JP5117855B2

JP5117855B2 - 炎症改善のための生体模倣エボジアルテカルパ果実抽出物

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Publication number: JP5117855B2
Application number: JP2007527885A
Authority: JP
Inventors: ヤロッシュ、ダニエル・ビー; ブラウン、デビッド・エイ; カニング、マシュー・ティ
Original assignee: アプライド・ジェネティクス・インコーポレーテッド・ダーマティクス
Priority date: 2004-08-19
Filing date: 2005-08-11
Publication date: 2013-01-16
Anticipated expiration: 2025-08-11
Also published as: JP5467129B2; EP1784225A2; WO2006023377A3; JP2008510003A; CN101005856A; EP1784225B1; US7655659B2; WO2006023377A2; EP1784225A4; US20080096902A1; JP2012232991A

Description

発明の詳細な説明

I．技術分野
本発明は、環境及び生化学的状態に起因する炎症効果を改善する化合物の生体模倣混合物の調製に関する。特に、この生体模倣混合物は、エボジアルテカルパ(Ｅｖｏｄｉａｒｕｔａｅｃａｒｐａ）果実から抽出調製される混合体に関する。この混合体は、循環酸素添加酵素活性を抑制し、プロスタグランジンの生成を低減し、紫外線光に露呈した後の紅斑の発症、或いは化学的炎症を抑制できる。

II．発明の背景
創傷や感染部位における顕在性炎症は、組織病状、細胞生物学、微生物学、生化学的及び分子生物学における指標として特徴付けられる。低レベルにおける同様な過程が微小な炎症状態を引き起こしているものと理解され、これは臨床学的な症例としては極僅かにしか現れないが、ヒトの健康に関係している。微小な炎症にかかり易くする状態は遺伝的性質と加齢との両方の結果であるので、微小炎症は年配者にはよくあることである。この症状は、血管反応性の低減及び環境毒素に対する応答の増大を含む。これらの症状に抗することは、過度な血管拡張、炎症細胞の流入、及び細胞毒素の解放をもたらす。これは紅班及び痛みを伴うが、しばしば、この挑戦と反応のサイクルは慢性的であり、人生の後半のみに現れる症例である。この種の微小炎症は多くは心疾患、アルツハイマー症、関節炎、癌、更に高齢者には最終的にはそれ自体が明白になる他の多くの慢性疾患に起因している。急性と微小炎症との両方の重要な媒介物はプロスタグランジン（ＰＧ）である。ＰＧ合成体は前駆性アラキドン酸からなり、酸素添加（ＣＯＸ）酵素により制御される。ＰＧ族は、血管拡張、炎症細胞の活性化など多くの反応を発する。ＰＧの基礎レベルはＣＯＸ−１により維持されており、これは通常の細胞の新陳代謝に必要である。有害な刺激に反応して、ＣＯＸ−２が誘発されて活性化して、多くの炎症反応をもたらす過剰なＰＧが生成される。残念ながら、我々が歳をとるにつれて、ＣＯＸ−２の休止レベルは増大するので、ひいては、刺激に応答するＰＧの生成が増大する。

ＰＧの調節剤は、その効果に対する巨大な市場が存在するので広く考えられている。非常に成功した新たな薬理学的な化学物質が市販されており、これはＣＯＸ−２を選択的に阻止するので、加齢による炎症応答特性を抑制する。これらの調節剤は、明確に規定して、その作用を一貫的に且つ選択的にして副作用を生じないようにせねばならない。これは特に、高齢者には長期間に亘って使用されるためである。

植物から調製された植物抽出物は、科学的な機関の会員によって、ＰＧ生産に対する影響力を持ち、抗炎症効果を持つものと考えられている。一つの例はエボジアルテカルパ（Ｅｖｏｄｉａｒｕｔａｅｃａｒｐａ）果実から生成された抽出物であり、これは伝統的な漢方薬であり、Ｗｕ−Ｃｈｕ−Ｙｕとして知られている。この抽出物を単独で又は他の植物の抽出物と組み合わせて用いることについては、抗炎症剤、抗新生物薬剤、抗新生物薬剤、皮膚白化処理、高血圧、乾燥を有する所定の皮膚の採取及び艶の増大、痛みの治療、及び他の様々な主張として既に説明されてきた。これらの抽出物は様々な有機合成物を包含しており、それらは個別に研究されており、様々な効果が個々の化合物に寄与しており、その主意な一つはインドールキナゾリンアルカロイドである。これらはキナゾルインドカーボリンアルカロイドとしても、及びエボジア果実内にも知られており、これらは主にルテカルピン、エボジアミン、及びデヒドロエボジアミンである。エボジア果実は一般的ではなく、その育成も容易ではなく、その果実から調製された抽出物における化合物の量も、その年、地理的な場所、収穫年、及び抽出物方法、保存方法、更に他の変動要因によって、大きく変動する。これら全ての要因が、その抽出物を商業化できない原因である。

ヒトの皮膚（これは一酸化窒素（ＮＯ）及びＰＧを生成する）における微小炎症反応の抑制を測定し、その効果が恒久的であり、対象に害悪を及ぼさない便利な試験システムも望まれる。炎症の抑制を試験するための現在の方法は、強い刺激剤、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ガラギーナン、或いはペルーのバルサンなどの使用を伴う。これらは強烈さをもたらし、ときには痛みを伴う炎症反応をもたらす。ニコチン酸メチル（ＭＮ）は統合失調症診断の一方法として紅潮反応を形成するために用いられてきた。皮膚を刺すことに対する感受性がニコチン酸メチルに対する過剰反応に関連して提案された（Ｉｓｓａｃｈａｒ他、１９９８年）が、これは既に否定されている（Ｃｏｖｅｒｌｙ他，１９９８年）。炎症により誘発されたニコチン酸メチルはＰＧ抑制剤により抑制される（Ｗｉｌｋｉｎ他，１９８５年）。

III．発明の概要
第１の態様によれば、本発明は組成物を与え、これは
（ａ）一つ又は複数のインドールキナゾリンアルカロイドと、
（ｂ）ブチル化ヒドロキシトルエンと
（ｃ）一つ又は複数の溶媒及び／又は一つ又は複数の担持体とを備え、前記組成物における前記一つ又は複数のインドールキナゾリンアルカイドの濃度は少なくとも０．０２μｇ／ｍｌであり、ブチル化ヒドロキシトルエンの濃度は少なくとも０．０１ｍｇ／ｍｌである。

第２の態様によれば、本発明は組成物を与え、その組成物は
（ａ）一つ又は複数のインドールキナゾリンアルカロイドと、
（ｂ）ブチル化ヒドロキシトルエンと、
（ｃ）一つ又は複数の溶媒及び／又は一つ又は複数の担持体とを備え前記組成物における（ａ）及び（ｂ）の乾燥重量の合計は、前記組成物における固体の総重量の少なくとも１０％である（好ましくは少なくとも５０％であり、更に好ましくは９０％である）。

本発明のこの態様に関連して、組成物における（ｂ）の乾燥重量は、前記組成物における固体の総計の好ましくは少なくとも５０重量パーセントである。

本発明の第３の態様は、組成物を与え、この組成物は、
（ａ）一つ又は複数のインドールキナゾリンアルカロイドと、
（ｂ）ブチル化ヒドロキシトルエンとを、
（ｃ）一つ又は複数の溶媒及び／又は一つ又は複数の担持体とを備え、５５０ナノメータにおける組成物の光吸収の指数を２７０ナノメータにおける吸収で割ると、０．０１未満である。

本発明の第４の態様は、組成物を与え、この組成物は、
（ａ）一つ又は複数のインドールキナゾリンアルカロイドと、
（ｂ）ブチル化ヒドロキシトルエンとを、
（ｃ）一つ又は複数の溶媒及び／又は一つ又は複数の担持体とを備え、４５０ナノメータにおける組成物の光吸収の指数を４００ナノメータにおける吸収で割ると、０．０１未満である。

上述の態様によれば、組成物は好ましくはブチレングリコールを即ち溶媒及び／又は担持体として含む。

本発明の第５の態様は、組成物を与え、この組成物は、
（ａ）一つ又は複数のインドールキナゾリンアルカロイドと、
（ｂ）ブチレングリコールとを備える。

この態様によれば、この組成物はブチレン化ヒドロキシトルエンも含む。

第６の態様によれば、本発明は哺乳類の皮膚炎症を少なくとも部分的に反転させるか及び／又は部分的に抑制する方法を与える。この方法は、そのような反転及び／又は抑制が必要な哺乳類の皮膚へ組成物を施し、その組成物は（ａ）一つ又は複数のインドールキナゾリンアルカロイドであり、組成物を作成するために用いる時は、その純度が５０％以上（好ましくは９０％以上）である該アルカロイド及び（ｂ）ブチル化ヒドロキシトルエンを備える。

第７の態様によれば、本発明は哺乳類の皮膚炎症を少なくとも部分的に反転させるか及び／又は少なくとも部分的に抑制する方法を与え、そのような反転及び／又は抑制が必要な哺乳類の皮膚に組成物を塗布し、その組成物は、
(ａ)一つ又は複数のインドールキナゾリンアルカロイドと、
(ｂ）ブチル化ヒドロキシトルエンとを備え、
この組成物の抗炎症活性化は、ヒトの皮膚上でニコチン酸メチル誘発紅斑を用いて試験した際に、ブチレングリコールが、一つ又は複数のインドールキナゾリンアルカロイド及びブチル化ヒドロキシトルエンと容積で同じ重量パーセントで溶融している組成物からなる組成物の抗炎症活性化と実質的に同程度かそれよりも大きい。

本発明の第６及び第７の態様によれば、組成物は好ましくはブチレングリコールからなる。

本発明の第８の態様によれば、本発明はシクロオキシナーゲ２の活性を少なくとも部分的に抑制する方法を与え、この方法は、そのような抑制が必要な哺乳類の皮膚に組成物を塗布し、この組成物は、ブチル化ヒドロキシトルエン、又はトリシクロ（３，３，１，１（３，７）−デカン−カルボキシリック酸エチルエステル、又はブチル化ヒドロキシトルエンとトリシクロ（３，３，１，１（３，７）−デカン−カルボキシリック酸エチルエステルとの組み合わせであり、ここで、ブチル化ヒドロキシトルエン、又はトリシクロ（３，３，１，１（３，７）−デカン−カルボキシリック酸エチルエステル、又はブチル化ヒドロキシトルエンとトリシクロ（３，３，１，１（３，７）−デカン−カルボキシリック酸エチルエステルとの組み合わせの組成物中の濃度は、シクロオキシナーゲ２の活性をすくなくとも部分的に抑制するには充分である。

この態様によれば、この組成物は好ましくはブチレングリコールを含む。

第９の態様によれば、本発明は哺乳類の皮膚に酸化窒素を誘発する方法を与え、この方法は、ニコチン酸メチルの有効量を有する組成物を、循環障害を示す症状、例えば肢端紅痛症又はレーノー症候群（Ｒｅｙｎａｕｄ’ｓｓｙｎｄｒｏｍｅ）を示す皮膚へ塗布する。

第１０の態様によれば、本発明は哺乳類の皮膚へ塗布される製剤に使用する組成物を調製する方法が与えられる。この方法は、
（ａ）インドールキナゾリンアルカロイドを含む第1の成分を与える段階と、
（ｂ）ブチル化ヒドロキシトルエンを含む第２の成分を与える段階と、
（ｃ）哺乳類の皮膚へ塗布するのに適した担持体及び／又は溶剤を与える段階と、
（ｄ）第1の成分、第２の成分、及び担持体及び／又は溶剤を用いて組成物を調製する段階とを含み、第１の成分のインドールキナゾリンアルカロイドの純度は５０パーセント以上（好ましくは９０パーセント以上）である。

第１１の態様によれば、本発明は哺乳類の皮膚へ塗布する製剤を調製する方法が与えられる。この方法は、
（ａ）インドールキナゾリンアルカロイドを含む第1の成分を与える段階と、
（ｂ）ブチル化ヒドロキシトルエンを含む第２の成分を与える段階と、
（ｃ）哺乳類の皮膚へ塗布するのに適した担持体及び／又は溶剤を与える段階と、
（ｄ）第1の成分、第２の成分、及び担持体及び／又は溶剤を用いて製剤を調製する段階とを含み、第１の成分のインドールキナゾリンアルカロイドの純度は５０パーセント以上（好ましくは９０パーセント以上）である。

本発明の第１０及び１１の態様によれば、担持体及び／又は溶剤は好ましくはブチレングリコールを含む。

上述の様々な態様によれば、本発明の組成物及び方法は以下の特徴の幾つか又は全てを有することが好ましい。

（１）一つ又は複数のインドールキナゾリンアルカロイドの組成物中の組み合わせ濃度は約４００乃至６００μｇ／ｍｌである。

（２）一つ又は複数のインドールキナゾリンアルカロイドは、ルテカルピン、エボジアミン、デヒドロエボジアミン及びそれらの糖からなるグループから個々に選択される。

（３）ブチル化ヒドロキシトルエンの濃度は少なくとも０．０５ｍｇ／ｍｌである。

（４）ブチル化ヒドロキシトルエンの濃度は少なくとも４乃至６ｍｇ／ｍｌであり、一つ又は複数のインドールキナゾリンアルカロイドの組成物中の組み合わせ濃度は約４００乃至６００μｇ／ｍｌである。

（５）組成物は更にエボジン（ｅｖｏｄｉｎｅ）を含む。

（６）組成物は更にプロスタグランジンの生成を抑制する一つ又は複数の薬剤を有する。

（７）この組成物は、プロスタグランジンの生成を刺激する一つ又は複数の薬剤を有する。

（８）組成物における一つ又は複数のインドールキナゾリンアルカロイドの組み合わせ濃度は、炎症を少なくとも部分的に反転及び／又は少なくとも部分的に抑制するのに充分である。

（９）組み合わせにおける一つ又は複数のインドールキナゾリンアルカロイド及びブチル化ヒドロキシトルエンの組み合わせ濃度は、炎症を少なくとも部分的に反転及び／又は少なくとも部分的に抑制するのに充分である。

（１０）組成物がエマルジョンの形態にある。

（１１）組成物は哺乳類の皮膚例えばヒトの皮膚へ塗布するのに適している。

上述の一般的な説明と以下の詳細な説明との両方は、単に本発明の例示であって、本発明の特性及び特徴の理解のために概観若しくは構成を与えることを意図したものである。

本発明の付加的な特徴及び利点は以下の詳細な説明に記載されており、当業者には説明から容易に理解し得るか、或いは本明細書に説明したように発明を実施することにより明らかとなろう。添付図面は本発明の更なる理解を与えるように添付されており、本明細書に組み込まれて、その一部を構成している。

V．本発明及びその好ましい実施例の詳細な説明
その特定の好ましい態様について以下に説明するように本発明はブチレングリコールに基づくＥｖｏｉａ果実抽出物の合成生体模倣混合物を与えて哺乳類、特にヒトにおける炎症を鎮静する。混合物はサイクロクロオキシゲンの活性化を抑制し、紫外線及び／又は化学物質への露呈により誘発されるプログスタンランディアンの生成を低減する。この混合体は例えば皮膚における炎症反応の出現を抑制する。

本明細書で用いるように、用語「生体模倣（ｂｉｏｍｉｍｅｔｉｃ）」とは人口物質又は化合物であって、その少なくとも一部の機能、模倣が、少なくとも部分的には、天然の物質又は化合物の機能であるものを意味する。この定義に従えば、本発明はその特定の実施例において、エボジアルテカルパ果実抽出物の生体模倣に関し、特に、この抽出物の報告された抗炎症特性を有する生体模倣に関する。

以下に説明するように、幾つかのエボジアルテカルパ果実抽出処方が得られて分析され、インドールキナゾリンアルカロイドの組成及び濃度とは大きく異なっていることが判っている。例１において説明したように、これらアルカロイドの高濃縮度はＣＯＸ−２酵素活性化を抑制し、ＵＶＢ誘発ＰＧ解放を低減することが判っている。これらの経験の過程では、溶解ブチレングリコールは抽出物の活性化を増強する（例１）という驚くべき発見がなされている。また、ルテカルピン及びエボジアミンの重量は、抽出物内で他の成分と混合されたときは、純粋な形態における場合（例２）よりもＵＶＢ−ＰＧ解放の抑制に効果的でないという予期せぬ発見もなされている。これはアルカロイドの抑制剤が抽出物中に存在していることを示している。

エボジアルテカルパ果実抽出物の解析は高性能薄層クロマトグラフィー（ＨＰＴＬＣ）によって様々な帯域が明らかになり、これは化合物の複雑な混合を示す。帯域パターンは果実のバッチ及び抽出物のロットの中で変動し、抗炎症活性化の効能も変動する。様々な調合液内の個々の断片を解析した後の結論は、ＣＯＸ−２抑制活性化はインドールキナゾリンアルカロイド断片には見られないが、むしろ２つの個別の断片（例２）に見られるということである。これは従来技術とは対照的であり、ＵＶＢ誘発ＰＧ解放の抑制は、ＣＯＸ−２の抑制に起因していると考えられており（ＡｎｄｒｅＭａｈａｎｓ，ＲａｉｎｅｒＷｏｌｂｅｒ，ＦｒａｎｚｅＳｔａｂ，Ｌａｒｓ−ＯｌｉｖｅｒＫｌｏｔｔｚ及びＨｅｌｍｕｔＳｅｉｓ，ＣｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆＵＶＢａｎｄＵＶＡｔｏＵＶ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎｏｆｃｙｃｌｏ−ｏｘｙｇｅｎａｓｅ−２ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎａｒｔｉｆｉｃｉａｌｅｐｉｄｅｍｉｓ．Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．３：２５７−２６２，２００４）、ＣＯＸ−２抑止はインドールキナゾリンアルカイドに起因することが判った（Ｍｏｏｎ他、１９９９年及びＧｕｐｔａ，２００１年）。アルカイドＵＹＢ誘発ＰＧ解放には、ＣＯＸ−２上の効果を伴わないが、何か他のものがＣＯＸ２を抑制していることも判った。

２つのＣＯＸ−２抑制断片の解析は、これらがブチレン化ハイドロシキロトルエンであることを明らかにし、これは合成酸化防止剤に広く用いられており、トリシクロ（３，３，１，１［３，７］−デカン−１−カロキシリック酸エチルエステル，天然香料（例２）である。発明者はＣＯＸ−２抑制活性をＢＨＴを用いて複製した（例２）。ＢＨＴは合成物質であるので、エボジア果実の天然成分とすることはできない。抽出物を供給する工場からの文献にはＢＨＴを構成する記載はない。発明者が同一の工場からのエボジア果実抽出物の二つの個別のロットについて検査してみたところ、第１のロット（＃０３０１２４）はＢＨＴ断片を包含し、且つ抗ＣＯＸ−２活性化を示したが、第２のロット（＃０３０７０２）はＢＨＴ断片を包含せず、抗ＣＯＸ−２活性化を有していなかった。発明者は、ＢＨＴは、エボジアルテカルパ果実抽出物に工場によって意図的に含有されているのではなく、抽出に散発的に用いられる溶剤からの混入物質であり、即ち処理後の期間に失われることが多いものであると結論した。エボジアルテカルパ果実抽出物における抗炎症活性のこれらの発見から、発明者は、インドールキナゾリンアルカロイドにブチル化ハイドロキシトルエンをブチレングリコール基内で混合することにより、好ましい生体模倣を調製した(例３）。インドールキナゾリンアルカロイドはｒｕｔａｅｃａｒｐｉｎｅ，ｄｉｈｙｄｏｒｏｒｕｔａｅｃａｒｐｉｎｅ，１４−ｆｏｒｍｙｌｄｉｈｙｄｏｒｏｒｕｔａｅｃａｒｐｉｎｅ，ｖｏｄｉａｍｉｎｅ，ｄｅｈｙｄｒｏｖｏｄｉａｍｉｎｅ，ｉｓｏｖｏｄｉａｍｉｎｅ，ｈｙｄｒｏｘｙｖｏｄｉａｍｉｎｅ（ｒｈｅｓｉｎｉｅ），ｅｖｏｃａｒｐｉｎｅ，ｄｉｈｙｄｒｏｅｖｏｃａｒｐｉｎｅ及びｗｕｃｈｕｙｉｎｅ，並びにそれらの合成のための方法が説明されている（ＢｅｒｇｍａｎａｎｄＢｅｒｇｍａｎ，１９８５，ＣｈａｖａｎａｎｄＳｉｖａｐｐａ，２００３）。インドールキナゾリンアルカロイドは現在は合成されているので、９０％（ｗ／ｗ）を越える純度で商業的に入手可能であり、これはｒｕｔａｅｃａｒｐｉｎｅ，ｖｏｄｉａｍｉｎｅ及びｄｅｈｙｄｒｏｖｏｄｉａｍｉｎｅである。従ってこれらインドールキナゾリンアルカロイドは好ましい。合成物は構造的に関連している（図１参照）。Ｄｅｈｙｄｒｏｖｏｄｉａｍｉｎｅ（構造１）は、Ｄ−リングにおけるＮ−１４のプロトン付加によりｖｏｄｉａｍｉｎｅ(構造２）と交換可能であり、これらは機能的に同族体である。

エボジアルテカルパ抽出物の生体模倣により近い製品を製造する目的で、エボジア果実に見出される一つ又は複数の非アルカロイド化合物を含ませることが好ましい。これらはルテビン、エボジン（リモニンとしても知られる）、エボドル、エボジノン、エボジン、及びグシュイック（ｇｕｓｈｕｙｉｃ）を含む。一つ又は複数の非アルカロイドが同一の抗炎症活性を有するならば、例２に示すマツダ他（１９９８年）に説明されたようなエボジンも望ましい。更に、消費者は透明又は白色の外用剤を好むので、一つ又は複数の非アルカロイドは可視光範囲で僅かな吸収性をもたねばならない。一つ又は複数の非アルカロイドは、安全であって、且つ９０％（ｗ／ｗ）以上の純度で商業的に入手可能であり、エボジンがそれらの基準を満たさねばならない。或る商業的市場の条件下では、生体模倣混合体における少なくとも一つの生成された成分が合成ではなく、エボジア植物の抽出物から精製され、植物果実種子から抽出された高純度（＞９０％（ｗ／ｗ）純度）エボジアが中国から得られる。これらの理由のため、好ましい非アルカロイド化合物は精製された天然エボジアである。

従って本発明の好ましい生体模倣は、インドールキナゾリンアルカロイド、エボジアミン、及びブチル化ヒドロキシトルエン（及び選択的にフェノキシエタノールなどの抗菌剤）の混合物である。この混合物は本明細書ではエボジア混合体（例３）と称する。これは軽く着色された製品であるが、エボジア抽出物は代表的には暗い色である。これら精製された成分の混合体は、ＵＶＢ誘発ＰＧ解放の抑制における相乗効果をもたらし、これは例３に説明したような個々の成分から予期される効果の総計よりも大きいことが判った。更に、このエボジア混合体は、塗布の僅か６０分の後に、ヒトの皮膚におけるニコチン酸メチルによる炎症を劇的に低減させる効能がある（例４）。１０００−フォールド稀釈液（即ち、０．１％（ｖ／ｖ））でさえも、混合体は２週間以上に亘って使用された際にヒトの皮膚における炎症を防止するのに効果的であった（例４）。

エボジア混合体は天然エボジア果実とは異なっており、天然エボジア果実は様々な方法で抽出されることに留意されたい。例えば、天然エボジア果実抽出体の特性には変化があり、これは、抗炎症活性の天然抑制体には欠けており、常にＢＨＴを包含し、化合物はエボジア果実には見られず、抽出体との一貫性は見られないためである。更に、エボジア混合体は、他でもなく若干のエボジア果実抽出成分を含んでおり、非天然化物と共に相乗作用をもたらす。これらの結果は、果実抽出体の固有の特性ではなく、自然の帰結でもない。

エボジア混合体の個々の成分の各々及び混合体全体は、適宜な溶剤で溶解させてもよいが、この化合物は脂肪親和性であるので、好ましい溶剤は無極性か有機体である。個々の成分又はエボジア混合体は搬送媒体、例えばリポソーム、ニオソーム、エソソーム、トランスファロソーム、マイクロスポンジ、又は他の剛な或いは可撓な封入系などに封入してもよく、それらは最終的な製品に加えられる。細菌性汚染を防ぐ薬剤を含めることが望ましいこともあろう。好ましい抗菌剤はフェノキシエタノールであり、これはその製造業者により濃度１％で用いることが推奨されている。

溶剤は局所的に塗布されるので、安全且つ非刺激性でなければならない。適宜な溶剤はアルコールを含むが、これは保管及び運搬中に火災の危険があり、プロプレングリコールは人によっては刺激性を伴う。例１で説明したように、抗炎症活性は、成分がブチレングリコールに溶解された場合には、アルコールにおけるよりも予期せぬ大きなものとなる。これらの理由により、局所的投与に好ましい溶剤はブチレングリコールである。個々の成分又はエボジア混合体は、基本的に許容される任意の化粧品又は医薬品に添加でき、それらは生来的に極性又は非極性、或いは基体が極性と非極性との組み合わせ相である。

個々の成分又はエボジア混合体が水又は極性相へ添加された際には、エマルジョンが形成されるが、このエマルジョンの形成を促進するように、極性相に対して非極性の個々の成分又は混合体の最少量を添加することが好ましい。この理由により、個々の成分又はエボジア混合体は、非極性溶剤中で実際的に最高の濃度、即ちその溶解の限界近傍にすることが望ましい。従って混合体の調合の上限は極性溶剤におけるその溶解の限界である。

エボジア混合体は、局所的処方における活性成分（即ち、インドールキナゾリン，ｅｖｏｄｉｎｅ，及びブチル課ヒドロキシトルエン）の０．０１μｇ／ｍｌ乃至５００μｇ／ｍｌの広い範囲に亘って有効である。例４に説明したように、低濃度は長期間に亘る使用に効果的である。高濃度は短期間に効果的である。例えば、０．１％（ｖ／ｖ）のエボジア混合体（活性成分の計６・０８μｇ／ｍｌを包含する）は、毎日二回、七日間に亘って皮膚へ使用するのに効果的である。一方、１％（ｖ／ｖ）のエボジア混合体（活性成分の計６０．８μｇ／ｍｌを包含する）は塗布後の６０分間以内は皮膚に有効である。適切な濃度の選択には、製品の費用、頻度、及び使用される時間の長さ、予期しない反応のおそれを考慮する。低コストで頻繁且つ長時間の使用、及び有害事象、例えばアレルギー反応の懸念については、低濃度が望ましい。皮膚に塗布する処方について特に好ましい使用レベルは、４乃至７μｇ／ｍｌインドールキナゾリンアルカロイド（単体又は複数）、０．２乃至０．４μｇ／ｍｌエボジア及び４０乃至６０μｇ／ｍｌブチル化ハイドロキシトルエンである。

抗炎症効果は、エボジア混合体そのものを用いるか、エボジア果実からは抽出できない付加的な成分を加えるか、或いは他の化学物質又は抽出物により達成される。これらの付加的な成分は、付加的なＣＯＸ−２抑制体、ＣＯＸ−１の抑制体、或いはホスホリパーゼＡ２とすることができる。これらは日焼け防止剤若しくは日焼け止め或いは酸化防止剤などの付加的な防止剤とすることもできる。これらは、ビタミン又はミネラルのような栄養素、或いはレチノイン酸又はホルモンなどの特定の代謝修正剤としてもよい。これらは、例えば着色剤、香料、及び制汗剤などのプログランジンの生成を刺激する潜在性を有する薬剤としてもよい。このような場合、エボジア混合体は、それらの潜在的ＰＧ−刺激剤の影響を受ける炎症側を覆う役割を果たすことができる。

エボジア混合体は、直接的に又は間接的に炎症反応を誘発する発作の前後でもその発作中でも用いることができる。しかしながら混合体は、対象となる組織へ塗布した後、その抗炎症効果が観察されるまで、約４５分を要する。従って使用の好ましい時間は、刺激の前に、少なくとも４５分間であり、好ましくは６０分間である。例えば、エボジア混合体は日光への露呈に先立つ６０分間に塗布することができる。実際的な目的では、或る種の炎症発作は予期できないので、エボジア混合体は朝に一回、更に好ましくは一日に朝晩二回用いることが好ましい。

エボジア混合体の抑制剤の開始剤の範囲は非常に広範囲である。これは、アラキドン酸をプロスタグランジンへの転換の任意の誘発物質を含む。その供給源は、外部環境の刺激或いは標準代謝過程又は疾病からもたらされる内部刺激である。外部刺激の例は、イオン化又は非イオン化輻射、熱、酸化、表皮剥離、創傷、有害物質、食物、過敏症又は感染物質である。内部刺激の例は、代謝、ホルモン、パラクリン、又は自己分泌失調の変化、神経症又は神経性刺激、癌又は自己免疫性反応である。

エボジア混合体は適宜な化粧品又は薬剤基材内で処方することができる。顔、頸、腕及び手、脚若しくは足、胴、腹部、髪、頭皮、又は粘膜などの局所的塗布のためには、これは局所的クリーム、ローション、美容液、エマルジョン、エマージョン、ゲル、シャンプー、ヘアーリンス、固体形態、パウダー状、ワックス、及び二種類若しくは複数の成分の混合系を含むことができる。

エボジア混合体は、炎症を受けた健康な者又は刺激成分を伴う疾病を被った者の治療に用いてもよい。これは、幼児、少児、成人又は高齢者に用いてもよい。エボジア混合体は、炎症性疾病の何らの兆候を示していない者、これは遺伝子の存在に起因する素因、突然変異遺伝子、個人により炎症を被り易くさせる遺伝子の特殊な形態を含む。（以下の文献を参照されたい：米国仮出願第６０／５７７，８２２号［出願日２００４年６月８日］及び６０／５７８，５３０号［出願日２００４年６月１０日］、発明者：ＤａｎｉｅｌＢ．Ｙａｒｏｓｈ及びＤａｖｉｄＡ．Ｂｒｏｗｎ、発明の名称”ＧｅｎｅｔｉｃＳｃｒｅｅｎｉｎｇｆｏｒＰｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓｉｎＨｕｍａｎＧｅｎｅｓＴｈａｔＩｎｃｅｒｅａｓｅｏｒＤｅｃｒｅａｓｅＳｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｔｏＴｏｘｉｃＡｇｅｎｔｓ”、これらの全ての内容は参照により本発明に組み込まれている。）一つの好ましい実施の形態では、環境的要因に対して皮膚の過敏性を示す４０歳代以上の者の治療に局所的ローションが用いられた。

エボジア混合体の抗炎症性活性は、ラウリル硫酸ナトリウム、カラジーナン、又はペルーのバルサム（ミヨシロンペロイロ樹脂［Ｍｙｒｏｘｙｌｏｎｐｅｒｅｉｒａｅｒｅｓｉｎ］）などの刺激又はアレルギーを用いた様々なモデルで示すことができた。これらの炎症は、２４時間を越える痛みを伴う反応を引き起こし、その影響は数日間に及ぶものである。実証のための好ましい方法は、ニコチン酸メチル反応の抑制にあった。ニコチン酸メチルの溶液を皮膚へ迅速に塗布して、紅潮反応を誘発し、これは１５乃至６０分間にピークがあり、約３時間で解消した。個人ごとに異なる反応最適化のためのニコチン酸メチルの必要量は０．１ｍＭ乃至３０ｍＭの範囲であるが、多くの場合には適切な反応は１ｍＭで達成される。この反応は誘発ＰＧ及びＮＯの基本的要素を包含する。比較的に高い濃度のエボジア混合体の処方の６０分間に亘る前置処置は、比較的に低濃度の２週間においてさえも、紅班の初期ピークを低減させ、反応の正常なレベルまでの時間が短縮させた。

本発明の何らかの目的の将来的な限定を伴うことなく、以下の例は本発明の態様及びその使用について様々な例示を示す。

例１
エボジアルテカルパ抽出物により皮膚細胞からのＣＯＸ−２の抑制及びＵＶ誘発ＰＧＥ２解放
四ロットのエボジアルテカルパ抽出物を中国の供給者から入手した。この抽出物は５０％グレインアルコールを用いる抽出により調整して、褐色の糊状のものから緑色の粘液状の形態へ変化させた。この四つのロットのｒルテカルピン含有量は２．２％（ｗ／ｗ）（ロット０２０４２０）、０．５％（ｗ／ｗ）（ロット２０９２９）、０．３％（ｗ／ｗ）（ロット０２０６２１）、及び４％（ｗ／ｗ）（ロット０３０１２４）であり、基準体として純粋なルテカルピン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を用いてＨＰＴＬＣにより判定した。抽出体供給者の説明によれば、この差異には意味は無く、薬草源は各ロット毎に異なるので、ルテカルピンの含有量はロット毎に変動するということであった。果実からの種子は通常は夏季に収穫されるので、冬季には高品位の未加工の薬草を入手するのは困難である。

ＨａＣａＴケラチノサイト細胞ラインはＧｉｂｃｏＢＲＬ（ニューヨーク、グランド島）Ｄ−ＭＥＭ低グルコース媒体で培養され、その媒体は１０％熱不活性ウシ胎仔血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、１％Ｌ−グルタミン、及び１％非必須アミノ酸を含有している。その直後にＵＶＢ（４００Ｊ／ｍ^２）を照射し、ＨａＣａＴ細胞を１２．５μｇ／ｍｌ乃至１００μｇ／ｍｌエボジアルテカルパ抽出物（ロット０３０１２４）でエタノール中で処理した。媒体はＵＶＢ照射の２４時間後に集菌して、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ_２）含有をＰＧＥ_２ＥＬＯＳＡキット（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍカタログ番号ＤＥ０１００）を用いて解析した。その結果は、ＨａＣａＴ細胞からのＵＶＢ誘発ＰＧＥ_２分泌は、エボジアルテカルパ抽出物１２．５μｇ／ｍｌにおいて２９％から１００μｇ／ｍｌにおいて７８％であった。

細胞からの誘導プロスタグランジン解放の主要な源は、シクロ−オキシゲナーゼ２（ＣＯＸ−２）の誘導に関係していることは良く知られている。従って、生体外での分析は、エボジアルテカルパ抽出物が直接にＣＯＸ−２酵素を抑制しているか否かを判定するために純粋なＣＯＸ−２を用いて実行される。この分析は商業的に入手可能なＣＯＸＩｎｈｉｂｉｔｏｒＳｃｒｅｅｎｉｎｇｓＡｓｓａｙ（Ｃａｙｍａｎ，ＡｎｎＡｒｂｏｒ，ミシガン）を製造者の仕様書に従って検査することによりなされた。その結果は生体外の純粋なＣＯＸ−２酵素活性の抑制は、エボジアルテカルパ抽出物をエタノールに溶解した場合は１２．５μｇ／ｍｌでは２５％から１００μｇ／ｍｌでは６１％、またエボジアルテカルパ抽出物を１，３−ブチレングリコールに溶解した場合は１２．５μｇ／ｍｌでは５０％から７１％であった（本明細書及び特許請求の範囲で用いるように、１，３−ブチレングリコール又は１，３ブタンエディオルは「ブチレングリコール」と称す）。エタノールに溶解したＣＯＸ−２生体外の５０％減少抑制凝縮（ＩＣ５０）エボジアルテカルパ抽出物は５７μｇ／ｍｌであり、ブチレングリコールに溶解したエボジアルテカルパ抽出物についてのＩＣ５０は１８μｇ／ｍｌであった。これらの結果は、エボジアルテカルパ抽出物はＣＯＸ−２抑制剤であり、ＣＯＸ−２抑制剤としての効果は、エタノールに溶解した抽出物に対して、ブチレングリコールに溶解した抽出物で増大することを示している。従って、ブチレングリコールは好ましい担体である。

構造性圧搾扁桃ＣＯＸ−１は必須の構造的且つ標準的ＰＧの供給源であることはよく知られている。対照的に、様々なproinflammatory刺激によりＣＯＸ−２を誘導でき、それによって生じたＰＧは、その生成の程度及び継続時間に応じて、有益にも有害にもなる。ＣＯＸ−２活性の抑制は、持続的炎症の副作用の予防及び治療になり得ることも広く認められている。しかしながら構造性ＣＯＸ−２活性の抑制は、ＣＯＸ−１の生成が不可欠であるので有害であろう。従って、ＣＯＸ−１に対してＣＯＸ−２を選択的に抑制する機能としての抗炎症剤シクロ−オキシゲナーゼ抑制剤の効力を示すことは一般的な方法である。ＣＯＸ−１及びＣＯＸ−２についてのＩＣ５０の測定は、エボジアルテカルパ果実抽出は、ＣＯＸ−１よりもＣＯＸ−２についての抑制が２１６倍であることを示している（図２）。これらの結果は、エボジアルテカルパ果実抽出物は選択的ＣＯＸ−２抑制剤であることを示し、また、エボジアルテカルパ果実抽出物は、ＣＯＸ−２活性の抑制による細胞からのＵＶＢ誘発ＰＧＥ_２分泌を抑制し得ることを示している。

例２
エボジアルテカルパ果実抽出物の精製成分による皮膚細胞からのＣＯＸ−２及びＵＶ誘発ＰＧＥ_２の抑制
効果的であったエボジアルテカルパ果実抽出物の一つが、エタノール（ＨＰＴＬＣにより定められたロット０３０１２４）に溶融した３％（ｗ／ｗ）エボジアミンと４％（ｗ／ｗ）ルタエカプリンとを含んでいたので、これらの物質の何れか一方又は両方が、細胞からのＵＶＢ誘発ＰＧＥ_２分泌及び生体内ＣＯＸ−２活性の抑制に原因しているのではないかと疑われた。更に、ルタエカプリンがＣＯ−Ｘ抑制剤であるとする文献からの報告もある（Ｍｏｏｎ他，１９９９，Ｇｕｐｔａ，２００１）。

意外にも、精製ルタエカプリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，セントルイス、ミズーリ州、アメリカ）とエボジアミン（ＥｎｖｉｒｏＴｅｓｔＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，エドモントン、アルバータ州、カナダ）との両方が、エボジアルテカルパ果実抽出物におけるよりも低濃縮度でＵＶＢ照射ＨａＣａｔ細胞からのＰＧＥ_２分泌を抑制することが見出された(表１）。４μｇ／ｍｌのルタエカプリン及び３μｇ／ｍｌのエボジアミンを包含する１００μｇ／ｍｌのエボジアミカン抽出物（ロット０３０１２４）は、ＰＧＥ_２分泌を８０％抑制するのに必要とし、精製ルタエカプリン又はエボジアミンは０．３μｇ／ｍｌでは同程度に有効であった。このデータは、インドールキナゾリンアルカロイドがその全活性を示すことを防ぐエボジアミカン抽出物内に抑制剤が存在していることを示す。

仮にＣＯＸ−２抑制によりエボジアルテカルパ果実抽出物がＵＶＢ誘発ＰＧＥ_２を抑制するのであれば、精製インドールキナゾリンアルカロイドも同様な濃縮度でＣＯＸ−２抑制剤になると考えられる。意外なことに、抽出物内のインドールキナゾリンアルカロイドは１μｇ／ｍｌ未満で有効ＣＯＸ−２抑制剤であったが、生体外ＣＯＸ−２を抑制するには実質的に一層に純粋なルタエカプリンか、純粋なデヒドロエボジアミン（エボジアミンの機能的同属体）が必要であり、即ち、デヒドロエボジアミンについては＞７．５μｇ／ｍｌが、ルタエカプリンについては１４．４μｇが必要であった（表２）。これらの結果は、抽出物の他の成分がＣＯＸ−２抑制活性の原因であることを示唆している。

従って、エボジアルテカルパ果実抽出物をＨＰＴＬＣを用いて断片化し、個々の断片をＣＯＸ−２抑制活性のために分析した。

ＨＰＴＬＣは、２０Ｘ２０ｃｍＲＰ−１８Ｆ２５４プレートを用いて、移動相でヘキサン：アセトン（３：１）でなされた。エボジアルテカルパ果実抽出物の合計１０ｍｇをルタエカプリン及びエボジアミン基準体に隣接する基点に沿って装填した。ＨＰＴＬＣは溶剤前部がプレートの上部に到達するまで続いている。乾燥状態では、プレートはＵＶＡランプ下で視覚化され、全ての可視帯の縁に標識を付けた。可視帯を含んで等しい大きさに分けられた２０の帯にプレートの領域上で指標を付けて、次に各帯をプレートから削り落とした。エボジアミン及びルタエカプリンは、それぞれ断片９及び１０における識別される単独の帯として除去した。断片は、エタノールに溶融させるのに続いて、６００×ｇの遠心力によりＨＰＴＬＣ基質から回収された。

断片は、上述した例で採用した生体外分析評価を用いてＣＯＸ−２抑制活性について分析した。その結果は、２０の断片を組み合わせたに等しい質量に達する非断片化エボジアルテカルパ果実抽出物に実質的に等しい断片１７におけるＣＯＸ−２抑制活性を示している（図３）。特に興味を惹くのは、ルタエカプリン（断片９）及びエボジアミン（断片１０）に対応する帯が、この分析評価においてはＣＯＸ−２抑制活性を示さないことであり、これはおそらく何らかの抑制活性には高濃縮度のインドールキナゾリンアルカロイドが必要なためであろう。断片１７におけるＣＯＸ−２抑制活性の存在及びインドールキナゾリンアルカロイドに対応する断片におけるＣＯＸ−２抑制活性の欠除から導かれることは、エボジアルテカルパ果実抽出物のＣＯＸ−２抑制活性は新たな未だ認識されていない成分によっているものと考えられることである。

断片１７が標準相ＨＰＴＬＣを用いて更に断片化された際に、ＣＯＸ−２抑制活性は６つの帯のうちの２つに見られた（図３Ｂにおける副断片１７−２及び１７−３）。この活性が、エボジアルテカルパ果実抽出物の実質的に全てのＣＯＸ−２抑制活性の原因になったと考えられる（図３Ｂ）。

副断片１７−２及び１７−３をガスクロマトグラフィー及び質量分光分析（ＧＣＭＳ）により二つの異なる解析により解析した。第１のＧＣＭＳは、３０メートルメチルシリコン（ＺＢ−１）カラムを用いてＪＥＯＬＧＣメイトにおける毎分１５℃で５０℃から３００℃に亘って電子イオン化モードを用いた。この化合物はワイリー質量スペクトルライブラリを検索することにより特定された。第２のＧＣＭＳは、３０メートルメチルシリコン（ＺＢ−１）カラムを用いてＦｉｎｎｉｇａｎＭＡＴＧＣＱにおける毎分１５℃で５０℃から３００℃に亘って電子イオン化モードと化学イオン化モードとの両方を用いた。この機器は化合物を特定するＮＩＳＴ質量スペクトルライブラリを用いた。断片１７−２はブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）を包含することが判明した。このＢＨＴは酸化防止剤として用いられる合成化合物であって、植物学的には自然界には見出されないものである。副断片１７−３はトリクロ（３，３，１，１［３，７］−デカン−１− カロキシリック酸、エチルアダマンタン−１−カルボン酸としても知られているエチルエステルを包含することが判明し、これは複雑な構造を有する天然の香料であって、現在は市販されていない。ＧＣＭＳデータからは、抽出の毎ｍｌ当りのＢＨＴのｍｇの条件にエボジア抽出物のロット＃０３０１２４におけるＢＨＴの濃縮度はたかだか０．００６ｍｇ／ｍｌであった。この抽出は、獲得された任意の抽出物のＢＨＴの最高レベルを有しており、全ての場合において抽出のＢＨＴ濃縮は実質的に０．０１ｍｇ／ｍｌ未満であった。

エボジアルテカルパ果実の副断片１７−２における動的要素としてのＢＨＴの識別に続き、生体外のＣＯＸ−１及びＣＯＸ−２分析を純粋なＢＨＴを用いてなした。その結果はＢＨＴはＣＯＸ−１とＣＯＸ−２との両方に対して能動的であり、ＣＯＸ−２に対しては選択的であることを示している（表３）。これは公知の植物学的ＣＯＸ−２抑制剤ウルソル酸よりもＣＯＸ−２についてより選択的であるが、公知のＣＯＸ−２抑制剤ＣＥＬＥＢＲＥＸほど選択的ではなかった（表３）。

観察によれば、エボジアルテカルパ果実抽出物の選択性（２１６、例１参照）は純粋なＢＨＴの選択性よりも大きい（８７、表３）ので、ＣＯＸ−２抑制における成分中には相乗効果があるという結論を導かせる。初期データは、この相乗効果は本発明の生体模倣中にも存在することに矛盾しない。ＵＶＢ照射ＨａＣａＴからのＰＧ分泌を抑制するＢＨＴの能力について、ＵＶＢ照射直後にＢＨＴを用いて細胞を処理することにより検査した。媒体を２４時間後に採取してＰＧＥ_２ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ、ミネアポリス、ミネソタ、アメリカ合衆国）を用いてＰＧＥ_２含有物について分析した。ＢＨＴは２−２０μｇ／ｍｌでＵＶＢ誘発分泌を抑制し、これはＣＯＸ―２生体外抑制についてのＩＣ５０の範囲内にある。

例３
純粋なルテカルピン、エボジン、出ヒドロエボジアミン及びブチル化ヒドロキシトルエンの混合物による皮膚細胞におけるＣＯＸ−２及びＵＶ誘発プロスタグランジン
上記の例は予期しなかった三つの結果を示している。先ず、インドールキナゾリンアルカロイドのＵＶＢ誘発ＰＧＥ_２を抑制する能力は、エボジアルテカルパ果実抽出物に混合されたときに減少した。というのは、抽出物は活性の抑制体をも含有するためである。第二に、エボジアルテカルパ果実抽出物のＣＯＸ−２を抑制する能力は、インドールキナゾリンアルカロイドには依存しないが、他の成分（その一つはＢＨＴ）に依存する。このことから第三の驚くべき結論、即ち従来技術に相反して、インドールキナゾリンアルカロイドは、ＣＯＸ−２抑制に効果的でない濃度でもＵＶＢ誘発ＰＧＥ_２を抑制するということが導かれる。更に、抗炎症性活性は、成分がブチレングリコール内にあるときに高くなることも判明した。

このエボジアルテカルパ果実抽出物の活性の新たな知見による利点を奏させるために、エボジアルテカルパ果実中に発見された純粋な成分の生体模倣混合体を調製した。このエボジアミカン混合体は、ブチレングリコール（純度９９．８％（ｗ／ｗ））中に溶解された合成ルテカルピン（純度９９．９％（ｗ／ｗ））、合成デヒドロエボジアミン（＞純度９６％（ｗ／ｗ））、天然エボジアン（≧純度９８％（ｗ／ｗ））、及び合成ブチル化ヒドロキシトルエン（≧純度９９．８％（ｗ／ｗ））を含有する（表４）。混合体は以下の好ましい処置を用いて調製した。ブチレングリコールを４０Ｃまで加熱し、且つルテカルピンを１０分間に亘って攪拌することにより溶解させた。その温度を６５Ｃまで上昇させ、ＢＨＴを３０分間に亘って攪拌することにより溶解させた。次に温度を８０Ｃまで上昇させ、且つエボジン及びデヒドロエボジアミンを９０分間に亘って攪拌することにより溶解させた。次に、この溶液を２５Ｃまで冷却して、フェノキシエタノール（防腐剤）を添加した。エボジア混合体におけるインドールキナゾリンアルカロイドルテカルピンとデヒドロエボジアミンとの各々の好ましい濃度、即ち細胞からのＵＶＢ誘発ＰＧＥ_２分泌抑制において効果的な濃度は、エボジア混合体を０．１％（ｖ／ｖ）で用いたときである。デヒドロエボジアミンはエボジアミンの機能相同体であって、発明者の把握したところでも、また文献においても、エボジアミンと同様な活性を有している。デヒドロエボジアミンの利点は、より容易に商業的に入手可能なことである。ＢＨＴの好ましい濃縮度、即ち細胞からのＵＶＢ誘発ＰＧＥ_２分泌抑制において効果的な濃度はエボジア混合体を０．０４％（ｖ／ｖ）で用いたときであり、ＣＯＸ−２抑制に効果的なのはエボジア混合体を１％（ｖ／ｖ）で用いたときである。好ましくは、エボジンは商業的目的で添加される。というのは、エボジンはエボジア果実から直接に抽出され、若干の抗炎症性活性を有することが報告されている。好ましくは、フェノキエタノールを抗菌剤として添加する。上述したことに基づいて、エボジア混合体の好ましい成分を表４に示す。

表４の好ましいエボジア混合体は僅かに黄ばんだ色合いを帯びているが、エボジア抽出物は暗色を呈しており、黒又は暗褐色の濁った色のこともあれば、暗緑色のこともある。エボジア
混合体は、黄色領域（４００ナノメータ周辺）から長波長へ増大する入射波長としての光吸収における実質的な低減により抽出物から識別される。吸光度を標準１ｃｍ光路キュベットを用いて分光光度計により測定し、この値を、試料に用いた特定の溶剤の背景吸収について補正した。吸収は透過率の逆数のｌｏｇ_１０に等しく、透過率は溶液により伝達された入射光の比であり、即ち透過率は入射強度で除した透過強度に等しい。大切なことは、試料を適切に稀釈して、吸収率測定が分光光度計測定の線形範囲内になるようしにして、とりわけ装置の検出限界に等しくなったり、或いはそれを下回ったりしないようにすることである。吸収率値は稀釈計数を掛けた分光光度計からの読み取り値である。

エボジア混合体とエボジア抽出物とは共に黄色領域で吸収されるが、僅かに長い波長で始まって、可視領域を越えて少なくとも７００ナノメートルへ延出するエボジア抽出物よりもエボジア混合体は吸収がかなり少ない。実際、表４に説明した１００％（ｖ／ｖ）エボジア混合体は実質的に４７５ｎｍと７００ｎｍとの間のバックグラウンドを超える吸収はないが、抽出体は相当なレベルを保持している。表５に示すように、好ましいエボジア混合体の５５０ｎｍの２７０ｎｍに対する吸収比は基本的に０（即ち５５０ナノメートル測定は分光光度計の検出限界を下回る）であり、一方、エボジア抽出物は１０×１０^−３又はそれ以上の比を有する。同様に、４５０ｎｍの４００ｎｍに対する吸収比は、エボジア混合体については０に近似（３×１０^−３）するが、エボジア抽出物については１００×１０^−３以上である。

表４の好ましいエボジア混合物を、ＨａＣａＴ細胞からのＵＶＢ誘発ＰＧＥ_２分泌を抑制するその能力について検査した。ＰＧＥ_２分泌を抑制する最も有効な濃度は０．０１％（ｖ／ｖ）であって、ＵＶＢ誘発ＰＧＥ_２分泌を５０％以上抑制する有効な範囲は０．００４％（ｖ／ｖ）乃至０．４％（ｖ／ｖ）である（図４）。エボジア混合体はこの分析評価においては０．００４％（ｖ／ｖ）において有効であるので、培養細胞へ投与された際にＵＶＢ誘発ＰＧＥ_２分泌抑制におけるその最も有効な成分よりもおよそ１０倍の効能がある。このことはエボジアルタエカルパ抽出物は、この活性を阻止する化合物を包含し、抑制体が除去された時、成分がＵＶＢ誘発ＰＧＥ _２を抑制するように相乗的に働くという知見を表している。好ましいエボジア混合体は生体外ＣＯＸ−２酵素の抑制においても有効である。表４の好ましいエボジア混合体の１％（ｖ／ｖ）溶液はＣＯＸ−２活性の５４％減少をもたらし、２％（ｖ／ｖ）溶液はＣＯＸ−２の８４％減少をもたらす。１％（ｖ／ｖ）エボジア混合体におけるＢＨＴの濃度は５５μｇ／ｍｌであり（表４）、ＣＯＸ−２についてのＩＣ５０は、ＣＯＸ−２分析において単独で用いたときのＢＨＴのそれと同様であることを示している（表３）。これらの結果はエボジア混合体は１％乃至２％（ｖ／ｖ）で用いたときＣＯＸ−２に最も大きな影響を有する。従ってエボジア混合体は、ＣＯＸ−２により専ら媒介される炎症状態について、０．０１％（ｖ／ｖ）で用いられたときに皮膚細胞からのＵＶＢ誘発ＰＧＥ_２分泌を抑制するのに有益であり、好ましい処方は少なくとも１％（ｖ／ｖ）エボジア混合体を含有する。

例４
皮膚におけるニコチン酸メチル誘発紅斑のブチレングリコール中の精製ルテカルピン、エボジン、デヒドロエボジアミン及びブチル化ヒドロキシトルエンによる抑制
ニコチン酸メチルの皮膚への塗布はＰＧにより媒介される一過性紅斑を誘発すると考えられる。ＰＧとＮＯとの両方はヒトの皮膚に紅斑を誘発することが知られており、ＰＧがＮＯを誘発することも知られている。ニコチン酸メチルの皮膚への塗布は、統合失調症に対する診断手順（Ｗａｒｄ他、１９９８年）と、また局所的に塗布された抗炎症薬の評価（Ｄｕｔｅｉｌ他、１９９０年）との両方に用いられている。発明者は、ニコチン酸メチルは培養皮膚細胞からのＰＧ分泌抑制に有益であり、局所的に塗布されたエボジア混合体の有効性を検査する手段であるという知見を得た。更に、これまでの検討では、ニコチン酸メチルの影響はＰＧ分泌の誘発により媒介されることを示していたが、発明者は、ニコチン酸メチルはＮＯも誘発し、これはＰＧの誘発に必要な濃度よりも非常に低い濃度であることを発見した。従って紅斑を誘発する皮膚へのニコチン酸メチルの塗布は、プロスタグランジンと酸化窒素生成との両方を抑制する薬剤を検査するのに有益である。

標準ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）及びヒト微小細胞（ＨＭＶＥＣ）は、商業的供給業者（ＣａｓｃａｄｅＢｉｏｌｏｇｉｃｓ、ポートランド、オレゴン、ＵＳＡ）から入手して、製造業者の推奨に従って培養した。ニコチン酸メチルはＨ_２Ｏにおける１Ｍ原液として作成した。この原液をＨ_２Ｏにおいて１００ｍＭへ稀釈した。この１００ｍＭニコチン酸メチルを細胞培養媒体中で１２５乃至１０００μＭへ更に稀釈し、ＮＨＥＫ及びＨＭＶＥＣ細胞が密集度約７０％に成長したときに、ニコチンメチル酸を包含する新鮮な媒体で処理した。ニコチン酸メチルの２４時間の常温放置の後、培養媒体を集めた。窒素酸化物は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ比色窒素酸化物分析キット（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、サンディエゴ、カリフォルニア州）に説明されたＧｒｅｉｓｓ試薬を用いて測定した。細胞培養媒体におけるＰＧは商業的に入手可能なＰＧＤ_２及びＰＧＥ_２ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍ、ミネアポリス、ミネソタ、米国）を用いて分析された。培養されたＮＨＥＫ及びまたＨＭＶＥＣからの結果は、ニコチンメチル酸はＰＧＤ_２（図５Ａ）とＰＧＥ_２分泌物（データは示さず）との両方を誘発することを示している。これは、ヒト皮膚における検討に従えば、ニコチンメチル酸の局所的塗布により誘発された紅斑は、ＰＧＤ_２により媒介されることを示している（Ｍｏｒｒｏｗ他、１９９２年）。培養媒体におけるＮＯについての試験は、ＰＧ分泌物の刺激に加えて、ニコチン酸メチルはＨＭＶＥＣ（図５Ｂ）からＮＯ分泌も誘発するが、これはＰＧＤ_２及びＰＧＥ_２の生成に必要なニコチン酸メチルの濃度よりも非常に低いことを示している。ＮＯは皮膚紅斑を誘発する血管拡張剤であるので、ニコチン酸メチルは、ＰＧＤ_２及びＰＧＥ_２の誘発を介してのみならず、ＮＯの誘発により皮膚紅斑を誘発する。従ってニコチン酸メチルは微小循環機能不全による症状、例えば肢端紅痛症及びレーノー症（Ｒｅｙｎａｕｄ’ｓｄｉｓｅａｓｅ）の治療に有益である。

７人の被験者の皮膚におけるニコチン酸メチルの試験的投与により誘発された紅斑を低減させる０．５４％（ｗ／ｖ）Ｃａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）ヒドロゲルローションにおける好ましいエボジア混合体（表４）の１％（ｖ／ｖ）による単独の処置の能力を検査するために検討をなした。各塗布領域は耐色性黒色インクマーカーにより形成された隣接するラベルにより境界を規定した。ニコチン酸メチルの試験的投与に先立つ一時間、エボジア混合体ローションを処置部位に大量に塗布した。エボジア混合体を包含しないＣａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）ヒドロゲルローションをビークル調整体として用いた。全ての被験者の上部及び下部掌前腕に処置を繰り返した。一時間後、ローションを腕から洗い落とし、Ｄｅｒｍａｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（ＣｏｒｔｅｘＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｍｅｄｅｖａｅｎｇｅｔ１０，９５６０Ｈａｄｓｕｎｄ，デンマーク）を用いて各処置部位について紅斑を三倍で読み取った。その直後に、水における０．１４ｍｇ／ｍｌニコチン酸メチル溶液の１０μＬを各処置部位に塗布した。紅斑を１５，３０，６０及び９０分後に読み取った。その結果は、１％（ｖ／ｖ）エボジア混合体ローションのピーク反応及び抑制効果は、ニコチン酸メチル試験的投与の３０分後に起きることを示している（図６）。ビークルにより前置処置された処理部位とエボジア混合体で前置処置された処理部位との間のニコチン酸メチル処理部位における紅斑の差異の例を図７に示す。ニコチン酸メチルの塗布の３０分後、ビークルによる前置処置部位は活発な紅斑反応を示しているが、エボジア混合体による前置処置部位は辛うじて知覚できる程度の反応を有している。全ての被験者についての結果を零時刻からの紅斑の変化の読み取りとして解析した。ニコチン酸メチルの塗布の１５分後においては、必ずしも全ての被験者が紅斑の誘発を示しているわけではない（データは示さない）。ニコチン酸メチルの試験的投与の３０分後、上腕と下腕との両方について結果は統計的に有意なもの（Ｐ≦０．０５；対Ｔ試験）となった（図６）。１％（ｖ／ｖ）エボジア混合体ローションによるニコチン酸メチル誘発紅斑の平均減少は上腕と下腕との両方について約３５％であった。ニコチン酸メチル塗布の６０分後、紅斑反応は薄れ始めて、紅斑反応におけるエボジアローションの効果は殆ど識別できなくなった。９０分後、紅斑の読み取りは基本に戻った。

エボイディア混合体の低量投与も長時間に亘って用いた場合に有効である。上述したのと同様な手順を一日二回、二週間に亘って五箇所の部位に続けた。三箇所は、ヒドロゲルローション内の０．１％、０．３％、及び１．０％（ｖ／ｖ）の試験品により処置し、一箇所はビークル調整ローションで処置し、あとの一箇所はローション又はニコチン酸メチルの何れでも処置しなかった。最初の一週間後、それらの箇所にニコチン酸メチルを試したところ、ビークル処置箇所は、未処置箇所に比べて特徴的な紅斑反応を示した。０．３％及び１．０％（ｖ／ｖ）エボジア混合体を含有するローションはニコチン酸メチル誘発紅斑を抑制するが、０．１％（ｖ／ｖ）においてはさしたる効果はなかった。一日二回の処置の二週間経過後、０．１％（ｖ／ｖ）エボジア混合体は、０．３％及び１．０％（ｖ／ｖ）ローションと共に、炎症反応を鎮静するのに効果的であった。

これらの結果は、エボジア混合体は人体の皮膚におけるニコチン酸メチル誘発紅斑を低減させることを示している。ニコチン酸メチルは人体の皮膚にＮＯ及びＰＧ分泌を誘発することが知られているので、上述の結果は、エボジア混合体が皮膚における幾多のＮＯ及びＰＧ媒介症状（紫外線、環境刺激物により誘発されたもの、並びに内因性炎症体及びその症状を含む）の改善に有益であることを示している。

ビサボロールは抗炎症ハーブカモミールにおける活性要素であって、局所薬として、また炎症反応を抑える茶に広く用いられている。エボジア混合体とビサボロールとを、各々をヒドロゲルローションに処方して、ビサボロールをエボジア混合体の活性の総量に等しくして比較した。その結果は、１％（ｖ／ｖ）エボジア混合体ローション(表４、６０．８μｇ／ｍｌ）はニコチン酸メチル媒介紅斑の低減に有効であるが、ビサボールローション（６１μｇ／ｍｌ）は効果がないことを示した。

本発明の特定の実施例について説明及び図示したが、当業者には上述の開示事項から本発明の目的及び要旨を逸脱することなく、様々な変更例をなせることが自明であることを理解されたい。単なる一例として、添付の請求項は本発明の様々な特徴を列挙しているが、本発明はそれらの特徴の任意の及び全ての組み合わせを包含しており、このことは、そのような組み合わせが添付の請求項に記載されているか否かは問わないことを了承されたい。

参考文献
エボジア果実抽出物及びその成分の研究
1. Jan Bergaman and Solveig Bergman. Studies of Rutaecarpine and Related Quinazolinocarboline Alkaloids. J. Org. Chem. 50: 1246-1255, 1985.
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3. Wen-Fei Chou, Jyh-Fei Liao, and Chieh-Fu Chen. Comparative Study on the Vasodilatory Effects of Three Quinazoline Alkaloids Isolated from Evodia rutaecarpa. J. Nat. Prod. 59: 374-378, 1996
4. Shyam Gupta. The Role of Phytopharmaceuticals in Topica Pain Relief. HAPPI December 2001, p110.
5. Yoshinori Kobayashi. The Nociceptive and Anti-Nociceptive Effects of Evodiamine from Fruits of Evodia rutaecarpa in Mice. Planta Med. 69: 425-428, 2003.
6. Yoshinori Kobayashi, Yumiko Nakano, Miho Kizaki, Kiyoko Hoshikuma, Yoshiharu Yokoo, and Toshikazu Kamiya. Capsaicin-Like Anti-Obese Activities of Evodiamine from Fruits of Evodia rutaecarpa, a Vanilloid Receptor Agonist. Planta Med. 67: 628-633, 2001.
7. Yoshinori Kobayashi, Kiyoko Hashikuma, Yumiko Nakano, Yoshiharu Yokoo, and Toshikazu Kamiya. The positive Ionotropic and Chronotropic Effects of Evodiamine and Rutaecarpine, Indoloquinazoline Alkaloids Isolated from the Fruits of Evodia rutaecarpa, on the Guinea-Pig Isolated Right Atria: Possible Involvement of Vanilloid Receptors. Planta Med. 67: 244-248, 2001.
8. Hedeaki Matsuda, Jian-xin Wu, Toshyuki Tanaka, Munekazu Iinuma, and Michinori Kubo. Antinociceptive Activities of 70% Methanol Extract of Evodia Fructus (Fruit of Evodia rutaecarpa var. bodinieri) and Its Alkaloidal Components Biol. Pharm. Bull. 20 (3) 243-248, 1997.
9. H. Matsuda, M. Yoshikawa, M. Linuma, M. Kubo. Antinociceptive and anti-inflammatory activities of limonin isolated from the fruits of Evodia rutaecarpavar. Bodinieri. Panta Med. May; 64(4):339-42, 1998.
10. T.C. Moon, M. Murakami, I. Kudo, K.H. Son, H.P. Kim, S.S. Kang, and H.W. Chang. A new class of COX-2 inhibitor, Rutaecarpine from Evodia rutaecarpa. Inflamm. Res. 48: 621-625, 1999.
11. Joen-Rong Sheu. Pharmaclological Effect of Rutaecarpine, and Alkaloid Isolated from Evodia rutaecarpa. Cardiovascular Drug Rev. 17:237-245, 1999.
12. Nikolaus Thuille, Manfred Fille, Markus Nagl. Bactericidal activity of herbal extracts. Int. J. Hyg. Environ,. Health. 206: 217-221, 2003.
13. H.G. Woo. C.H. Lee, M.S. Noh, JJ. Lee, Y.S. Jung, E.J. Baik, C.H. Moon, S.H. Lee. Rutaecarpine, a quinazolinocarboline alkaloid, inhibits prostaglandin production in raw264.7 macrophages. Planta Med. 67(6):505-9, 2001.

ニコチン酸メチルの作用機構に関する研究
14. J. Coverly, L. Peters, E. Whittle and D. Basketter. Susceptibility to skin stinging, non-immunologic contact uticaria and acute skin irritation; is there a relationship? Contact Dermatitis 38:90-95, 1998.
15. I. Dutel, C. Queille, M. Poncet, J.P. Ortonne, and J. Czernielewski. Objective assessment of topical corticosteroids and non-steroidal anti-inflammatory drugs in methyl-nicotinate-induced skin inflammation. Clin. Exp. Dermatol 15:195-9, 1990.
16. N. Issachar, Y. Gall, M. Borrel and M-C. Poelman. Correlation between percutaneous penetration of methyl nicotinate and sensitive skin, using laser Doppler imaging. Contact Dermatitis 39:182-186, 1998.
17. J. D. Morrow, J. A. Awad, J. A. Oates, and L. J. Roberts, 1992, Identification of skin as a major site of prostaglandin D₂ release following oral administration of niacin in humans. J. Invest. Dermatol. 98-812-5.
18. P. E. Ward, J. Sutherland, E. M. T. Glen, and A. I. M. Glen. 1998. Niacin skin flush in schizophrenia: a preliminary report. Schizophrenia Res. 29:269-74.
19. Jonathan Wilkin, Glenn Fortner, Linda Reinhardt, Otero Flowers, S. James Kilpatrick and W. Carson Streeter. Prostaglandins and nicotinate-provoked increase in cutaneous blood flow. Clin. Pharmacol Ther. 38:273-277, 1985.

関連特許公報
1. 米国特許５，５９８，４２１号及び６，２１４，８３１号は活性抑制を有するエボジアミン、ルテカルピン又はエボジアからの抽出物を包含する食物又は他の組成に関する。

2. 米国特許６，３２３，２４１号は勃起不全治療目的のための血管作用薬としてのエボジアルテカルパ抽出物の使用を開示している。

３. 米国特許６，２３９，１１４号は他の組成との混合体における抗癌剤としてのエボジン（ここではリモニンと称されている）の使用を開示している。

上述の「エボジア果実抽出物及びその成分の研究」「ニコチン酸メチルの作用機構に関する研究」及び「関連特許公報」の欄に列挙した文献の内容は参照により本明細書に組み込まれている。

図1はデヒドロエボジアミン、エボジアミン及びルテカルピンの化学構造である。図２は担体としてブチレングリコールを用いるエボジアルテカルパ抽出物による体外のＣＯＸ−１及びＣＯＸ−２の５０％抑制濃縮をプロットした図である。図３ＡはＲＰ−１８Ｆ２５４ＨＰＴＬＣプレートから励起された個々のエボジアルテカルパ抽出物片によるＣＯＸ−２酵素の抑制であって、全エボジアルテカルパ抽出物（ＥＶＥ）は個々の解析された断片の総質量に等しい。図３ＢはＲＰ−１８Ｆ２５４ＨＰＴＬＣプレートからの断片１７の励起により発生した準断片によるＣＯＸ−２酵素の抑制であって、基準相ＨＰＴＬＣプレート上の更なる断片化が続き、エボジアルテカルパ抽出物（ＥＶＥ）の質量は図３Ａにおけるものと同様である。図４はエボジア混合体によるＨａＣａＴケラチノサイト細胞からのＵＶＢ誘発ＰＧＥ_２分泌の抑制を示す図である。図５Ａは正常なヒトの表皮ケラチノサイト（ＮＨＥＫ）からのＰＧＤ_２分泌におけるニコチン酸メチルの効果を示す図である。図５Ｂはヒト微小血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ）からの酸化窒素（ＮＯ）の解放におけるニコチン酸メチルの効果を示す図である。図６はＭＮ処置の後の３０分及び６０分後におけるヒトの皮膚の０．１４ｍｇ／ｍｌニコチン酸メチルにより誘発された紅班上の単独の１％（ｖ／ｖ）エボジア混合体ローション前置処置の効果を示す図である。図７は１％（ｖ／ｖ）エボジア混合体又は媒体制御の何れかで前置処置されて、０．１４ｍｇ・ｍｌニコチン酸メチルが試みられた被験者の前腕掌の写真である。この写真は試みの３０分後に撮られたものであって、媒体制御側の暗い円は誘導酵素であり、これはエボジア混合体側には事実上存在していない。

Claims

哺乳類の皮膚炎を少なくとも部分的に回復に向わせるか、少なくとも部分的に抑制するかの何れか一方又は両方のための医薬の製造における組成物の使用方法であり、前記組成物が、
ａ．少なくとも一つのインドールキナゾリンアルカロイドと、
ｂ．ブチル化ヒドロキシトルエンと、
ｃ．ブチレングリコール
を含む組成物であることを特徴とする前記使用方法。
哺乳類の皮膚炎を少なくとも部分的に回復に向わせるか、少なくとも部分的に抑制するかの何れか一方又は両方のための医薬の製造における組成物の使用方法であり、前記組成物が、
ａ．少なくとも一つのインドールキナゾリンアルカロイドと、
ｂ．ブチル化ヒドロキシトルエンと、
ｃ．ブチレングリコール
を備えると共に、以下の（ｉ）乃至（ｉｖ）、即ち、
（ｉ）前記組成物における前記少なくとも一つのインドールキナゾリンアルカロイドの混合濃度は少なくとも０．０２μｇ／ｍｌであり、且つブチル化ヒドロキシトルエンの濃度は少なくとも０．０１ｍｇ／ｍｌであること、
（ｉｉ）前記組成物における前記ａと前記ｂとの乾燥重量の合計は、前記組成物における全固形物の重量の少なくとも１０％であること、
（ｉｉｉ）５５０ナノメートルにおける前記組成物の光吸収率を２７０ナノメートルにおけるその光吸収率で除した商は、０．０１以下であること、及び
（ｉｖ）４５０ナノメートルにおける前記組成物の光吸収率を４００ナノメートルにおけるその光吸収率で除した商は、０．１以下であること、
のうちの少なくとも一つを備える組成物であることを特徴とする前記使用方法。
請求項２に記載の組成物において、前記組成物における前記ａと前記ｂとの乾燥重量の合計は、前記組成物における全固形物の重量の少なくとも９０％である組成物であることを特徴とする請求項２に記載の使用方法。
請求項２に記載の組成物において、前記組成物における前記ｂの乾燥重量の合計は、前記組成物における全固形物の重量の少なくとも５０％である組成物であることを特徴とする請求項２に記載の使用方法。
請求項１又は２に記載の組成物は、以下の（ｉ）乃至（ｉｘ）、即ち、
（ｉ）前記少なくとも一つのインドールキナゾリンアルカロイドの混合濃度が約４００乃至６００μｇ／ｍｌである組成物であること、
（ｉｉ）前記少なくとも一つのインドールキナゾリンアルカロイドがルテカルピン、エボジアミン、デヒドロエボジアミン及びそれらの塩類からなるグループから個々に選択されるように設けられた組成物であること、
（ｉｉｉ）エボジンを更に含む組成物であること、
（ｉｖ）プロスタグランジンの生成を抑制する少なくとも一つの薬剤を更に含む組成物であること、
（ｖ）プロスタグランジンの生成を刺激する潜在性を有する少なくとも一つの薬剤を更に含む組成物であること、
（ｖｉ）前記少なくとも一つのインドールキナゾリンアルカロイドの混合濃度は、炎症を少なくとも部分的に回復させるか、少なくとも部分的に抑制するかの何れか一方又は両方に有効である組成物であること、
（ｖｉｉ）エマルジョンの形態である組成物であること、
（ｖｉｉｉ）哺乳類の皮膚へ塗布するのに適する組成物であること、及び
（ｉｘ）ヒトの皮膚へ塗布するのに適する組成物であること、
のうちの少なくとも一つである組成物であることを特徴とする請求項１又は２に記載の使用方法。
請求項１又は２に記載の組成物は、以下の（ｉ），（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）、即ち、
（ｉ）ブチル化ヒドロキシトルエンの濃度が少なくとも０．０５ｍｇ／ｍｌである組成物であること、
（ｉｉ）ブチル化ヒドロキシトルエンの濃度が４乃至６ｍｇ／ｍｌであり、前記組成物における前記少なくとも一つのインドールキナゾリンアルカロイドの混合濃度が約４００乃至６００μｇ／ｍｌである組成物であること、及び
（ｉｉｉ）前記少なくとも一つのインドールキナゾリンアルカロイド及び前記ブチル化ヒドロキシトルエンの混合濃度は、炎症を少なくとも部分的に回復させるか、少なくとも部分的に抑制するかの何れか一方又は両方に有効である組成物であること、
のうちの少なくとも一つである組成物であることを特徴とする請求項１又は２に記載の使用方法。