテニル)-4,7-フェナントロリニウム クロライド ブロマイド(4,7-PHEN-m-SBBV)の薄膜コポリマーのヒドロゲルの蛍光分光分析
蛍光は、実施例17の手順に従い測定した。基準値の441(蛍光強度)は緩衝液で一定とした。ぺリスタリックポンプを止めて、ポンプ溶液を400mg/dlのグルコース溶液(pH7.4リン酸緩衝液)に変えた。蛍光強度は12単位増加して453となり、これは2.7%の顕著な増加に相当するものであった。溶液の交換を再び行い、溶液を400mg/dlのフルクトース溶液(pH7.4リン酸緩衝液)に変えた。その緩衝液の基準値は443であった。蛍光強度は14単位増加して457となり、これは3.2%の顕著な増加に相当する値であった。最終的に、ポンプによりpH7.4のリン酸緩衝液をシステムに通すと、基準値は446となった。これらの結果は図11に示すとおりである。
4,7-N,N-ビス(ベンジル-3-ボロン酸)-4-7-フェナントロリニウム ジブロミド(4,7-PHEN-m-BBV)の合成
乾燥機で乾燥させた100mLの丸底フラスコにマグネットスターラーを入れて還流冷却器を設置し、アルゴン下で冷却して、4,7-phen-m-BV(0.814g、1.92mmols)及び3-ブロモメチルフェニルボロン酸(1.77g、8.24mmols)を入れた。システムをアルゴンでパージし、乾燥したDMF(35mL)を加えた。その懸濁液をアルゴン層下で48時間80℃まで加熱した。その混合物をアルゴン下で室温まで冷却し、1MHClを含む氷冷ジエチルエーテル:アセトン混液(1:1、500mL)に滴下(10滴)した。沈殿物を濾過して、冷アセトンで複数回洗浄し、続いて減圧下で乾燥させた。収率は0.913g、1.50mmols(78%)であった。1H-NMR(250MHz、CD3OD、ppm)測定の結果は、6.526(s、4H)、7.668(m、4H)、7.426(m、4H)、8.660(q、2H、J=4.5Hz)、9.833(d、2H、J1=6Hz)、9.117(s、2H)、10.387(d、2H、J=9Hz)であり、11B-NMR(80MHz、CD3OD、ppm)測定の結果は、30(s、broad)であった。この化合物は実施例28の染料を消光し、グルコースに対して反応性を示した。
4-N-(ベンジル-3-(ボロン酸)-7-N-[ベンジル-3-(メチレン-(1-オキシ-3-(オキシベンジルビニル)-プロパン))-5-ボロン酸]-4,7-フェナントロリニウム ジブロミドの合成
乾燥機で乾燥させた100mLの丸底フラスコにマグネットスターラーを入れ、4,7-phen-m-BBVOH(0.491g、0.641mmols)及び4-ビニルベンジルクロライド(0.137g、0.9mmols)を入れた。新たに活性化したNaH(0.048g、2mmols)をDMF(10mL)に懸濁し、カニューレで100mLフラスコに入れた。その混合物を室温で46時間攪拌し、その後アセトン(30mL)及び1MHCl(10滴)で消光して、一晩(〜20時間)攪拌した。その懸濁液を冷ジエチルエーテル(200mL)に滴下すると、沈殿が生じた。遠心分離の後上清を除去し、その後、残留物を少量のメタノールに溶かした。アセトン:ジエチルエーテルの混液(1:1、20mL)を添加し、沈殿を4℃で一晩放置した。その懸濁液を濾過し、複数回ジエチルエーテルで洗浄して、減圧下で乾燥させた。収率は0.201g、0.247mmols(38.5%)であった。1H-NMR(500MHz、D2O、ppm)測定の結果は、1.73(d、2H)、3.581(d、2H)、3.707(d、2H)、4.7(s、4H)、5.565(d、1H)、6.090(s、1H)、6.554(m、8H)、6.980(dd、1H)、7.66(m、7H)、8.150(d、1H)、8.737(d、1H)、8.804(d、1H)、9.261(d、1H)、9.515(d、1H)、9.605(d、1H)、10.024(d、1H)であり、11B-NMR(80MHz、CD3OD、ppm)測定の結果は、30(s、broad)であった。この化合物は実施例28の染料を消光し、グルコースに対して反応性を示した。
4,4’-N,N’-ビス-[ベンジル-(3-ブロモメチル)-5-(ボロン酸)]-ジピリジニウム ジブロミド(m-BBVBBr)の調整
乾燥機で乾燥させた100mLの丸底フラスコにマグネットスターラーを入れ、アルゴン下で冷却して、4,4’-ジピリジル(0.394g、2.52mmols)及び2-(3,5-ビス-ブロモメチル-フェニル)-[1,3,2]ジオキサボリナン(2.63g、7.56mmols)を入れてセプタムで密栓した。そのフラスコをアルゴンでパージし、N,N-ジメチルホルムアミド(10mL)を加えた。その溶液を室温で72時間攪拌し、その結果生じた懸濁液をプラスティック製カニューレでアセトン:ジエチルエーテル混合溶液(1:1、300mL)に入れた。空気に対する感度が高いガラス製漏斗で沈殿を濾過して、アルゴン層下ジエチルエーテルで複数回洗浄した。減圧下で鮮黄色固体を乾燥させて、アルゴン下で分離した。収率は1.632g、1.92mmols(76%)であった。この化合物は実施例36で用いた。
4,4’-N,N’-ビス-[ベンジル-(3-メチレン-4-ビニル-ピリジニウム ブロミド)-5-(ボロン酸)]-ジピリジニウム ジブロミド(m-BBVBP)の合成
乾燥機で乾燥させた50mLの枝付丸底フラスコにマグネットスターラーを入れ、還流冷却器に設置して、アルゴン下で冷却し、m-BBVBBr(500mg、0.587mmols)を入れた。その固体を少量の無水CH3OH(6mL)に溶かして、4-ビニルピリジン(63mg、0.60mmols)を枝から加えた。その溶液を室温で15時間攪拌し、その後加熱して6時間還流した。さらに4-ビニルピリジン(63mg、0.60mmols)を添加して、その混合物を4日間還流した。濃緑色溶液をアルゴン下で室温まで冷却し、減圧してCH3OHを除去した。重油に1MのHCl(5滴)を含むアセトン:水の混液(40:1)(4×30mL)を混ぜて、10分間激しく攪拌し、上清を静かに取り除いた。メタノール:エタノールの混液(1:1、50mL)を沸騰させることでその残留物を再結晶させると、濃緑色の結晶が生じた。その固体をガラス製漏斗で回収し、氷冷エタノール(95%水)及びジエチルエーテルで洗浄した。その後減圧下で乾燥させると、黄緑色の粉末が生じた。収率は0.446g、0.506mmols(86%)であった。1H-NMR(500MHz、D2O、ppm)測定の結果は、5.87(m、2H)、6.055(m、8H)、6.400(m、2H)、7.44(d、2H)、7.899(m、6H)、8.612(d、8H)、9.225(d、8H)であり、11B-NMR(80MHz、CD3OD、ppm)測定の結果は、30ppm(s、broad)であった。この化合物は実施例37及び40で使用した。
ニ成分システム:
HPTS-CO2MAヒドロゲルを用いたm-BBVBPの重合体薄膜
10mLの容量フラスコに2-ヒドロキシエチル メタクリレート(3.525g、27.08mmols)、m-BBVBP(0.617mg、7.5×10-4mmols)、ポリエチレングリコール ジメタクリレート(1.11g、1.11mmols)、2,2’-アゾビス[2-(2-イミダゾリン-2イル)プロパン]ジヒドロクロライド(0.025g、0.077mmols)及びHPTS-CO2MA(1.26mg、1.5×10-3mmols)を入れ、それにメタノール:水の混液(1:1、V/V)を10mLまで加えた。その溶液をボルテックス・ミキサーで激しく攪拌した後に50mL丸底フラスコに移して、そのフラスコをゴム製セプタムで密栓した。それをアルゴンで20分間脱酸素した。測定溶液をシリンジで採り、その針にゴム栓をかぶせた。その後、それを実施例16に記載の重合槽と共にアルゴンを充填したグローブ・ボックスに移した。緑色膜は、実施例38で使用するまで、pH7.4のリン酸緩衝液中で保存した。
二成分システムの蛍光分光分析:
HPTS-CO2-MAを用いた4,4’-N,N’-ビス-(ベンジル-(3-(メチレン-4-ビニルピリジニウムブロミド)-5-(ボロン酸)))ジピリジニウム ジブロミド共重合ヒドロゲル薄膜の蛍光分光分析
実施例12に従い、蛍光を測定した。パーキンエルマー社製LS50Bソフトウエアの時間駆動機能を用いて、2秒の積分時間に対して10秒毎の読み取り値として蛍光強度を得た。励起周波数は463nmのところに設定し、発光スリット幅は518nmに設定した。励起スリット幅は15nmで設定し、発光スリット幅は4.3nmで設定した。緩衝溶液を用いてベースライン値である451(蛍光強度)を設定した。ぺリスタリックポンプを止め、ポンピング溶液をグルコース360mg/dlのpH7.4リン酸緩衝液に入れた。蛍光強度は、1.6%の顕著な信号増加に相当する29単位増加して、458となった。緩衝液の入れ替えを繰り返し行うと、その信号は予想通りベースライン値の451となった。
一成分ビオロゲンセンサーHPTS-BV
(a) 乾燥機で乾燥させた丸底フラスコをアルゴン下で冷却し、マグネットスターラーを入れて、4-クロロメチルベンゾイルクロライド(1.89g、10mmols)を加え、ゴム製セプタムで密栓した。ジクロロメタン(25mL)を添加して、その溶液を攪拌し、氷水槽で冷却した。1,3-プロパンジアミン(0.89g、12mmol)を滴下したところ、即座に白色沈殿が生じた。アルゴン下で中位のガラス製漏斗を用いてその白色固体を回収して、冷ジクロロメタンで洗浄した。その白色固体をバキューム(100mトール、3時間)で乾燥させると、2.61g(収率99%)の4-クロロメチルベンゾイル-(1-アミドプロピル-3-アンモニウムクロライド)が得られた。1H-NMR(500MHz、D2O、ppm)測定の結果は、1.7〜1.8(m)、2.5、2.8(t)、3.3(q)、4.8(s)、7.5(d)、7.8(d)、8.6(t)であった。
励起波長 463nm
発光波長範囲 450〜650nm
励起スリット幅 15nm
発光スリット幅 15nm
発光フィルター 1% T attenuator
スキャン速度 100nm/sec
ニ成分システム:
HPTS-MAを用いたm-BBVBPの共重合薄膜
10mLの容量フラスコに、2-ヒドロキシエチルメタクリレート(3.525g、27.08mmols)、m-BBVBP(12.3mg、0.015mmols)、ポリエチレングリコール・ジメタクリレート(1.11g、1.11mmols)、2,2’-アゾビス(2-(2-イミダゾリン-2-イル)プロパン)ジヒドロクロライド(0.025g、0.077mmols)、及びHPTS-MA(1.32mg、1.5×10-3mmols)を入れた。それにメタノール:水の混液(1:1、V/V)を加えて10mLにした。その溶液をボルテックス・ミキサーで激しく攪拌した後に、50mLの丸底フラスコに移して、そのフラスコをゴム製のセプタムで密栓した。それを20分間アルゴンで脱酸素した。測定用の溶液をシリンジで採り、針にゴム栓をかぶせた。その後、重合槽に設置されているアルゴンの充満したグローブボックスにそれを移した。(実施例を11参照。)シリンジを重合槽に取り付け、アルゴン下で全てのセル穴がいっぱいとなるようにその溶液をセルに注入した。その槽にLUER-LOCK(登録商標)栓で封をし、2つのZIPLOC(登録商標)冷凍用バッグで包装した。全てのバッグを40℃のオーブンに入れ、10時間加熱した。重合槽をオーブンから取り出し、室温になるまで放置した。それを取出して、膜をpH8のNaOH溶液中に4時間浸した。この膜はpH7.4のリン酸緩衝液中に保存して、実施例41で分析を行った。
二成分システムの蛍光分光分析:
HPTS-MAを用いた4,4’-N,N’-ビス-[ベンジル-(3-メチレン-4-ビニルピリジニウムブロミド)-5-(ボロン酸)]-ジピリジニウム ジブロミド(m-BBVBP)のコポリマーヒドロゲル薄膜の蛍光分光分析
分析は、実施例12と同様の手順で行った。ぺリスタリックポンプを用いて、1分間に30mLの速さでセルにpH7.4のリン酸緩衝液(イオン強度0.1)を循環させた。パーキンエルマー社製LS50Bソフトウエアの時間駆動機能を用いて蛍光強度を得た。試料をパルス機能(2秒毎)を用いて照射し、2秒の積分時間に対する10秒毎の読み取り値を得た。励起周波数は475nmのところに設定し、発光周波数は525nmに設定した。励起スリット幅を15nmに設定し、発光スリット幅を4mnに設定した。緩衝溶液を用いてベースライン値である464(蛍光強度)を設定した。ぺリスタリックポンプを止め、ポンピング溶液をグルコース360mg/dlのpH7.4リン酸緩衝液に入れた。蛍光強度は、6.3%の信号増加に相当する29単位増加して、493となった。緩衝液の入れ替えを繰り返し行うと、その信号は、予想通り緩衝液によるベースライン値の464となった。溶液をグルコース100mg/dlのpH7.4リン酸緩衝液に替えると、蛍光強度は4.3%の信号増加に相当する20単位増加して、484となった。最後に、ポンプでシステムに緩衝液を通すと、予想通りベースライン値は464に下がった。この結果は、図14に示す通りである。
Claims (2)
- 下記一般式
の構造を有する化合物から選択されることを特徴とし、式中、(V)2+がジピリジル、ジピリジル エチレン、ジピリジル フェニレン、フェナントロリン又はジアザフルオレンの異性体から選択された窒素含有の複素環式芳香族基であって、窒素原子2つはそれぞれ異なる芳香環に存在し、環の全ての位置において窒素原子は4級の塩を形成することができ、
かつ
Z 2が-CH2-C6H4-CH=CH2 である重合可能なエチレン性不飽和基である、消光剤前駆体組成物。 - 下記一般式の化合物
から選択されたことを特徴とし、式中、Xが臭素又は塩素である、消光剤前駆体組成物。
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