JP5124561B2 - 感温性ポリホスファゼン重合体−生理活性分子共役体、その製造方法及びその用途 - Google Patents

感温性ポリホスファゼン重合体−生理活性分子共役体、その製造方法及びその用途 Download PDF

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Description

本発明は温度変化に応じてゾル-ゲル転移を示す官能基を有する生分解性及び温度感応性ポリ有機ホスファゼンと薬品などの生物活性分子が結合されたポリ有機ホスファゼン-生物活性分子接合体、その製造方法及びその生物活性分子の到達材料としての用途に関するものである。
温度感応性高分子ハイドロゲルは低い温度では高分子水溶液がゾル相を維持するが、温度上昇に従って高分子水溶液がゲル相に変わる。
このようなゾル-ゲル転移は可逆的に起こる。温度感応性高分子ハイドロゲルは、その高分子水溶液が治療用薬品と混合が容易であるという長所により、有用な注入用薬物の到達材料として見なされている。それゆえに、温度感応性高分子ハイドロゲルは外科的手術の必要なく簡便に必要な部位に注入可能で、生体の所望の領域に注入した場合、温度感応性高分子ハイドロゲルは体温によって３次元構造のゲル相を形成し、これによって薬物の注入の制御および徐放に有用である（参照文献１）。
しかし、低分子量の薬物や親水性の高い薬物は高分子と共に体内に注入された後、温度感応性高分子ハイドロゲルの３次元網状構造ゲルを容易に通過して放出されるため、含まれていた親水性薬物の３０％以上が初期に放出される。さらに体内での親水性薬物の速い拡散速度によって短時間に薬物の放出が終了するため、薬物の持続放出が達成できないという問題がある（参照文献２）。
したがって、生物活性分子または薬物が直接ハイドロゲルに結合している生分解性および温度感応性高分子が要求された。さらに、細胞はゲル内で生育できないため、移植型細胞の到達物質としての生物活性分子が結合された温度感応性ハイドロゲルが要求される。
代表的な温度感応性高分子ハイドロゲルであるポリエチレンオキサイドとポリプロピレンオキシドの共重合体（ポロキサマー）はよく知られた温度感応性高分子である。しかしながら、このポロキサマーは生体内で分解されない（参照文献３）。最近、たポリエチレンオキサイドとポリ乳酸との生分解性共重合体（Ｒｅｇｅｌ(登録商標)）が報告された（参照文献４）。しかし、Ｒｅｇｅｌ(登録商標)は官能基を持たないという欠点があり、薬物または生物活性分子と直接的に組み合わせるのには限界がある。
本発明者らはジクロロホスファゼン直鎖状高分子をアミノ酸エステルとメトキシポリエチルレングリコールで置換することで得られるポリ有機ホスファゼンが、一定温度以下では水溶液状態であるが、一定温度以上では３次元構造のゲルにゾル-ゲル転移を示す温度感応性を示すことを報告した。さらに、これら温度感応性ポリ有機ホスファゼンは水溶液中で徐々に加水分解する（参照文献５）。
また、本発明者らは、温度変化に応じてゾル-ゲル転移を示す官能基を有するポリ有機ホスファゼンを開発した（参照文献６）。
薬物または生物活性分子は、官能基を有するポリ有機ホスファゼンに共有結合または配位結合などの結合によって導入することができる。生体分布、生分解性、薬物動力学、溶解度または抗原反応などのポリ有機ホスファゼンの特性は、結合する方法に応じて変えることができる。
高分子-薬物接合体は薬物の放出を調節することができ、薬物の毒性を減少させＥＰＲ効果（増進された透過及び維持効果）によって薬理効果は増加させることができる（参照文献７）。このような結合による薬物到達に対する代表的な研究としてシクロトリホスファゼン-抗癌剤接合体が知られている（参照文献８）。
薬物または生物活性分子が接合している生分解性および温度感応性ポリ有機ホスファゼンは、温度感応性高分子に適用した高分子-薬物接合体である。薬物または生物活性分子が接合しているポリ有機ホスファゼンは、高分子-薬物接合体および従来の薬物到達体の長所と有しており、薬物を効果的に体内に到達し、優れた薬理効果を示し、ハイドロゲル内で細胞が生育できる埋め込み型ハイドロゲルになる。
さらに、高分子ハイドロゲルへの多様な添加剤の導入は、細胞到達物質または薬物の効率を増加させることができる。ポリペプチドやタンパク質薬物を到達させる場合、添加剤の導入はハイドロゲル内での薬物の安定性を維持することができ、これら薬物と添加剤とのイオン結合を誘導し、およびハイドロゲルからの薬物放出速度を制御することができる。さらに、治療用細胞を到達させる場合、ハイドロゲルに導入された添加剤は、体内に到達後の細胞の活性を増加させることができる。
[非特許文献１Ａ]参照文献１； Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ, ６５, ２６１ （１９９９）
［非特許文献１Ｂ］Ｊ. Ｃｏｎｔｒｏｌ. Ｒｅｌ, ６３, １５５ （２０００）
［非特許文献２］参照文献２；Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ, ３１, １９７ （１９９８）
［非特許文献３］参照文献３；Ｊ. Ｐｈａｒｍ. Ｐｈａｒｍａｃｏｌ, ４８, ６６９ （１９９６）
［非特許文献４］参照文献４；Ｎａｔｕｒｅ, ３８８, ８６０ （１９９７）
［非特許文献５Ａ］参照文献５；Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ３２, ２１８８ （１９９９）
［非特許文献５Ｂ］Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ３２, ７８２０ （１９９９）
［非特許文献５Ｃ］Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ３５, ３８７６ （２００２）
［非特許文献７］参照文献７；Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ. ３, ３５１ （１９９２）
［非特許文献８］参照文献８；Ｊ. Ｃｏｎｔｒｏｌ. Ｒｅｌｅａｓｅ, １６１, ５５ （１９９８）
［非特許文献９］参照文献９；Ｉｎｔ. Ｊ. Ｃａｎｃｅｒ, ７３, ８５９‐８６４ （１９９７） 、
［非特許文献１０］参照文献１０；Ｉ. Ｂｉｏｃｈｅｍ. Ｐｈａｒｍａｃｏｌ, ３４, ２８９ （１９８５） 、
［非特許文献１１］参照文献１１；Ｊ. Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ, ７３, ８９‐１０２ （２００１）
［特許文献１Ａ］ 米国特許 第６,３１９,９８４号
［特許文献１Ｂ］ 大韓民国特許 第２５９，３６７号
［特許文献１Ｃ］ 大韓民国特許 第３１５，６３０号
［特許文献１Ｄ］ 参照文献６ 韓国特許出願２００６-０００５５７９
本発明の目的は、温度変化に応じてゾル-ゲル転移を示す温度感応性及び生分解性ポリ有機ホスファゼンが薬物などの多様な生物活性分子と結合している、ポリ有機ホスファゼン-生物活性分子接合体及びその製造方法を提供することにある。
また、本発明の他の目的は、ポリ有機ホスファゼン-生物活性分子接合体ハイドロゲルを提供することにある。
さらに、本発明の他の目的は、生物活性物質の到達のための、ポリ有機ホスファゼン-生物活性分子接合体、及び/またはそのハイドロゲル、及び１種以上の追加的薬物及び/または添加剤を含む組成物を提供することにある。
本発明は温度変化に応じてゾル-ゲル転移を示し、官能基を有する生分解性及び温度感応性ポリ有機ホスファゼンと、薬物などの生物活性分子とを結合されたポリ有機ホスファゼン-生物活性分子接合体、その製造方法及びその生物活性分子到達材料としての用途に関するものである。
本発明のポリ有機ホスファゼンは、生分解性および温度変化に応じてゾル-ゲル転移を示す温度感応性を有するホスファゲンを基にした分子である。よって、薬物などの生物活性分子と共に体内に注入する場合、ポリ有機ホスファゼンは体温によってゲルを形成して生物活性分子の制御された放出を可能にする。さらに、ポリ有機ホスファゼンは、その良好な結合特性により生物活性分子の持続的放出を可能にする、生物活性分子とイオン結合、共有結合、配位共有結合を通じた化学結合が可能な官能基を有している。ゆえに、ポリ有機ホスファゼンは薬物などの生物活性分子の到達材料として非常に有用である。
本明細書において、「生分解性」とは生物体内に注入する場合、生体内で無害な物質に分解及び排出されて生体内に残存せず、生体組織に無害な特性のことを意味する。
また、「温度感応性」とは、物質が温度上昇によってゾル相の溶液がゲル相に変わるゾル-ゲル転移を示すことを意味し、この時、ゾル-ゲル転移が起こる温度を「ゲル化温度」と言う。
また、「生物活性分子」とは生体内で有益な効果を示す物質を意味する。例えば、生物活性分子は、各種薬物（抗癌剤、新生血管抑制剤など）、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ワクチン、遺伝子及びホルモンからなる群より選択された１つ以上のものである。
一態様として、本発明は温度変化に応じてゾル-ゲル転移を示し、官能基を有する生分解性及び温度感応性ポリ有機ホスファゼンと、１つ又はそれ以上の生物活性分子が結合しているポリ有機ホスファゼン-生物活性分子接合体を提供する。
本発明のポリ有機ホスファゼン-生物活性分子接合体は下記の化学式１で示すことができる:
Figure 0005124561
 前記式で、
ｐはエチレングリコールの反復単位数を示すもので、７乃至５０の整数値を有し、
ＮＨＣＨ（Ｒ１）ＣＯ２Ｒ２はアミノ酸エステルで、
Ｒ１はＨ、ＨＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ２ＳＨ、ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ（ＣＨ３）Ｃ２Ｈ５、ＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ３、ＣＨ２Ｃ６Ｈ５、ＣＨ２Ｃ６Ｈ４ＯＨ、ＣＨ２Ｃ２ＮＨ２Ｃ６Ｈ４、ＯＣＯＣ４Ｎ＋Ｈ９、ＣＯ２Ｃ２Ｈ５、ＣＨ２ＣＯ２Ｃ２Ｈ５、（ＣＨ２）２ＣＯ２Ｃ２Ｈ５及びＨＣＯＮＨＣＨ（ＣＨ２Ｃ６Ｈ５）からなる群より選択され、
Ｒ２はＣＨ３、Ｃ３Ｈ７、Ｃ４Ｈ９、Ｃ２Ｈ５、ＣＨ２Ｃ６Ｈ５及びＣＨ２ＣＨＣＨ２からなる群より選択され、
ＮＨ（Ｒ３）（Ｒ４）（Ｒ５）はアミノ酸、ペプチドまたはデプシペプチドエステルで、
Ｒ３はＣＨ（Ｗ）であり、
Ｒ４はＣＯ２、ＣＯ２ＣＨ２ＣＯ２、ＣＯ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＯ２及びＣＯＮＨＣＨ（Ｘ）ＣＯ２からなる群より選択され、
Ｒ５はＨ、ＣＨ３及びＣ２Ｈ５からなる群より選択され、
ここで、Ｗ及びＸはそれぞれ独立的にＨ、ＨＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ（ＣＨ３）Ｃ２Ｈ５、ＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ３、ＣＨ２Ｃ６Ｈ５、ＣＨ２Ｃ２ＮＨ２Ｃ６Ｈ４、ＯＣＯＣ４Ｎ＋Ｈ９、ＣＯ２Ｃ２Ｈ５、（ＣＨ２）２ＣＯ２Ｃ２Ｈ５、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ（ＣＨ３）ＯＨ、ＣＨ２Ｃ６Ｈ４ＯＨ、ＣＨ２ＣＯＯＨ、ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ、ＣＨ２ＣＯＮＨ２、Ｃ４Ｈ８ＮＨ２、Ｃ３Ｈ６ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、ＣＨ２Ｃ３Ｎ２Ｈ３及びＣＨ２ＳＨからなる群より選択され、
ＮＨ（Ｒ６）（Ｒ７）（Ｒ８）及びＮＨ（Ｒ６）（Ｒ７）（Ｒ９）は官能基を有している置換体で、
Ｒ６はＣＨ（Ｙ）であり、
Ｒ７はＣ２Ｈ４、Ｃ３Ｈ６、Ｃ４Ｈ８、ＣＨ２Ｃ６Ｈ４、ＣＨ２ＣＯ２、Ｏ、ＣＯＮＨＣＨ（Ｚ）Ｏ、ＣＯ、ＣＯ２、Ｓ、ＣＯＮＨＣＨ（Ｚ）Ｓ、Ｎ、ＣＯＮＨＣＨ（Ｚ）Ｎ、ＣＯＮ、ＣＯＣＨＮＨ（Ｚ）ＣＯＮ、ＣＯＮＨＣＨ（Ｚ）ＣＯ及びＣＯＮＨＣＨ（Ｚ）ＣＯ２からなる群より選択され、
Ｒ８はＯＨ、ＳＨ、Ｈ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、Ｃ３Ｈ７、Ｃ４Ｈ９、ＣＨ２Ｃ６Ｈ５、ＣＨ２ＣＨＣＨ２及び下記表１の保護基からなる群より選択され、
ここで、Ｙ及びＺはそれぞれ独立的にＨ、ＨＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ（ＣＨ３）Ｃ２Ｈ５、ＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ３、ＣＨ２Ｃ６Ｈ５、ＣＨ２Ｃ２ＮＨ２Ｃ６Ｈ４、ＯＣＯＣ４Ｎ＋Ｈ９、ＣＯ２Ｃ２Ｈ５、（ＣＨ２）２ＣＯ２Ｃ２Ｈ５、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ（ＣＨ３）ＯＨ、ＣＨ２Ｃ６Ｈ４ＯＨ、ＣＨ２ＣＯＯＨ、ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ、ＣＨ２ＣＯＮＨ２、Ｃ４Ｈ８ＮＨ２、Ｃ３Ｈ６ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、ＣＨ２Ｃ３Ｎ２Ｈ３及びＣＨ２ＳＨからなる群より選択され、
Ｒ９はＯＨ、ＳＨ、Ｈ、ＮＨ２、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、Ｃ３Ｈ７、Ｃ４Ｈ９、ＣＨ２Ｃ６Ｈ５、ＣＨ２ＣＨＣＨ２、ＮＨＣＨ（ＳＨ）ＣＯ２Ｈ、ＮＨ（ＣＨ２）ｑＳＨ、ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｒＨ、［ＮＨＣＨ（Ｃ４Ｈ８ＮＨ２）ＣＯ］ｒＯＨ、［ＮＨＣＨ［（ＣＨ２）３Ｃ（＝ＮＨ）（ＮＨ２）］ＣＯ］ｒＯＨ及びプロタミンからなる群より選択され、
ここで、ｑはメチレンの反復単位数を示すもので１乃至２０の整数値を有し、
rはエチレンイミン、リジンまたはアルギニンの反復単位数を示すもので１乃至１８０００の整数値を有し、
ＮＨ（Ｒ６）（Ｒ７）（Ｒ１０）は薬物などの生物活性分子と化学結合している置換体で、
Ｒ６及びＲ７は前記置換体ＮＨ（Ｒ６）（Ｒ７）（Ｒ８）及びＮＨ（Ｒ６）（Ｒ７）（Ｒ９）で定義した通りであり、
Ｒ１０はパクリタキセル、ドキソルビシン、カンプトテシン、エピルビシン、５-フルオロウラシル、１０-ヒドロキシカンプトテシン、１０-アミノカンプトテシン、７-エチルカンプトテシン、イリノテカン、メトトレキサート、マイトマイシンＣ、タキソイド、ドセタキセル、クロラムブシル、カリケアマイシン、マイタンシノイド、２-ピロリノドキソルビシン（ＡＮ-２０１）、ダウノルビシン、ブチル酸、メルファラン、４'-ジメチルデオキシポドフィロトキシン、 クルクミン、ポドフィロトキシン、エピポドフィロトキシン、４β−アミノ-４'-Ｏ-ジメチルエピポドフィロトキシン、タリソマイシンＳ１０ｂ、ダウノマイシン、デュオカルマイシンＡ、デュオカルマイシンＳＡ、シス-アコニチル-ダウノマイシン、カリケアマイシン、ジアゼニウムジオレート、ネトロプシン、６-メルカプトプリン、グルクロン酸抱合、フォスミドシン、ストレプトニグリン、ヘマトポルフィリン、デスフェリオキサミン（ＤＦＯ）、デフェリプロン、アシビシン、エストラムスチン、エネジイン、アルギニン-グリシン-アスパラギン酸ペプチド誘導体、ニューロペプチド [例えば、ニューロテンシン、タキキニン、ニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）、ペプチドＹＹ（ＰＹＹ）、血管活性臓内ポリペプチド（ＶＩＰ）、下垂体アデニル酸シクラーゼ-活性ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）など]、アルブミン、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、牛膵臓リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅＡ）、牛精液リボヌクレアーゼ（ＢＳ‐ＲＮａｓｅ）、Ｂｏｗｍａｎ‐ｂｒｉｋプロテアーゼ阻害剤（ＢＢＩ）、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、インターフェロン、ヒルジン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インシュリン、デスモプレシン、グルカゴン類似ペプチド１（ＧＬＰ１）、ヒト成長ホルモン拮抗剤、腫瘍壊死因子収容体１（ＴＮＦＲ１）、アスパラギナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、骨形成蛋白質（ＢＭＰｓ）、成長因子 [例えば、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、血小板性成長因子（ＰＤＦＧ）、インシュリン類似成長因子（ＩＧＦ）、変異性成長因子β（ＴＧＦ‐β）、脳神経成長因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン-３（ＮＴ‐３）、ニューロトロフィン-４/５（ＮＴ‐４/５）など]、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）、サイトカイン [例えば、インターフェロン-α１ａ（ＩＦＮ‐α１ａ）、インターフェロン-α２ａ（ＩＦＮ‐α２ａ）、インターフェロン-α２ｂ（ＩＦＮ‐α２ｂ）、インターフェロン-ガンマ（ＩＦＮ‐γ）、インターロイキン-１（ＩＬ‐１）、インターロイキン-２（ＩＬ‐２）、インターロイキン-３（ＩＬ‐３）、インターロイキン-４（ＩＬ‐４）、インターロイキン-５（ＩＬ‐５）、インターロイキン-６（ＩＬ‐６）、腫瘍壊死因子-α（ＴＮＦ-α）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）など]、テアニン、デキサメタゾン、ヘパリン、キトサン、ヒアルロナン、シクロデキストラン、澱粉、炭水化物、糖類、蛍光蛋白質 [例えば、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）、赤色蛍光蛋白質（ＲＦＰ）など]、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）及びワクチンからなる群より選択され、
ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ及びｆは各置換体の含量を示す値で、ａ、ｂ、ｆは独立して０．０１乃至１．９の値を有し、ｃ及びｄ、ｅは独立して０乃至１．９の値を有し、ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ＋ｅ＋ｆ＝２．０であり、
nはポリホスファゼンの重合度で５乃至１０００００の値を有する。
前記Ｒ９として使用可能なプロタミンは分子量に制限を受けず、好ましくは４，０００乃至１０，０００範囲の分子量を有するものであり得る。
使用可能な保護基を下記の表1に示したが、これらに限定されない
Figure 0005124561
Figure 0005124561
Figure 0005124561
Figure 0005124561
Figure 0005124561
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本発明のポリ有機ホスファゼンの一態様としては、温度感応性と生分解性を示すように、ジクロロホスファゼン直鎖高分子に疎水性アミノ酸エステルと分子量３５０乃至２５００の親水性メトキシポリエチルレングリコールが導入される。さらに、高分子の分解速度を調節することができるアミノ酸、ペプチド、デプシペプチドエステルが一部導入されているものであってもよい。
本発明のさらなる一態様としては、官能基は様々な方法でポリ有機ホスファゼンに導入される。例えば、ヒドロキシ基、アミド基、アミノ基、チオール基またはカルボキシル基などの置換基を直接高分子の主鎖に対する側鎖に導入またはアミノ酸エステルまたはペプチドエステル置換基を導入し、ここで官能基は保護基によって高分子主鎖に対して保護されており、後で保護基を取りはずす方法などである。
本発明のさらなる一態様としては、リジン、アルギニン、システイン、チオールアルキルアミンまたはポリエチレンイミン、ポリリジン、ポリアルギニンまたは多様な分子量のプロタミンを、カルボキシル酸を有するポリホスファゼンと反応させて、ポリホスファゼンに官能基を導入させることができる。
また、疎水性アミノ酸エステルの種類、分解速度が調節できるアミノ酸、ペプチドまたはデプシペプチドエステルの種類、官能基を有する置換基の種類、メトキシポリエチルレングリコール鎖の長さ、すべての置換基の組成、ポリ有機ホスファゼンの分子量、多分散指数、ポリ有機ホスファゼン溶液の濃度などを調節して、本発明のポリ有機ホスファゼンのゾル-ゲル転移を示す温度（ゲル化温度）、ゲル強度及び/または生分解速度などを調節することができる。
例えば、疎水性アミノ酸の組成が増加するほどゲル化温度が低くなる。ポリ有機ホスファゼン溶液の濃度が高いほどゲル化温度は低くなり、ゲル強度は増加する。メトキシポリエチルレングリコール鎖の長さが長いほどゲル強度が増加してゲル化温度が高くなる。デプシペプチドエステルが含まれたポリ有機ホスファゼンは、デプシペプチドエステルを含まないポリ有機ホスファゼンよりさらに速く生分解される。カルボン酸官能基を有する置換体を含むポリ有機ホスファゼンは、カルボン酸官能基を有せずに置換体を含まないポリ有機ホスファゼンより速く生分解される。
他の態様において、本発明は前記化学式１の構造を有する温度変化に応じてゾル-ゲル転移を示すポリ有機ホスファゼンと生物活性分子が結合されたポリ有機ホスファゼン-生物活性分子接合体の製造方法を提供する。
本発明の製造過程は、手段として次の段階を含む。
（１）次の化学式２のホスファゼン三量体を熱重合させて次の化学式３のジクロロホスファゼン直鎖高分子を得る下記反応式１の段階：
Figure 0005124561
Figure 0005124561
 （ここでｎは７乃至１０００００の整数値である。）
（２）前記段階（１）で生成された前記化学式３の化合物を次の化学式４のアミノ酸エステルまたはその塩の０．０１乃至１．９当量と反応させる段階：
[化４]
ＮＨ２ＣＨ（Ｒ１）ＣＯ２Ｒ２；
（３）前記段階（２）の生成物を次の化学式５のアミノ酸、ペプチド、デプシペプチドエステルまたはその塩の０乃至１．９当量と反応させる段階:
[化５]
ＮＨ２（Ｒ３）（Ｒ４）（Ｒ５）；
（４）前記段階（３）の生成物を次の化学式６の官能基を有する置換体またはその塩の０．０１乃至１．９当量と反応させる段階：
[化６]
ＮＨ２（Ｒ６）（Ｒ７）（Ｒ８）；
（５）前記段階（４）の生成物を次の化学式７のアミノメトキシポリエチレングリコールまたはその塩の０．０１乃至１．１９当量と反応させる段階：
[化７]
ＮＨ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｐＣＨ３；
前記化学式６のＲ８がＣＨ２Ｃ６Ｈ５又はＣＨ２ＣＨＣＨ２である場合、本発明の製造方法は、前記段階（５）で生成された高分子を脱水素化反応（Ｒ８がＣＨ２Ｃ６Ｈ５である場合）または脱アリルエステル化反応（Ｒ８がＣＨ２ＣＨＣＨ２である場合）させることによってＲ８が水素（Ｈ）官能基を有するものであるポリ有機ホスファゼンを得る段階（５-１）を含む。
さらに本発明の製造方法は追加的に、前記段階（５）の生成物または段階（５-１）の生成物をリジン、アルギニン、システイン、チオールアルキルアミンまたは多様な分子量のポリエチレンイミン、ポリリジン、ポリアルギニンまたはプロタミンと反応させてＲ９がＮＨＣＨ（ＳＨ）ＣＯ２Ｈ、ＮＨ（ＣＨ２）ｑＳＨ、ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｒＨ、［ＮＨ（ＣＨ２）４ＣＨ（ＮＨ２）ＣＯ］ｒＯＨ、［ＮＨＣ（＝ＮＨ）（ＣＨ２）３ＣＨ（ＮＨ２）ＣＯ］ｒＯＨまたはプロタミンなどの多様な官能基を有するようにしてポリ有機ホスファゼンを製造する段階（５-２）を含むことができる。
さらに本発明の製造方法は、段階（５）、段階（５-１）または段階（５-２）の生成物である多様な官能基を有しているポリ有機ホスファゼンに、生物活性分子（Ｒ１０）を反応させる段階（６）を含む。Ｒ１０は、パクリタキセル、ドキソルビシン、カンプトテシン、エピルビシン、５-フルオロウラシル、１０-ヒドロキシカンプトテシン、１０-アミノカンプトテシン、７-エチルカンプトテシン、イリノテカン、メトトレキサート、マイトマイシンＣ、タキソイド、ドセタキセル、クロラムブシル、カリケアマイシン、マイタンシノイド、２-ピロリノドキソルビシン（ＡＮ‐２０１）、ダウノルビシン、ブチル酸、メルファラン、４'-ジメチルデオキシポドフィロトキシン、クルクミン、ポドフィロトキシン、エピポドフィロトキシン、４β−アミノ-４'-Ｏ-ジメチルエピポドフィロトキシン、タリソマイシンＳ１０ｂ、ダウノマイシン、デュオカルマイシンＡ、デュオカルマイシンＳＡ、シス-アコニチル-ダウノマイシン、カリケアマイシン、ジアゼニウムジオレート、ネトロプシン、６-メカプトプリン、グルクロン酸抱合、フォスミドシン、ストレプトニグリン、ヘマトポルフィリン、デスフェリオキサミン（ＤＦＯ）、デフェリプロン、アシビシン、エストラムスチン、エネジイン、アルギニン-グリシン-アスパラギン酸ペプチド誘導体、ニューロペプチド [例えば、ニューロテンシン、タキキニン、ニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）、ペプチドＹＹ（ＰＹＹ）、血管活性臓内ポリペプチド（ＶＩＰ）、下垂体アデニル酸シクラーゼ-活性ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）など]、アルブミン、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、牛膵臓リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅＡ）、牛精液リボヌクレアーゼ（ＢＳ‐ＲＮａｓｅ）、Ｂｏｗｍａｎ‐ｂｒｉｋプロテアーゼ阻害剤（ＢＢＩ）、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、インターフェロン、ヒルジン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インシュリン、デスモプレシン、グルカゴン類似ペプチド１（ＧＬＰ１）、ヒト成長ホルモン拮抗剤、腫瘍壊死因子収容体１（ＴＮＦＲ１）、アスパラギナーゼ、アデノシンデアミナーゼ骨形成蛋白質（ＢＭＰｓ）、成長因子 [例えば、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、血小板性成長因子（ＰＤＦＧ）、インシュリン類似成長因子（ＩＧＦ）、変異性成長因子β（ＴＧＦ‐β）、脳神経成長因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン-３（ＮＴ‐３）、ニューロトロフィン-４/５（ＮＴ‐４／５）など]、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）、サイトカイン [例えば、インターフェロン-α１ａ（ＩＦＮ‐α１ａ）、インターフェロン-α２ａ（ＩＦＮ‐α２ａ）、インターフェロン-α２ｂ（ＩＦＮ‐α２ｂ）、インターフェロン-ガンマ（ＩＦＮ‐γ）、インターロイキン-１（ＩＬ‐１）、インターロイキン-２（ＩＬ‐２）、インターロイキン-３（ＩＬ‐３）、インターロイキン-４（ＩＬ‐４）、インターロイキン-５（ＩＬ‐５）、インターロイキン-６（ＩＬ‐６）、腫瘍壊死因子-α（ＴＮＦ‐α）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）など]、テアニン、デキサメタゾン、ヘパリン、キトサン、ヒアルロナン、シクロデキストラン、澱粉、炭水化物、糖類、蛍光蛋白質 [例えば、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）、赤色蛍光蛋白質（ＲＦＰ）など]、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）及びワクチンからなる群より１種以上選択されたものである。
段階（６）の場合、本発明の製造方法は、ポリ有機ホスファゼンに前記生物活性分子が直接的に化学結合しているポリ有機ホスファゼン-生物活性分子接合体を得ることができる。
このような化学式１の薬物または生物活性分子と化学結合しているポリ有機ホスファゼンの製造工程を整理すると以下の化学式８の通りである:
Figure 0005124561
前記化学式１０、１１、１２、１３及び化学式１４において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｎ及びｐは化学式１の化合物に対して定義したことと同様である。
以下では化学式１で示されるポリ有機ホスファゼン-生物活性分子接合体の製造方法をさらに詳しく説明する。
すべての製造反応工程は水分が入らないように真空及び/または窒素ラインを使用するのが好ましい。さらに、反応に使用した各種溶媒は普遍的な方法で水分を十分に除去して使用するのが好ましい。
段階（１）は化学式２の化合物と０．１乃至１０重量%のＡｌＣｌ３をガラス反応管に入れて密封した後、毎分１回転の速度（１ｒｐｍ）で回転させながら、２００乃至２５０℃で４乃至８時間反応させて行うことができる。
段階（２）は段階（１）の生成物１当量を基準に化学式４で示されるアミノ酸エステルまたはその塩の０．０１乃至１．９当量と、４当量のトリエチルアミン存在下で反応させる方法で行う。化学式４の塩は硫酸塩または塩化水素塩であるのが好ましい。反応溶媒としてはテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジオキサン、クロロホルムまたはトルエンを使用することができるが、これらに限定されない。反応は-６０乃至５０℃で約８乃至７２時間行うことができる。
段階（３）は段階（２）の生成物を化学式５で示されるアミノ酸、ペプチド、デプシペプチドエステルまたはその塩の０乃至１．９当量と４当量のトリエチルアミン存在下で反応させる方法で行うことができる。化学式５の塩はシュウ酸塩、塩化水素塩またはトリフルオロ酸塩であるのが好ましい。反応溶媒としてはアセトニトリル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、クロロホルムまたはトルエンを使用することができるが、これらに限定されない。反応は０乃至５０℃で１乃至７２時間程度行うことができる。
段階（４）は段階（３）の生成物を前記化学式６で示される官能基を有する置換体またはその塩の０．０１乃至１．９当量と４当量のトリエチルアミン存在下で反応させる方法で行うことができる。化学式６の塩はシュウ酸塩、塩化水素塩、またはトリフルオロ酸塩であるのが好ましい。反応溶媒としてはアセトニトリル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、クロロホルムまたはトルエンを使用することができるが、これらに限定されない。反応は２５乃至５０℃で１２乃至７２時間程度行うことができる。
段階（５）では段階（４）の生成物の残っているクロリンを基準に２当量の化学式６で示されるアミノメトキシポリエチレングリコールと４当量のトリエチルアミン存在下で反応させて、段階（４）の生成物のうちに残っているクロリン基を全て置換させる。この時、反応溶媒としてはテトラヒドロフラン、ジオキサン、クロロホルムまたはトルエンを使用することができるが、これらに限定されない。反応は２５乃至５０℃で２４乃至７２時間程度行うことができる。
化学式６でＲ８がＣＨ２Ｃ６Ｈ５である場合、段階（５-１）は段階（５）の生成物を段階（５）の生成物の５０乃至９０重量％のパラジウム/チャーコールまたはパラジウムブラックと３０乃至８０ｐｓｉ（ＳＩ単位概算値：２００−５６０ｋＰａ）圧力の水素ガス存在下で脱水素化反応させてカルボキシ基に置換させることで行うことができる。この時、反応溶媒はメチルアルコールまたはエチルアルコールであることができるが、これらに限定されない。反応は１０乃至３５℃で１乃至２４時間程度行うことができる。
化学式６でＲ８がＣＨ２ＣＨＣＨ２である場合、前記段階（５）の生成物を１０乃至２０モル％のテトラキストライフェニルホスフィンパラジウム（Ｏ）と１０乃至２０当量のモルフォリン存在下で脱アリルエステル化反応させてカルボキシ基で置換させることによって行うことができる。反応溶媒としてはテトラヒドロフラン、ジオキサン、クロロホルムまたはトルエンを使用することができるが、これらに限定されない。反応温度は０乃至２５℃で１乃至２４時間程度行うことができる。
段階（５‐２）はカルボキシル酸を含む前記段階（５）の生成物または段階（５-１）の生成物をリジン、アルギニン、システイン、チオールアルキルアミン、ポリエチレンイミン、ポリリジン、ポリアルギニンおよび多様な分子量のプロタミンと１乃至３当量のジシクロヘキシルカルボジイミドと１乃至３当量のヒドロキシコハク酸イミド存在下で反応をさせて多様な官能基を有するポリ有機ホスファゼンを得る。反応溶媒としてはテトラヒドロフランまたはクロロホルムを使用することができるが、これらに限定されない。反応は０乃至２５℃で１乃至４８時間程度行うことができる。
段階（６）はカルボキシル酸を含む段階（５）の生成物、段階（５-１）の生成物または段階（５-２）の生成物とヒドロキシ基を有する薬物などの生物活性分子を１乃至３当量のジシクロヘキシルカルボジイミドと１乃至３当量のジメチルアミノピリジン存在下で反応させてポリ有機ホスファゼンに薬物などの生物活性分子が化学結合しているポリ有機ホスファゼン-生物活性分子接合体を得る。反応溶媒としてはジクロロメタンを使用することができるが、これに限定されない。反応は０乃至２５℃で１乃至４８時間程度行うことができる。
また、段階（６）でカルボキシル酸を含む段階（５）の生成物、段階（５-１）の生成物または段階（５-２）の生成物とアミンを有する薬物などの生物活性分子を１乃至３当量のトリブチルアミンと１乃至３当量のクロロギ酸イソブチル存在下で反応させてポリ有機ホスファゼンに薬物などの生物活性分子が化学結合しているポリ有機ホスファゼン-生物活性分子接合体を得る。反応溶媒としてはテトラヒドロフランを使用することができるが、これに限定されない。反応は０乃至２５℃で１乃至４８時間程度行うことができる。
また、段階（６）において、多様な官能基を有する段階（５）の生成物、段階（５-１）の生成物または段階（５-２）の生成物と前記官能基に結合可能な官能基を有する薬物などの生物活性分子は硫酸化結合［Ｉｎｔ. Ｊ. Ｃａｎｃｅｒ, ７３, ８５９‐８６４ （１９９７）］、カルバメート（ｃａｂａｍｉｔｅ）結合［Ｉ. Ｂｉｏｃｈｅｍ. Ｐｈａｒｍａｃｏｌ, ３４, ２８９ （１９８５）］、またはヒドラゾン結合［Ｊ. Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ, ７３, ８９‐１０２ （２００１）］を通じてポリ有機ホスファゼンに結合することができる。
前記段階（１）乃至（５-２）において、各段階の生成物を精製せずにそのまま次の段階の反応に使用することができる。前記段階（６）の反応混合物から純粋な目的生成物を次のような方法で回収することができる。
まず、反応混合物を遠心分離またはろ過して沈殿物（例えば、トリエチル塩化アンモニウム、シュウ酸のトリエチルアンモニウム塩など）を反応混合物から除去し、溶媒が少し残るまで濾液を減圧濃縮する。得られた濃縮液をテトラヒドロフランに溶解させ、過剰のエチルエーテル、ヘキサンまたはエチルエーテルとヘキサンの混合溶媒を加えて生成物の沈澱を誘導する。沈殿を２または３回ろ過して未反応置換体を除去する。この工程を経て得られた化合物を再び少量のメチルアルコールまたはエチルアルコールに溶解させる。メチルアルコールまたはエチルアルコールで３乃至１０日間２５℃で透析し、蒸溜水で３乃至１０日間４乃至２５℃で透析する。反応生成物は低温乾燥され、純粋な化学式１の化合物を得る。
また、他の態様において本発明は、化学式１のポリ有機ホスファゼン-生物活性分子接合体を含む温度変化に応じてゾル-ゲル転移を示す高分子溶液（ハイドロゲル）を提供する。
本発明の化学式１のポリ有機ホスファゼン-生物活性分子接合体は適切な溶媒に溶解された溶液状態で温度変化に応じて明確なゾル-ゲル転移を示し、体温範囲でゲル化されて体内に注入する時には３次元のゲルを形成する。
本発明の温度変化によってゾル-ゲル転移と生分解性を示すポリ有機ホスファゼン-生物活性分子接合体ハイドロゲルは前記のような化学式１のポリ有機ホスファゼン-生物活性分子接合体が水、緩衝溶液、酸性溶液、塩基性溶液、塩容液、生理食塩水、注射用水及びブドウ糖食塩液からなる群より選択された適切な溶媒に１乃至５０重量％の濃度、好ましくは３乃至２０重量％濃度で溶解されているものであり得る。
本発明のポリ有機ホスファゼン-生物活性分子接合体は１０乃至６０℃範囲でゾル-ゲル転移を示す。よって、本発明のポリ有機ホスファゼン-生物活性分子接合体は体温範囲でゲル相を有することができるので、結合している多様な生物活性分子の体内到達に非常に有用である。
また、他の側面において本発明は、前記温度変化に応じてゾル-ゲル転移を示すポリ有機ホスファゼン-生物活性分子接合体及びポリ有機ホスファゼン-生物活性分子接合体ハイドロゲルからなる群より選択された１つ以上を含む生物活性分子到達用組成物を提供する。
前記生物活性分子到達用組成物は１つ以上の添加剤を含むものであり得る。
また、他の側面において本発明は、前記温度変化に応じてゾル-ゲル転移を示すポリ有機ホスファゼン-生物活性分子接合体及びポリ有機ホスファゼン-生物活性分子接合体ハイドロゲルからなる群より選択された１つ以上と、薬物または細胞を所望する部位に到達させ、優れた薬理効果及び細胞活性を得るための追加の生物活性分子、細胞及び添加剤からなる群より選択された１つ以上を追加的に含む生物活性分子到達システムを提供する。
本発明において、化学式１のポリ有機ホスファゼン-生物活性分子接合体またはハイドロゲルに添加剤として多様な塩を添加することによって、ポリ有機ホスファゼン水溶液のゾル-ゲル転移を調節して所望するゲル強度とゾル-ゲル変化温度を得ることができる（参考文献５：Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ３２， ７８２０，１９９９）。
また、ポリペプチドまたはタンパク質薬物を到達させようとする場合、適切な添加剤の導入はハイドロゲル内での薬物の安全性を維持することができ、これら薬物との相互作用を誘導して薬物放出速度を制御することができる。さらに、治療用細胞を到達させようとする場合は、適切な添加剤の導入によって体内に到達後に細胞の活性を増加させることができる。
つまり、前記添加剤は前記ポリ有機ホスファゼン-生物活性分子接合体またはハイドロゲルと薬物などの生物活性分子との多様な相互作用を誘導して生体活性物質の放出を調節したり及び/または治療用細胞などの生体活性物質の生体内活性を増加させるものであってもよい。
このような添加剤の例としてはポリ−Ｌ−アルギニン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリエチルレングリコール、ポリエチレンイミン、キトサン及びプロタミン、ポリ（Ｎ-ビニル-２-ピロリドン）などの陽イオン高分子（分子量２００乃至７５００００）；ポリビニルアセテート（ＰＶＡ）、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸塩、ヘパリン、アルギン酸塩などの陰イオン高分子;アミロライド、プロカインアミド、アセチル-β−メチルコリン、スペルミン、スペルミジン、リゾチーム、フィブロイン、アルブミン、コラーゲン、変異性成長因子β（ＴＧＦ‐β）、骨形成蛋白質（ＢＭＰｓ）、繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、デキサメタゾン、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）、フィブロネクチン、フィブリノーゲン、トロンビン、タンパク質、デクスラゾキサン、ロイコボリン、リシノール酸、リン脂質、小腸粘膜下組織、ビタミンＥ、脂肪酸のポリグリセロールエステル、ラブラフィル、ラブラフィルＭ１９４４ＣＳ、クエン酸、グルタミン酸、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ゼラチン、イソプロピルミリステート、オイドラギット（Ｅｕｄｒａｇｉｔ）、テゴベタイン、ジミリストイルフォスファチジルコリン及びスクルレログルルカンなどの生物が利用可能な物質;Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ、エタノール及びジメチルスルホキシドなどの有機溶媒;メチルパラベンなどの保存剤;澱粉、シクロデキストリン及びその誘導体、ラクトース、グルコース、デキストラン、マンノース、スクロース、トレハロース、マルトース及びフィコールなどの糖類;イノシトール、マンニトール及びソルビトールなどのポリオール;スクロース-マンニトール及びグルコース-マンニトールなどの糖含有ポリオール;アラニン、アルギニン及びグリジンなどのアミノ酸;トレハロース-ポリエチルレングリコール、スクロース-ポリエチルレングリコール及びスクロース-デキストランなどのポリマー含有ポリオール;ソルビトール-グリシン及びスクロース-グリシンなどの糖含有アミノ酸;多様な分子量のポロキサマー、Ｔｗｅｅｎ ２０、Ｔｗｅｅｎ８０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ-１００、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）及びＢｒｉｊなどの界面活性剤;トレハロース-硫酸亜鉛及びマルトース-硫酸亜鉛などの糖含有イオン;ならびに珪酸塩、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＮａＢｒ、ＮａＩ、ＬｉＣｌ、ｎ‐Ｂｕ４ＮＢｒ、ｎ‐Ｐｒ４ＮＢｒ、Ｅｔ４ＮＢｒ、Ｍｇ（ＯＨ）２、Ｃａ（ＯＨ）２、ＺｎＣＯ３、Ｃａ３（ＰＯ４）２、ＺｎＣｌ２、（Ｃ２Ｈ３Ｏ２）２Ｚｎ、ＺｎＣＯ３、ＣｄＣｌ２、ＨｇＣｌ２、ＣｏＣｌ２、（ＣａＮＯ３）２、ＢａＣｌ２、ＭｇＣｌ２、ＰｂＣｌ２、ＡｌＣｌ３、ＦｅＣｌ２、ＦｅＣｌ３、ＮｉＣｌ２、ＡｇＣｌ、ＡｕＣｌ３、ＣｕＣｌ２、テトラデシル硫酸ナトリウム、臭化ドデシルトリメチルアンモニウム、塩化ドデシルトリメチルアンモニウム及び臭化テトラドデシルトリメチルアンモニウムなどの生物学的に許容可能な塩類（ｂｉｏａｃｃｅｐｔａｂｌｅ ｓａｌｔｓ）からなる群より選択された、１種類以上のものであり得る。
本発明において添加剤の含量は全生体活性物質到達用組成物または生体活性物質到達システム質量を基準に１×１０-６乃至３０重量%であってもよく、より好ましくは１×１０-３乃至１０重量%であり得る。添加剤の含量が前記範囲より少ない場合には所望する添加剤による効果を得ることができない。一方、前記含量より多い場合には有効成分の効果及び/または本発明の温度感応性高分子の特性を低下させる。
前記追加的に含まれる生物活性分子は蛋白質、ポリペプチド、ペプチド、ワクチン、遺伝子、ホルモン、抗癌剤及び新生血管抑制剤からなる群より選択された１つ以上のものであり得る。
前記タンパク質、ポリペプチド及びペプチドは赤血球生成因子（ＥＰＯ）、インターフェロン-α、インターフェロン-β、インターフェロン-γ、成長ホルモン（人間、豚、牛など）、成長ホルモン放出因子、神経成長因子（ＮＧＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ‐ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ‐ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ‐ＣＳＦ）、血液凝固因子、インシュリン、オキシトシン、バソプレッシン、副腎皮質刺激ホルモン、上皮成長因子、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、プロラクチン、ルリベリン、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）、ＬＨＲＨ作用剤、ＬＨＲＨ拮抗剤、ソマトスタチン、グルカゴン、インターロイキン-２（ＩＬ-２）、インターロイキン-１１（ＩＬ-１１）、ガストリン、テトラガストリン、ペンタガストリン、ウロガストロン、セクレチン、カルシトニン、エンケファリン、エンドルフィン、アンジオテンシン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＴＲＨ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘発リガンド（ＴＲＡＩＬ）、ヘパリン分解酵素、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ヒト心房性ナトリウム利尿ペプチド（ｈＡＮＰ）、グルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ‐１）、レニン、ブラジキニン、バシトラシン、ポリミキシン、コリスチン、チロシディン、グラミシジン、シクロスポリン、及びこれらの合成アナログ、単クローン抗体、抗体、修飾又は薬と同じ効果を示す物質、酵素及びサイトカインからなる群より選択された１つ以上のものであり得る。
前記ワクチンは肝炎ワクチンからなる群より選択された１つ以上のワクチンであり得る。
前記遺伝子は短い干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）、プラスミドＤＮＡ及びアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＡＳ‐ＯＤＮ）からなる群より選択された１つ以上のものであり得る。
前記ホルモンはテストステロン、エストラジオール、プロゲストロン、プロスタグランジン及びこれらの合成アナログならびに修飾又は薬と同じ効果を示す物質からなる群より選択された１つ以上のものであり得る。
前記抗癌剤はパクリタキセル、ドキソルビシン、５-フルオロウラシル、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、テガフール、イリノテカン、ドセタキセル、シクロホスファミド、ゲムシタビン（ｃｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、イホスファミド、マイトマイシンＣ、ビンクリスチン、エトポシド、メトトレキサート、トポテカン、タモキシフェン、ビノレルビン、カムトテシン、ダヌオルビシン、クロラムブシル、ブリオスタチン-１、カリケアマイシン、マイアタンシン、レバミゾール、ＤＮＡ組換えインターフェロンα-２ａ、ミトキサントロン、ニムスチン、インターフェロンα-２ａ、ドキシフルリジン、フォルメスタン、酢酸ロイプロリド、酢酸メゲストロール、カルモフール、テニポシド、ブレオマイシン、カルムスチン、ヘプタプラチン、エキセメスタン、アナストロゾール、エストラムスチン、カペシタビン、酢酸ゴセレリン、ポリサッカライドカリウム、酢酸メドロキシポゲステロン、エピルビシン、レトロゾール、ピラルビシン、トポテカン、アルトレタミン、トレミフェンクエン酸塩、ＢＣＮＵ、タキソテール、アクチノマイシンＤポリエチルレングリコール接合蛋白質、及びこれらの合成アナログならびに修飾又は薬と同じ効果を示す物質からなる群より選択された１つ以上の物質であり得る。
前記新生血管抑制剤はＢＭＳ‐２７５２９１（Ｂｒｉｓｔｏｌ‐Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ）、クロドロネート、６-デオキシ-６-デメチル-４-デジメチルアミノテトラサイクリン（ＣＯＬ‐３）、ドキシサイクリン、マリマスタット、２-メトキシエストラジオール、スクアラミン、ＳＵ５１６４，サリドマイド、ＴＮＰ-４７０，コンブレタスタチンＡ４、大豆イソフラボン、エンザスタウリン、ＣＣ５０１３（Ｒｅｖｉｍｉｄ；ＣｅｌｇｅｎｅＣｏｒｐ、Ｗａｒｒｅｎ、ＮＪ）、セレコキシブ、ＺＤ６４７４，ハロフジノン臭化水素酸塩、インターフェロン-α、ベバシズマブ、ＡＥ-９４１、インターロイキン-１２、血管内皮成長因子トラップ（ＶＥＦＧ‐ｔｒａｐ）、セツキシマブ及びこれらの合成アナログならびに修飾又は薬と同じ効果を示す物質からなる群より選択された１つ以上の物質であり得る。
前記追加的に含まれる細胞は治療目的の細胞でもあり、前骨芽細胞、軟骨細胞、新生血管細胞（ＵＶＥＣ）、骨芽細胞、成体幹細胞、シュワン細胞、希突起膠細胞、肝細胞、壁細胞（ＵＶＥＣと組み合わせて治療）、筋芽細胞、インシュリン分泌細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、繊維芽細胞、β細胞、内胚葉細胞、肝幹細胞、糸球体傍細胞、骨格筋細胞、角化細胞、メラニン細胞、ランゲルハンス細胞、メルケル細胞、真皮繊維芽細胞及び前脂肪細胞からなる群より選択された１つ以上のものであり得る。
本発明のポリ有機ホスファゼン-生物活性分子接合体組成物が追加の薬物を含む場合、追加的生物活性分子の含量は全組成物体積を基準に１×１０-８乃至５０体積％、好ましくは１×１０-４乃至２０体積％であるのがよい。薬物の含量が前記範囲より少ない場合には所望する薬物の効果を得ることができず、前記含量より多い場合には温度感応性高分子のを低下させる。
本発明のポリ有機ホスファゼン-生物活性分子含有組成物は腸管外投与、眼科的投与、軟骨組織、骨組織、脂肪組織、または癌組織への局所的注入、吸入、経皮性投与、膣投与、尿道投与、直腸投与、経鼻投与、経口投与、肺投与、経耳投与、筋肉投与、皮下投与及び静脈投与からなる群より選択された投与経路を通じて投与されるのが可能であり、特に皮下投与、筋肉投与、経皮投与、または腫瘍内投与などの局部投与が好ましい。
本発明の組成物は温度感応性ポリ有機ホスファゼンの特性上室温ではゾル相で存在するので、多様な形態で体内注入が容易である。特に、本発明の組成物は所望する部位に局部的に適用するのに容易で、組成物が体内に注入された場合、体温によって生物活性分子はゲル相に変化しるので、結合された生物活性分子の放出調節が容易である。
以下の実施例で、当業者はより明らかに、現在の発明を実施する方法を理解することができる。本発明はその好ましい特定の具体例と共に記述されるが、以下の記載は、本発明の範囲を明らかにし、および限定しないことを目的とすることを理解すべきである。本発明の他の態様は、発明が関係する当業者にとって明らかである。
以下の実施例において、生成物に対する炭素、水素及び窒素元素分析は韓国科学技術研究院特性分析センターのＰｅｒｋｉｎ‐ＥｌｍｅｒＣ、Ｈ、Ｎ分析器によって行った。
水素及びリン核磁気共鳴スペクトルはＶａｒｉａｎ Ｇｅｍｉｎｉ‐３００で、重量平均分子量（Ｍｗ）はＷａｔｅｒｓ １５１５ポンプ及び２４１０微分屈折計のゲル透過クロマトグラフィーでそれぞれ測定した。
全ての製造反応工程では、反応物質は５０℃で真空、窒素ラインを使用して２日間乾燥させて水分を最大限に除去した後に使用し、フラスコもまた真空状態で複数回乾燥させて使用した。製造工程中にカニューレによって溶媒と添加物を滴加した。
実施例１:ポリ[（イソロイシンエチルエステル）（アミノメトキシポリエチレングリコール５５０）（グリシルグリシン）（グリシルグリシルパクリタキセル）ホスファゼン]、[ＮＰ（ＩｌｅＯＥｔ）１．２５（ＡＭＰＥＧ５５０）０．５１（ＧｌｙＧｌｙＣＯＯＨ）０．２２(ＧｌｙＧｌｙＰＴＸ)０．０２]ｎの製造
乾燥させたイソロイシンエチルエステル塩化水素塩（４．２２ｇ、２１．５８ｍｍｏｌ）を無水テトラヒドロフラン１００ｍｌに溶解した後、トリエチルアミン（６．５５ｇ、６４．７４ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液に無水テトラヒドロフラン５０ｍｌに溶かしたポリ（ジクロロホスファゼン）（２．００ｇ、１７．２６ｍｍｏｌ）を‐６０℃のドライアイス-アセトン湯煎で滴加した後、徐々に常温に上げて４８時間反応させた。
３１Ｐ‐ＮＭＲを確認しながら反応の進行程度を確認した後、乾燥させたグリシルグリシンアリルエステルトリフルオロ酢酸塩（１．１９ｇ、４．１４ｍｍｏｌ）を無水テトラヒドロフラン５０ｍｌに溶かした。トリエチルアミン（１．２６ｇ、１２．４２ｍｍｏｌ）を加えて反応物に添加して、混合物を８時間反応させた。
再び３１Ｐ‐ＮＭＲを確認しながら反応の進行程度を確認した後、乾燥させた分子量５５０のアミノメトキシポリエチレングリコール（９．６８ｇ、１７．６１ｍｍｏｌ）を無水テトラヒドロフラン（５０ｍｌ）に溶かした溶液を前記反応生成物に滴加した。混合物は常温で１２時間及び４０乃至５０℃で２４時間反応させた。
反応溶液をろ過して生成されたトリエチルアミンヒドロクロライド塩を除去した。反応濾液を溶媒が少し残るまで減圧濃縮した。この濃縮液をテトラヒドロフラン（１０ｍｌ）に溶かした後、過剰のヘキサンを加えて沈澱を誘導した。工程を２乃至３回繰り返した後、沈殿物を再び少量のメチルアルコールに溶かした。得られた溶液はＭＷＣＯ１２０００メンブレン（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ.）に入れて、室温で５日間メチルアルコールで透析した後、５日間蒸溜水で透析した。得られた生成物は低温乾燥して、ポリ（ジクロロホスファゼン）高分子[ＮＰ(ＩｌｅＯＥｔ)１．２５(ＡＭＰＥＧ５５０)０．５１(ＧｌｙＧｌｙＯＡｌｌ)０．２４]ｎ(１４．２１g)を得た。
得られた[ＮＰ(ＩｌｅＯＥｔ)１．２５(ＡＭＰＥＧ５５０)０．５１(ＧｌｙＧｌｙＯＡｌｌ)０．２４]ｎ(１４．２１ｇ)を無水テトラヒドロフラン（２００ｍｌ）に溶かして１５モル％のテトラキストライフェニルホスフィンパラジウム（０）（０．５６ｇ）と２０当量のモルフォリン（４．２３ｇ）を使用して常温で８時間反応させた。得られた溶液はＭＷＣＯ６-８０００メンブレン(Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ.)に入れて室温でメチルアルコールで５日間透析した後、４℃で蒸溜水で５日間透析した後、低温乾燥して中間生成物[ＮＰ(ＩｌｅＯＥｔ)１．２５(ＡＭＰＥＧ５５０)０．５１(ＧｌｙＧｌＣＯＯＨ)０．２４]ｎ(１３．７８ｇ)を得た。
得られた[ＮＰ(ＩｌｅＯＥｔ)１．２５(ＡＭＰＥＧ５５０)０．５１(ＧｌｙＧｌｙＣＯＯＨ)０．２４]ｎ(１３．７８ｇ)を無水ジクロロメタン（１００ｍｌ）に溶かし、０．０２当量のパクリタキセル（０．３９ｇ）及び０．０４当量のジシクロヘキシルカルボジイミド（０．１６ｇ）と０．０４当量のジメチルアミノピリジン（０．１０ｇ）を添加して０℃で２４時間反応させた。得られた溶液をＭＷＣＯ６-８０００メンブレン(Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ.)に入れて、室温でメチルアルコールで５日間透析した後、４℃で蒸溜水で５日間透析した。得られた生成物を低温乾燥して最終生成物[ＮＰ(ＩｌｅＯＥｔ)１．２５(ＡＭＰＥＧ５５０)０．５１(ＧｌｙＧｌｙＣＯＯＨ)０．２２(ＧｌｙＧｌｙＰＴＸ)０．０２]ｎ１３．０２ｇ（収率８９％）を得た。
組成式: Ｃ２５Ｈ４３Ｎ３Ｏ８Ｐ
元素分析値:Ｃ、５５．２７；Ｈ、７．８３；Ｎ、７．６３
理論値:Ｃ、５５．４５；Ｈ、７．７２；Ｎ、７．７１
水素核磁気共鳴スペクトル(ＤＭＳＯ‐ｄ６、ｐｐｍ):δ０．９２(ｂ、ＣＨ３)、０．１１(ｓ、ＣＨ３)、１．２５(ｂ、ＣＨ２)、１．５７（ｓ、ＣＨ３）、１．６５乃至１．７９（ｂ、ＣＨ）、１．８６（ｓ、ＣＨ３）、２．１８（ｓ、ＣＨ３）、２．３０（ｓ、ＣＨ３）、３．３０（ｓ、ＣＨ３）、３．４２乃至３．５０（ｂ、ＣＨ２）、３．５６（ｓ、ＣＨ２）、４．０８（ｂ、ＣＨ）、４．１５（ｂ、ＣＨ２）、４．６５（ｔ、ＣＨ）、４．７８（ｓ、ＯＨ）、４．９９（ｔ、ＣＨ）、５．２２（ｓ、ＣＨ）、５．４８（ｄ、ＣＨ）、５．６４（ｄ、ＣＨ）、５．９６（ｔ、ＣＨ）、６．２６（ｄ、ＣＨ）、６．３６ｓ、ＯＨ）、７．２８乃至８．０４（ｍ、芳香族）、９．００（ｄ、ＮＨ）。
リン核磁気共鳴スペクトル（ＤＭＳＯ‐ｄ６、ｐｐｍ）:δ１７．９
平均分子量（Ｍｗ）:４５０００
実施例２:ポリ[（イソロイシンエチルエステル）（アミノメトキシポリエチレングリコール５５０）（グリシルグリシン）（グリシルグリシルパクリタキセル）ホスファゼン]、[ＮＰ(ＩｌｅＯＥｔ)１．２５(ＡＭＰＥＧ５５０)０．５５(ＧｌｙＧｌｙＣＯＯＨ)０．１８(ＧｌｙＧｌｙＰＴＸ)０．０２]ｎの製造
ポリ（ジクロロホスファゼン）（２．００ｇ、１７．２６ｍｍｏｌ）、イソロイシンエチルエステル（４．２２ｇ、２１．５８ｍｍｏｌ）、グリシルグリシンアリルエステルトリフルオロ酢酸塩（０．９９ｇ、３．４５ｍｍｏｌ）、分子量５５０のアミノメトキシポリエチレングリコール（１０．４４ｇ、１８．９９ｍｍｏｌ）、テトラキストライフェニルホスフィン、パラジウム（０）（０．６１ｇ）、モルフォリン（４．８５ｇ）、パクリタキセル（０．４０ｇ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（０．１７ｇ）、ジメチルアミノピリジン（０．１０ｇ）、トリエチルアミン（７．５９ｇ）、テトラヒドロフラン（５５０ｍｌ）、ジクロロメタン（１００ｍｌ）を使用することを除き、実施例１と同じ方法で、最終生成物[ＮＰ(ＩｌｅＯＥｔ)１．２５(ＡＭＰＥＧ５５０)０．５５(ＧｌｙＧｌｙＣＯＯＨ)０．１８(ＧｌｙＧｌｙＰＴＸ)０．０２]ｎ６．９５ｇ（収率７７％）を得た。
組成式: Ｃ３０Ｈ６８Ｎ８Ｏ１４Ｐ
元素分析値:Ｃ、４７．８０；Ｈ、９．２０；Ｎ、９．６０
理論値:Ｃ、４８．２１；Ｈ、８．９７；Ｎ、９．５８
水素核磁気共鳴スペクトル(ＤＭＳＯ‐ｄ６、ｐｐｍ):δ０．９２(ｂ、ＣＨ３)、０．１１(ｓ、ＣＨ３)、１．２５(ｂ、ＣＨ２)、１．５７(ｓ、ＣＨ３)、１．６５乃至１．７９(ｂ、ＣＨ)、１．８６(ｓ、ＣＨ３)、２．１８(ｓ、ＣＨ３)、２．３０(ｓ、ＣＨ３)、３．３０(ｓ、ＣＨ３)、３．４２乃至３．５０(ｂ、ＣＨ２)、３．５６(ｓ、ＣＨ２)、４．０８(ｂ、ＣＨ)、４．１５(ｂ、ＣＨ２)、４．６５(ｔ、ＣＨ)、４．７８(ｓ、ＯＨ)、４．９９(ｔ、ＣＨ)、５．２２(ｓ、ＣＨ)、５．４８(ｄ、ＣＨ)、５．６４(ｄ、ＣＨ)、５．９６(ｔ、ＣＨ)、６．２６(ｄ、ＣＨ)、６．３６（ｓ、ＯＨ)、７．２８乃至８．０４(ｍ、芳香族)、９．００(ｄ、ＮＨ)。
リン核磁気共鳴スペクトル(ＤＭＳＯ‐ｄ６、ｐｐｍ):δ１８．２
平均分子量（Ｍｗ）:３１０００
実施例３:ポリ[（イソロイシンエチルエステル）（アミノメトキシポリエチレングリコール５５０）（グリシルグリシン）（グリシルグリシルドキソルビシン）ホスファゼン]、[ＮＰ(ＩｌｅＯＥｔ)１．２０(ＡＭＰＥＧ５５０)０．６０(ＧｌｙＧｌｙＣＯＯＨ)０．１０(ＧｌｙＧｌｙＤＯＸ)０．０４]ｎの製造
ポリ（ジクロロホスファゼン）（２．００ｇ、１７．２６ｍｍｏｌ）、イソロイシンエチルエステル（４．２２ｇ、２１．５８ｍｍｏｌ）、グリシルグリシンアリルエステルトリフルオロ酢酸塩（０．９９ｇ、３．４５ｍｍｏｌ）、分子量５５０のアミノメトキシポリエチレングリコール（１０．４４ｇ、１８．９９ｍｍｏｌ）、テトラキストライフェニルホスフィンパラジウム（０）（０．６２ｇ）、モルフォリン（４．９５ｇ）、トリエチルアミン（７．６０ｇ）、テトラヒドロフラン（５５０ｍｌ）を使用することを除き、実施例１と同じ方法で中間生成物[ＮＰ(ＩｌｅＯＥｔ)１．２０(ＡＭＰＥＧ５５０)０．６０(ＧｌｙＧｌｙＣＯＯＨ)０．１４]ｎ（１１．２３ｇ）を得た。
得られた[ＮＰ(ＩｌｅＯＥｔ)１．２０(ＡＭＰＥＧ５５０)０．６０(ＧｌｙＧｌｙＣＯＯＨ)０．１４]ｎ（１１．２３ｇ）を無水テトラヒドロフラン（１００ｍｌ）に溶かし、０．０８当量のトリブチルアミン（０．２２ｇ）と０．０８当量のイソブチルギ酸エステル（０．１６ｇ）を０℃で３０分間滴加して加えた。その後０．０４当量のドキソルビシン（０．４４ｇ）を少量の水に溶かし、前記活性化した溶液に滴加して０℃で１時間室温で２４時間反応させた。
反応濾液をＭＷＣＯ６-８０００メンブレンに入れて室温でメチルアルコールで５日間透析し、次いで４℃で蒸溜水に５日間透析した後、低温乾燥して最終生成物[ＮＰ(ＩｌｅＯＥｔ)１．２０(ＡＭＰＥＧ５５０)０．６０(ＧｌｙＧｌｙＣＯＯＨ)０．１０(ＧｌｙＧｌｙＤＯＸ)０．０４]ｎ１０．０２g（収率８２％）を得た。
組成式： Ｃ２９Ｈ７０Ｎ５Ｏ１４Ｐ
元素分析値:Ｃ、４７．０１；Ｈ、９．３８；Ｎ、９．５９
理論値:Ｃ、４６．９８；Ｈ、８．９７；Ｎ、８．９８
水素核磁気共鳴スペクトル(ＤＭＳＯ‐ｄ６、ｐｐｍ):δ０．９２(ｂ、ＣＨ３)、１．２５(ｂ、ＣＨ２)、１．５７(ｓ、ＣＨ３)、１．６５乃至１．７９(ｂ、ＣＨ)、２．１６(ｍ、ＣＨ)、３．４２乃至３．５０(ｂ、ＣＨ２)、３．５６(ｓ、ＣＨ２)、４．０８(ｂ、ＣＨ)、４．５６(ｍ、ＣＨ)、４．６８(ｄ、ＣＨ)、４．８５(ｍ、ＣＨ)、４．９４(ｍ、ＣＨ)、５．２１(ｓ、ＣＨ)、５．４５(ｓ、ＣＨ)、６．６３(ｄ、ＮＨ)、７．６５(ｍ、ＣＨ)、７．９２(ｄ、ＣＨ)、４．０８(ｂ、ＣＨ)。
リン核磁気共鳴スペクトル(ＤＭＳＯ‐ｄ６、ｐｐｍ):δ１７．９
平均分子量（Ｍｗ）:３９２０００
実施例４:ポリ[（イソロイシンエチルエステル）（アミノメトキシポリエチレングリコール５５０）（グリシルグリシン）（グリシルグリシルドキソルビシン）ホスファゼン]、[ＮＰ(ＩｌｅＯＥｔ)１．２４(ＡＭＰＥＧ５５０)０．５７(ＧｌｙＧｌｙＣＯＯＨ)０．１４(ＧｌｙＧｌｙＤＯＸ)０．０５]ｎの製造
ポリ（ジクロロホスファゼン）（２．００ｇ、１７．２６ｍｍｏｌ）、イソロイシンエチルエステル（４．１９ｇ、２１．４０ｍｍｏｌ）、グリシルグリシンアリルエステルトリフルオロ酢酸塩（０．９４ｇ、３．２８ｍｍｏｌ）、分子量５５０のアミノメトキシポリエチレングリコール（１０．８２g、１９．６８ｍｍｏｌ）、テトラキストライフェニルホスフィンパラジウム（０）（０．６３ｇ）、モルフォリン（５．０５ｇ）、ドキソルビシン（０．５１ｇ）、イソブチルギ酸エステル（０．１９ｇ）、トリブチルアミン（０．２６ｇ）、トリエチルアミン（７．４９ｇ）、テトラヒドロフラン（６５０ｍｌ）を使用することを除き、実施例３と同じ方法で最終生成物[ＮＰ(ＩｌｅＯＥｔ)１．２４(ＡＭＰＥＧ５５０)０．５７(ＧｌｙＧｌｙＣＯＯＨ)０．１４(ＧｌｙＧｌｙＤＯＸ)０．０５]ｎ１１．２５g（収率８１％）を得た。
組成式： Ｃ２５Ｈ５７Ｎ５Ｏ１１Ｐ
元素分析値：Ｃ、４８．１２；Ｈ、９．３０；Ｎ、１１．２６
理論値：Ｃ、４９．４１；Ｈ、９．６３；Ｎ、１０．９１
水素核磁気共鳴スペクトル(ＤＭＳＯ‐ｄ６、ｐｐｍ):δ０．９２(ｂ、ＣＨ３)、１．２５(ｂ、ＣＨ２)、１．５７(ｓ、ＣＨ３)、１．６５乃至１．７９(ｂ、ＣＨ)、２．１６(ｍ、ＣＨ)、３．４２乃至３．５０(ｂ、ＣＨ２)、３．５６(ｓ、ＣＨ２)、４．０８(ｂ、ＣＨ)、４．５６(ｍ、ＣＨ)、４．６８(ｄ、ＣＨ)、４．８５(ｍ、ＣＨ)、４．９４（ｍ、ＣＨ)、５．２１(ｓ、ＣＨ)、５．４５(ｓ、ＣＨ)、６．６３(ｄ、ＮＨ)、７．６５(ｍ、ＣＨ)、７．９２(ｄ、ＣＨ)、４．０８(ｂ、ＣＨ)。
リン核磁気共鳴スペクトル(ＤＭＳＯ‐ｄ６、ｐｐｍ):δ１８．１
平均分子量（Ｍｗ）:９１８００
実施例５:ポリ[（イソロイシンエチルエステル）（アミノメトキシポリエチレングリコール５５０）（グリシルグリシン）（グリシルグリシルドキソルビシン）ホスファゼン]、[ＮＰ(ＩｌｅＯＥｔ)１．２２(ＡＭＰＥＧ５５０)０．６６(ＧｌｙＧｌｙＣＯＯＨ)０．０６(ＧｌｙＧｌｙＤＯＸ)０．０６]ｎの製造
ポリ（ジクロロホスファゼン）（２．００ｇ、１７．２６ｍｍｏｌ）、イソロイシンエチルエステル（４．１２ｇ、２１.０６ｍｍｏｌ）、グリシルグリシンアリルエステルトリフルオロ酢酸塩（０．５９ｇ、２．０７ｍｍｏｌ）、分子量５５０のアミノメトキシポリエチレングリコール（１２．５３ｇ、２２．７８ｍｍｏｌ）、テトラキストライフェニルホスフィンパラジウム（０）（０．５３ｇ）、モルフォリン（４．７８ｇ）、ドキソルビシン（０．８０ｇ）、イソブチルクロロギ酸エステル（０．２９ｇ）、トリブチルアミン（０．４０ｇ）、トリエチルアミン（７．０２ｇ）、テトラヒドロフラン（６５０ｍｌ）を使用することを除き、実施例３と同じ方法で最終生成物[ＮＰ(ＩｌｅＯＥｔ)１．２２(ＡＭＰＥＧ５５０)０．６６(ＧｌｙＧｌｙＣＯＯＨ)０．０６(ＧｌｙＧｌｙＤＯＸ)０．０６]ｎ１３．３８g（収率８７％）を得た。
組成式： Ｃ２６Ｈ６３Ｎ５Ｏ１２Ｐ
元素分析値：Ｃ、４６．９５；Ｈ、９．４８；Ｎ、１０．７４
理論値：Ｃ、４６．２１；Ｈ、８．９５；Ｎ、１０．１３
水素核磁気共鳴スペクトル(ＤＭＳＯ‐ｄ６、ｐｐｍ):δ０．９２(ｂ、ＣＨ３)、１．２５(ｂ、ＣＨ２)、１．５７(ｓ、ＣＨ３)、１．６５乃至１．７９(ｂ、ＣＨ)、２．１６(ｍ、ＣＨ)、３．４２乃至３．５０(ｂ、ＣＨ２)、３．５６(ｓ、ＣＨ２)、４．０８(ｂ、ＣＨ)、４．５６(ｍ、ＣＨ)、４．６８(ｄ、ＣＨ)、４．８５(ｍ、ＣＨ)、４．９４(ｍ、ＣＨ)、５．２１(ｓ、ＣＨ)、５．４５(ｓ、ＣＨ)、６．６３(ｄ、ＮＨ)、７．６５(ｍ、ＣＨ)、７．９２(ｄ、ＣＨ)、４．０８(ｂ、ＣＨ)。
リン核磁気共鳴スペクトル(ＤＭＳＯ‐ｄ６、ｐｐｍ):δ１９．０
平均分子量（Ｍｗ）:８８５００
実施例６:ポリ[（イソロイシンエチルエステル）（アミノメトキシポリエチレングリコール７５０）（グリシルグリシン）（グリシルグリシルドキソルビシン）ホスファゼン]、[ＮＰ(ＩｌｅＯＥｔ)１．２７(ＡＭＰＥＧ７５０)０．５７(ＧｌｙＧｌｙＣＯＯＨ)０．２３(ＧｌｙＧｌｙＤＯＸ)０．０５]ｎの製造
ポリ（ジクロロホスファゼン）（２．００g、１７．２６ｍｍｏｌ）、イソロイシンエチルエステル（４．２９ｇ、２１．９２ｍｍｏｌ）、グリシルグリシンアリルエステルトリフルオロ酢酸塩（１．３８ｇ、４．８３ｍｍｏｌ）、分子量７５０のアミノメトキシポリエチレングリコール（１４．７６ｇ、１９．６８ｍｍｏｌ）、テトラキストライフェニルホスフィンパラジウム（０）（０．７１ｇ）、モルフォリン（５．９８ｇ）、ドキソルビシン（０．６７ｇ）、イソブチルクロロギ酸エステル（０．２４ｇ）、トリブチルアミン（０．３４ｇ）、トリエチルアミン（８．１２ｇ）、テトラヒドロフラン（６５０ｍｌ）を使用することを除き、実施例３と同じ方法で最終生成物[ＮＰ(ＩｌｅＯＥｔ)１．２７(ＡＭＰＥＧ７５０)０．５７(ＧｌｙＧｌｙＣＯＯＨ)０．２３(ＧｌｙＧｌｙＤＯＸ)０．０５]ｎ１４．９５g（収率７３％）を得た。
組成式： Ｃ２０Ｈ４０Ｎ３Ｏ７Ｐ
元素分析値：Ｃ、５０．６５；Ｈ、８．６４；Ｎ、８．９８
理論値：Ｃ、４９．４９；Ｈ、８．５５；Ｎ、８．７９
水素核磁気共鳴スペクトル(ＤＭＳＯ‐ｄ６、ｐｐｍ):δ０．９２(ｂ、ＣＨ３)、１．２５(ｂ、ＣＨ２)、１．５７(ｓ、ＣＨ３)、１．６５乃至１．７９(ｂ、ＣＨ)、２．１６(ｍ、ＣＨ)、３．４２乃至３．５０(ｂ、ＣＨ２)、３．５６(ｓ、ＣＨ２)、４．０８(ｂ、ＣＨ)、４．５６(ｍ、ＣＨ)、４．６８(ｄ、ＣＨ)、４．８５(ｍ、ＣＨ)、４．９４(ｍ、ＣＨ)、５．２１(ｓ、ＣＨ)、５．４５(ｓ、ＣＨ)、６．６３(ｄ、ＮＨ)、７．６５(ｍ、ＣＨ)、７．９２(ｄ、ＣＨ)、４．０８(ｂ、ＣＨ)。
リン核磁気共鳴スペクトル(ＤＭＳＯ‐ｄ６、ｐｐｍ):δ１９．１
平均分子量（Ｍｗ）:８７４００
実施例７:ポリ[（イソロイシンエチルエステル）（アミノメトキシポリエチレングリコール５５０）（グリシルグリシン）（グリシルグリシルグリシン-アルギニン-グリシン-アスパラギン-セリン酸ペプチド）ホスファゼン]、[ＮＰ(ＩｌｅＯＥｔ)１．３０(ＡＭＰＥＧ５５０)０．５３(ＧｌｙＧｌｙＣＯＯＨ)０．０７(ＧｌｙＧｌｙＧＲＧＤＳ)０．１０]ｎの製造
ポリ（ジクロロホスファゼン）（２．００ｇ、１７．２６ｍｍｏｌ）、イソロイシンエチルエステル（４．３９ｇ、２２．４４ｍｍｏｌ）、グリシルグリシンアリルエステルトリフルオロ酢酸塩（０．８４ｇ、２．９３ｍｍｏｌ）、分子量５５０のアミノメトキシポリエチレングリコール（１０．０６ｇ、１８．３０ｍｍｏｌ）、テトラキストライフェニルホスフィンパラジウム（０）（０．４８ｇ）、モルフォリン（４．２３ｇ）、グリシン-アルギニン-グリシン-アスパラギン-セリン酸ペプチド（０．８７ｇ）、イソブチル クロロギ酸エステル（０．０６ｇ）、トリブチルアミン（０．６２ｇ）、トリエチルアミン（７．７０ｇ）、テトラヒドロフラン（６５０ｍｌ）を使用することを除き、実施例３と同じ方法で最終生成物[ＮＰ(ＩｌｅＯＥｔ)１．３０(ＡＭＰＥＧ５５０)０．５３(ＧｌｙＧｌｙＣＯＯＨ)０．０７(ＧｌｙＧｌｙＧＲＧＤＳ)０．１０]ｎ１０．８７g（収率７２％）を得た。
製造された最終生成物は韓国基礎科学研究院のプロテオーム分析チームでタンパク質分析を用いてＧＲＧＤＳの含量を計算した。
組成式： Ｃ２２Ｈ４４Ｎ３Ｏ９Ｐ
元素分析値：Ｃ、５０．５４；Ｈ、８．５０；Ｎ、８．０３
理論値：Ｃ、５０．５０；Ｈ、８．２３；Ｎ、７．９８
水素核磁気共鳴スペクトル(ＤＭＳＯ‐ｄ６、ｐｐｍ):δ０．９２(ｂ、ＣＨ３)、１．２５(ｂ、ＣＨ２)、１．５７(ｓ、ＣＨ３)、１．６５乃至１．７９(ｂ、ＣＨ)、３．４２乃至３．５０(ｂ、ＣＨ２)、３．５６(ｓ、ＣＨ２)、４．０８(ｂ、ＣＨ)、４．１５(ｂ、ＣＨ２)。
リン核磁気共鳴スペクトル(ＤＭＳＯ‐ｄ６、ｐｐｍ):δ１８．９
平均分子量（Ｍｗ）:１０８１００
実施例８:ポリ[（イソロイシンエチルエステル）（アミノメトキシポリエチレングリコール５５０）（グリシルグリシン）（グリシルグリシルグリシン-アルギニン-グリシン-アスパラギン-セリン酸ペプチド）ホスファゼン]、[ＮＰ(ＩｌｅＯＥｔ)１．１３(ＡＭＰＥＧ５５０)０．５０(ＧｌｙＧｌｙＣＯＯＨ)０．０４(ＧｌｙＧｌｙＧＲＧＤＳ)０．１５]ｎの製造
ポリ（ジクロロホスファゼン）（２．００ｇ、１７．２６ｍｍｏｌ）、イソロイシンエチルエステル（３．８１ｇ、１９．５０ｍｍｏｌ）、グリシルグリシンアリルエステルトリフルオロ酢酸塩（０．９４ｇ、３．２８ｍｍｏｌ）、分子量５５０のアミノメトキシポリエチレングリコール（９．４９ｇ、１７．２６ｍｍｏｌ）、テトラキストライフェニルホスフィンパラジウム（０）（０．４３ｇ）、モルフォリン（４．１２ｇ）、グリシン-アルギニン-グリシン-アスパラギン-セリン酸ペプチド（２．６１ｇ）、イソブチル クロロギ酸エステル（０．１８ｇ）、トリブチルアミン（１．８６ｇ）、トリエチルアミン（６．９２ｇ）、テトラヒドロフラン（６５０ｍｌ）を使用することを除き、実施例３と同じ方法で最終生成物[ＮＰ(ＩｌｅＯＥｔ)１．１３(ＡＭＰＥＧ５５０)０．５０(ＧｌｙＧｌｙＣＯＯＨ)０．０４(ＧｌｙＧｌｙＧＲＧＤＳ)０．１５]ｎ１１．２１g（収率８１％）を得た。
組成式： Ｃ２４Ｈ５０Ｎ３Ｏ１０Ｐ
元素分析値：Ｃ、５１．２５；Ｈ、８．７１；Ｎ、７．２１
理論値：Ｃ、５０．９８Ｈ、８．５０Ｎ、７．９２
水素核磁気共鳴スペクトル(ＤＭＳＯ‐ｄ６、ｐｐｍ):δ０．９２(ｂ、ＣＨ３)、１．２５(ｂ、ＣＨ２)、１．５７(ｓ、ＣＨ３)、１．６５乃至１．７９(ｂ、ＣＨ)、３．４２乃至３．５０(ｂ、ＣＨ２)、３．５６(ｓ、ＣＨ２)、４．０８(ｂ、ＣＨ)、４．１５(ｂ、ＣＨ２)。
リン核磁気共鳴スペクトル（ＤＭＳＯ‐ｄ６、ｐｐｍ）:δ１９．２
平均分子量（Ｍｗ）:９８３００
実施例９:ポリ[（イソロイシンエチルエステル）（アミノメトキシポリエチレングリコール５５０）（グリシルグリシン）（グリシルグリシルグルライシネティレステル）（グリシルグリシルグリシン-アルギニン-グリシン-アスパラギン-セリン酸ペプチド）ホスファゼン]、[ＮＰ(ＩｌｅＯＥｔ)１．１９(ＡＭＰＥＧ５５０)０．５２(ＧｌｙＧｌｙＣＯＯＨ)０．１０(ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＯＥｔ)０．０２(ＧｌｙＧｌｙＧＲＧＤＳ)０．１０]ｎの製造
ポリ（ジクロロホスファゼン）（２．００ｇ、１７．２６ｍｍｏｌ）、イソロイシンエチルエステル（３．８１ｇ、１９．５０ｍｍｏｌ）、グリシルグリシンアリルエステルトリフルオロ酢酸塩（０．９４ｇ、３．２８ｍｍｏｌ）、分子量５５０のアミノメトキシポリエチレングリコール（９．４９ｇ、１７．２６ｍｍｏｌ）、テトラキストライフェニルホスフィンパラジウム（０）（０．６１ｇ）、モルフォリン（５．３２ｇ）、グリシン-アルギニン-グリシン-アスパラギン-セリン酸ペプチド（１．７４ｇ）、イソブチル クロロギ酸エステル（０．１２ｇ）、トリブチルアミン（１．２４ｇ）、トリエチルアミン（７．７０ｇ）、テトラヒドロフラン（６５０ｍｌ）を使用することを除き、実施例３と同じ方法で中間生成物[ＮＰ(ＩｌｅＯＥｔ)１．１９(ＡＭＰＥＧ５５０)０．５２(ＧｌｙＧｌｙＣＯＯＨ)０．２０(ＧｌｙＧｌｙＧＲＧＤＳ)０．１０]ｎ（１３．７８g）を得た。
得られた[ＮＰ(ＩｌｅＯＥｔ)１．１９(ＡＭＰＥＧ５５０)０．５２(ＧｌｙＧｌｙＣＯＯＨ)０．２０(ＧｌｙＧｌｙＧＲＧＤＳ)０．１０]ｎをテトラヒドロフラン（１５０ｍｌ）に溶かした後、トリブチルアミン（０．１６ｇ）を入れて少量の水に溶解されているグリシルエチルエステル（０．０８ｇ）を滴下して室温で１時間反応させた。反応濾液をＭＷＣＯ６-８０００メンブレン(Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ.)に入れて室温でメチルアルコールで５日間透析した後、４℃で蒸溜水に５日間透析した。得られた生成物を低温乾燥して最終生成物[ＮＰ(ＩｌｅＯＥｔ)１．１９(ＡＭＰＥＧ５５０)０．５２(ＧｌｙＧｌｙＣＯＯＨ)０．１０(ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＯＥｔ)０．１０(ＧｌｙＧｌｙＧＲＧＤＳ)０．１０]ｎ１３．６４g（収率９１％）を得た。
組成式： Ｃ２５Ｈ５２Ｎ３Ｏ１０Ｐ
元素分析値:Ｃ、５１．５４；Ｈ、８．７７；Ｎ、７．１０
理論値:Ｃ、５１．８７Ｈ、８．５１Ｎ、６．８９
水素核磁気共鳴スペクトル(ＤＭＳＯ‐ｄ６、ｐｐｍ):δ０．９２(ｂ、ＣＨ３)、１．２５(ｂ、ＣＨ２)、１．５７(ｓ、ＣＨ３)、１．６５乃至１．７９(ｂ、ＣＨ)、３．４２乃至３．５０(ｂ、ＣＨ２)、３．５６(ｓ、ＣＨ２)、４．０８(ｂ、ＣＨ)、４．１５(ｂ、ＣＨ２)。
リン核磁気共鳴スペクトル(ＤＭＳＯ‐ｄ６、ｐｐｍ):δ１９．１
平均分子量（Ｍｗ）:２７２００
実施例１０:ポリ[（イソロイシンエチルエステル）（アミノメトキシポリエチレングリコール５５０）（グリシルグリシルグリシルエチルエステル）（グリシルグリシルグリシン-アルギニン-グリシン-アスパラギン-セリン酸ペプチド）ホスファゼン]、[ＮＰ(ＩｌｅＯＥｔ)１．１３(ＡＭＰＥＧ５５０)０．６５(ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＯＥｔ)０．１７(ＧｌｙＧｌｙＧＲＧＤＳ)０．０５]ｎの製造
ポリ（ジクロロホスファゼン）（２．００ｇ、１７．２６ｍｍｏｌ）、イソロイシンエチルエステル（４．３６ｇ、２２．２７ｍｍｏｌ）、グリシルグリシンアリルエステルトリフルオロ酢酸塩（０．８４ｇ、２．９３ｍｍｏｌ）、分子量５５０のアミノメトキシポリエチレングリコール（１０．２５ｇ、１８．６４ｍｍｏｌ）、テトラキストライフェニルホスフィンパラジウム（０）（０．５７ｇ）、モルフォリン（４．９８ｇ）、グリシン-アルギニン-グリシン-アスパラギン-セリン酸ペプチド（０．７９ｇ）、クルライシレティレステル（０．１３ｇ）、イソブチルクロロギ酸エステル（０．０７ｇ）、トリブチルアミン（０．６１ｇ）、トリエチルアミン（７．６４ｇ）、テトラヒドロフラン（８００ｍｌ）を使用することを除き、実施例３と同じ方法で最終生成物[ＮＰ(ＩｌｅＯＥｔ)１．２９(ＡＭＰＥＧ５５０)０．５４(ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＯＥｔ)０．１２(ＧｌｙＧｌｙＧＲＧＤＳ)０．０５]ｎ１２．２９g（収率８０％）を得た。
組成式： Ｃ２４Ｈ４７Ｎ３Ｏ９Ｐ
元素分析値：Ｃ、５１．６５；Ｈ、８．４８；Ｎ、７．６０
理論値：Ｃ、５０．９１；Ｈ、８．３０；Ｎ、７．８６
水素核磁気共鳴スペクトル(ＤＭＳＯ‐ｄ６、ｐｐｍ):δ０．９２(ｂ、ＣＨ３)、１．２５(ｂ、ＣＨ２)、１．５７(ｓ、ＣＨ３)、１．６５乃至１．７９(ｂ、ＣＨ)、３．４２乃至３．５０(ｂ、ＣＨ２)、３．５６(ｓ、ＣＨ２)、４．０８(ｂ、ＣＨ)、４．１５(ｂ、ＣＨ２)。
リン核磁気共鳴スペクトル（ＤＭＳＯ‐ｄ６、ｐｐｍ）:δ２０．０
平均分子量（Ｍｗ）:８６５００
実施例１１:ポリ[（イソロイシンエチルエステル）（アミノメトキシポリエチレングリコール５５０）（グリシルグリシン）（グリシルグリシルグリシン-アルギニン-グリシン-アスパラギン-チロシン酸ペプチド）ホスファゼン]、［ＮＰ（ＩｌｅＯＥｔ）１．２９（ＡＭＰＥＧ５５０）０．５４（ＧｌｙＧｌｙＣＯＯＨ）０．１２（ＧｌｙＧｌｙＧＲＧＤＹ）０．０５］ｎの製造
ポリ（ジクロロホスファゼン）（２．００ｇ、１７．２６ｍｍｏｌ）、イソロイシンエチルエステル（４．３６ｇ、２２．２７ｍｍｏｌ）、グリシルグリシンアリルエステルトリフルオロ酢酸塩（０．８４ｇ、２．９３ｍｍｏｌ）、分子量５５０のアミノメトキシポリエチレングリコール（１０．２５ｇ、１８．６４ｍｍｏｌ）、テトラキストライフェニルホスフィンパラジウム（０）（０．５１ｇ）、モルフォリン（４．２８ｇ）、グリシン-アルギニン-グリシン-アスパラギン-セリン酸ペプチド（０．８１ｇ）、イソブチル クロロギ酸エステル（０．０７１ｇ）、トリブチルアミン（０．６３ｇ）、トリエチルアミン（７．６５ｇ）、テトラヒドロフラン（６５０ｍｌ）を使用することを除き、実施例３と同じ方法で最終生成物［ＮＰ（ＩｌｅＯＥｔ）１．２９（ＡＭＰＥＧ５５０）０．５４（ＧｌｙＧｌｙＣＯＯＨ）０．１２（ＧｌｙＧｌｙＧＲＧＤＹ）０．０５］ｎ１６．１２g（収率８２％）を得た。
組成式： Ｃ２３Ｈ４５Ｎ３Ｏ９Ｐ
元素分析値:Ｃ、５０．６３；Ｈ、８．５２；Ｎ、７．７９
理論値:Ｃ、４９．４７；Ｈ、８．４９；Ｎ、７．７０
水素核磁気共鳴スペクトル（ＤＭＳＯ‐ｄ６、ｐｐｍ）:δ０．９２（ｂ、ＣＨ３）、１．２５（ｂ、ＣＨ２）、１．５７（ｓ、ＣＨ３）、１．６５乃至１．７９（ｂ、ＣＨ）、３．４２乃至３．５０（ｂ、ＣＨ２）、３．５６（ｓ、ＣＨ２）、４．０８（ｂ、ＣＨ）、４．１５（ｂ、ＣＨ２）。
リン核磁気共鳴スペクトル（ＤＭＳＯ‐ｄ６、ｐｐｍ）:δ１９．１
平均分子量（Ｍｗ）:８７４００
実施例１２:温度変化による薬物または生物活性分子が接合しているポリ有機ホスファゼン溶液のゾル-ゲル相転移の観察
本発明の実施例１乃至１１による薬物または生物活性分子が結合しているポリ有機ホスファゼンを各℃各１０重量％の濃度で４℃でリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）に溶解させた。この溶液を自動温度調節浴（ｂａｔｈ、ＴＣ-５０１）に装置された粘度計（Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ ＤＶ‐ＩＩＩ＋ Ｒｈｅｏｍｅｔｅｒ）のチャンバーに入れた。前段速度を秒当たり０．１乃至１．７にして分当り０．０４℃で温度を上昇させながら、これらの温度変化に応じるゾル-ゲル相転移を観察した。
前記で観察された本発明の薬物または生物活性分子が結合しているポリ有機ホスファゼンの温度変化に応じるゲル特性実験結果をの以下の表２に示した。
Figure 0005124561
図１は本発明実施例１のパクリタキセルと結合しているポリ有機ホスファゼン溶液の温度変化に対するゾル-ゲル相転移を表す写真である。この写真は、開始ゲル温度以下では流れる液相であるが、開始ゲル温度以上の最高ゲル温度ではゲル相であることを示す。
図２は本発明の抗癌剤または生物活性物質と接合したポリ有機ホスファゼンの温度変化に対する粘度変化を示したものである。
ポリ有機ホスファゼンに置換されている疎水性アミノ酸エステルの種類、分解速度が調節できるアミノ酸、ペプチド、デプシペプチドエステルの種類、官能基を有しているアミノ酸またはペプチド置換体の種類、メトキシポリエチルレングリコールの鎖長及びすべての置換体の組成の調節によって、広い範囲の最高ゲル温度及び最高ゲル強度を示すポリ有機ホスファゼンを製造することができる（大韓民国特許出願２００６-０００５５７９号）。
さらに、官能基に置換されている薬物または生物活性分子の種類及び置換程度に応じて最高ゲル強度を調節することができる。室温では溶液相で、および体温ではゲル相の、薬物または生物活性分子が直接的に結合されているポリ有機ホスファゼンを製造することができた。
実施例１３:パクリタキセルと結合しているポリ有機ホスファゼンの時間に対する質量減少程度の観察
本発明の実施例１及び実施例２のパクリタキセルと結合しているポリ有機ホスファゼンを１０重量％にリン酸緩衝食塩水に溶解させた。０．５ｍｌのパクリタキセルが化学結合しているポリ有機ホスファゼン溶液をミリセル（ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ）に入れて３７℃でハイドロゲルを作った後、１０ｍｌの０．１体積％のＳＤＳが含まれたリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）に浸して３７℃水槽に置いて５０ｒｐｍで振盪した。決められた時間にミリセルを取り出して凍結乾燥した後、パクリタキセルと結合しているポリ有機ホスファゼンの重量を測定した。
本発明のパクリタキセルと結合しているポリ有機ホスファゼンの時間経過に対する重量減少を図３に示した。図３から分かるように、パクリタキセルが結合しているポリ有機ホスファゼンハイドロゲルは３７℃水溶液条件で１０日目に５０％の質量減少を示し、３０日目には２０％のハイドロゲルが残っていた。
また、一定期間分解が進められた溶液を成分分析した結果、パクリタキセル、リン酸塩、アンモニア、エチルアルコールなどが検出された。よって、本発明のパクリタキセルと結合しているポリ有機ホスファゼンはパクリタキセルと高分子の結合が体内で分解され、パクリタキセルと結合が切れたポリ有機ホスファゼンは人体に無害なリン酸塩、アンモニア、エチルアルコールなどに分解されると推定される。
実施例１４:ドキソルビシンまたはＲＧＤペプチドが結合しているポリ有機ホスファゼンの時間に対する分子量減少程度の観察
本発明実施例３及び実施例４にで得られたドキソルビシンと接合しているポリ有機ホスファゼンと、実施例９で得られたＲＧＤペプチドが接合されているポリ有機ホスファゼンを、それぞれ１０重量％の濃度でリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）に溶解して３７℃水槽で置いて５０ｒｐｍで振盪した。時間経過に対する加水分解の程度を、ゲル透過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）を利用して測定した分子量の減少程度で評価した。
前記で測定された本発明のドキソルビシンと接合しているポリ有機ホスファゼン及びＲＧＤペプチドが接合されているポリ有機ホスファゼンの時間に応じる分子量の減少程度を図４に示した。図４から分かるように、３７℃で最も低い粘度を有している実施例９のＲＧＤペプチドが結合しているポリ有機ホスファゼンが最も速く加水分解され、３７℃で最も高い粘度を有している実施例３のドキソルビシンが結合しているポリ有機ホスファゼンが最も遅く加水分解された。
よって、本発明では３７℃で薬物及び生物活性分子が結合しているポリ有機ホスファゼンの粘度を調節して加水分解速度を調節することができた。
実施例１５:パクリタキセルが結合しているポリ有機ホスファゼンハイドロゲルの生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）へのパクリタキセルの放出挙動の観察
実施例３のポリ有機ホスファゼンが７重量％でリン酸緩衝食塩水に溶解している溶液にパクリタキセルを０．１体積％に溶解した。０．５ｍｌのパクリタキセルが結合されているポリ有機ホスファゼン溶液をミリセルに入れて３７℃でハイドロゲルを作った。
パクリタキセルが結合されているポリ有機ホスファゼンハイドロゲルを１００ｍｌの放出溶液に入れた。放出溶液は０．１体積％のＳＤＳが含まれたリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）を使用した。
放出溶液を３７℃水槽に置いて５０ｒｐｍで振盪した。その後、指定された時間に５ｍｌの放出溶液を採取してＨＰＬＣを使用して放出したパクリタキセル量を測定した。５ｍｌの放出溶液を採取した後には新たな放出溶液を充填した。
前記で測定されたパクリタキセルが結合しているポリ有機ホスファゼンハイドロゲルでのパクリタキセルの放出挙動を図５に示した。図５に示したように、パクリタキセルを含むポリ有機ホスファゼンハイドロゲルではパクリタキセルの放出が十分に調節され、および持続し、パクリタキセルは少なくとも５０日目まで放出できる。
実施例１６:ドキソルビシンが接合しているポリ有機ホスファゼンハイドロゲルの生体外へのドキソルビシンの放出挙動の観察
本発明の実施例３のドキソルビシンが接合しているポリ有機ホスファゼンを１０重量％で水に溶解させた。得られた溶液にドキソルビシンを０．１重量％で溶解させた。０．５ｍｌの溶解したドキソルビシンが結合しているポリ有機ホスファゼン溶液をミリセルに入れて３７℃でハイドロゲルを作製した。得られたドキソルビシンを含むポリ有機ホスファゼンを放出溶液として使用する１０ｍｌのリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）に加えた。得られたドキソルビシンを含むポリ有機ホスファゼンを含む放出溶液を３７℃水槽に入れて５０ｒｐｍで震盪した。
その後、指定された時間にミリセルを新たな放出溶液へ移した。ドキソルビシンの放出が起こる放出溶液中に放出されたドキソルビシン量は、ＵＶ‐ＶＩＳ分光器（励起:４９５ｎｍ）で測定した。
ドキソルビシンが結合しているポリ有機ホスファゼンハイドロゲルでのドキソルビシンの放出挙動を図５に示した。図５に示すように、ドキソルビシンが含まれたポリ有機ホスファゼンハイドロゲルではドキソルビシンの放出が十分に調節され、および持続し、ドキソルビシンは少なくとも６０日目まで放出することができる。
実施例１７:抗癌剤と接合しているポリ有機ホスファゼンの生体外での抗癌活性の観察
本発明の抗癌剤が接合しているポリ有機ホスファゼン-抗癌剤接合体の生体外での抗癌活性を知るため、ヒト乳癌細胞（ＭＣＦ‐７、韓国細胞株銀行）及びヒト子宮頸部癌細胞（Ｈｅｌａ、韓国細胞株銀行）に対して以下の試験を行った。
生体外細胞実験では抗癌剤が結合しているポリ有機ホスファゼン-抗癌剤接合体の癌細胞に対する５０％増殖抑制濃度（ＩＣ５０）を求めるために、３-（４，５-ジメチルチアゾール-２-イル）-２，５-ジフェニル-２Ｈ-テトラゾリウム[３-（４，５-ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ-２-ｙｌ）-２，５‐ｄｉｐｈｅｎｙｌ‐２Ｈ‐ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ(ＭＴＴ)]分析法を使用した[Ｔ.Ｍｏｓｍａｎｎ, Ｊ. Ｉｍｍｕｎｏｌ. Ｍｅｔｈｏｄ, ６５, (１９８５) ５５]。
測定しようとする物質をそれぞれ少量のＤＭＳＯに溶かした後、蒸留水で２００倍希釈した。この物質溶液を癌細胞であるＭＣＦ‐７（韓国細胞株銀行）及びＨｅｌａ（韓国細胞株銀行）に加えて混合した。その後、前記癌細胞濃度が１０×１０４細胞/ｍｌになるようにして９６-ウェル マイクロタイタープレーターに加えた。癌細胞は５％のＣＯ２存在下３７℃でそれぞれ２、３、４日間培養した。
培養された細胞にＭＴＴ溶液（２０μｌ）を混合した後、５％のＣＯ２存在下３７℃で４時間さらに培養した。その後、各細胞の上層培地を除去した後、各ウェルにＤＭＳＯ（１００μｌ）を加えて室温でプレートシェーカーで約２０分間振盪してＭＴＴが還元されて生じたホルマルザン結晶を溶解させた。その後、ＥＬＩＳＡ Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ ＩＩ Ｒｅａｄｅｒ(Ｂｉｏ‐ｒａｄ)を利用して５７０ｎｍの波長で吸光度を測定した。
本発明の抗癌剤が結合しているポリ有機ホスファゼン-抗癌剤接合体の生体外抗癌活性測定結果を次の表３に示した。
Figure 0005124561
前記表３に示したように、パクリタキセルと結合しているポリ有機ホスファゼンはパクリタキセルと類似の生体外抗癌活性を示した。また、ドキソルビシンと結合しているポリ有機ホスファゼンはドキソルビシンと類似の生体外抗癌活性を示した。
実施例１８:パクリタキセルが結合しているポリ有機ホスファゼンハイドロゲルの生体内での抗癌活性観察
本発明実施例１のパクリタキセルが結合しているポリ有機ホスファゼンハイドロゲルの生体内抗癌性を以下の方法で測定した。
生体内動物実験では、ヌードマウス（オリエンタルバイオ、Ｂａｌｂ／Ｃ、５週齢の雌、２０ｇ）を動物モデルとして使用した。胃癌細胞であるＳＮＵ-６０１（１×１０７Ｃｅｌｌ、０．２ｍｌ、韓国細胞株銀行）をマウスの背と股の間の皮下に注射した。リン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）に実施例１のポリ有機ホスファゼン-パクリタキセル接合体が１０重量％の濃度で溶解されているポリマー溶液を調整した。この溶液をそれぞれ０．１ｍｌ及び０．２ｍｌの前記胃癌細胞に注入し、癌細胞の大きさ変化を測定した。
この溶液を０．１ｍｌ注入する場合、マウス重量１ｋｇ当り１５ｍｇのパクリタキセルが注入される。この溶液を０．２ｍｌ注入する場合、マウス重量１ｋｇ当り３０ｍｇのパクリタキセルが注入される。
また、対照群としてパクリタキセルをマウス重量１ｋｇ当り６０ｍｇ投与したマウスの癌細胞の大きさの変化と、抗癌剤を投与せずに食塩水のみを投与したマウスの癌細胞の大きさの変化を測定した。使用したマウスの数はそれぞれ１０匹ずつであった。
上記のマウスの癌細胞の大きさの変化を、図６に示した。
図６に示したように、癌細胞に食塩水のみを投与した対照群は投与後２６日目に９４％の増加、投与後３４日目には１３４％の癌細胞の増加を示した。
しかし、０．１ｍｌのパクリタキセルが結合しているポリ有機ホスファゼンハイドロゲルを投与した群では、癌細胞の大きさは投与後２６日目には６０％に、投与後３４日目には５７％に減少した。さらに０．２ｍｌのパクリタキセルが結合しているポリ有機ホスファゼンハイドロゲルを投与した群では、癌細胞の大きさは投与後２６日目には８１％に、投与後３４日目には８１％に減少した。
そして、６０ｍｇ／ｋｇの濃度でパクリタキセルのみを注入した対照群では、１０日後にパクリタキセルの毒性によって８匹のマウスが死んだ。
実施例１９:ドキソルビシンが結合しているポリ有機ホスファゼンハイドロゲルの生体内での抗癌活性の観察
前記実施例５のドキソルビシンが結合しているポリ有機ホスファゼン-ドキソルビシン接合体ハイドロゲルの生体内での抗癌活性を以下の方法で測定した。
生体内動物実験では、ヌードマウス（オリエンタルバイオ、Ｂａｌｂ／Ｃ、５週齢の雌、２０ｇ）を動物実験モデルとして使用した。胃癌細胞のＳＮＵ-６０１（１×１０７Ｃｅｌｌ、０.２ｍｌ、韓国細胞株銀行）をマウスの背と股の間の皮下に注射した。リン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）に実施例５のポリ有機ホスファゼン-ドキソルビシン接合体が１０重量％の濃度で溶解された溶液を調整した。それぞれ０．１ｍｌ及び０．２ｍｌの溶液を前記胃癌細胞に腫瘍内に注入し、癌細胞の大きさの変化を測定した。
前記溶液が０．１ｍｌ注入される場合、マウス重量１ｋｇ当り３０ｍｇのドキソルビシンが投与された。前記溶液が０．２ｍｌ注入される場合、マウス重量１ｋｇ当り６０ｍｇのドキソルビシンが投与された。
対照群としてドキソルビシンをマウス重量１ｋｇ当り３０ｍｇ投与したマウスおよび抗癌剤を投与せず食塩水のみを投与したマウスの癌細胞の大きさ変化をそれぞれ測定した。使用したマウスの数はそれぞれ１０匹ずつであった。
上記のマウスの癌細胞の大きさの変化を図７に示した。
図７に示すように、癌細胞に食塩水のみを投与した対照群は投与後１４日目には７０％の増加、投与後２８日目には２２３％の癌細胞の増加を示した。
しかし、０．１ｍｌのドキソルビシンが結合しているポリ有機ホスファゼンハイドロゲルを投与した群では、癌細胞の大きさは１４日目には６８％に、投与後２６日目には１７３％に、２８日目には１６８％に減少した。また０．２ｍｌのドキソルビシンが結合しているポリ有機ホスファゼンハイドロゲルを投与した群では、癌細胞の大きさは投与後１４日目には１５５％に、投与後２２日目には１９５％に、２８日目には１８２％に減少した。
そして、３０ｍｇ／ｋｇの濃度でドキソルビシンのみを注入した対照群は１４日後にドキソルビシンの毒性によってすべてのマウスが死んだ。しかし、３０ｍｇ／ｋｇ及び６０ｍｇ／ｋｇのドキソルビシン濃度のドキソルビシンが結合されているポリ有機ホスファゼンハイドロゲルを注入した群では一匹も死ななかった。
上記で記載されているように、本発明の薬物到達システムは薬物組成における優れた薬剤安定性、長時間の薬物放出および優れた生物活性を有している。したがって、本発明の薬物到達システムは、薬物の担体として有用であるのと同時に、組織工学に関する様々な生体適合物質の分野への適用が期待されている。
本発明のパクリタキセルが結合しているポリ有機ホスファゼンのゾル-ゲル転移を示す写真である。 本発明の抗癌剤または生物活性分子が結合しているポリ有機ホスファゼンの温度変化に対する粘度の変化を示すものである。 本発明のパクリタキセルが結合しているポリ有機ホスファゼンハイドロゲルの時間経過に対する質量減少の程度を示すものである。 本発明の抗癌剤または生物活性分子が結合しているポリ有機ホスファゼンの時間経過に対する分子量減少の程度を示すものである。 本発明の抗癌剤が結合しているポリ有機ホスファゼンハイドロゲルから時間経過に対する抗癌剤の放出挙動を示すものである。 本発明のパクリタキセルが結合しているポリ有機ホスファゼンハイドロゲルの生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）での抗癌活性を示すものである。 本発明のドキソルビシンが結合しているポリ有機ホスファゼンハイドロゲルの生体内での抗癌活性を示すものである。

Claims (13)

  1. 下記化学式１の構造で示される置換基を有することにより温度感応性および生分解性を
    有するポリ有機ホスファゼンと、置換基Ｒ１０で示される生物活性分子が結合している、
    ポリ有機ホスファゼン−生理活性分子接合体:
    Figure 0005124561
     前記式で、ｐは７乃至５０の整数値を有し、
    Ｒ１はＨ、ＨＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ２ＳＨ、ＣＨ(ＣＨ３)２、ＣＨ２ＣＨ(ＣＨ３)２、ＣＨ(ＣＨ３)Ｃ２Ｈ５、ＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ３、ＣＨ２Ｃ６Ｈ５、ＣＨ２Ｃ６Ｈ４ＯＨ、ＣＨ２Ｃ２ＮＨ２Ｃ６Ｈ４、ＯＣＯＣ４Ｎ＋Ｈ９、ＣＯ２Ｃ２Ｈ５、ＣＨ２ＣＯ２Ｃ２Ｈ５、(ＣＨ２)２ＣＯ２Ｃ２Ｈ５及びＨＣＯＮＨＣＨ(ＣＨ２Ｃ６Ｈ５)からなる群より選択され、
    Ｒ２はＣＨ３、Ｃ３Ｈ７、Ｃ４Ｈ９、Ｃ２Ｈ５、ＣＨ２Ｃ６Ｈ５及びＣＨ２ＣＨＣＨ２からなる群より選択され、
    Ｒ３はＣＨ(Ｗ)であり、
    Ｒ４はＣＯ２、ＣＯ２ＣＨ２ＣＯ２、ＣＯ２ＣＨ(ＣＨ３)ＣＯ２及びＣＯＮＨＣＨ(Ｘ)ＣＯ２からなる群より選択され、
    Ｒ５はＨ、ＣＨ３及びＣ２Ｈ５からなる群より選択され、
    ここで、Ｗ及びＸはそれぞれ独立的にＨ、ＨＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ(ＣＨ３)２、ＣＨ２ＣＨ(ＣＨ３)２、ＣＨ(ＣＨ３)Ｃ２Ｈ５、ＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ３、ＣＨ２Ｃ６Ｈ５、ＣＨ２Ｃ２ＮＨ２Ｃ６Ｈ４、ＯＣＯＣ４Ｎ＋Ｈ９、ＣＯ２Ｃ２Ｈ５、(ＣＨ２)２ＣＯ２Ｃ２Ｈ５、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ(ＣＨ３)ＯＨ、ＣＨ２Ｃ６Ｈ４ＯＨ、ＣＨ２ＣＯＯＨ、ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ、ＣＨ２ＣＯＮＨ２、Ｃ４Ｈ８ＮＨ２、Ｃ３Ｈ６ＮＨＣ(＝ＮＨ)ＮＨ２、ＣＨ２Ｃ３Ｎ２Ｈ３及びＣＨ２ＳＨからなる群より選択され、
    Ｒ６はＣＨ(Ｙ)であり、
    Ｒ７はＣ２Ｈ４、Ｃ３Ｈ６、Ｃ４Ｈ８、ＣＨ２Ｃ６Ｈ４、ＣＨ２ＣＯ２、Ｏ、ＣＯＮＨＣＨ(Ｚ)Ｏ、ＣＯ、ＣＯ２、Ｓ、ＣＯＮＨＣＨ(Ｚ)Ｓ、ＣＯＮＨＣＨ(Ｚ)Ｎ、ＣＯＮＨＣＨ(Ｚ)ＣＯ及びＣＯＮＨＣＨ(Ｚ)ＣＯ２からなる群より選択され、
    Ｒ８はＯＨ、ＳＨ、Ｈ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、Ｃ３Ｈ７、Ｃ４Ｈ９、ＣＨ２Ｃ６Ｈ５、ＣＨ２ＣＨＣＨ２及び下記の表１に記載された保護基からなる群より選択され、
    ここで、Ｙ及びＺはそれぞれ独立的にＨ、ＨＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ(ＣＨ３)２、ＣＨ２ＣＨ(ＣＨ３)２、ＣＨ(ＣＨ３)Ｃ２Ｈ５、ＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ３、ＣＨ２Ｃ６Ｈ５、ＣＨ２Ｃ２ＮＨ２Ｃ６Ｈ４、ＯＣＯＣ４Ｎ＋Ｈ９、ＣＯ２Ｃ２Ｈ５、(ＣＨ２)２ＣＯ２Ｃ２Ｈ５、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ(ＣＨ３)ＯＨ、ＣＨ２Ｃ６Ｈ４ＯＨ、ＣＨ２ＣＯＯＨ、ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ、ＣＨ２ＣＯＮＨ２、Ｃ４Ｈ８ＮＨ２、Ｃ３Ｈ６ＮＨＣ(＝ＮＨ)ＮＨ２、ＣＨ２Ｃ３Ｎ２Ｈ３及びＣＨ２ＳＨからなる群より選択され、
    Ｒ９はＯＨ、ＳＨ、Ｈ、ＮＨ２、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、Ｃ３Ｈ７、Ｃ４Ｈ９、ＣＨ２Ｃ６Ｈ５、ＣＨ２ＣＨＣＨ２、ＮＨＣＨ(ＳＨ)ＣＯ２Ｈ、ＮＨ(ＣＨ２)ｑＳＨ、ＮＨ(ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ)ｒＨ、［ＮＨＣＨ(Ｃ４Ｈ８ＮＨ２)ＣＯ］ｒＯＨ、［ＮＨＣＨ［（ＣＨ２）３Ｃ（＝ＮＨ）（ＮＨ２）］ＣＯ］ｒＯＨ及びプロタミン残基からなる群より選択され、
    ｑは１乃至２０の整数値を有し、
    rは１乃至１８０００の整数値を有し、
    Ｒ１０はパクリタキセル、ドキソルビシン、カンプトテシン、エピルビシン、５−フルオロウラシル、１０−ヒドロキシカンプトテシン、１０−アミノカンプトテシン、７−エチルカンプトテシン、イリノテカン、メトトレキサート、マイトマイシンＣ、タキソイド、ドセタキセル、クロラムブシル、カリケアマイシン、マイタンシノイド、２−ピロリノドキソルビシン（ＡＮ−２０１）、ダウノルビシン、メルファラン、４’−ジメチルデオキシポドフィロトキシン、クルクミン、ポドフィロトキシン、エピポドフィロトキシン、４β−アミノ−４'−Ｏ−ジメチルエピポドフィロトキシン、タリソマイシンＳ１０ｂ、ダウノマイシン、デュオカルマイシンＡ、デュオカルマイシンＳＡ、シス−アコニチル−ダウノマイシン、ジアゼニウムジオレート、ネトロプシン、６−メルカプトプリン（６−ｍｅｔｃａｐｔｏｐｕｒｉｎｅ）、グルクロン酸抱合、ホスミドシン、ストレプトニグリン、ヘマトポルフィリン、デスフェリオキサミン（ＤＦＯ）、デフェリプロン、アシビシン、エストラムスチン、エネジイン、アルギニン-グリシン-アスパラギン酸ペプチド、ニューロペプチド、アルブミン、牛血清アルブミン、牛膵臓リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ Ａ）、牛精液リボヌクレアーゼ（ＢＳ−ＲＮａｓｅ）、Ｂｏｗｍａｎ‐ｂｉｒｋプロテアーゼ阻害剤（ＢＢＩ）、コラーゲン、フィブロネクチン（ｆｉｂｒｏｎｅｔｉｎ）、ラミニン、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、インターフェロン、ヒルジン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インシュリン、デスモプレシン、グルカゴン類似ペプチド１（ＧＬＰ１）、ヒト成長ホルモン拮抗剤、腫瘍壊死因子受容体１（ＴＮＦＲ１）、アスパラギナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、変異性成長因子β（ＴＧＦ−β）、骨形成蛋白質（ＢＭＰｓ）、成長因子（繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、血小板性成長因子（ＰＤＦＧ）、インシュリン類似成長因子（ＩＧＦ）、変異性成長因子β（ＴＧＦ−β）、脳神経成長因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、及びニューロトロフィン−４/５（ＮＴ−４/５））、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）、サイトカイン、テアニン、デキサメタゾン、ヘパリン、キトサン、ヒアルロナン、シクロデキストラン、澱粉、炭水化物、糖、蛍光蛋白質（緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ））、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）及びワクチンからなる群より選択され、
    ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ及びｆは各置換体の含量を示す値で、ａ、ｂ、ｆは独立して０．０１乃至１．９の値を有し、ｃ、ｄ及びｅは独立して０乃至１．９の値を有し、ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ＋ｅ＋ｆ＝２．０であり、
    ｎは５乃至１０００００の値を有する。
    Figure 0005124561
    Figure 0005124561
    Figure 0005124561
    Figure 0005124561
    Figure 0005124561
    Figure 0005124561
    Figure 0005124561
  2. ポリ[（イソロイシンエチルエステル）（アミノメトキシポリエチレングリコール５５０）（グリシルグリシン）（グリシルグリシルパクリタキセル）ホスファゼン]、ポリ[（イソロイシンエチルエステル）（アミノメトキシポリエチレングリコール５５０）（グリシルグリシン）（グリシルグリシルドキソルビシン）ホスファゼン]、ポリ[（イソロイシンエチルエステル）（アミノメトキシポリエチレングリコール５５０）（グリシルグリシン）（グリシルグリシルグリシン−アルギニン−グリシン−アスパラギン−セリン)ホスファゼン]、ポリ[（イソロイシンエチルエステル）（アミノメトキシポリエチレングリコール５５０）（グリシルグリシン）（グリシルグリシルグリシンエチルエステル）（グリシルグリシルグリシン−アルギニン−グリシン−アスパラギン−セリン）ホスファゼン]及びポリ[（イソロイシンエチルエステル）（アミノメトキシポリエチレングリコール５５０）（グリシルグリシン）（グリシルグリシルグリシン−アルギニン−グリシン−アスパラギン−チロシン）ホスファゼン]からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１に記載のポリ有機ホスファゼン−生物活性分子接合体。
  3. 次の段階を含むことを特徴とする請求項１のポリ有機ポリ有機ホスファゼン−生物活性分子接合体の製造方法:
    （１）次の化学式２のホスファゼン三量体を熱重合させて次の化学式３のジクロロホスファゼン直鎖高分子を得る段階
    Figure 0005124561
    Figure 0005124561
     （前記式の中で、ｎは７乃至１０００００の整数値）;
    （２）前記段階（１）で生成された化学式３の化合物を次の化学式４のアミノ酸エステルまたはその塩の０．０１乃至１．９当量と反応させる段階
    [化４]
    ＮＨ２ＣＨ（Ｒ１）ＣＯ２Ｒ２；
    （３）前記段階（２）の生成物を次の化学式５のアミノ酸、ペプチド、デプシペプチドエステルまたはその塩から選択される一つと、０乃至１．９当量と反応させる段階:
    [化５]
    ＮＨ２（Ｒ３）（Ｒ４）（Ｒ５）；
    （４）前記段階（３）の生成物を次の化学式６の官能基を有する置換体またはその塩の０．０１乃至１．９当量と反応させる段階
    [化６]
    ＮＨ２（Ｒ６）（Ｒ７）（Ｒ８）；
    （５）前記段階（４）の生成物を次の化学式７のアミノメトキシポリエチレングリコールまたはその塩の０．０１乃至１．１９当量と反応させる段階
    [化７]
    ＮＨ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｐＣＨ３； 及び、
    （６）前記で得られた生成物をタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ワクチン、遺伝子、ホルモン、抗癌剤及び新生血管抑制剤からなる群より選択された生物活性分子と反応させて結合させる段階
    （前記式で、ｐは７乃至５０の値を有する）。
  4. 前記段階（５）と前記段階（６）の間に、前記段階（５）の生成物のＲ８がＣＨ２Ｃ６Ｈ５またはＣＨ２ＣＨＣＨ２を含む場合、前記段階（５）の生成物を脱水素化反応または脱アリルエステル化反応させる段階（５−１）をさらに含むことを特徴とする、請求項３に記載の方法。
  5. 前記段階（５）と前記段階（６）との間、または前記段階（５−１）と前記段階（６）との間に、前記段階（５）または段階（５−１）で得られた生成物をリジン、アルギニン、システイン、チオールアルキルアミン、ポリエチレンイミン、ポリリジン、ポリアルギニン及びプロタミンからなる群より選択された官能基を有する置換体と反応させる段階（５−２）をさらに含む、請求項３または４に記載の方法。
  6. 以下の化学式８のポリ有機ホスファゼン−生物活性分子接合体を含む、温度変化に応じてゾル−ゲル転移を示すハイドロゲル:
    Figure 0005124561
     前記式で、
    ｐは７乃至５０の整数値を有し、
    Ｒ１はＨ、ＨＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ２ＳＨ、ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ（ＣＨ３）Ｃ２Ｈ５、ＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ３、ＣＨ２Ｃ６Ｈ５、ＣＨ２Ｃ６Ｈ４ＯＨ、ＣＨ２Ｃ２ＮＨ２Ｃ６Ｈ４、ＯＣＯＣ４Ｎ＋Ｈ９、ＣＯ２Ｃ２Ｈ５、ＣＨ２ＣＯ２Ｃ２Ｈ５、（ＣＨ２）２ＣＯ２Ｃ２Ｈ５及びＨＣＯＮＨＣＨ（ＣＨ２Ｃ６Ｈ５）からなる群より選択され、
    Ｒ２はＣＨ３、Ｃ３Ｈ７、Ｃ４Ｈ９、Ｃ２Ｈ５、ＣＨ２Ｃ６Ｈ５及びＣＨ２ＣＨＣＨ２からなる群より選択され、
    Ｒ３はＣＨ（Ｗ）であり、
    Ｒ４はＣＯ２、ＣＯ２ＣＨ２ＣＯ２、ＣＯ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＯ２及びＣＯＮＨＣＨ（Ｘ）ＣＯ２からなる群より選択され、
    Ｒ５はＨ、ＣＨ３及びＣ２Ｈ５からなる群より選択され、
    ここで、Ｗ及びＸはそれぞれ独立的にＨ、ＨＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ（ＣＨ３）Ｃ２Ｈ５、ＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ３、ＣＨ２Ｃ６Ｈ５、ＣＨ２Ｃ２ＮＨ２Ｃ６Ｈ４、ＯＣＯＣ４Ｎ＋Ｈ９、ＣＯ２Ｃ２Ｈ５、（ＣＨ２）２ＣＯ２Ｃ２Ｈ５、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ（ＣＨ３）ＯＨ、ＣＨ２Ｃ６Ｈ４ＯＨ、ＣＨ２ＣＯＯＨ、ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ、ＣＨ２ＣＯＮＨ２、Ｃ４Ｈ８ＮＨ２、Ｃ３Ｈ６ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、ＣＨ２Ｃ３Ｎ２Ｈ３及びＣＨ２ＳＨからなる群より選択され、
    Ｒ６はＣＨ（Ｙ）であり、
    Ｒ７はＣ２Ｈ４、Ｃ３Ｈ６、Ｃ４Ｈ８、ＣＨ２Ｃ６Ｈ４、ＣＨ２ＣＯ２、Ｏ、ＣＯＮＨＣＨ（Ｚ）Ｏ、ＣＯ、ＣＯ２、Ｓ、ＣＯＮＨＣＨ（Ｚ）Ｓ、ＣＯＮＨＣＨ（Ｚ）Ｎ、ＣＯＮＨＣＨ（Ｚ）ＣＯ及びＣＯＮＨＣＨ（Ｚ）ＣＯ２からなる群より選択され、
    Ｒ８はＯＨ、ＳＨ、Ｈ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、Ｃ３Ｈ７、Ｃ４Ｈ９、ＣＨ２Ｃ６Ｈ５、ＣＨ２ＣＨＣＨ２及び下記の表１に記載された保護基からなる群より選択され、
    ここで、Ｙ及びＺはそれぞれ独立的にＨ、ＨＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ（ＣＨ３）Ｃ２Ｈ５、ＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ３、ＣＨ２Ｃ６Ｈ５、ＣＨ２Ｃ２ＮＨ２Ｃ６Ｈ４、ＯＣＯＣ４Ｎ＋Ｈ９、ＣＯ２Ｃ２Ｈ５、（ＣＨ２）２ＣＯ２Ｃ２Ｈ５、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ（ＣＨ３）ＯＨ、ＣＨ２Ｃ６Ｈ４ＯＨ、ＣＨ２ＣＯＯＨ、ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ、ＣＨ２ＣＯＮＨ２、Ｃ４Ｈ８ＮＨ２、Ｃ３Ｈ６ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、ＣＨ２Ｃ３Ｎ２Ｈ３及びＣＨ２ＳＨからなる群より選択され、
    Ｒ９はＯＨ、ＳＨ、Ｈ、ＮＨ２、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、Ｃ３Ｈ７、Ｃ４Ｈ９、ＣＨ２Ｃ６Ｈ５、ＣＨ２ＣＨＣＨ２、ＮＨＣＨ（ＳＨ）ＣＯ２Ｈ、ＮＨ（ＣＨ２）ｑＳＨ、ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｒＨ、［ＮＨＣＨ（Ｃ４Ｈ８ＮＨ２）ＣＯ］ｒＯＨ、［ＮＨＣＨ［（ＣＨ２）３Ｃ（＝ＮＨ）（ＮＨ２）］ＣＯ］ｒＯＨ及びプロタミン残基からなる群より選択され、
    ｑは１乃至２０の整数値を有し、
    ｒは１乃至１８０００の整数値を有し、
    Ｒ１０は、パクリタキセル、ドキソルビシン、カンプトテシン、エピルビシン、５−フルオロウラシル、１０−ヒドロキシカンプトテシン、１０−アミノカンプトテシン、７−エチルカンプトテシン、イリノテカン、メトトレキサート、マイトマイシンＣ、タキソイド、ドセタキセル、クロラムブシル、カリケアマイシン、マイタンシノイド、２−ピロリノドキソルビシン（ＡＮ−２０１）、ダウノルビシン、メルファラン、４'−ジメチルデオキシポドフィロトキシン、クルクミン、ポドフィロトキシン、エピポドフィロトキシン、４β−アミノ−４'−Ｏ−ジメチルエピポドフィロトキシン、タリソマイシンＳ１０ｂ、ダウノマイシン、デュオカルマイシンＡ、デュオカルマイシンＳＡ、シス−アコニチル-ダウノマイシン、ジアゼニウムジオレート、ネトロプシン、６−メルカプトプリン、グルクロン酸抱合、ホスミドシン、ストレプトニグリン、ヘマトポルフィリン、デスフェリオキサミン（ＤＦＯ）、デフェリプロン、アシビシン、エストラムスチン、エネジイン、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸ペプチド誘導体、ニューロペプチド、アルブミン、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、牛膵臓リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅＡ）、牛精液リボヌクレアーゼ（ＢＳ−ＲＮａｓｅ）、Ｂｏｗｍａｎ−ｂｉｒｋプロテアーゼ阻害剤（ＢＢＩ）、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、インターフェロン、ヒルジン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）インシュリン、デスモプレシン、グルカゴン類似ペプチド１（ＧＬＰ１）、ヒト成長ホルモン拮抗剤、腫瘍壊死因子収容体１（ＴＮＦＲ１）、アスパラギナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、変異性成長因子β（ＴＧＦ−β）、骨形成蛋白質（ＢＭＰｓ）、成長因子（繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、血小板性成長因子（ＰＤＦＧ）、インシュリン類似成長因子（ＩＧＦ）、変異性成長因子β（ＴＧＦ−β）、脳神経成長因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、及びニューロトロフィン−４/５（ＮＴ−４/５））、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）、サイトカイン、テアニン、デキサメタゾン、ヘパリン、キトサン、ヒアルロナン、シクロデキストリン、澱粉、炭水化物、糖、蛍光蛋白質、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）及びワクチンからなる群より選択され、
    ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ及びｆは各置換体の含量を示す値で、ａ、ｂ、ｆは独立して０．０１乃至１．９の値を有し、ｃ及びｄ、ｅは独立して０乃至１．９の値を有し、ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ＋ｅ＋ｆ＝２．０であり、
    ｎは５乃至１０００００の値を有する。
    Figure 0005124561
    Figure 0005124561
    Figure 0005124561
    Figure 0005124561
    Figure 0005124561
    Figure 0005124561
    Figure 0005124561
  7. 前記ポリ有機ホスファゼン−生物活性分子接合体が、水、緩衝溶液、生理食塩水、及びブドウ糖食塩液からなる群より選択される１つ以上の溶媒に、１乃至５０重量％の濃度で溶解していることを特徴とする、請求項６に記載のハイドロゲル。
  8. 請求項１または２に記載のポリ有機ホスファゼン−生理活性分子接合体及び請求項６または７に記載のポリ有機ホスファゼン−生理活性分子接合体含有ハイドロゲルからなる群より選択される１つ以上を含む、生物活性分子到達用組成物。
  9. タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ワクチン、遺伝子、ホルモン、抗癌剤及び新生血管抑制剤からなる群より選択される１つ以上の追加の生物活性分子、
    前骨芽細胞、軟骨細胞、新生血管細胞（ＵＶＥＣ）、骨芽細胞、成体幹細胞、シュワン細胞、希突起膠細胞、肝細胞、壁細胞（ＵＶＥＣと組み合わせて治療）、筋芽細胞、インシュリン分泌細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、繊維芽細胞、β細胞、内胚葉細胞、肝幹細胞、糸球体傍細胞、骨格筋細胞、角化細胞、メラニン細胞、ランゲルハンス細胞、メルケル細胞、真皮繊維芽細胞及び前脂肪細胞からなる群より選択される１つ以上の細胞、及び
    分子量２００乃至７５００００の陽イオン高分子、ポリ（Ｎ−ビニル−２−ピロリドン）、ポリビニルアセテート（ＰＶＡ）、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸塩、ヘパリン、アルギン酸塩、アミロライド、プロカインアミド、アセチル−β−メチルコリン、スペルミン、スペルミジン、リゾチーム、フィブロイン、アルブミン、コラーゲン、成長因子、骨形成蛋白質（ＢＭＰｓ）、デキサメタゾン、フィブロネクチン、フィブリノーゲン、トロンビン、タンパク質、クレモフォアＥＬ、デクスラゾキサン、ロイコボリン（商品名）、リシノール酸、リン脂質、小腸粘膜下組織、ビタミンＥ、脂肪酸のポリグリセロールエステル、ラブラフィル（商品名）、ラブラフィルＭ１９４４ＣＳ（商品名）、クエン酸、グルタミン酸、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ゼラチン、イソプロピルミリステート、オイドラギット（商品名）、テゴベタイン（商品名）、ジミリストイルフォスファチジルコリン、スクレログルカン（ｓｃｌｅｒｏｇｌｕｃａｎ）、エタノール、ジメチルスルホキシド、保存剤、糖、ポリオール、糖含有ポリオール、アミノ酸、ポリマー含有ポリオール、糖含有アミノ酸、界面活性剤、糖含有イオン（トレハロース−硫酸亜鉛及びマルトース−硫酸亜鉛）、珪酸塩、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＮａＢｒ、ＮａＩ、ＬｉＣｌ、ｎ‐Ｂｕ４ＮＢｒ、ｎ‐Ｐｒ４ＮＢｒ、Ｅｔ４ＮＢｒ、Ｍｇ（ＯＨ）２、Ｃａ（ＯＨ）２、ＺｎＣＯ３、Ｃａ３（ＰＯ４）２、ＺｎＣｌ２、（Ｃ２Ｈ３Ｏ２）２Ｚｎ、ＺｎＣＯ３、ＣｄＣｌ２、ＨｇＣｌ２、ＣｏＣｌ２、（ＣａＮＯ３）２、ＢａＣｌ２、ＭｇＣｌ２、ＰｂＣｌ２、ＡｌＣｌ３、ＦｅＣｌ２、ＦｅＣｌ３、ＮｉＣｌ２、ＡｇＣｌ、ＡｕＣｌ３、ＣｕＣｌ２、テトラデシル硫酸ナトリウム、臭化ドデシルトリメチルアンモニウム、塩化ドデシルトリメチルアンモニウム、及び臭化テトラドデシルトリメチルアンモニウムからなる群より選択される添加剤
    からなる群より選択される１種以上をさらに含むことを特徴とする、請求項８に記載の生物活性分子到達用組成物。
  10. 前記添加剤の含量は全生物活性分子到達用組成物重量を基準に１×１０-６乃至３０重量％であることを特徴とする、請求項９に記載の生物活性分子到達用組成物。
  11. 前記生物活性分子の含量は全生物活性分子到達用組成物体積基準で１×１０−８乃至５０体積％であることを特徴とする、請求項９に記載の生物活性分子到達用組成物。
  12. 前記タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドが、赤血球生成因子（ＥＰＯ）、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、成長ホルモン（人間、豚、牛）、成長ホルモン放出因子、神経成長因子（ＮＧＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、血液凝固因子、インシュリン、オキシトシン、バソプレッシン、副腎皮質刺激ホルモン、上皮成長因子、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、プロラクチン、ルリベリン、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）、ＬＨＲＨ作用剤、ＬＨＲＨ拮抗剤、ソマトスタチン、グルカゴン、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）、ガストリン、テトラガストリン、ペンタガストリン、ウロガストロン、セクレチン、カルシトニン、エンケファリン、エンドルフィン、アンジオテンシン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＴＲＨ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘発リガンド（ＴＲＡＩＬ）、ヘパリン分解酵素、骨形成蛋白質（ＢＭＰ）、ヒト心房性ナトリウム利尿ペプチド（ｈＡＮＰ）、グルカゴン類似ペプチド（ＧＬＰ−１）、レニン、ブラジキニン、バシトラシン、ポリミキシン、コリスチン、チロシディン、グラミシジン、シクロスポリン、酵素及びサイトカインからなる群より選択される１つ以上であり、
    前記ワクチンは肝炎ワクチンであり、
    前記遺伝子は低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、プラスミドＤＮＡ及びアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＡＳ−ＯＤＮ）からなる群より選択される１つ以上であり、
    前記ホルモンはテストステロン、エストラジオール、プロゲストロン、及びプロスタグランジンからなる群より選択される１つ以上であり、
    前記抗癌剤はパクリタキセル、ドキソルビシン、５−フルオロウラシル、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、テガフール、イリノテカン、ドセタキセル、シクロホスファマイド、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、イホスファミド、マイトマイシンＣ、ビンクリスチン、エトポシド、メトトレキサート、トポテカン、タモキシフェン、ビノレルビン、カムトテシン、ダヌオルビシン、クロラムブシル、ブリオスタチン−１、カリケアマイシン、マイアタンシン、レバミゾール、ＤＮＡ組換えインターフェロンα−２ａ、ミトキサントロン、ニムスチン、インターフェロンα−２ａ、ドキシフルリジン、フォルメスタン、酢酸ロイプロリド、酢酸メゲストロール、カルモフール、テニポシド、ブレオマイシン、カルムスチン、ヘプタプラチン、エキセメスタン、アナストロゾール、エストラムスチン、カペシタビン、酢酸ゴセレリン、ポリサッカライドカリウム塩、酢酸メドロキシプロゲステロン、エピルビシン、レトロゾール、ピラルビシン、トポテカン、アルトレタミン、トレミフェンクエン酸塩、タキソテール（商品名）、アクチノマイシンＤ、及びポリエチルレングリコール接合タンパク質からなる群より選択される１つ以上の物質であり、
    前記新生血管抑制剤はＢＭＳ−２７５２９１、クロドロネート、６−デオキシ−６−デメチル−４−デジメチルアミノテトラサイクリン、ドキシサイクリン、マリマスタット、２−メトキシエストラジオール、スクアラミン、ＳＵ５６１４、サリドマイド、ＴＮＰ−４７０、コンブレタスタチンＡ４、大豆イソフラボン、エンザスタウリン、ＣＣ５０１３、セレコキシブ、ＺＤ６４７４、ハロフジノン臭化水素酸塩、インターフェロン−α、ベバシズマブ、ＡＥ−９４１、インターロイキン−１２、血管内皮成長因子トラップ（ＶＥＦＧ−ｔｒａｐ）、及びセツキシマブからなる群より選択される１つ以上の物質であることを特徴とする、請求項９に記載の生物活性分子到達用組成物。
  13. 腸管外投与、眼科的投与、軟骨組織、骨組織、脂肪組織または癌組織への局所的注入、吸入、経皮性投与、膣投与、尿道投与、直腸投与、経鼻投与、経口投与、肺投与、経耳投与、筋肉投与、皮下投与及び静脈投与からなる群より選択される投与経路を通じて投与されることを特徴とする、請求項９に記載の生物活性分子到達用組成物。
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