JP5172894B2

JP5172894B2 - 抗ｃ型肝炎組成物、ｃ型肝炎ウイルスを抑制またはｃ型肝炎を治療する薬剤の調製方法、およびリモノイド化合物の使用

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Publication number: JP5172894B2
Application number: JP2010105429A
Authority: JP
Inventors: 連滋李; 秀鳳張; ▲ケイ▼冰蔡; 宗鏗郭; 振方鍾
Original assignee: Industrial Technology Research Institute ITRI
Current assignee: Industrial Technology Research Institute ITRI
Priority date: 2009-06-16
Filing date: 2010-04-30
Publication date: 2013-03-27
Anticipated expiration: 2030-04-30
Also published as: EP2263676A1; JP2011001345A; TW201100077A; ATE522219T1; TWI351280B; EP2263676B1

Description

本発明は、抗Ｃ型肝炎組成物に関し、特に、Ｃ型肝炎ウイルスを抑制またはＣ型肝炎を治療するのに用いることができるリモノイド化合物を含む組成物に関するものである。

全世界の人口の約２〜３％（約３億人）がＣ型肝炎に感染しており、毎年３００〜４００万の患者が増加する速度で蔓延している。現在のところ、実証かつ承認されている唯一の抗Ｃ型肝炎ウイルス薬剤は、α−インターフェロンであり、また、リバビリンは、α−インターフェロンの抗Ｃ型肝炎ウイルス効果を高めることが実証かつ承認されている。しかしながら、両者はいずれも重大な副作用を引き起こし、かつ薬剤耐性を形成させることが多い。

リモノイド化合物の基本構造は、３つの六員環に１つの五員環を加え、さらに単結合でフラン環を連結させて構成されている。リモノイド化合物は、主にミカン科（Ｒｕｔａｃｅａｅ）およびセンダン科（Ｍｅｌｉａｃｅａｅ）の植物中に存在する。リモノイド化合物のうち、トウセンダニン（ｔｏｏｓｅｎｄａｎｉｎ）は、トウセンダン（ＭｅｌｉａｔｏｏｓｅｎｄａｎＳｉｅｂ．ＥｔＺｕｃｃ．）から分離することができる。トウセンダニンは、主に天然の殺虫剤として用いられているが、現在、トウセンダニンが白血病細胞のアポトーシスを誘導できることがすでに判明している。また、センレンシからトウセンダニンを抽出することもできる。センレンシは、成熟したトウセンダンの果実を乾燥させたものであり、回虫および蟯虫を駆除する漢方薬として用いることができる。

しかしながら、リモノイド化合物がＣ型肝炎を有効に抑制できるか否かについては、現在のところ、まだ明らかとなっていない。

上述した状況の下、本発明が解決すべき課題は、抗Ｃ型肝炎組成物、Ｃ型肝炎ウイルスを抑制またはＣ型肝炎を治療する薬剤の調製方法、およびリモノイド化合物の使用を提供することにある。

本発明は、抗Ｃ型肝炎組成物であって、分子式が下記式（Ｉ）に示すとおりの有効量のリモノイド化合物と、

（式中、Ｒ１はＨまたはＯＡｃを表し、Ｒ２はＨまたはＣＯＣＨ（ＣＨ_３）_２を表す）

薬学的に許容される担体または塩類と、を含み、前記抗Ｃ型肝炎組成物がＣ型肝炎ウイルスを抑制するのに用いられることを特徴とする抗Ｃ型肝炎組成物を提供する。

また、本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスを抑制またはＣ型肝炎を治療する薬剤の調製方法であって、Ｃ型肝炎ウイルスを抑制またはＣ型肝炎を治療する前記薬剤の活性成分として、有効量のリモノイド化合物を用い、前記リモノイド化合物の分子式が下記式（Ｉ）に示すとおりであることを特徴とするＣ型肝炎ウイルスを抑制またはＣ型肝炎を治療する薬剤の調製方法を提供する。

さらに、本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスを抑制またはＣ型肝炎を治療するのに用いる薬剤の調製におけるリモノイド化合物の使用であって、前記リモノイド化合物の分子式が下記式（Ｉ）に示すとおりであることを特徴とするリモノイド化合物の使用を提供する。

本発明の上記およびその他の課題、特徴ならびに長所がより明らかになるよう、以下に好適な実施例を挙げて、詳細に説明していく。

本発明によれば、植物材料から抽出されるリモノイド化合物を有効成分として含む抗Ｃ型肝炎組成物を提供することができる。

本発明は、リモノイド化合物を含む組成物を抗Ｃ型肝炎薬剤とするものであり、それはＣ型肝炎ウイルスを抑制またはＣ型肝炎を治療するのに用いることができる。ある実施形態において、本発明の組成物は、有効量のリモノイド化合物と、薬学的に許容される担体または塩類と、を含んでいてよく、リモノイド化合物の分子式は、下記式（Ｉ）に示すとおりである。

上記リモノイド化合物は、植物材料から抽出することができる。植物材料としては、トウセンダン（川楝、ＭｅｌｉａｔｏｏｓｅｎｄａｎＳｉｅｂ．ＥｔＺｕｃｃ．）またはクレン（苦楝、ＭｅｌｉａａｚｅｄａｒａｃｈＬｉｎｎ．）が挙げられる。

上記リモノイド化合物は、トウセンダニンまたはトリキリンＨを含むことができる。トウセンダニンおよびトリキリンＨの分子式は、それぞれ下記式（ＩＩ）および下記式（ＩＩＩ）に示すとおりである。

Ｃ型肝炎ウイルスレプリコン系は、Ｃ型肝炎の研究分野において、すでに現在周知になっていると共に広く認められ、かつ使用されている新薬スクリーニング研究の方法である（ヴィ・ローマン（Ｖ．Ｌｏｈｍａｎｎ）ら，１９９９，ヘパトーマ細胞系におけるサブゲノムＣ型肝炎ウイルスＲＮＡの複製（ＲｅｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｓｕｂｇｅｎｏｍｉｃｈｅｐａｔｉｔｉｓＣｖｉｒｕｓＲＮＡｓｉｎｈｅｐａｔｏｍａｃｅｌｌｌｉｎｅ），サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），Ｖｏｌ．２８５，１１０−１１３；アール・バーテンシュラーガー（Ｒ．Ｂａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒ），２００２，Ｃ型肝炎ウイルスの複製：薬剤開発のための潜在的な役割（ＨｅｐａｔｉｔｉｓＣｖｉｒｕｓｒｅｐｌｉｃｏｎｓ：ｐｏｔｅｎｔｉａｌｒｏｌｅｆｏｒｄｒｕｇｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ），ネイチャー・レビューズ／ドラッグ・ディスカバリー（ＮａｔｕｒｅＲｅｖｉｅｗｓ／ＤｒｕｇＤｉｓｃｏｖｅｒｙ），Ｖｏｌ．１，９１１−９１６；ジェイ・エム・ヴォルリーク（Ｊ．Ｍ．Ｖｏｒｌｉｊｋ）ら，２００３，慢性Ｃ型肝炎患者におけるインターフェロン測定用のレプリコン・ベース・バイオアッセイ（Ａｒｅｐｌｉｃｏｎ−ｂａｓｅｄｂｉｏａｓｓａｙｆｏｒｔｈｅｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｏｆｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓｉｎｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｃｈｒｏｎｉｃｈｅｐａｔｉｔｉｓＣ），ジャーナル・オブ・ヴァイロロジカル・メソッズ（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＶｉｒｏｌｏｇｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓ），１１０：２０１−２０９）。Ｈｕｈ−ｌｕｃ／ｎｅｏ−ＥＴ細胞は、Ｉ３８９ｌｕｃ−ｕｂｉ−ＮＳ３−３’／ＥＴ遺伝子構築物を有するＣ型肝炎ウイルスレプリコン系である。このＣ型肝炎ウイルスレプリコン系は、Ｃ型肝炎ウイルスの配列内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）が翻訳を行うことにより、ホタルルシフェラーゼ−ユビキチン−ネオマイシンホスホトランスフェラーゼのポリタンパク質を発現することができ、かつ脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）の配列内リボソーム進入部位が翻訳を行うことにより、プロテアーゼ、ヘリカーゼおよびポリメラーゼのポリタンパク質を含むＣ型肝炎ウイルス非構造タンパク質（ＮＳ３−５Ｂ）を発現することができる。Ｃ型肝炎ウイルスの配列内リボソーム進入部位またはＣ型肝炎ウイルス非構造タンパク質により構成される複製複合体が試験化合物の影響を受けたとき、ホタルルシフェラーゼ活性も変化する。よって、本発明のリモノイド化合物がＣ型肝炎ウイルスを抑制する効果は、リモノイド化合物の存在下で、Ｈｕｈ−ｌｕｃ／ｎｅｏ−ＥＴ細胞がホタルルシフェラーゼ活性を発現する強度により測定することができる。

Ｈｕｈ−ｌｕｃ／ｎｅｏ−ＥＴ細胞において、リモノイド化合物のＣ型肝炎ウイルス複製に対する５０％阻害濃度（ＩＣ_５０）は、少なくとも約０．５μｇ／ｍＬ未満であり、好ましくは約０．０４５μｇ／ｍＬである。また、リモノイド化合物の５０％細胞傷害濃度（ＣＣ_５０）とＣ型肝炎ウイルス複製に対する５０％阻害濃度（ＩＣ_５０）との比は、少なくとも約１００よりも大きく、好ましくは約２５００よりも大きい。

ある実施形態において、リモノイド化合物は、トウセンダニンを含んでいてよく、その分子式は、下記式（ＩＩ）に示すとおりである。

トウセンダニンは、植物材料から抽出することができる。植物材料としては、トウセンダンまたはクレンが挙げられる。Ｈｕｈ−ｌｕｃ／ｎｅｏ−ＥＴ細胞において、トウセンダニンのＣ型肝炎ウイルス複製に対する５０％阻害濃度（ＩＣ_５０）は、少なくとも約０．０５μｇ／ｍＬ未満であり、また、トウセンダニンの５０％細胞傷害濃度（ＣＣ_５０）とＣ型肝炎ウイルス複製に対する５０％阻害濃度（ＩＣ_５０）との比は、少なくとも約２５００よりも大きい。

別の実施形態において、リモノイド化合物は、トリキリンＨを含んでいてよく、その分子式は、下記式（ＩＩＩ）に示すとおりである。

トリキリンＨは、植物材料から抽出することができる。植物材料としては、トウセンダンまたはクレンが挙げられる。Ｈｕｈ−ｌｕｃ／ｎｅｏ−ＥＴ細胞において、トリキリンＨのＣ型肝炎ウイルス複製に対する５０％阻害濃度（ＩＣ_５０）は、少なくとも約０．５μｇ／ｍＬ未満であり、また、トリキリンＨの５０％細胞傷害濃度（ＣＣ_５０）とＣ型肝炎ウイルス複製に対する５０％阻害濃度（ＩＣ_５０）との比は、少なくとも約１００よりも大きい。

薬学的に許容される担体としては、特に限定されるものではないが、例えば、溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤や抗真菌剤、等張剤や吸収遅延剤など、薬学的投与に適合するものが挙げられる。それぞれ異なる投薬形式に応じて、一般的な方法により、本発明の組成物を所定の剤型に製剤化することができる。

薬学的に許容される塩類としては、特に限定されるものではないが、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩類；マグネシウム、カルシウム塩などのアルカリ土類金属塩類；亜鉛塩、アルミニウム塩、ジルコニウム塩などの２価または４価カチオンを含む塩類；アミン塩類；などの無機カチオン塩類が挙げられる。また、薬学的に許容される塩類は、ジシクロヘキシルアミン塩類；メチル−Ｄ−グルカミン；アルギニン、リジン、ヒスチジン、グルタミンなどのアミノ酸塩類；などの有機塩類であってもよい。

本発明の組成物は、経口、非経口、噴霧吸入によるか、または、植込型容器を介した方式により投与することができる。非経口投与としては、特に限定されるものではないが、例えば、皮下注射、皮内注射、静脈内注射、筋肉内注射、関節内注射、動脈内注射、滑液嚢内注射、胸骨内注射、くも膜下腔内注射、病巣内注射、輸液技術などが挙げられる。また、経口投与としては、特に限定されるものではないが、例えば、錠剤、カプセル剤、乳剤、水性懸濁液剤、分散液剤、溶液剤などが挙げられる。

本発明の組成物における有効成分の通常の一日投与量は、通常は約０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは約０．００５〜５０ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは約０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲内であり、単一投与量または分割投与量で投与することができる。しかし、実際に投与される有効成分の量は、治療する疾患、選択された投与経路、患者の年齢、性別および体重、ならびに、疾患の程度を含む種々の関連因子を考慮して決定されるものであり、したがって、前記投与量は本発明の範囲を限定するものではない。

また、本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスを抑制またはＣ型肝炎を治療する方法を提供する。Ｃ型肝炎ウイルスを抑制またはＣ型肝炎を治療する方法は、必要とする患者に対して、有効量の抗Ｃ型肝炎組成物を投与する工程を含み、この抗Ｃ型肝炎組成物は、上記式（Ｉ）で示されるリモノイド化合物および薬学的に許容される担体または塩類を含む。この抗Ｃ型肝炎組成物に適する担体または塩類は、上記のとおりである。

別の態様において、本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスを抑制またはＣ型肝炎を治療する薬剤の調製方法を提供する。

本発明の調製方法では、有効量のリモノイド化合物を、Ｃ型肝炎ウイルスを抑制またはＣ型肝炎を治療する薬剤の活性成分として用いる。例えば、有効量のリモノイド化合物を薬学的に許容される担体または塩類と組み合わせることにより、Ｃ型肝炎ウイルスを抑制またはＣ型肝炎を治療する薬剤を調製する。リモノイド化合物の分子式は、下記式（Ｉ）に示すとおりである。

Ｃ型肝炎ウイルスレプリコン系試験により、Ｈｕｈ−ｌｕｃ／ｎｅｏ−ＥＴ細胞において、リモノイド化合物のＣ型肝炎ウイルス複製に対する５０％阻害濃度（ＩＣ_５０）は、少なくとも約０．５μｇ／ｍＬ未満、好ましくは約０．０４５μｇ／ｍＬであることが示された。また、リモノイド化合物の５０％細胞傷害濃度（ＣＣ_５０）とＣ型肝炎ウイルス複製の５０％阻害濃度（ＩＣ_５０）との比は、少なくとも約１００よりも大きく、好ましくは約２５００よりも大きい。

上記リモノイド化合物は、植物材料から抽出することができる。植物材料としては、トウセンダンまたはクレンが挙げられる。

また、上記リモノイド化合物は、トウセンダニンまたはトリキリンＨを含むことができる。トウセンダニンおよびトリキリンＨの分子式は、それぞれ下記式（ＩＩ）および下記式（ＩＩＩ）に示すとおりである。

さらにまた別の態様において、本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスを抑制またはＣ型肝炎を治療するのに用いる薬剤の調製におけるリモノイド化合物の使用を提供する。前記リモノイド化合物の分子式は、下記式（Ｉ）に示すとおりである。

Ｃ型肝炎ウイルスレプリコン系試験により、Ｈｕｈ−ｌｕｃ／ｎｅｏ−ＥＴ細胞において、上記リモノイド化合物のＣ型肝炎ウイルス複製に対する５０％阻害濃度（ＩＣ_５０）は、少なくとも約０．５μｇ／ｍＬ未満、好ましくは約０．０４５μｇ／ｍＬであることが示された。また、リモノイド化合物の５０％細胞傷害濃度（ＣＣ_５０）とＣ型肝炎ウイルス複製に対する５０％阻害濃度（ＩＣ_５０）との比は、少なくとも約１００よりも大きく、好ましくは約２５００よりも大きい。

以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記の実施例により制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。

≪実施例１≫
植物材料からＣ型肝炎ウイルスを抑制する有効成分を抽出
センレンシアルコール抽出物５．９６ｇを取り、メタノールと水の混合溶媒２０ｍＬ中に溶解してから、ｎ−ヘキサン、ジエチルエーテル、ジクロロメタンおよび酢酸エチル各１５ｍＬで、それぞれ２〜３回抽出し、ｎ−ヘキサン層抽出液、ジエチルエーテル層抽出液、ジクロロメタン層抽出液および酢酸エチル層抽出液をそれぞれ得た。各層の抽出液をそれぞれ濃縮・乾燥した後、ｎ−ヘキサン層抽出物、ジエチルエーテル層抽出物、ジクロロメタン層抽出物および酢酸エチル層抽出物を得て、Ｈｕｈ−ｌｕｃ／ｎｅｏ−ＥＴ細胞（Ｃ型肝炎ウイルスレプリコン系）を用いて、それらのＣ型肝炎ウイルスを抑制する活性をそれぞれ測定した。

その結果、得られたジエチルエーテル層抽出物（１．１１３ｇ）がＣ型肝炎ウイルス複製を抑制する活性を備えていることが判明し、そのＣ型肝炎ウイルス複製に対する５０％阻害濃度（ＩＣ_５０）は、０．６８±０．１１μｇ／ｍＬであった。

ジエチルエーテル層抽出物１．１ｇを取り、オープンカラムクロマトグラフィー（充填物：シリカゲル３３ｇ、寸法：２．２ｃｍ×２５．３ｃｍ）で、異なる混合比率のｎ−ヘキサンとアセトンを移動相として分離を行い、ジエチルエーテル層抽出物を多数の画分に粗分画し、活性試験により活性成分の画分を選定してから、逆相セミ分取カラムクロマトグラフィーで、水とアセトニトリルを移動相とし、２つの化合物を分離した。次いで、これら２つの化合物について、分光分析および質量分析を行った。

第１化合物の分光分析結果は、以下のとおりであった：
^１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤ_３ＯＤ）：７．３９（ｓ，１Ｈ）；７．１９（ｓ，１Ｈ）；６．１６（ｓ，１Ｈ）；５．３４（ｓ，１Ｈ）；５．２０（ｓ，１Ｈ）；４．７１−４．２４（ｍ，５Ｈ）；３．８０（ｓ，１Ｈ）；３．５８−３．３１（ｍ，１Ｈ）；２．９０−２．５４（ｍ，４Ｈ）；２．１９−１．８９（ｍ，８Ｈ）；１．３７−１．３３（３Ｈ）；１．１４−１．１１（３Ｈ）；０．８４（ｓ，３Ｈ）。

第１化合物の質量分析結果は、以下のとおりであった：
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ：６２１［Ｍ＋２×Ｎａ］^＋；５９８［Ｍ＋Ｎａ］^＋；５５８［Ｍ−Ｏ］^＋；４９８［Ｍ−Ｏ−ＯＡｃ］^＋；４３８［Ｍ−Ｏ−２×ＯＡｃ］^＋。

以上の結果から、第１化合物は、トウセンダニンであることが確認された。

第２化合物の分光分析結果は、以下のとおりであった：
^１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤ_３ＯＤ）：７．４０（ｓ，１Ｈ）；７．２０（ｓ，１Ｈ）；６．１６（ｓ，１Ｈ）；５．７７（ｓ，１Ｈ）；５．４７（ｓ，１Ｈ）；５．３７（ｓ，１Ｈ）；５．３４（ｓ，１Ｈ）；４．５２（ｓ，１Ｈ）；４．５３−４．３１（ｍ，２Ｈ）；３．８２（ｓ，１Ｈ）；３．５７８（ｍ，１Ｈ）；２．９６−２．８７（ｍ，２Ｈ）；２．４８−２．５０（ｍ，１Ｈ）；２．２０（ｍ，２Ｈ）；２．０８（ｓｍ，２Ｈ）；１．９９（ｓ，３Ｈ）；１．９３（ｓ，３Ｈ）；１．９０（ｓ，３Ｈ）；１．３４−１．２９（３Ｈ）；１．１７−１．１３（ｍ，３Ｈ）；０．９５−０．８８（ｍ，６Ｈ）；０．８３（ｓ，３Ｈ）。

第２化合物の質量分析結果は、以下のとおりであった：
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ：７４９［Ｍ＋２×Ｎａ］^＋；７２６［Ｍ＋Ｎａ］^＋；６３５［Ｍ−フラン］^＋；６１６［６３５−ＣＯＣＨ（ＣＨ_３）_２］^＋；５５８［６１６−ＯＡｃ］^＋。

以上の結果から、第２化合物は、トリキリンＨであることが確認された。

≪実施例２≫
１．トウセンダニンのＨｕｈ−ｌｕｃ／ｎｅｏ−ＥＴ細胞に対する細胞毒性試験
Ｈｕｈ−ｌｕｃ／ｎｅｏ−ＥＴ細胞を、２．５×１０^４個／１００μＬ／ウェルの細胞密度で、９６ウェル細胞培養プレート（コーニング・インコーポレイション（ＣｏｒｎｉｎｇＩｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）製、ＣＯＳＴＡＲ，３５９９）に播種し、インキュベーター（ニューエアー（ＮＵＡＩＲ）社製、ｎｕ−５５１０）に入れて培養した。

翌日、トウセンダニン試料を、ＤＭＥＭ培地で、それぞれ希釈して、濃度を２８．７３μｇ／ｍＬ、９．５７μｇ／ｍＬ、３．１９μｇ／ｍＬ、１．０６μｇ／ｍＬ、０．３５μｇ／ｍＬ、０．１１μｇ／ｍＬ、０．０３９μｇ／ｍＬおよび０．０１３μｇ／ｍＬとする、または、希釈して、１１４．９２μｇ／ｍＬ、３８．３３μｇ／ｍＬ、１２．７７μｇ／ｍＬ、４．２５μｇ／ｍＬ、１．４２μｇ／ｍＬ、０．４６μｇ／ｍＬ、０．１６μｇ／ｍＬおよび０．０５７μｇ／ｍＬなど、それぞれ異なる希釈濃度のトウセンダニン培地とし、９６ウェルプレート中の元の培地を真空ポンプ（ＤＯＡＴ−７０４ＡＡ）で吸引除去した。その際、細胞を吸引しないように注意した。そして、上記濃度のトウセンダニン培地を、１００μＬ／ウェルの量で、細胞の入った上記９６ウェル細胞培養プレートに、それぞれ加えて実験群とし、また、対照群は、細胞に何らの処理もしていない培地を加えたものとした。

２日間培養した後、培地を除去してから、１×ＰＢＳ（１ｍＭＫＨ_２ＰＯ_４、１０ｍＭＮａ_２ＨＰＯ_４、１３７ｍＭＮａＣｌ、２．７ｍＭＫＣｌ）１００μＬで２回洗浄し、試料の沈殿があるか否かを観察し、これを記録した。続いて、ＰＢＳを除去し、各ウェルに０．５ｍｇ／ｍＬＭＴＴ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）社製、Ｍ２１２８）を含む培地５０μＬを加え、ＣＯ_２インキュベーター中に入れて１時間培養した後、ＤＭＳＯ（リーデル・デ・ヘーン（Ｒｉｅｄｅｌ−ｄｅＨａｅｎ）製、６０１５３）１５０μＬを加え、ボルテクサー（ＫＳｓｈａｋｅｒＴｙｐｅ６７０）で紫色の沈殿を均一に攪拌し、次いで、連続波長マイクロプレート分析システム（モレキュラー・デバイシーズ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ）社製、ＳＰＥＣＴＲＡＭＡＸ１９０）で、波長５６０ｎｍにおける細胞の吸光度を測定した。

対照群の平均吸光度を１００％の細胞生存率（％）とし、各種濃度の試料を加えた実験群の細胞の生存率（％）を計算した。細胞生存率の計算式は、（実験群の吸光度／対照群の吸光度）×１００％である。各実験群の試料濃度に対する細胞生存率をプロットしてｘｙ散布図を作成することにより、Ｒ^２値が０．９を超える傾向線の式を求めた。

ｙ＝５０とし、この式に代入して得られるｘは、５０％の細胞に傷害をもたらす試料濃度（ＣＣ_５０）であり、また、ｙ＝８５とし、この式に代入して得られるｘは、１５％の細胞に障害をもたらす試料濃度（ＣＣ_１５）である。試料の特性により、試料濃度が３．１９μｇ／ｍＬ、１．０６μｇ／ｍＬ、０．３５μｇ／ｍＬ、０．１１μｇ／ｍＬおよび０．０３９μｇ／ｍＬの実験群から得られた傾向線の式のみを用いて、ＣＣ_１５値を計算した。結果を表１に示す。トウセンダニンの５０％細胞傷害濃度（ＣＣ_５０）は、１１４．８μｇ／ｍＬより高く、トウセンダニンの１５％細胞傷害濃度（ＣＣ_１５）は、０．３４μｇ／ｍＬであった。

細胞生存率が８５％を超えるとき、この試料は、その濃度（ＣＣ_１５値未満の濃度）以下では、細胞毒性を有しないとみなした。細胞毒性を有しない濃度の試料を選択して、Ｈｕｈ−ｌｕｃ／ｎｅｏ−ＥＴ細胞のホタルルシフェラーゼ活性試験を行った（以下に詳述する）。

２．ホタルルシフェラーゼ活性の試験によるトウセンダニンのＣ型肝炎ウイルス複製抑制効果の評価
Ｈｕｈ−ｌｕｃ／ｎｅｏ−ＥＴ細胞を、２．５×１０^４個／１００μＬ／ウェルの細胞密度で、９６ウェル細胞培養プレート（コーニング・インコーポレイション（ＣｏｒｎｉｎｇＩｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）製、ＣＯＳＴＡＲ，３５９９）に播種し、濃度０．１５μｇ／ｍＬ、０．０７５μｇ／ｍＬ、０．０３８μｇ／ｍＬ、０．０１９μｇ／ｍＬおよび０．００８５μｇ／ｍＬのトウセンダニンと共に、それぞれ２日間共培養した。次いで、１×ＰＢＳ（１ｍＭＫＨ_２ＰＯ_４、１０ｍＭＮａ_２ＨＰＯ_４、１３７ｍＭＮａＣｌ、２．７ｍＭＫＣｌ）１００μＬで、２回洗浄した後、ＰＢＳを吸引除去した。１×細胞溶解液（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社製、Ｅ１９４１）３５μＬを加えてから、ボルテクサー（ＫＳｓｈａｋｅｒＴｙｐｅ６７０）で１０分間ボルテックスし、細胞を均一に分散させた。

細胞液３０μＬを吸い取り、ホタルルシフェラーゼ測定用の白９６ウェルプレート（ヌンク（ＮＵＮＣ）社製、２３６１０８）に加えてから、発光分析緩衝液（２１．５ｍＭＭｇＣｌ_２、３．７ｍＭＡＴＰ、０．１ＭＫＨ_２ＰＯ_４）４０μＬおよび発光基質（１ｍＭＤ−ルシフェリン）２０μＬを順次加え、基質を加えた後、直ちに、マイクロプレートルミノメーター（ベルトールド（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）社製、ＭＰＬ４）で、そのルシフェラーゼ活性（Ｒｌｕ／ｓ）を測定した。

対照群のルシフェラーゼ活性を基準として、実験群のＣ型肝炎ウイルス抑制率（％）を計算した。抑制率（％）の計算式は、｛［（対照群のルシフェラーゼ活性）−（実験群のルシフェラーゼ活性）］／（対照群のルシフェラーゼ活性）｝×１００％である。試料を連続希釈し、異なる濃度におけるＣ型肝炎ウイルス複製抑制率を測定した後、ソフトウェア・グラフィット・ファイヴ（ｇｒａｆｉｔ５）（エリサクス・ソフトウェア（ＥｒｉｔｈａｃｕｓＳｏｆｔｗａｒｅ）社製）を用いて、Ｃ型肝炎ウイルス複製抑制率５０％における試料濃度（ＩＣ_５０）を計算した。

各実験時において、０．５ｎｇ／ｍＬおよび０．１ｎｇ／ｍＬのＰＥＧＩＦＮａｌｐｈａ−２ａをＩＣ_５０試験の陽性対照群として用いたほか、１μｇ／ｍＬのシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）もＩＣ_５０試験の陽性対照群として用いた。

結果を表１に示す。トウセンダニンのＣ型肝炎ウイルス複製に対する５０％阻害濃度（ＩＣ_５０）は、０．０４５±０．００４μｇ／ｍＬであり、また、トウセンダニンのＣ型肝炎ウイルス複製に対する９０％阻害濃度（ＩＣ_９０）を計算したところ、０．３５μｇ／ｍＬであった。

≪実施例３≫
１．トリキリンＨのＨｕｈ−ｌｕｃ／ｎｅｏ−ＥＴ細胞に対する細胞毒性試験
実験の手順は、実施例２と同様としたが、試験試料をトリキリンＨに代えた。トリキリンＨ試料をＤＭＥＭ培地で希釈し、濃度５０μｇ／ｍＬ、２５μｇ／ｍＬ、８．３３μｇ／ｍＬ、２．７８μｇ／ｍＬ、０．９３μｇ／ｍＬ、０．３１μｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬおよび０．０３μｇ／ｍＬのトリキリンＨ培地を、それぞれ作製した。

結果を表１に示す。トリキリンＨの５０％細胞傷害濃度（ＣＣ_５０）は、５０μｇ／ｍＬより高く、トリキリンＨの１５％細胞傷害濃度（ＣＣ_１５）は、０．７μｇ／ｍＬであった。

２．ホタルルシフェラーゼ活性の試験によるトリキリンＨのＣ型肝炎ウイルス複製抑制効果の評価
実験の手順は、実施例２と同様とし、試験試料をトリキリンＨに代えた。Ｈｕｈ−ｌｕｃ／ｎｅｏ−ＥＴ細胞を、濃度０．７５μｇ／ｍＬ、０．５μｇ／ｍＬ、０．２５μｇ／ｍＬおよび０．１２５μｇ／ｍＬのトリキリンＨと共に、それぞれ共培養した。

結果を表１に示す。トリキリンＨのＣ型肝炎ウイルス複製に対する５０％阻害濃度（ＩＣ_５０）は、０．４８±０．１０μｇ／ｍＬであり、トリキリンＨのＣ型肝炎ウイルス複製に対する９０％阻害濃度（ＩＣ_９０）は、０．９μｇ／ｍＬであった。

ＣＣ_５０：５０％細胞傷害薬剤濃度；
ＣＣ_１５：１５％細胞傷害薬剤濃度；
ＩＣ_５０：５０％の細胞内のＣ型肝炎ウイルス複製を抑制する薬剤濃度；
ＩＣ_９０：９０％の細胞内のＣ型肝炎ウイルス複製を抑制する薬剤濃度；
有効係数（ＥＷ）：５０％細胞傷害薬剤濃度／５０％の細胞内のＣ型肝炎ウイルス複製を抑制する薬剤濃度。

好適な実施例を挙げて本発明を以上のように説明したが、これらは本発明を限定するものではなく、当業者であれば、本発明の精神と範囲を逸脱しない限りにおいて、いくらかの変更および修飾を加えることができる。よって、本発明の保護範囲は、添付の特許請求の範囲の記載が基準となる。

Claims

抗Ｃ型肝炎組成物であって、
分子式が下記式（Ｉ）に示すとおりの有効量のリモノイド化合物を含む、
（式中、Ｒ１はＨまたはＯＡｃを表し、Ｒ２はＨまたはＣＯＣＨ（ＣＨ₃）₂を表す）
Ｃ型肝炎ウイルスを抑制またはＣ型肝炎を治療するための抗Ｃ型肝炎組成物。
前記リモノイド化合物が植物材料から抽出される請求項１に記載の抗Ｃ型肝炎組成物。
前記植物材料がトウセンダンまたはクレンを含む請求項２に記載の抗Ｃ型肝炎組成物。
前記リモノイド化合物がトウセンダニンまたはトリキリンＨであり、前記トウセンダニンおよびトリキリンＨの分子式がそれぞれ下記式（ＩＩ）および下記式（ＩＩＩ）に示すとおりである請求項１に記載の抗Ｃ型肝炎組成物。
前記リモノイド化合物がトウセンダニンであり、前記トウセンダニンの分子式が下記式（ＩＩ）に示すとおりである請求項１に記載の抗Ｃ型肝炎組成物。
前記トウセンダニンが植物材料から抽出される請求項５に記載の抗Ｃ型肝炎組成物。
前記植物材料がトウセンダンまたはクレンを含む請求項６に記載の抗Ｃ型肝炎組成物。
前記リモノイド化合物がトリキリンＨであり、前記トリキリンＨの分子式が下記式（ＩＩＩ）に示すとおりである請求項１に記載の抗Ｃ型肝炎組成物。
前記トリキリンＨが植物材料から抽出される請求項８に記載の抗Ｃ型肝炎組成物。
前記植物材料がトウセンダンまたはクレンを含む請求項９に記載の抗Ｃ型肝炎組成物。
Ｃ型肝炎ウイルスを抑制またはＣ型肝炎を治療するための薬剤の調製におけるリモノイド化合物の使用であって、前記リモノイド化合物の分子式が下記式（Ｉ）に示すとおりであることを特徴とするリモノイド化合物の使用。
（式中、Ｒ１はＨまたはＯＡｃを表し、Ｒ２はＨまたはＣＯＣＨ（ＣＨ₃）₂を表す）
前記リモノイド化合物が植物材料から抽出される、請求項１１に記載のＣ型肝炎ウイルスを抑制またはＣ型肝炎を治療するための薬剤の調製におけるリモノイド化合物の使用。
前記植物材料がトウセンダンまたはクレンを含む、請求項１２に記載のＣ型肝炎ウイルスを抑制またはＣ型肝炎を治療するための薬剤の調製におけるリモノイド化合物の使用。
前記リモノイド化合物がトウセンダニンまたはトリキリンＨであり、前記トウセンダニンおよびトリキリンＨの分子式がそれぞれ下記式（ＩＩ）および下記式（ＩＩＩ）に示すとおりである、請求項１１に記載のＣ型肝炎ウイルスを抑制またはＣ型肝炎を治療するための薬剤の調製におけるリモノイド化合物の使用。