JP5116671B2 - 抗αVβ6抗体およびその使用 - Google Patents
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Description
本発明は、細胞生物学、免疫学及び腫瘍学の分野に属する。特に、本発明は、非ヒト起源の可変領域及びヒト起源の免疫グロブリンの少なくとも一部分を含むv6インテグリンを認識するヒト化抗体に関する。本発明は又、これらの抗体を調製するプロセス、これらの抗体を含む薬学的組成物、及びヒト化抗v6抗体を投与することにより種々の疾患を処置する方法にも関する。本発明は又、腫瘍細胞及び組織の表面におけるインテグリンαvβ6の差次的発現の特定、腫瘍細胞の転移の可能性を測定することにおけるこの差次的発現の使用、並びにインテグリンαvβ6に結合するリガンド、特に抗体を使用して、腫瘍転移を診断及び処置/予防する、及び残存する転移腫瘍細胞を排除する方法にも関する。
インテグリンは、細胞外マトリックスタンパク質を結合し、細胞−細胞及び細胞−細胞外マトリックスの相互作用(一般的には細胞接着事象と呼ばれる)を媒介する細胞表面糖タンパク質受容体である(Ruoslahti, E., J. Clin. Invest. 87:1−5 (1991); Hynes, R.O., Cell 69:11−25 (1992))。これらの受容体は、互いに組み合わさると、異なる細胞特異性及び接着特異性を有する種々のヘテロ2量体タンパク質が生じる、非共有結合により会合したアルファ(α)及びベータ(β)鎖からなる(Albeda, S.M., Lab. Invest. 68:4−14 (1993))。最近の試験では、細胞接着、遊走、浸潤、分化、増殖、アポトーシス及び遺伝子発現を含めた細胞プロセスの調節において特定のインテグリンが関与していることが示唆されている(Albeda, S.M., Lab. Invest. 68:4−14 (1993); Juliano, R., Cancer Met. Rev. 13:25−30 (1994); Ruoslahti, E. and Reed, J.C., Cell 77:477−478 (1994);及びRuoslahti, E. and Giancotti, F.G., Cancer Cells 1:119−126 (1989); Plow, Haas, et al., 2000;van der Flier and Sonnenberg 2001)。
「約」:何れかの数値を指す場合に本明細書で使用する場合、「約」という用語は、記載した値の±10%の値を意味する(例えば「約50℃」とは両端を含む45℃〜55℃の温度範囲を包含し;同様に「約100mM」とは両端を含む90mM〜110mMの濃度範囲を包含する)。
本発明は、インテグリンαvβ6に対して特異的なヒト化抗体を特徴とする。本明細書には、本発明の抗体を製造する種々の方法を記載する。当該技術分野で既知であるが、本明細書に具体的に記載していない方法も本発明の適用範囲に含まれる。
一実施形態において、本発明により提供される抗体はモノクローナル抗体であり、これは好ましい実施形態においては他の種に由来する同属体抗αvβ6抗体のヒト化型である。ヒト化抗体は、抗原結合に必要ではないヒト免疫グロブリンの軽鎖又は重鎖のアミノ酸の一部又は全て(例えば定常領域及び可変ドメインのフレームワーク領域)を使用して同属体、非ヒト抗体の軽鎖又は重鎖から対応するアミノ酸を置換する組換えDNA技術により生成された抗体である。一例として、所定の抗原に対するマウス抗体のヒト化型はその重軽鎖の両方において、(1)ヒト抗体の定常領域;(2)ヒト抗体の可変ドメイン由来のフレームワーク領域;及び(3)マウス抗体由来のCDRを有する。必要に応じて、ヒトフレームワーク領域の1つ以上の残基をマウス抗体の対応する位置における残基に変化させることにより、抗原に対するヒト化抗体の結合親和性を維持することができる。この変化を「復帰突然変異」と称する場合がある。ヒト化抗体は一般的に、キメラヒト抗体と比べて、前者がかなり少量の非ヒト成分を含有することから、ヒトにおいて免疫応答を誘発する可能性がより低い。
以下に更に詳述する通り、本発明のヒト化モノクローナル抗体は、その他の部分を更に含むことにより、所望の機能を作用させる場合がある。例えば、ヒト化抗体は、抗体がターゲティングする細胞を殺傷するために毒素部分(例えば破傷風トキソイド又はリシン)又は放射性核種(例えば111In又は90Y)を含む場合がある(例えば米国特許第6,307,026号を参照)。ヒト化抗体は、単離又は検出を容易にするための部分(例えばビオチン、蛍光部分、放射性部分、ヒスチジンタグ又は他のペプチドタグ)を含む場合がある。ヒト化抗体は又、その血清半減期を延長することができる部分、例えばポリエチレングリコール(PEG)部分を含む場合もある。
(A)アルキル化剤:これらの薬剤の一部の特定の例には、シクロホスファミド、クロラムブシル、ブスルファン、メルファラン及びニトロソ尿素がある;
(B)代謝拮抗物質及び抗増殖材、例えばアントラサイクリン、ビンカ薬剤、マイトマイシン、ブレオマイシン、ヌクレオシド、プテリジン、エンジイン:例としては、アドリアマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、アミノプテリン、メトトレキセート、マイトマイシンC、アクチノマイシン−D、5−フルオロウラシル、6−メルカプトプリン、シトシンアラビノシド、タキソール、タキサン、シトカラシンB、コルヒチン及びピューロマイシンエトポシド、メルファラン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、カリケアマイシン、マイタンシノイド誘導体及びドリスタチン誘導体がある;
(C)ホルモン及びホルモン拮抗物質、例えばコルチコステロイド、プロゲスチン及びエストロゲン。
本発明のヒト化抗体は、αvβ6媒介疾患の予防を含む診断及び処置において有用である。例えば、これらのヒト化抗体は、TGF−βの活性化を阻害すること、又はフィブロネクチン、ビトロネクチン及びテナシンのようなその他何れかのリガンドへのαvβ6の結合を阻害することにより、線維症(例えば肺線維症、急性肺傷害、腎線維症、肝線維症、Alport症候群及び硬皮症)及び本明細書に別途記載するその他の疾患及び障害を処置するために使用することができる。特に、本発明のヒト化抗体は、傷害/線維症に関連する肺疾患(例えば、特発性肺線維症、放射線誘導線維症、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、硬皮症、ブレオマイシン誘導線維症、慢性喘息、珪肺症、アスベスト誘導線維症、急性肺傷害及び急性呼吸窮迫症(例えば細菌性肺炎誘導性、外傷誘導性、ウィルス性肺炎誘導性、換気装置誘導性、非肺敗血症誘導及び吸引誘導性)が含まれるがこれらに限定されない)を処置するために使用することができる。本発明のヒト化抗体は又、傷害/線維症に関連する慢性腎症(例えば、狼瘡、糖尿病、硬皮症、糸球体腎炎、巣状分節状糸球体硬化症、IgG腎症、高血圧、自家移植片及びAlport疾患が含まれるがこれらに限定されない)を処置するためにも使用することができる。ヒト化抗体は又、腸の線維症、硬皮症、放射線誘導線維症を処置するにも有用である。本発明のヒト化抗体は、肝線維症、例えば限定しないが胆管傷害誘導線維症を処置するためにも使用することができる。本発明のヒト化抗体が処置に有用である可能性があるその他の適応症には、頭頚部線維症、放射線誘導線維症、角膜瘢痕形成、LASIX、角膜移植、柵状織切除術、肥大性瘢痕形成、熱傷誘導線維症、外科的線維症、サルコイドーシス、乾癬及び脊髄傷害/線維症が含まれる。
本発明は又、本発明の1つ以上のヒト化抗体又はその薬学的に許容される誘導体を場合により何れかの薬学的に許容される担体と共に含む薬学的組成物を提供する。本明細書で使用される「担体」という用語には、既知の許容されるアジュバント及びビヒクルが含まれる。
別の実施形態において、本発明は又、細胞によるインテグリンαvβ6の発現レベルを測定することによって、転移癌細胞を同定する、又は腫瘍内の細胞の転移能力(即ち腫瘍内の細胞が原発腫瘍部位から二次的、又は転移性の部位にin vivo転移する可能性)を予測する方法であって、αvβ6の細胞表面発現の増大が、癌細胞が転移する可能性がより高いことを示す、方法も対象とする。関連する実施形態において、本発明は、腫瘍を除去するための医療介入(例えば腫瘍の外科的切除、又は化学療法又は放射線療法による腫瘍の低減又は剥離)の後にαvβ6を発現する残存腫瘍細胞、特に転移性の腫瘍細胞を排除する方法を対象とする。別の関連する実施形態において、本発明は、浸潤性又は転移性の形態への進行の可能性がより高い癌腫、特に腺癌又はin situ癌腫(例えば乳房の上皮内腺管癌(DCIS)又は上皮内小葉癌(LCIS))の非浸潤性の形態を発見する方法を提供する。特定のこのような実施形態は、癌腫の細胞中、又は癌腫を包囲する筋肉上皮中、このような癌腫に罹患しする患者から得た組織切片中におけるインテグリンαvβ6の発現レベルを測定することを含み、非腫瘍組織試料(理想的には同じ患者の同じ臓器に由来)と比べてインテグリンαvβ6の発現レベルが上昇していることは、癌腫が近い将来の何れかの時点において浸潤性又は転移性の形態の癌に進行する可能性がより高いことを示す。このような実施形態のそれぞれにおいて、本発明は、腫瘍細胞中のαvβ6の増大した発現の同定又は利用に依存しており、その同定は、組織、腫瘍又は腫瘍細胞中のインテグリンαvβ6に結合する1つ以上のリガンドに組織、腫瘍又は腫瘍細胞を接触させることにより達成される。特定の実施形態において、組織、腫瘍又は腫瘍細胞は、癌腫の組織、腫瘍又は腫瘍細胞、例えば腺癌のような癌腫に由来するものである。より特定の実施形態において、癌腫は、乳癌腫、子宮内膜癌腫、膵臓癌腫、結腸直腸癌腫、肺癌腫、卵巣癌腫、子宮頚癌腫、前立腺癌腫、肝臓癌腫、食道癌腫、頭頚部癌腫、胃癌腫又は脾臓癌腫である。より具体的には、癌腫は乳癌腫(上皮内乳癌腫、例えば上皮内腺管癌(DCIS)及び上皮内小葉癌(LCIS)を含むがこれらに限定されない)、子宮内膜癌腫、膵臓癌腫、結腸直腸癌腫、子宮頸癌腫又は肺癌腫である。
特定の実施形態において、αvβ6に結合するリガンド、例えば抗体は、未コンジュゲートの形態で使用することができる。他の実施形態において、αvβ6に結合するリガンド、例えば抗体は、例えば検出可能な標識、薬剤、プロドラッグ又は同位体にコンジュゲートすることができる。
今回、転移性の特定の腫瘍に由来する細胞が、低転移性又は非転移性の細胞に比べて、インテグリンαvβ6の有意に増大したレベルを発現することを見出した。更に、本発明者等は、in situ癌腫の特定の形態、例えば乳房の上皮内腺管癌(DCIS)又は上皮内小葉癌(LCIS))において、腫瘍を包囲する筋肉上皮が、癌腫の腫瘍細胞と比べて、及び正常な乳房組織と比べて、有意に増大したレベルのインテグリンαvβ6を発現することも発見した。従って、本発明は、腺癌のような癌腫由来の腫瘍を含めた腫瘍細胞の転移能を診断するのに有用な方法を提供する。より特定の実施形態において、癌腫は、乳癌腫、子宮内膜癌腫、膵臓癌腫、結腸直腸癌腫、肺癌腫、卵巣癌腫、子宮頚癌腫、前立腺癌腫、肝臓癌腫、食道癌腫、頭部頚部癌腫、胃癌腫及び脾臓癌腫である。より具体的には、癌腫は、乳癌腫(例えば上皮内乳癌腫、例えば上皮内腺管癌(DCIS)又は上皮内小葉癌(LCIS))、子宮内膜癌腫、膵臓癌腫、結腸直腸癌腫、子宮頚癌腫又は肺癌腫である。
本発明の別の実施形態において、αvβ6結合リガンド、例えばαvβ6結合抗体又はそれらのフラグメントは、特定の疾患、特に特定の癌腫、例えば本明細書に別途記載するものに罹患した哺乳動物を処置する治療計画において使用される場合がある。本発明のこのような方法は、癌及び関連する事象、例えば腫瘍の生育、転移及び血管形成を処置するのに有用である。このような方法に特に好適なものは、疾患に罹患した哺乳動物の組織又は細胞におけるαvβ6発現レベルの増大を特徴とし、且つαvβ6発現レベルの増大を示す組織又は細胞をターゲティングし、これらの組織又は細胞を排除する処置に応答するような疾患又は癌である。これらの方法により特に処置が可能な疾患には、乳房、卵巣、前立腺、肝臓、肺、膵臓、結腸、頭頚部組織(例えば口腔、咽頭、舌及び喉頭組織)、子宮内膜、子宮頚部、胃及び脾臓を含めた上皮組織の転移癌(即ち、転移癌腫及び/又は腺癌)が含まれる。本発明のこれらの方法による処置に特に好適なものには、子宮内膜、膵臓、結腸(例えば結腸直腸癌腫)、子宮頚部、肺及び乳房(上皮内腺管癌(DCIS)及び上皮内小葉癌(LCIS)を含む)の癌腫がある。処置に好ましい哺乳動物には、サル、類人猿、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギ及びヒトが含まれる。特に好ましくはヒトである。
製造業者の推奨するプロトコルに従い、Qiagen RNeasyミニキットを使用し、3G9マウスのハイブリドーマ細胞由来の総細胞RNSを調製した。重鎖及び軽鎖の可変領域をコードする相補的DNAは、Amersham/Pharmacia First Strand cDNA合成キットを使用し、プライミングのためにランダム六量体を使用し、製造業者の推奨するプロトコルに従い、総細胞RNAからRT−PCRによってクローン化した。
cDNAsは、マウス−ヒトキメラ(ch3G9)を発現するためのベクターを構築するために使用された重鎖及び軽鎖のマウス3G9可変領域をコードしており、ここでは、mu3G可変領域とヒトIgG1及びκ定常領域とが結合している。
ヒト化3G9(hu3G9)を発現させるために再形成された可変ドメインの設計は以下の通りに実施した。3G9軽鎖可変ドメインをヒトκ3に、重鎖可変ドメインをヒト重鎖サブグループ3に対応させた。ヒト受容体フレームワークの選択は、プログラムIgBLAST:軽鎖のヒトL6(ヒトJK4由来J領域を使用する)及び重鎖のヒト3−7(ヒトJH4由来J領域を使用する)を使用して、ヒト生殖細胞系列配列への相同性マッチングによって実施した。表1に示す通り、再形成された可変軽鎖及び可変重鎖それぞれにつき3種類の変異型を設計した。第1変異型ではマウスドナー配列に突然変異を最も多く取り入れ、第3変異型では最も突然変異を最も少なくした(即ち、最も「ヒト化」した)。重鎖及び軽鎖可変ドメインのCDR領域は、下の表1に示す通り、従来のKabatナンバリング分類システムによって定義されている。しかし、下に示した配列のナンバリングは、互いに関連する種々の配列の相対線形位置決め方式に基づいている。
二重鎖DNAを生成した。この反応は、95℃での2.5分間の初回溶解後に94℃での30秒間の溶解×16サイクル、64℃での30秒間のアニーリング後、72℃での1分間の伸長からなる。この反応はQiagen Qiaquick ゲル抽出キットを使用し、製造業者の推奨するプロトコルに従って精製した。
ヒト化キメラ重鎖発現ベクターと軽鎖ベクターとの可能性のある全ての組み合わせを293−EBNA細胞に同時移入した(16通りの組み合わせ)。移入細胞胞は抗体分泌及び特異性について試験した。ならし培地のウェスタンブロット分析(抗ヒト重鎖及び軽鎖抗体を使用して検出する)及び簡易滴定(Pierce)分析から、hu3G9移入細胞が合成され、重鎖及び軽鎖を効率的に分泌し、発現のレベルが抗体ヒト化の増大を伴って増大している思われることが示された。図2に示す通り、軽鎖変異型1を含有する変異体は、これよりも高レベルで発現する軽鎖変異型2を含有する変異体の発現量が乏しく、このことは、ヒト化が増大すると高次の発現を引き起こす傾向があることを示唆している。
(a)VH3〜7のFR1由来ヒトFR1;
(b)マウス3G9 CDR1重鎖配列;
(c)VH3〜7のFR2由来ヒトFR2;
(d)マウス3G9 CDR2重鎖配列;
(e)VH3〜7のFR3由来ヒトFR3;
(f)マウス3G9 CDR3重鎖配列;及び
(g)大多数のヒト抗体に存在し、WGQGTLVTVSSという配列を有するコンセンサスフレームワーク配列由来のヒトFR4。
軽鎖可変ドメインの場合、配列は以下を含む:
(a)L6のFR1由来ヒトFR1;
(b)アスパラギン(N)からセリン(S)へのアミノ酸置換を有するマウス3G9 CDR1軽鎖配列;
(c)L6のFR2由来ヒトFR2;
(d)マウス3G9 CDR2軽鎖配列;
(e)L6のFR3由来ヒトFR3;
(f)マウス3G9 CDR3軽鎖配列;及び
(g)大多数のヒト抗体に存在し、FGGGTKVEIKという配列を有するコンセンサスフレームワーク配列由来のヒトFR4。
上述のEBVベクターは、望ましくない外来5’並びに3’ UTRsを含有する。hu−3G9重鎖変異3型及び軽鎖変異5型(H3/L5)のために安定CHO発現ベクターを生成し、集合的に変異5型とし、この中から外来配列を除去した。更に、発現した3G9抗体とFcガンマ受容体との間に生じる可能性のある相互作用を除去するために、アグリコシル重鎖ベクターを生成した。
hu3−G9変異5型の発現プラスミドpKJS189、pKJS196及びpKJS195をCHO細胞に移入した。αvβ6への結合特異性を示す抗体分泌の見られる移入細胞胞のhu−3G9変異5型(H3/L5)及びアグリコシル化したhu−3G9変異5型(a−H3/L5)の発現が観察された。
ヒト化抗体の設計においては、相補性決定領域(CDRs)には抗体と最も結合する可能性の高い残基が含まれ、再形成された抗体の中に保存されていると考えられる。CDRsは、Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest. 5th Edition, U.S. Dept. Health and Human Services, U.S. Govt. Printing Office (1991)に従った配列によって定義した。CDRsは、重要な残基がCDRループの広範囲の立体構造を決定する標準クラス(Chothia, et al., Nature, 342:877−883 (1989))に分類した。このような残基は、殆どの場合、再形成された抗体に保存されている。このCDRsの重鎖及び軽鎖は、以下の通り標準クラスに分類した。
軽鎖: 重鎖:
L1:15残基 クラス4 H1:5残基 クラス1
L2:7残基 クラス1 H2:17残基 クラス2
L3:9残基 クラス1 H3:17残基 標準クラスなし
このようなクラスに重要な標準的な残基を表3に示した。何れの標準的な残基もルールに従って記載している。ループH3には標準クラスは見られない。
(a)VH1〜2のFR1由来のヒトFR1;
(b)マウス8G6 CDR1重鎖配列;
(c)VH1〜2のFR2由来のヒトFR2;
(d)マウス8G6 CDR2重鎖配列;
(e)VH1〜2のFR3由来のヒトFR3;
(f)マウス8G6 CDR3重鎖配列;及び
(g)NRデータベースからのヒトフレームワークgi|392715と100%同一であり、WGQGTLVTVSSという配列を有する大多数のヒト抗体に存在するコンセンサスフレームワーク配列由来のヒトFR4。
軽鎖可変ドメインの場合、配列は以下を含む:
(a)L6のFR1由来のヒトFR1;
(b)マウス8G6 CDR1軽鎖配列;
(c)L6のFR2由来のFR2由来のヒトFR2;
(d)マウス8G6 CDR2軽鎖配列;
(e)L6のFR3由来のヒトFR3;
(f)マウス8G6 CDR3軽鎖配列;及び
(g)FGGGTKVEIKという配列を有する大多数のヒト抗体に存在するコンセンサスフレームワーク配列由来のヒトFR4。
E1D: これはCDR立体構造/抗原結合(Kolbinger, et al., Protein Eng., 8.971−980 (1993))を示す。モデルでは、このE1DとCDRs L1及びL3のS26、Q27及び又はE93の骨格又は側鎖との間に相互作用が見られる可能性がある。このE1Dは変異型2及び変異3型では、置換反応が保存的であることから、除去している。
A24G: この物質はCDR−H1の標準残基である。保存的突然変異。変異型2では除去している。
細胞によって取り込まれる抗体は、癌細胞を選択的に標的とし、癌細胞の増殖を阻害するための毒素、放射性化合物又は他の抗癌剤に抱合される可能性があるため、癌等の臨床適用に特定の利益をもたらす可能性がある。抗αvβ6抗体が取り込まれる能力については、以前に国際特許第WO 03/100033号に記載されていることから、ここでは参考としてそのまま転載する。国際特許第WO 03/100033号では、6.8G6及び6.1A8等のカチオン非依存的モノクローナル抗体(RGD含有リガンド模倣剤)に関してインターナリゼーション(取り込み化)が観察されたことを発表した。しかし、6.3G9、7.1C5及び6.4B4等のカチオン依存性mAbsにはインターナリゼーションは観察されなかった。8G6等の抗体が細胞によって取り込まれる能力は、取り込まれる抗体と治療的成分/治療薬との結合を有利にし、成分/薬剤の細胞内への送達を可能にする。例えば、薬剤又は毒素の成分は8G6取り込み抗体と接合する可能性がある。しかし、この同じ用法が3G9等の非取り込み抗体に適用できる可能性があり、その場合には、化学成分をこのような抗体と接合させ、標的の細胞表面(例えば、腫瘍細胞表面等)に送達させることが可能であると思われる。
この実験では、上皮性起源の種々の癌でのαvβ6の発現及び転移性部位での発現を試みた他、αvβ6 mAbsを遮断する機能がin vivoでのαvβ6発現腫瘍の増殖を阻害するかどうかを明らかにした。本発明者等は、ヒト咽頭癌、Detroit62に及ぼす自験の抗ヒトαvβ6 mAbsのin vitro及びin vivo抗抗体活性を評価した他、これとTβRII:Fcのin vivo抗腫瘍活性とを比較した。自験データは、ヒト癌におけるαvβ6の役割の他、αvβ6 mAbsの機能的遮断による治療的介入の可能性を裏付けている。
免疫組織化学のために、組織切片は蒸留水で再水和したキシレン及びエタノール中で脱パラフィン化した後、0.45%H2O含有のメタノールに浸漬した。この組織をペプシン(00−3009、Zymed[米国カリフォルニア州サンフランシスコ])で培養し、アビジン及びビオチン(SP−2001; Vector Laboratories[米国カリフォルニア州バーリンゲーム])で阻害した。一次抗体を0.1%ウシ血清アルブミン(BSA)含有のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で希釈し、その組織を4℃にて一晩培養した。マウス異種移植組織での免疫染色β6については、切片を抗αvβ6 mAb、2A1(Weinreb, P.H., et al., J. Biol. Chem. 279(17): 17875−17887 (2004))のヒト/マウスキメラ型及び抗ヒトビオチン化二次抗体(PK−6103、Vector Laboratories[米国カリフォルニア州バーリンゲーム])で培養した。ヒト組織での免疫染色β6については、切片をマウス2A1及び抗マウスビオチン化二次抗体(PK−6102、Vector Laboratories)で培養した。この切片にアビジン−ビオチン複合ホースラディッシュ(セイヨウワサビ)ペルオキシダーゼ(Vector Kit、PK−6102)を使用して、室温にて30分間培養した後、製造業者の指示通りに3,3’−ジアミノベンジジン(DAB)基質を準備し(SK−4100、Vector Laboratories)、切片に室温にて5分間使用した。組織切片をMayerのヘマトキシリンで1分間染色した後、水及びPBS中で洗い流した。
I. 転移腫瘍におけるαvβ6発現
αvβ6免疫染色を種々の転移腫瘍で評価した。転移腫瘍の78%(43/55)が陽性に免疫染色されたことは、転移腫瘍の大多数が強度の染色であることを示す(図13A〜F;図14A〜I)。この結果から、頭頸部腫瘍のみで陽性の免疫染色率が増大し、子宮頸部腫瘍と膵臓腫瘍とは同程度の発現が見られることがわかった(表1)。
上の表1に示した通り、αvβ6免疫染色は試験した子宮内膜腫瘍の53%で陽性であった。少数の例外はあるが、染色は高悪性度の腫瘍の浸潤性の高い領域になるほど、有意に認められた。一次腫瘍の3例をリンパ節転移腫瘍と対応させた。この内2例では、リンパ節転移腫瘍における免疫染色率は対応させた一次腫瘍と比較して有意に高値であった(図15Aと図15Bとの比較、図15Cと図15Dとの比較)。3例目では、免疫染色率はリンパ節転移腫瘍及び対応させた一次腫瘍の両者で高値であった(データなし)。αvβ6陽性腫瘍上皮染色率は、3例の一次腫瘍でそれぞれ10%、20%及び90%であったが、対応させた転移リンパ節でのαvβ6陽性腫瘍上皮の割合は、それぞれ80%、100%及び100%であった。正常な子宮内膜では、嚢胞と同じように、染色が表面層の一部の細胞に限局していた。
免疫組織化学を用い、上記の「材料及び方法」で記載した方法に従って、αvβ6発現の程度に関してヒト乳癌細胞の100サンプル以上を評価した。原位置での幾つかの腺管癌の症例(DCIS)において、αvβ6発現は腫瘍を囲む筋上皮に限局され、腫瘍そのものは観察できなかった(例えば、BrCa19;図16A)。しかし、幾つかの浸潤性乳癌では、同じように腫瘍でαvβ6が発現されていた(例えば、BrCa23;図16B)。
上の表1に示す通り、αvβ6免疫染色は試験した膵臓腫瘍の80%で陽性であった。8名の別々の患者からの一次膵臓腫瘍のサンプルを免疫組織化学法によって試験したところ、高悪性度腫瘍の浸潤性領域で染色が著明であった(図17A〜17C; 18A〜18E)。この一次腫瘍サンプルは、リンパ節転移細胞とも対応しており(図17D〜17F; 18F〜18J)、この領域でも強力なαvβ6染色が示されたことは、αvβ6陽性細胞が一次腫瘍部位から播種されたものであるという考えを裏付けている。正常な膵臓(図17G〜17H; 18K〜18L)では、染色は表面層の一部の細胞に限局していた。
In vitroで、β6移入細胞の浸潤、遊走及びマトリックスメタロプロテアーゼ9(MMP−9)を生成する能力を遮断する能力について、αvβ6遮断モノクローナル抗体(mAb)3G9(Weinreb, P.H., et al., J. Biol. Chem. 279(17): 17875−17887 (2004))及び可溶性組換え型TGF−βRII−Ig(Cosgrove, D, et al., Am. J. Pathol. 157(5): 1649−1659 (2000))を評価した。このような活性はそれぞれ、腫瘍細胞浸潤並びに遊走と関連付けてモニターした。3G9及びTGF−βRII−Igの効果は、非移入親細胞(C1)及びC1細胞のβ6移入誘導体(VB6)を使用して評価した。
既述の通り、C1及びVB6ヒト口腔扁平癌細胞はKGM培地の中で増殖した(Thomas, G.J., et al., J. Invest. Derm. 117(1):67−73 (2001)。本発明者等は遊走を測定するため、製造業者の指示に従ってFLUROBLOKTMプレート(平板培地)及びインサート(BD Biosciences[米国マサチューセッツ州ベッドフォード])を使用した。手短に言えば、空のウェルにKGM培地を満たしたものか又は無血清KGMを陰性対照とした。細胞を回収し、抗体を使用して無血清培地で前培養した。50,000細胞をインサートに加え、これをウェルに入れ、組織培養器の37℃にて24時間培養した。培養後、細胞及び培地をインサートの上部から除去した。フィルター底部に遊走した細胞は2μg/mLのカルセイン(Invitrogen Corpn.[米国カリフォルニア州カールズバッド])で1時間標識化し、底部読み取りモードの蛍光性を測定することによって、定量化した。阻害率は、抗体の存在下で遊走した細胞数を培地のみの場合と比較した減少率として計算した。浸潤度についても同じような方法で、MATRIGEL(登録商標)でコーティングされたFLUROBLOCKインサートを使用し、48時間培養して測定した。
1% FBSを含有する培地の細胞は、記載の時間にわたりMATRIGELコーティングウェル(BD Biosciences)中で培養した。上澄みを採取し、細胞残渣を遠心分離で除去した後、試験まで凍結させた。MMP濃度をELISA(R&D, Systems[米国ミネソタ州ミネアポリス])によって定量化した。
図20A〜20Cに示す通り、αvβ6遮断mAb 3G9はin vitroで遊走、浸潤及びVB6細胞によるMMP−9の生成を有意に阻害した。又、可溶性組換え可溶性TGF−βRII−IgによるTGF−β活性の遮断も、浸潤及びVB6細胞によるMMP−9の生成を阻害したが(図20B及び20C)、このような細胞の遊走には作用を及ぼさなかった(図21A)。このようなデータは、αvβ6機能の遮断とTGF−β活性の遮断とを比較して、明白な機能的差異を示している。この結論は、αvβ6にはフィブロネクチンへの結合を通じての細胞接着及び遊走の両者を媒介する他、潜在的な前駆物質TGF−βの活性化を媒介する能力(Sheppard, D., Cancer Metast. Rev. 24:395−402 (2005))と一致している。
1. 背景
新規結腸癌モデルであるLIM1863は、最近になって特徴が明らかにされた(Bates, R.C. and Mercurio, A.M., Mol. Biol. Cell 14:1790−1800 (2003); Bates, R.C., et al., J. Clin. Invest. 115(2):339−347 (2005))。In vitroでは、LIM1893細胞は懸濁培養中で増殖し、高分化型の3D球状体(奇形)となった。しかし、TGF−β及びTNFαへの曝露後、この細胞株は、典型的にはE−カドヘリンの損失が見られる上皮から間葉への移行(EMT)を特徴とする形態学的変化を伴う移行性単分子層表現型に変換した。この移行はαvβ6発現の有意な増大を伴う。In vivoでは、ヌードマウスの脇腹に皮下注入する場合、LIM1863細胞は発癌性である(Bates, R.C., et al., J. Clin. Invest. 115(2): 339−347 (2005))。図6に示した通り、LIM1863細胞はαvβ6発現の著明なパターンを示している(上述)。具体的に言えば、αvβ6の発現は一次腫瘤から腫瘍間質内への浸潤が見られる細胞において特に著明である。この所見は、先に記載した通り、このような細胞が上皮から間葉への移行(EMT)を経ているという考えと一致している(上述を参照)。
LIM1863細胞はRPMI−1640(GIBCO; Invitrogen Corp.[米国カリフォルニア州ラホイヤ])のオルガノイドとして増殖させ、5%ウシ胎仔血清(FCS)で補完した。LIM1863オルガノイド(約8×106細胞)は、雌のヌードマウスの脇腹に皮下的に接種した。試験した何れのマウスもBiogen IdecのInstitutional Animal Care and Use Committee(IACUC)の許可を得ていた。このマウス集団に10mg/kgの抗αvβ6特異的マウスモノクローナル抗体3G9(Weinreb, P.H., et al., J. Biol. Chem. 279(17):17875−17887 (2004))、2mg/kgの組み替え可溶性TGF−βRII−Ig融合タンパク質(Cosgrove, D., et al., Am. J. Pathol. (157(5):1649−1659 (2000))又はビヒクルの対照物質(PBS)を週3回腹腔内投与した。腫瘍容積は、測径器を使用して対応する時点に測定し、その腫瘍用量を計算式(L×W2)/2を使用して計算した。異種移植片は7週間後に採取し、これをホルマリンで固定し、パラフィンに埋め込んだ切片を上記実施例9(図21)で記載した通りに実施された免疫組織化学法に使用した。
抗αvβ6 mAb 3G9及び/又は可溶性の組み替えTGF−βRII−Igは、腫瘍増殖に直接的な作用を及ぼさなかった(図22A、22B)。しかし、このようなリガンドは、治療に対して盲検であった病理学者によって実施された間質内のαvβ6陽性腫瘍細胞領域(図22〜22F)の定量化から評価した通り、LIM1863細胞の間質浸潤を約80%と有意に阻害した(図22C)。
概要
非ヒト霊長類(NHP)αvβ6インテグリン上の抗αvβ6遮断モノクローナル抗体6.3G9(m3G9)に関する親和性及び生物活性は、種々のin vitro方法によって測定した。蛍光活性化細胞分類(FACS)を使用したところ、高濃度のαvβ6を発現するNHP細胞株は、2種類の動物種から同定された(アフリカミドリザルからは12MBr6、アカゲザルからは4MBr5)。m3G9は12MBr6及び4MBr5で発現したαvβ6と結合し、ED50値はそれぞれ0.30μg/mL及び0.38μg/mLであった。又、m3G9は12MBr6及び4MBr5がそれぞれのIC50値0.22μg/mL及び0.29μg/mLで、TGFβ1潜伏関連ペプチド(LAP)と結合するのを阻害した。最終的に、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター1プロモーター(TMLC)の一部を安定して発現するTGFβ応答性ミンク肺上皮レポーター細胞による共培養試験を使用して、IC50値0.31μg/mLで測定した通り、m3G9は4MBr5細胞株が潜在TGFβを活性化する能力を遮断した。
この試験の目的は、非ヒト霊長類(NHP)細胞で発現するαvβ6インテグリンのためのαvβ6モノクローナル抗体6.3G9(m3G9)の親和性及び生物活性を測定することであった。m3G9は、ヒト化モノクローナル抗体hu3G9(BG00011)のマウス前駆物質である。このマウス抗体は高親和性の特異的αvβ6インテグリン標的試薬である1。m3G9はその標的である高親和性(KD=16pM)のαvβ6インテグリンと結合し、細胞発現αvβ6とリガンド(TGFβ潜伏関連ペプチド(LAP)及びフィブリネクチン)との結合を阻害し、αvβ6が潜伏TGFβ1を活性化する能力を遮断する1。この抗体が結合するためにはαv及びβ6の両者のサブユニットの存在が必要であり、他の関連インテグリン(αvβ3、αvβ3、αvβ5、αvβ3及びαIIbβ3)との交差反応性は観察されておらず、このことはm3G9がαvβ6に対して高度に特異的であることを示している1。
試薬
マウスモノクローナル抗体6.3G9(m3G9)及び6.4B4は、参考文献1及び本明細書で上に記載した通り、生成及び精製した。組換えヒトLAP(LAP)はR&D Systems(カタログ番号246−LP)から購入した。ヒトβ6移入SW480(ヒト結腸直腸腺癌)細胞株(SW480β6)はDean Sheppard(UCSF)から提供された。
次の細胞株はAmerican Type Culture Collection(ATCC)から入手した:
細胞はトリプシン処理によって採取し、リン酸緩衝生理食塩水で1回洗浄後、FC緩衝液中(PBS、2% FBS、0.1% NaN3、1 mM CaCl2、及び1mM MgCl2)で再懸濁させた。次に、1×106細胞に10μg/mL m3G9を加え、氷上の計50μLのFC緩衝液中で0.5時間培養した。培養後の細胞は氷温のFACS緩衝液(PBS、2% FBS、0.1% NaN3)で2回洗浄し、Alexa488−共役ヤギ抗マウスIgG(Jackson ImmunoResearch)の1:200の希釈物を含有する100μLのFC緩衝液中で再懸濁させた後、氷上で30分間培養した。次に、細胞を氷温のFC緩衝液で2回洗浄し、100μLのFC緩衝液及び50μLのパラホルムアルデヒド中で再懸濁させた。標識した二次抗体の結合は、フローサイトメトリー(Biogen Idec Research core facility)でモニターした。
96ウェルマイクロタイタープレートを重炭酸ナトリウム50mM中で希釈した0.5μg/mL LAPの50μL/ウェルでコーティングし、pH9.2の4℃にて一晩保存した。このプレートをPBS(100μL/ウェル)で2回洗浄し、PBS(100μL/ウェル)中の1%BSAにより、25℃にて1時間、活性を遮断した後、分析緩衝液(50mMトリス、pH 7.5、150mM NaCL、1mM CaCl2、1mM MgCl2)の100μL/ウェルで2回洗浄した。分析緩衝液中の12MBr6又は4MBr5細胞(4〜12×106細胞/mL)に2μM蛍光染料(BCECF−AM、Molecular Probes)加え、37℃の水槽で15分間静かに振盪培養し、遠心分離によって採取した後、4〜12×106細胞/mLになるまで分析緩衝液中に再懸濁させた。洗浄したプレートの各ウェルに25μLの2倍濃度のm3G9及び標識細胞25μLを加え、25℃にて0.5時間培養した。このプレートを分析緩衝液(100μL/ウェル)で4〜6回洗浄し、プレート上で捕捉した細胞に起因する蛍光発光を96ウェル蛍光プレート読み取り器(CytoFluor Series 4000、Perseptive Biosystems)に記録した。最終洗浄段階の前(即ち、全細胞数を加えたもの)と後(結合した細胞)との蛍光発光と比較することによって、結合率を決定した。
TMLC(プラスミノーゲン−アクチベーター阻害剤1タンパク質の一部を安定的に導入されたミンク肺上皮細胞株Mv 1 Lu)4を2mLのLグルタミン、ペニシリン−ストレプトマイシン及び200μg/mLのG418を加えたDMEM+10%ウシ胎仔血清中で増殖させた。細胞をPBS+5mM EDTAによってフラスコから引き上げ、PBS+0.1% BSA中で洗浄し、血球計算板によってカウントした後、96ウェルプレートに平板培養した。DMEM+0.1%FBS中の96ウェルプレートに104細胞/ウェルでTMLCを植え込んでいる間、αvβ6発現細胞は氷上で2時間保存し、37℃にしてから接着させ、その後、結合したTMLCをDMEM+0.1%BSAで1回洗浄した。モノクローナル抗体はαvβ6発現細胞に加えてDMEM+0.1%BSAで希釈した後、室温にて20分間、前培養した。次に、DMEM+0.1%BSA中で、このαvβ6発現細胞を4×104細胞/ウェルのTMLCに加えた(100μL/ウェル)。プレートを加湿状態の二酸化炭素を強化した培養器で、37℃、20時間培養した。上澄み液は廃棄し、代わりに100μL PBS+1mM Ca+2及び1mM Mg+2を補充した。細胞を溶解させ、マイクロプレート照度計(Tropix TR717マイクロプレート照度計、Perkin Elmer Life Sciences)を使用して、LucLite kit(Perkin Elmer Life Sciences[米国マサチューセッツ州ボストン])でルシフェラーゼ(発光酵素)を検出した。
1. 霊長類αvβ6インテグリンのためのマウス6.3G9(m3G9)の結合親和性及び遮断効力
非ヒト霊長類(NHP)αvβ6インテグリンのm3G9の親和性を試験するため、ATCCから4種類のNHP細胞株を入手した。初回スクリーン(図23)では、12MBr6並びに4MBr5細胞株でαvβ6発現量が最も高かったため、この2種類の細胞株をm3G9の特性決定のために使用した。αvβ6非遮断抗体である6.4B4も又、m3G9に関して観察された強度とほぼ同じ平均蛍光強度で12MBr6及び4MBr5と結合した。
m3G9と12MBr6及び4MBr5との結合は、材料及び方法の項で記載した通り、蛍光活性化細胞分類(DACS)を使用して測定した。各細胞株にm3G9の完全滴定を実施し、非線形回帰を使用して、ED50(半最大信号をもたらす抗体の濃度)を測定した。12MBr6及び4MBr5のED50値はそれぞれ0.30μg/mL(図24A)及び0.38μg/mL(図24B)であった。
12MBr6及び4MBr5がLAPと結合する能力は、細胞接着試験を使用して明らかにした。この接着はm3G9によって遮断されるが、対照用タンパク質(BSA)又はαvβ6非遮断抗体(6.4B4)によっては遮断されなかった(図25)。この相互作用を遮断するm3G9の効力は、各細胞株に及ぼす阻害の濃度依存性を測定することによって評価した(図26)。このような実験から、IC50値(半最大阻害をもたらす抗体の濃度)を決定した。12MBr6及び4MBr5のIC50値はそれぞれ0.220μg/mL及び0.29μg/mLであった。
12MBr6及び4MBr5が潜在的TGFβを活性化する能力は、共培養試験を使用して明らかにした。この試験では、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター1プロモーター(TMLC)の一部を安定的に発現するTGFβ応答性ミンク肺上皮レポーター細胞と共に細胞を培養した(図27)。この試験では、細胞内シグナル伝達及び/又は潜在的TGFβの生成の差も活性化に影響を及ぼすと思われることから、αvβ6の発現量はTGFβ活性化を促進するには十分ではない。このような2種類の細胞株の内、4MBr5のみが潜在的TGFβの活性化において効果的であり、一方の12MBr6は作用を示さなかった。又、ヒトαvβ6を安定的に発現するβ6−移入ヒト結腸癌細胞株である陽性対照細胞株SW480β6を使用した場合にも、活性化が観察された。非移入対照親細胞株(SW 480)は、予測通りに活性化を示さなかった。
マウス、NHP及びヒトαvβ6に関するm3G9の結合及び活性について得られたデータを次の表にまとめている。この表の最初の欄は、FACSによって測定した結合ED50sを示している。各場合の測定したED50は0.38μg/mL(2.5nM)以下であった。表の2番目の欄は、細胞接着のm3G9による阻害に関するIC50値を示している。各場合のm3G9による細胞接着は、IC50≦0.29μg/mL(1.9nM)で阻害されている。表の3番目の欄は、共培養試験を使用して明らかにしたように、αvβ6媒介性TGFβ活性化の阻害に関するIC50値を示している。NHP細胞株4MBr5は、ヒト細胞株SW480β6と類似の活性を示した(IC50値はそれぞれ0.40μg/mL及び0.24μg/mL)。
要約:
αvβ6は、上皮のリモデリングの部位に優先的に発現し、潜在的前駆体であるTGF−βと結合して活性化することが明らかになっているTGF−βを誘導インテグリンである。本明細書では、αvβ6が、膜性糸球体腎炎、糖尿病、IgA腎症、グッドパスチャー症候群及びアルポート症候群においてヒト腎上皮で過剰発現することを明らかにする。腎疾患におけるαvβ6の果たしうる調節の役割を評価するため、αvβ6モノクローナル抗体(mAb)の阻害機能の作用及び、アルポート症候群のマウスモデルであるCol4A3−/−マウスにおける腎線維症に対するβ6サブユニットの遺伝子除去を試験した。アルポート症候群マウス腎におけるαvβ6の発現は、主として皮質尿細管上皮細胞に認められ、線維症の進行と相関した。αvβ6阻害mAbの投与により、活性化線維芽細胞の蓄積及び間質性コラーゲンマトリックスの沈着を阻害した。同様に、腎線維症の阻害がβ6欠損アルポート症候群マウスで認められた。腎組織の転写プロファイルは、αvβ6阻害mAbが線維性及び炎症性媒介物質の発現の疾患関連変化を有意に阻害したことを明らかにした。組換えの可溶性TGF−β RIIの投与により同様の転写調節パターンが得られ、αvβ6及びTGF−βの調節機能が分担していることが示唆された。これらの所見は、αvβ6が腎線維症の調節に寄与することができることを示し、このインテグリンが治療標的としての可能性を有することを示唆している。
進行性線維症は、末期の腎疾患にいたる共通のプロセスであり、上皮リモデリング、線維芽細胞の活性化、炎症及び細胞外マトリックス(ECM)との細胞の相互関係の再構築によって助長される。これらの事象に寄与する分子的機序は複雑で、TGF−β軸の調節不全、ECMリモデリング異常及びインテグリンスーパーファミリーの細胞接着受容体の発現及び機能の変化を含む1〜5。近年の試験で、腎上皮及び間葉細胞において幾つかのインテグリン及び関連分子が重要な制御機能を有することが明らかにされた3、6〜8。
1. 試薬
αvβ6モノクローナル抗体を、本明細書及び過去の刊行物23に記載の通りに生成した。ヒト/マウスキメラ2A1及び3G9 cDNAを、First Strand cDNA合成キット(Amersham/Pharmacia[米国ニュージャージー州ピスカタウェイ])を使用して、重鎖には定常領域プライマーCDL−739を、軽鎖にはCDL−738と共に個々の親ハイブリドーマの全RNAから生成した。重鎖及び軽鎖の可変領域遺伝子を、cDNA合成に使用したのと同じ3'プライマー及び殆どのマウス抗体遺伝子シグナル配列(請求により入手可能な配列)に特異的な縮重プライマーのプール及びPfu DNAポリメラーゼ(Stratagene[米国カリフォルニア州ラホイヤ])を使用してポリメラーゼ連鎖反応により増幅した。クローン化した重鎖及び軽鎖の可変領域を、ヒトIgG1定常領域と共に哺乳類発現ベクターに結合させた。組換え可溶性マウスTGF−β受容体II−Ig型融合タンパク質(rsTGF−βRII−Ig)を、過去の刊行物7に記載の通り、R&D Systems(532−R2、米国ミネソタ州ミネアポリス)から購入した。抗体は下記の通り購入した。FITC抱合汎抗サイトケラチンモノクローナル抗体(C−11)、Sigma−Aldrich(F3418、米国ミズーリ州セントルイス);抗ラミニンB1鎖モノクローナル抗体(LT3)、Chemicon(MAB1928、米国カリフォルニア州テメキュラ);フィコエリトリン(PE)抱合抗αvモノクローナル抗体(RMV7)、Chemicon(CBL1346P);ウサギ抗αv、Chemicon(AB1930);PE−ラットIgG1、BD Biosciences(553925、米国カリフォルニア州サンホゼ);及び抗平滑筋アクチン(SMA)−Cy3、Sigma−Aldrich(C−6198)。潜在的TGF−βを発現する293細胞の異種移植部位に比べて、本質的に活性なTGF−βを発現する293細胞の異種移植部位に優先的に結合する抗体として24、ウサギポリクローナル抗TGF−β、Santa Cruz Biotechnology(sc−146、米国カリフォルニア州サンタクルーズ)を同定した。
遺伝的背景129Sv/Jを有するCol4A3+/−マウスを、Dr. Domonique Cosgrove(Boy's Town National Research Hospital、米国ネブラスカ州オハマ)から入手し、注射試験用に交配してCol4Ad−/−マウスを作成した。遺伝的背景129SVを有するβ6−/−マウスを、Dr. Dean Sheppard(カリフォルニア大学[米国カリフォルニア州サンフランシスコ])から入手し、Col4A3+/−マウスと交配させた。全ての動物はBiogen Idecで飼育し、全ての動物試験は承認され、Institutional Animal Care and Use Committee(研究機関内の動物の管理及び使用に関する委員会)に従って実施した。
マウスβ6安定トランスフェクトNIH3T3細胞(NIH3T3b6)を、過去の刊行物23に記載の通り作成した。細胞をトリプシン処理により回収し、PBSで洗浄し、FC緩衝液(1×PBS、2%FBS、0.1% NaN3、1mM CaCl2及び1mM MgCl2)で再懸濁させた。細胞0.2×105を、精製一次抗体を含有する合計容量100μLのFC緩衝液中で、氷上で1時間培養した。培養後、細胞を氷冷したFC緩衝液で2回洗浄し、5μg/mLのPE抱合ロバ抗マウスIgG(Jackson ImmunoResearch)を含有するFC緩衝液100μLで再懸濁し、氷上で30分間培養した。αvの発現を監視するため、細胞をPE抱合ラット抗マウスαvモノクローナル抗体(RMV−7)及び対照のPE抱合ラットIgG1と共に培養した。細胞を氷冷したFC緩衝液で2回洗浄し、標識二次抗体の結合をフローサイトメトリーで監視した。
組織切片をキシレン及びエタノール中で脱パラフィン処理し、蒸留水で再水和して、0.45% H2Oを含有するメタノールに浸漬した。組織をペプシン(00−3009, Zymed[米国カリフォルニア州サンフランシスコ])と共に培養し、アジビン及びビオチン(SP−2001; Vector Laboratories[米国カリフォルニア州バーリンゲーム])で阻害した。一次抗体を0.1%BSA含有PBSで希釈し、組織を一晩4℃にて培養した。マウス組織にβ6による免疫染色を施すため、切片をヒト/マウスキメラ型抗αvβ6モノクローナル抗体2A123及び抗ヒトビオチン化二次抗体(PK−6103, Vector Laboratories[米国カリフォルニア州バーリンゲーム])と共に培養した。ヒト組織にβ6による免疫染色を施すため、切片をマウス2A123及び抗マウスビオチン化二次抗体(PK−6102、Vector Laboratories)と共に培養した。アビジン−ビオチン複合体−西洋ワサビペルオキシダーゼ(Vector Kit、PK−6102)を切片に塗布し、30分間室温にて培養し、3,3'−ジアミノベンジジン(DAB)マトリックスを指示通りに調製し(SK−4100、Vector Laboratories)、室温にて5分間切片に塗布した。組織切片をMayer's Hematoxylinで1分間染色し、水及びPBSで洗い流した。
MetaMorph v5.0(Universal Imaging Corporation[米国カリフォルニア州サニーベール])を使用して、SMA免疫染色を定量化し、全体の画像サイズに対する陽性の百分率として表した。各動物について、少なくとも皮質切片5つ及び髄質切片1〜2つの20倍画像を解析した。投与群の統計学的解析をANOVAを使用して実施した。
遺伝的背景129Sv/Jを有するCol4A3−/−マウスを交配して、Col4A3−/−マウスを作成した。マウスにはタンパク質を1週間に3回、3週齢から7又は8.5週齢になるまで指示通り腹腔内注射した。モノクローナル抗体は4mg/kg、rsTGF−βRII−Igは2mg/kg腹腔内注射した。マウスを安楽死させ、RNA採取及び免疫染色のため腎を回収した。全ての動物試験は承認され、Institutional Animal Care and Use Committee(研究機関内の動物の管理及び使用に関する委員会)に従って実施した。
腎をTRIzol(155−96−018、Invitrogen[米国カリフォルニア州カールズバッド])中で直接ホモジナイズし、製造業者のプロトコルに従いつつも、1mLの酸フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール25:24:1 pH6.6抽出物を追加して、RNAを抽出した。精製された全RNAをH2O(Ambion Inc.[米国テキサス州オースチン])で処理したジエチルピロカーボネート(DEPC)に再懸濁して、260及び280を記録した(Spectra max Plus、Molecular devices[米国カリフォルニア州サニーベール])。残留DNAをDnase I amplification grade(カタログ番号18068−015、Invitrogen)5単位を20℃にて15分使用して除去した。高性能cDNAアーカイブキット(カタログ番号4322171、Applied Biosystems Inc.[米国カリフォルニア州フォスターシティ])を製造業者のプロトコル通りに使用して、cDNAを作成した。
オリゴヌクレオチドプライマー及びTaqman MGBプローブをAffymetrix共通配列から、Primer Express version 2.0.0(Applied Biosystems Inc.)を使用して設計した。Taqman MGBプローブは、5'共有結合の蛍光受容体染料(FAM)と共に設計し、副溝結合剤/非蛍光クエンチャー(MGBNF)が3'末端に共有結合した。オリゴヌクレオチド標準テンプレートは、アンプリコンの5'及び3'末端に10bpの遺伝子特異的配列を追加することによって設計した。逆相HPLCでプライマーを精製し、オリゴヌクレオチド標準テンプレートはBiosearch technologies Inc.(米国カリフォルニア州ノバト)から購入した。HPLCで精製されたマウスグリセラルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)用のプライマー及びプローブを、Biogen Idecで合成した[CATGGCCTTCCGTGTTCCTA, GCGGCACGTCAGATCC, 6FAM−CCCCAATGTGTCCGTC]。
下記の条件で、7900HT(Applied Biosystems Inc.)サーマルサイクラーで、試料及び標準品の4連のPCR反応を処理した。50℃にて2分間(ウラシルN−デグリコシラーゼ消化物)、95℃にて10分間(Taq熱安定ポリメラーゼの活性化)及び95℃にて15秒間及び60℃にて60秒間を40サイクル。各反応ウェルについて操作期間中7秒毎に蛍光を測定した。Sequence Detection Software(Applied Biosystems Inc.)を使用してオリゴヌクレオチド標準曲線との比較によって、各試料の相対的転写量を決定した。
Genechip(登録商標) Expression Analysis(Affymetrix[米国カリフォルニア州サンタクララ])のAffymetrix Technical Manual(701021 rev 1)に記載のEukaryotic Target Preparationプロトコルに従って、試料の標識、ハイブリダイゼーション及び染色を実施した。要約すれば、精製した全RNA 5μgを、200UのSuperScript II(カタログ番号18064−022、Invitrogen)及び0.5μgの(dT)−T7プライマー[5'−GGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGAGGCGG(T)24]が入った20μLの第一鎖反応液で42℃にて1時間使用した。第二鎖の合成は、40Uの大腸菌DNAポリメラーゼ(カタログ番号18010−025、Invitrogen)、2Uの大腸菌RNase H(カタログ番号18021−071、Invitrogen)及び10Uの大腸菌DNAリガーゼ(カタログ番号18052−019、Invitrogen)を添加した後に、16℃にて2時間培養することによって実施した。この第二鎖合成反応液を、Genechip(登録商標) Sample Cleanup Module(カタログ番号900371、Affymetrix[米国カリフォルニア州サンタクララ)を使用して製造業者のプロトコルに従って精製した。精製したcDNAを、BioArray high yield RNA transcription labeling kit(カタログ番号42655−40、Enzo Life Sciences, Inc.[米国ニューヨーク州パーミンデール])を使用して製造業者のプロトコルに従って増幅し、70〜120μgのビオチン標識cRNA(相補的RNA)を作成した。マウスMgU74Av2、MgU74Bv2及びMgU74Cv2 GeneChip(登録商標)プローブアレイを、製造業者のプロトコルに従って、GeneChip(登録商標) Hybridization Oven 640(Affymetrix[米国カリフォルニア州サンタクララ)の中でプレハイブリダイズした。フラグメント化した標識cRNAを、100mMの2−モルホリノエタンスルホン酸、1Mの[Na+]、20mMのEDTA、0.01% Tween 20、0.5mg/mLのアセチル化BSA、0.1mg/mLのニシン精子DNA、対照オリゴB2及び対照転写産物bioB 1.5pM、bioC 5pM、bioD 25pM及びcre 100pMを含有する1×ハイブリダイゼーション緩衝液300μL中で再懸濁させ、製造業者のプロトコルに従って、Genechip(登録商標)プローブアレイ(Affymetrix[米国カリフォルニア州サンタクララ)とハイブリダイズした。ハイブリダイズしたGeneChip(登録商標)プローブアレイを洗浄し、Streptavidin−Phycoerythrinin(カタログ番号S866、Molecular Probes[米国オレゴン州ユージーン])を使用して染色し、GeneChip(登録商標) Fluidics Station 400(Affymetrix[米国カリフォルニア州サンタクララ)を使用して、ビオチン化抗ストレプトアビジン(BA−0500, Vector Laboratories[米国カリフォルニア州バーリンゲーム])で増幅した。GeneChip(登録商標)プローブアレイをGeneArray Scanner(Hewlett Packard[米国オレゴン州コーバリス])を使用してスキャンした。
アレイスキャンデータをAffymetrixの.CELファイルに変換し、結果として得られたデータセット(全実験を代表する.CELファイル群)を、Robust Microarray Average(RMA)法を使用して正規化した。GeneSpring(Agilent)及びSpotfire(Spotfire)データマイニングツールを使用して、統計学的及びクラスタリング解析を実施した。二段階式ANOVA及びFold changeフィルタリングを使用して、シグナル強度が実験的投与により、非投与Col4A3−/−群に比べてp<0.05及び2倍以上変化したプローブセットを同定した。同様に、疾患関連転写産物を、非投与Col4a3−null及び未感作野生型群の間での発現の差から、統計学的カットオフ値をp<0.01、シグナルfold−changeカットオフ値を2として選択した。結果として得られた遺伝子群及び実験条件群のプロファイルを、階層的クラスタリングによって解析し描出した。Ingenuity Pathway Analysis database(Ingenuity Systems)を使用して、バーチャル経路解析を実施した。
1. 線維症を来したヒト腎試料におけるαvβ6の発現
炎症性/線維性病理に起因する数種類のヒト腎疾患では、腎組織においてTGF−βの発現の亢進が対応して認められることが明らかになっている25〜27。免疫組織化学的解析を使用して、TGF−βの活性化の亢進につながりうる機序として、慢性炎症及び線維症に起因するヒト腎生検試料のαvβ6の発現を調査した(図29A及び29B)。膜性糸球体腎炎、糖尿病、IgA腎症、グッドパスチャー症候群、アルポート症候群及び狼瘡の組織試料では全て、拡大し損傷を受けた尿細管の上皮内膜に有意なαvβ6の染色が認められた。対照的に、形態学的に正常な腎試料(腎癌及び正常組織)では、尿細管にわずかな免疫染色が時に認められた。糸球体の染色は解析した腎試料全てで認められなかった。この所見は、αvβ6が健常な成人の上皮には低レベルでしか発現しないが、組織の外傷及び修復時にはアップレギュレートされるとした過去の報告と一致する10、11、13、15、17。
ヒトアルポート症候群のマウスモデルであるCol4A3−/−マウスは、線維症の多数の標準的マーカー発現の増加を伴う、腎の糸球体及び間質の両方におけるECMの蓄積につながる進行性糸球体腎炎を発症する28、29。Col4A3−/−マウスにrsTGF−βRII−Igを投与すると、腎線維症が抑制されるという過去の報告がある7。Col4A3−/−マウスの腎は、約5〜6週齢から線維症の組織学的徴候を呈し始めた。疾患は年齢と共に迅速に進行し、マウスは約11週間で腎不全のため死亡した。ヘテロ接合体Col4A3+/−は糸球体腎炎を発症せず、その腎は野生型の同腹子のそれと組織学的に鑑別不可能である。年齢を経たCol4A3+/−及びCol4A3−/−(アルポート)マウスの腎におけるαvβ6の発現の力学を確認するため、4、7及び8週齢のマウスから単離した腎におけるαvβ6の発現に関して免疫組織化学的解析を実施した(図30A〜C)。4週齢では、Col4A3+/−及びCol4A3−/−マウスの両方の尿細管に時にαvβ6の発現が認められた。7週齢までに、αvβ6の発現はCol4A3−/−マウスの尿細管上皮細胞で有意に増加したが、Col4A3+/−の腎ではこの増加は認められなかった。このαvβ6発現量の増加は、Col4A3−/−マウスで8週齢を超えても持続していた。又、6週齢を超えたCol4A3−/−(アルポート)マウスの拡大し損傷のある尿細管の上皮細胞におけるαvβ6の染色の強度が増加し、αvβ6の強い発現を示す腎組織の面積が有意に増加した。7〜8週齢の期間中の発現量の増加は、Col4A3−/−マウスにおける腎線維症の迅速な進行と一致した。一方、Col4A3+/−マウスの腎では、全ての期間にわたって、わずかなαvβ6の発現及び年齢依存性の免疫染色の強度のわずかな上昇しか検出されなかった。Col4A3−/−マウスの腎のαvβ6発現量は線維症の進行と相関したため、αvβ6機能の阻害が線維症病変の開始及び進行を阻害できるのかどうかを確認することにした。
本発明者等は過去に、リガンドへの結合能を損なうことなしにαvβ6に結合するmAb(非阻害mAb)及び、リガンド結合及びαvβ6媒介性のTGF−β活性化の両方を阻害するmAb(阻害mAb)をはじめとする強力且つ選択的な抗αvβ6モノクローナル抗体の作成について報告した23。in vivo試験で使用したαvβ6を阻害するmAbがαvβ6インテグリンに選択的に結合しているのかどうかを確認するため、αvβ6とmAbとの結合を、トランスフェクトしていない親NIH3T3細胞及びマウスβ6 cDNAをトランスフェクトしたNIH3T3細胞(NIH3T3b6)を比較するFAC解析を実施した(図31A)。対照の抗αvモノクローナル抗体であるRMV7では未トランスフェクト及びαvβ6を発現している両方のNIH3T3細胞が染色されたのに対し、抗αvβ6モノクローナル抗体は選択的にNIH3T3b6細胞のみに結合した。腎におけるαvβ6の結合の特異性を確認するため、阻害αvβ6モノクローナル抗体の一つである3G9のヒト/マウスキメラ型を作成し、ウサギ抗αvポリクローナル抗体で作成した免疫染色パターンを比較した(図31B及び31C)。3G9のキメラ型及び元来のマウス型は、FACS及びELISAで測定した場合(データなし)、標的との結合親和性が同等であった。3G9のキメラ型は、Col4A3−/−マウスの腎において尿細管上皮細胞を特異的に免疫染色し、β6−/−マウスと交配させたCol4A3−/−マウス(Col4A3−/−;β6−/−)の腎切片は免疫染色しなかった。抗αv抗体による腎の免疫染色では、Col4A3−/−マウスとCol4A3−/−;β6−/−マウスとに有意な差は認められなかった。
腎線維症の制御においてαvβ6が果たしうる機能的関与を調べるため、αvβ6モノクローナル抗体の進行線維症病変の開始及び進行を阻害するための阻害能力を試験した。αvβ6による阻害の予防的作用を評価するため、Col4A3−/−マウスを3週齢から7週齢まで、又は3週齢から8.5週齢まで、2種類の阻害αvβ6モノクローナル抗体である3G9及び8G6、非阻害αvβ6モノクローナル抗体の6.8B3又はアイソタイプでマッチさせた陰性対照モノクローナル抗体の1E6を投与した。表現型の参照として、又TGF−βの全身性の阻害作用を監視するため、これらの試験には、rsTGFβRII−Igを投与するCol4A3−/−マウスも含めた。腎を回収して、組織学的評価を行い、RNAを単離した。線維症並びにSMA発現の組織学的特徴は、週齢でマッチさせたCol4A3+/−マウスの腎に比べて、7及び8.5週齢のCol4A3−/−マウスの腎で劇的に増加した。陰性対照のmAbを投与したCol4A3−/−マウスの腎では、糸球体のメサンギウムの拡大及び線維症及びボーマン嚢の半月体形成が認められた(図32A、1E6)。又、これらの腎では有意な筋線維芽細胞の活性化及び尿細管上皮の外傷及び拡張に起因する間質の線維症が認められた。阻害αvβ6モノクローナル抗体6.3G9又は6.8G6を投与したCol4A3−/−では、糸球体及び間質の外傷及び線維症が有意に抑制され、相当量の腎構造が保持された(図32A、3G9及び8G6)。これらの阻害αvβ6 mAbの作用は、SMAの発現の糸球体では>65%、間質領域では>90%の抑制を伴った(図32B及び32C)。糸球体のSMA発現に対する阻害mAbの作用は、αvβ6インテグリンの発現は尿細管上皮細胞に限定されるが、その機能を阻害すれば組織の遠位部にも作用を及ぼすことができることを示唆している。それは少なくとも部分的には阻害αvβ6 mAbの間接的な全身作用を介するものであると考えられる。非阻害αvβ6 mAbである8B3を注射したCol4A3−/−マウスの腎では、線維症の進行に対する作用は全く認められなかった。TGF−βの阻害を介して腎線維症が抑制されたとする過去の報告と矛盾することなく7、30〜33、Col4A3−/−マウスに対するrsTGFβRII−Igの投与は、組織学的外観の変化及び腎組織中のSMAの量が裏付けるように、阻害αvβ6 mAbにより生じるのと同様の腎線維症の抑制をもたらした。SMA発現に対するαvβ6阻害mAbの作用は、腎全組織におけるコラーゲン1α1及びコラーゲン1α2 mRNAの減少と並行した(図33A及び33B)。Col4A3−/−マウスに3G9、8G6又はrsTGF−βII−Igを投与したところ、コラーゲン1α1及びコラーゲン1α2 mRNA量が有意に減少したのに対し、非阻害αvβ6 mAb及び対照アイソトープmAbは、これらの転写産物の量に有意な作用を及ぼさなかった。
αvβ6の機能に起因する疾患の機序を更に理解するため、野生型及びアルポート症候群マウスの腎組織における遺伝子発現のAffymetrix GeneChip解析を実施した。Col4a3−/−の腎において発現が変化した遺伝子の一群を、7週齢のCol4a3−/−腎と週齢でマッチした野生型の腎とで正規化したシグナル強度にp<0.01で2倍以上の平均差が認められた395のGeneChipプローブセットとして同定した(図35)。異なる発現をみせた遺伝子の機能注釈を、Ingenuity Pathway Analysis(IPA)ツールを使用して実施し、Col4a3−/−の腎で過剰発現している遺伝子は、第一に炎症及び白血球機能の制御に関連しているのに対し、その発現が減少した遺伝子は主として代謝制御に関連していたことが示された(図36)。
3G9及び8G6mAbの投与により明らかになった腎線維症の減少が、TGF−β発現量の減少に起因しているのかどうかを明らかにするため、腎切片を抗TGF−β1 mAbで免疫染色した(図38A)。免疫染色に使用したmAbは、潜在的TGF−βに比べて本質的に活性のTGF−βを発現する組織切片に優先的に結合するものであった(データなし)24。3G9又は8G6をこのマウスに投与すると、腎の間質領域でも糸球体領域でもTGF−β1の免疫染色が有意に減少した。TGF−β発現量のこれらの変化は、TGF−βmRNAの全腎組織レベルの類似の変化を伴っていた(図38B)。TGF−β1免疫染色パターンは、αvβ6の発現が尿細管の内膜上皮に制限されているものの、αvβ6機能の阻害は、αvβ6発現部位に直接隣接しない糸球体領域のような遠位部でもTGF−βの発現量を減少させることができることを示した。これは、αvβ6が局所性のTGF−βの活性化の初回のトリガーとして働くが、TGF−βを広範囲にわたって制御する作用も示すことを示唆している。このような広範囲の作用の一つの考えられる機序とは、TGF−βが自らの発現を自己分泌性又はパラ分泌性に活性化することができ、TGF−βの発現組織部位の拡大につながることに基づくものである。又、これには、αvβ6の阻害によるTGF−βの活性化の初回の局所性阻害が、炎症及び線維症のプロセスに干渉し、その後間接的にTGF−βの活性を更に抑制するという可能性も含む。
mAbの実験から得られた所見を裏付けるため、Col4A3及びβ6のダブルノックアウトマウス(Col4A3−/−;β6−/−)を作成した。週齢でマッチさせたCol4A3−/−;β6+/−マウス及びCol4A3−/−;β6−/−マウスの腎の組織学的検査は、αvβ6阻害mAbを使用した試験で得られた結果を裏付けた。7〜10週齢のCol4A3−/−;β6−/−の腎では、週齢でマッチさせたCol4A3−/−;β6+/−マウスに比べて、SMA免疫染色の有意な抑制が認められた(データなし)。これは腎の糸球体及び間質領域における線維症の劇的な抑制を伴った(図39)。これは、コラーゲン発現の抑制及び週齢でマッチさせたCol4A3−/−;β6+/−マウスの腎に比べて、10週齢のCol4A3−/−;β6−/−マウスのトリクロム・マッソン染色で認められたように良好に保持された腎構造により示されている。β6機能の遺伝子除去に比べて阻害αvβ6 mAbの投与により認められた抗線維症作用の合致性は、in vivoにおけるαvβ6機能の阻害に対してはmAb投与が効率的な手法であることを示している。
Col4A3−/−マウスに、3G9の濃度を上昇させながら1週間に3回投与を行った。3週齢から7週齢までのマウスに投与を行い、その後屠殺した。SMAの免疫組織化学的分析を、腎の皮質及び髄質の両方で行った。用量漸増法により、3G9はCol4A3−/−マウスにおいてED50が0.3〜0.4mg/kgでSMAの発現を抑制した(図40)。
腎疾患の進行には、集中的な組織リモデリング、炎症及び線維症病変の形成が伴い、最終的には腎組織構造の破壊及び腎機能の低下につながる。線維症はこのプロセスの中心にあり、線維芽細胞の活性化及び拡大、罹患組織の血管新生及び細胞外マトリックスの大量な沈着に関与する。これらの事象の主要な要因として関与する分子機序には、細胞が集まる線維症病変におけるECMタンパク質及びその受容体の発現の変化を伴うTGF−β軸の調節不全が含まれる34〜36。TGF−βの発現亢進は線維症したヒト組織の特徴であり25〜27、組織の線維症の促進におけるTGF−βの機能的重要性は、in vitroでも動物疾患モデルでも確認されてきた。TGF−βの過剰発現は、in vivoにおける線維芽細胞の活性化及び血管新生を惹起し、器官培養及び細胞培養におけるECMの過剰生成を活性化するのに十分である34,37,38。これに対して、TGF−βシグナル伝達の遺伝的又は薬理学的破壊は、肺、皮膚及び腎の線維症モデルにおいて線維症からの効率的な保護をもたらす30,32,33,39〜41。
αvβ6は炎症及び線維症を伴うヒトの腎疾患において過剰発現する。
要約
一側尿管結紮(UUO)は尿細管間質性線維症へと急激にいたる確立された腎の外傷動物モデルである。尿管結紮により尿管及び尿細管内の内腔圧が上昇し、腎実質性損傷を来す。UUOは、水腎症、尿細管拡大、尿細管アポトーシス、進行性腎萎縮、間質性細胞浸潤、腎TGF−βの増加及び腎間質線維症を特徴とする[1]。インテグリンαvβ6の機能は、TGF−βの活性化及び上皮間葉移行のプロセスの両方に関与することができる。これらのプロセスは疾患の進行に寄与するため、UUOモデルを、抗αvβ6モノクローナル抗体mu3G9及び組換え可溶性マウスTGF−β受容体II−Ig型融合タンパク質(rsTGF−βRII−Ig)の、迅速に進行する腎線維症に対する有効性を評価するのに使用した。用量4m/kgのmu3G9を週3回、10日間にわたって腹腔内投与したところ、平滑筋アクチン染色の平均阻害率は32%であった。
進行性線維症は、末期の腎疾患にいたる共通のプロセスであり、上皮リモデリング、線維芽細胞の活性化、炎症及び細胞外マトリックス(ECM)との細胞の相互関係の再構築によって助長される。これらの事象に寄与する分子的機序は複雑で、TGF−β軸の調節不全、ECMリモデリング異常及びインテグリンスーパーファミリーの細胞接着受容体の発現及び機能の変化を含む2〜9。近年の試験で、腎上皮及び間葉細胞において幾つかのインテグリン及び関連分子が重要な制御機能を有することが明らかにされた8、10〜13。
1. 動物
雄で8〜12週齢の25.5±0.2gのウィルス抗原フリーのC57BLマウス(Jackson Laboratories[米国メーン州バーハーバー])を本試験に使用した。動物はBiogen Idecウイルスフリー研究所動物施設において、換気型アイソレーターケージラックに収容し、試験の開始の7日前から飼育した。マウスには飼育及び実験期間を通じて、照射済み標準マウス飼料(LabDiet Prolab(登録商標) 5P75 Isopro(登録商標) RMH 3000)及び滅菌水を自由に摂取させた。マウスの健康のモニタリングの一環として定期的に体重を測定した。
αvβ6 mAbsを、本明細書及び過去の刊行物30に記載の通りに生成した。ヒト/マウスキメラ2A1及び3G9 cDNAを、First Strand cDNA synthesis kit(Amersham/Pharmacia[米国ニュージャージー州ピスカタウェイ])を使用して、重鎖には定常領域プライマーCDL−739を、軽鎖にはCDL−738と共に個々の親ハイブリドーマの全RNAから生成した。重鎖及び軽鎖の可変領域遺伝子を、cDNA合成に使用したのと同じ3'プライマー及び殆どのマウス抗体遺伝子シグナル配列(請求により入手可能な配列)に特異的な縮重プライマーのプール及びPfu DNAポリメラーゼ(Stratagene[米国カリフォルニア州ラホイヤ])を使用してポリメラーゼ連鎖反応により増幅した。クローン化した重鎖及び軽鎖の可変領域を、ヒトIgG1定常領域と共に哺乳類発現ベクターに結合させた。組換え可溶性マウスTGF−β受容体II−Ig型融合タンパク質(rsTGF−βRII−Ig)を、過去の刊行物11に記載の通り作成し、R&D Systems(532−R2、米国ミネソタ州ミネアポリス)から購入した。
組織切片をキシレン及びエタノール中で脱パラフィン処理し、蒸留水で再水和して、0.45% H2Oを含有するメタノールに浸漬した。組織をペプシン(00−3009, Zymed[米国カリフォルニア州サンフランシスコ])と共に培養し、アジビン及びビオチン(SP−2001; Vector Laboratories[米国カリフォルニア州バーリンゲーム])で阻害した。一次抗体を0.1%BSA含有PBSで希釈し、組織を一晩4℃にて培養した。マウス組織にβ6による免疫染色を施すため、切片を抗αvβ6 mAb、2A130及び抗ヒトビオチン化二次抗体のヒト/マウスキメラ型と共に培養した(PK−6103、Vector Laboratories[米国カリフォルニア州バーリンゲーム])。アビジン−ビオチン複合体−西洋ワサビペルオキシダーゼ(Vector Kit、PK−6102)を切片に塗布し、30分間室温にて培養し、3,3'−ジアミノベンジジン(DAB)マトリックスを指示通りに調製し(SK−4100、Vector Laboratories)、室温にて5分間切片に塗布した。組織切片をMayer's Hematoxylinで1分間染色し、水及びPBSで洗い流した。
試験のための手術を2日間かけて行い、マウスへの投与スケジュールを尿管結紮日に応じて決定した。ケタミン:キシラジン(1000:10mg/kg、皮下投与)による麻酔下で、正中左側の開腹により左側尿管を無菌的に取り出した。腎下極の位置で尿管を6−0絹縫合糸で2箇所結紮し、その間で尿管を切断した。腹壁を4−0ビクリル縫合糸で閉鎖し、皮膚を4−0ナイロン縫合糸で閉鎖した。ヒーティングパッドの上でマウスを回復させ、ブプレノルフィン0.05mg/kgを0日目及び1日目に1日2回皮下投与した。手術の前日からmu3G9を週3回又はsTGF−βRII−Igを週2回投与した。手順は以前に記載した報告書31から適用した。
結紮から10日目に、マウスを二酸化炭素で安楽死させた。両側の腎(左結紮、右未結紮)を摘出し、腎盂の中心から横に二等分した。各腎の半分を10%中性緩衝ホルマリンに入れて固定組織染色した。残る半分の腎は15%スクロース液、その後30%スクロース液に入れ、平滑筋アクチンの免疫組織化学的染色を行った。
各測定野のコラーゲン含量を、200倍以内の全組織における百分率(白い空白は除く)として、即ち、青い面積の%として表した。各腎につき16〜35視野を測定した。これらには、切片の皮質及び髄質組織の全てを含め、腎乳頭は除外した。左側結紮腎の全ての視野で得られた平均の青い面積%を、各マウスで算出し、統計学的検定のためにそのマウスの線維症スコアとして取り扱った。幾つかの投与群における投与に起因する青い面積%の差の統計学的有意性を、一元配置分散分析により決定し、その後、Student−Newman−Keuls検定で対の多重比較を行った。p<0.05の場合に差を統計学的有意とした。
1. UUO後の腎におけるαvβ6の発現
UUO後の腎におけるαvβ6インテグリンの発現を免疫組織化学的解析で調査した。無外傷(正常)の腎では検出されたαvβ6の発現がわずかであったのに対し、UUOから7、10及び14日後では有意な発現亢進が明らかになった(図41)。検出可能な発現は、UUOから3日後から測定された。
マウスUUOモデルにおける線維症の広がりを、免疫組織化学的α平滑筋アクチン染色(褐色の染色)又はマッソン・トリクロームコラーゲンマトリックス染色(青色の染色)の組織形態計測による解析で測定した。各試験で、線維症で占められた組織面積の比率を、担体又は対照アイソタイプmAbを投与したUUOマウス群(陰性対照群)、被験物質を投与したUUOマウス群及び無結紮の正常マウス群で測定した。陰性対照群と被験物質投与群との間の染色面積の差の、陰性対照群と無結紮正常マウス群の差に対する比率を算出することにより、治療効果をマッソン・トリクロームコラーゲンマトリックス(青)染色又は平滑筋アクチン(褐色)染色の阻害率として表した。
緒言
肺線維症は、肺外傷の後に異常なマトリックスリモデリングが続いた場合に発症する(Chapman 2004)。肺線維症において異常制御される多くのシグナル因子の中でも、TGFβは特に重要な役割を果たす。動物モデルでは、TGFβのシグナル伝達を阻害すると、肺、腎、肝及び皮膚の線維症が予防できる。
1. 動物
使用したマウスは全て雌であった。Itgb6−/−マウスはUCSFのDean Sheppard氏から寄贈され、本発明者等の施設で遺伝的背景をC57BL/6として交配した。野生型マウスは、Jackson Laboratory(米国メーン州バーハーバー)から購入したC57BL/6であり、到着時に7〜9週齢で、照射前に本発明者等の動物施設で1週間馴化した。全ての動物取り扱い手順及び実験は、ニューヨーク医科大学の動物ケア委員会により承認され、実験動物のケア及び使用のNIHガイドラインに合致した。動物施設のプロトコルにより、1ケージにつき5匹までの飼育とした。マウスの罹患及び死亡を毎日監視した。瀕死のマウスは屠殺した。
2種類の抗体をBiogen Idec(米国マサチューセッツ州ケンブリッジ)から入手し、本明細書の他の場所に記載の通りに調製した。最初の被験抗体である3G9は、αvβ6を媒介するTGFβの活性化を阻害する抗αvβ6 mAbである。これはIgG1サブタイプであり、αvβ6をカチオン非依存性に結合する。対照のAb(1E6)は、マウスLFA−3と相互作用しないマウス抗ヒトLFA−3 IgG1モノクローナル抗体とした。この対照抗体の最大用量200mg/kg/週を4週間にわたって正常なマウスに投与したところ、毒性は全く認められなかった(Biogen Idecのデータ)。滅菌PBSでの希釈により、用量0.3、1、3、6及び10mg/kgで総用量200μLとして抗体の画分を調製した。実験に応じて右側腹部への皮下注射又は腹腔内注射を、照射の15週間後から開始した。
マウスには8〜10週齢で照射を行った。照射前に、Avertin(2,2,2−トリブロモエタノール;Acros Organics[米国ニュージャージー州])の2.5%溶液15μL/gを腹腔内に送達して麻酔を施した。その後、マウスを仰臥位にしてテープでプレキシガラス表面に貼り付けた。遮蔽用の鉛を適切に配置して、照射が胸部に限局するようにした。肺尖部から剣状突起までの照射野は1.8cmであった。60Co線源を使用して、14Gyの放射線を送達した。線源から皮膚までの距離は65cmであった。この線源への曝露時間は11分までであった。放射線への曝露後、マウスをケージの中に戻し、顔面を上にして寝かせ、回復を監視した。
照射後、規定の時点まで生存したマウス(抗体試験では26、28又は32週間)を屠殺して、下記の方法で処理した。Avertinで深い麻酔をかけた後、70%エタノールを胸部及び腹部の皮膚に噴霧した。胸腔を横隔膜を介して開いた。心室から直接400〜500μLの血液を吸引した。気管を露出させ、22ゲージの血管カテーテルを挿入した。1回につきPBS 700μLで2回、肺を洗浄した。右側の主気管支を肺門で結紮し、各肺葉を摘出して別々の試験管に入れ、液体窒素で迅速に凍結し、−80℃にて保存した。左肺は10%ホルマリン400μLで充満させ、10%ホルマリンに一晩漬け、パラフィンに包埋した。屠殺時に入手した気管支肺胞洗浄(BAL)液を200μLとその残りの2つに分けた。両方の試験管を2000RPMで3分間遠心分離した。両方の試験管の上清液を合わせ、液体窒素で凍結させ、−80℃にて保存した。大きな試験管の沈殿細胞を凍結標本にし、同じ方法で保存した。沈殿細胞200μLの画分を赤血球溶解緩衝液200μLで再懸濁し、十分に混合した。50μLは血球計での血球計算に使用した。残りの150μLは、サイトスピンの準備に使用した。心穿刺により得た血液を使用して、下記のように血清又は血漿を作成した。Capiject試験管又はヘパリン加1.5ccマイクロ遠心分離管で初回の混合を行った後、試料を14000RPMで20分間遠心分離した。上清液を除去し、即刻−80℃にて凍結した。
屠殺日までに死亡若しくは瀕死の状態であったマウスを解剖して肺標本を得た。瀕死のマウスは解剖前にAvertinで安楽死させた。胸腔を横隔膜を介して開いた。気管までの解剖は完全に露出させて実施した。気管に22ゲージの血管カテーテルを挿入した。肺を10%ホルマリン800〜1000μLで充満させた。胸腔の内容物を一塊に摘出し、10%ホルマリンに24時間以上漬けてから、肺を分離してパラフィン包埋を行った。
サイトスピン用調製物をDiffQuik法(Fixative、1%Eosin−Y、1%Azure A及び脱イオン水の順番で15秒ずつの浸漬)により染色した。その後脱水しスライド上に乗せた。好中球、リンパ球及びマクロファージの数を、2つの個別の強拡大(400倍)視野で徒手的に計数した。
幾つかのホルマリン固定試料を、β6の免疫組織化学的検出のために使用した。内因性ペルオキシダーゼ活性をメタノール中の3%過酸化水素で15分間停止させ、Digest−All 3 Pepsin(Zymed[米国カリフォルニア州サウスサンフランシスコ])を5〜7分間使用して抗原を回収した。アビジン/ビオチンブロック溶液(Vector Laboratories[米国カリフォルニア州バーリンゲーム])を製造業者の指示書に従って使用した。0.5%カゼイン溶液を使用して15分間阻害した。ヒトIgG内にクローン化したマウス抗β6 mAbの種々の領域からなる抗β6モノクローナル抗体ch2A1(Biogen Idec)を、0.1% BSAで1:500で希釈し室温にて1時間使用した。Vectastain ABC kit(Vector Laboratories)を使用して、抗ヒト二次抗体で、製造業者の指示に従い検出を実施した。DAB kit(Sigma[米国ミズーリ州セントルイス])で発色を行い、ヘマトキシリンによるカウンター染色を行った。並行して取り扱われた切片の一次抗体を除外することがルーチンに行われ、Itgb6−/−マウスの肺切片に対する予備試験の結果が陰性であったことから、この手順の特異性が確認された。
ホルマリン固定パラフィン包埋肺を横方向に5ミクロンの厚さに切断した。肺の切片は、視覚的推定により肺門又はその近傍で採取した。スライド標本を脱イオン水まで脱パラフィン処理した(キシレン浴で各3分間2回、100%エタノールで各3分間2回、95%エタノールで各3分間2回、70%エタノールで3分間、脱イオン水で3分間)。切片をマッソン三重染色で染色した(媒染処理のためにブアン液一晩、Weigertの鉄ヘマトキシリン5分間、BiebrichのScarlet−酸性フクシン5分間、リンタングステン/リンモリブデン酸溶液5分間、アニリンブルー溶液5分間、間の脱イオン水洗浄、及び酢酸1% 2分間)。次いで、スライド標本を脱水し(70%エタノール、95%エタノール、100%エタノール及びキシレン)、Permountを使用してマウントした。
ヒドロキシプロリン含量の測定は、Reddy and Enwememkaの方法の変法によった。右肺を除去し、重量を測定した。肺組織(湿重量が約20mg)を400μLの2N NaOH中で12時間培養し(室温にて)、次いで、ホモジナイズした。ホモジネート及び標準ヒドロキシプロリン溶液を120℃に30分間加熱して加水分解した。クロラミンT溶液(0.056M、450μL)を50μLの加水分解物に加え、酸化を25分間進行させた。エールリッヒ試薬(1M、500μL)を加え、冷却して65℃にて20分間発色させた。次いで、550nmでの吸光度を測定した。最終濃度をμgヒドロキシプロリン/mg湿肺組織として表わす。
この実験に使用したマウスは、照射後32週目に屠殺したコホートに属していた。7匹の別の非照射C57BL/6マウスを対照として使用した。照射マウスからの心臓は、28〜32週目に死亡したマウス又は32週目の屠殺まで生存していたマウスからのものであった。心臓は、ホルマリンで固定した。解剖顕微鏡下で、心房を摘出し、壁を含まない右心室(RV)を左心室及び中隔(LV)から切り離した。心室組織の各断片の重量を測定し、比率を計算した。7匹の非照射C57BL/6マウスを対照として使用した。
群間の線維症の割合の差の統計的有意性の検定は、ノンパラメトリックデータに関するMann−Whitney検定を使用して行った。死亡の日を記録し、Kaplan−Meier曲線を作製するのに使用した。Kaplan−Meier曲線の個々の群比較並びに総比較を対数順位(Mantel−Cox)検定を使用して行った。測定の平均値を平均値の対応する標準誤差又は標準偏差と共に報告する。RV/LV質量比の測定値の平均値の比較については、Studentのt検定(対応のない、両側)を使用した。Itgb6−/−マウスとItgb6+/+マウスとの間の線維症の有無の比較にはFisherの直接確率法を使用した。統計的有意性をp<0.05と定義した。
1. マウスRILFはαvβ6発現を必要とする:胸郭照射後のItgb6−/−及びItgb6+/+マウスの比較
この実験は、ベースライン及び照射後のαvβ6発現を比較し、αvβ6の非存在が線維症を予防したかどうかを判断するために設計された。本発明者等はItgb6−/−及びItgb6+/+マウスを照射し、28週目の前の種々の時点及び28週目に屠殺した。
(a) β6は照射後18〜20週目にアップレギュレートされる。
(b) 高αvβ6発現は線維症性領域で持続する。
(c) αvβ6を欠くマウスはRILFを発現しない。
(d) αvβ6の非存在は肺照射後の生存に影響しない。
以前の結果は、RILFがαvβ6インテグリンの発現に依存し、αvβ6の欠乏は照射後死亡率を悪化させないことを示している。αvβ6の必要性は、潜在性TGFβ1のアクチベーターとしてのその既知の機能と一致している。これらの結果は、抗線維症戦略としてのαvβ6阻害の実現可能性も示唆している。この着想を検定し、RILFのマウスモデルがTGFβ依存性であることを確認するために、本発明者等は照射マウスに対照Ab、可溶性TGFβ受容体又は3G9の3用量の内の1つを投与した(1群当たりN=27)。より少数のマウス(N=15)にPBS注射液(200μL)のみを投与した。3G9は0.3、1及び10mg/kgの用量で使用し、照射Abは10mg/kgで使用し、可溶性TGFβ受容体は5mg/kgで使用した。投与は、照射後15週目(αvβ6アップレギュレーションの約3週間前)に開始し、照射後26週目の屠殺まで週1回継続した(詳細については方法の項を参照)。
(a) 3G9及び可溶性TGFβ受容体は線維症を低減する。
(b) 10mg/kgの用量の3G9は好中球性及びリンパ球性肺胞隔炎を引き起こす。
(c) 低用量の抗体によるαvβ6遮断は肺照射後の生存に影響を及ぼさない。
以前の結果は、マウスモデルにおけるRILFはTGFβ媒介性であり、1mg/kg及び10mg/kgの用量の3G9により有意に低減することを示している。しかし、肺胞炎症の増加、及び死亡の増加の傾向が10mg/kgの用量で存在する。この実験では、本発明者等は3G9の投与はRILFを予防するのではなく、RILFの発症を単に数週間遅延させるという可能性を検定するために、より後の時点(照射後32週目まで)に線維症を評価した。又、1mg/kg用量と10mg/kg用量との間の肺胞炎症及び生存の差をより十分に明らかにするために、本発明者等は1mg/kgと10mg/kgの間の追加の用量を試験した。本発明者等は270匹のマウスを照射し、それらを3G9の4用量(1、3、6及び10mg/kg)の内の1つ又は対照Ab(10mg/kg)の投与を受ける等しい群に分けた。投与は、照射後15週目に開始し、後の屠殺まで週1回継続した。実験は、約1ヵ月の間隔をあけて照射したマウスの2群を使用して行った。1つの群では、マウスが照射後28週目まで生存していた場合(群1)投与を開始したマウスを屠殺し、他の群では、マウスが32週目まで生存していた場合(群2)屠殺した。抗体は、皮下に投与した(以前の実験におけるようにIPではない)。
(a) 1、3、6及び10mg/kgの用量の3G9は線維症を低減する。
(b) 高用量の3G9は好中球性及びリンパ球性肺胞隔炎を引き起こす。
(c) 6mg/kgの用量の3G9は生存率の低下に関連する。
(d) RV/LV質量比及び肺潅流に対する肺照射の影響
以前の試験で、肺照射後の線維症相中の死亡は空気間隙(airspace)閉塞(主として線維症に起因する)と肺胞潅流の喪失の組合せに起因する呼吸困難によることが示唆された(Sharplin and Franko 1989)。潅流の喪失は肺動脈高血圧及び右心室肥大の原因となるはずであり、RV質量の増加がこのモデルで報告された。本発明者等は32週目まで生存していたマウス及び28週目から32週目までの間に死亡したマウスのRV/LV質量比を測定した。死亡したマウスは、生存していたマウスと比較して、又非照射マウスと比較して有意に高いRV/LV比を有していた(図56)。更に、死亡した一部のマウスで、肺胞潅流が完全に喪失したことを示唆する所見である、肺胞壁に赤血球が完全に存在しない明瞭な部位が認められた(図57)。
TGFβは、線維症誘発性メディエーターであることが知られている。以前の試験で、インテグリンαvβ6が潜在性TGFβ1及びTGFβ3を活性化し、Itgb6−/−マウスはブレオマイシン誘発性肺線維症から保護されることが示された。ここに示す結果は、Itgb6−/−マウスは放射線誘発性肺線維症からも保護されることを示している。これらの結果は、αvβ6インテグリンを標的とする抗線維症療法の根拠を提供する。
概要
肺線維症の現行の療法は大部分が無効であり、新規の治療薬を開発することが極めて必要である。線維芽細胞の活性化と増殖、及び細胞外マトリックス分子の発現等の肺線維症を特徴付ける多くの病理学的過程の推進にTGF−βが中心的役割を果たしているため、TGF−β経路を遮断する薬剤に特に関心が払われている。その線維症誘発活性に加えて、TGF−βは重要な抗炎症性サイトカインであり、従って、TGF−βの治療的阻害は、過度の炎症を促進せずに、線維症を理想的に阻止するはずである。以前の試験で、インテグリンαvβ6はin vivo、特に肺におけるTGF−βの活性化の重要なメディエーターであることが示された。αvβ6は細胞外間隙における潜在性TGF−β複合体に直接結合し、この結合は、多くの場合、活性形の遊離を必要とする。αvβ6を欠くマウスは、肺におけるTGF−βシグナリングの障害のため軽度の肺炎症を有し、ブレオマイシン誘発性肺線維症に対して抵抗性である。本発明者等は、潜在性TGF−βへのαvβ6の結合を阻止し、TGF−βの活性化とその後のシグナリングを阻害するモノクローナル抗体を開発した。ここに本発明者等は、これらの抗体がマウスにおけるブレオマイシン誘発性線維症の減弱に有効であることを示す。本発明者等は更に、肺コラーゲン発現の減弱のほぼ最大の有効性が、気管支肺胞洗浄液中の炎症細胞の数により測定される付加的な炎症をもたらさない用量で達成することができることを示す。一方、線維症も減弱するより高用量の抗体は、αvβ6欠乏マウスで認められるものと一致する炎症を誘発することができる。これらの所見は、αvβ6媒介性TGF−βの阻害の炎症誘発及び抗線維症効果はこのモデルにおいて分離可能であり、炎症誘発効果より線維症の抑制がより低用量で起こることを示している。
TGF−β1サイトカインは、罹患組織の過剰細胞外マトリックス(ECM)による置換によって特徴付けられ、最終的に臓器瘢痕化及び不全の原因となる病理学的過程である線維症の開始及び維持に中心的なものである。TGF−β1は、ECMの分泌及び線維症過程の進行の維持を担っている線維芽細胞増殖及び筋線維芽細胞の活性化を促進する[1−6]。TGF−β1は、創傷治癒時に起こる組織リモデリング事象における十分に制御された役割を果たしている。しかし、多くの疾患において、この組織リモデリングの過程は、異常になり、長時間にわたるアップレギュレートされたTGF−βシグナリング、過剰な線維芽細胞蓄積、ECM沈着及び瘢痕化によって特徴付けられる。in vivoでの線維症の進行におけるTGF−β1の重要性は、機能の獲得試験並びに遮断により示された[1、7〜12]。肺における様々なサイトカインのアデノウイルス及びトランスジェニック過剰発現は、TGF−β1が著しい炎症の非存在下で線維症を促進するその能力が特有であることを示すものであった。線維症を促進する他のサイトカインは、組織におけるTGF−β1発現をアップレギュレートすることによってしばしば線維症を促進する。更に、試験により、TGF−βシグナリングのメディエーターであるSMAD3が欠乏したノックアウトマウスは、肺線維症の発現に対して抵抗性であることが示された[13]。抗TGF−β薬を使用した多くの試験で、疾患モデルにおける線維症からの顕著な保護が示されている[8、9、11、14〜17]。従って、TGF−β1は、線維症の病理学に関連する疾患の治療の潜在的治療標的として特定された。
1. 試薬
αvβ6mAbsを本明細書における他所に記載又は以前に記載した[31]ように生成した。ヒト/マウスキメラ2A1及び3G9 cDNAsを、重鎖の定常領域プライマーCDL−739及び軽鎖のCDL−738を含む各親ハイブリドーマ総RNAsからFirst Strand cDNA合成キット(Amersham/Pharmacia[米国ニュージャージー州ピスカタウェイ])を使用して生成した。重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子は、cDNA合成に使用した同じ3’プライマー及び大部分のマウス抗体遺伝子シグナル配列(請求あり次第入手可能な配列)に特異的な縮重プライマーのプール及びPfu DNAポリメラーゼ(Stratagene[米国カリフォルニア州ラホイヤ])を使用してポリメラーゼ連鎖反応により増幅した。クローン化した重鎖及び軽鎖可変領域を、ヒトIgG1定常領域を含む哺乳動物発現ベクターに結合させた。組換え可溶性マウスTGF−β受容体II−Ig型融合タンパク質(sTGF−bRII−Ig)を以前に記載した[32]ように生成した。研究用mu3G9、1E6及びsTGF−bRII−Ig(リン酸緩衝生理食塩水中精製タンパク質)を全ての実験に使用した。
マウス
肺ヒドロキシプロリンをエンドポイントとした実験にはSV129マウスを使用した(Sheppard Laboratory[カリフォルニア大学サンフランシスコ校(UCSF)])。組織形態計測又はBAL収集及び解析をエンドポイントとした実験にはC57B16マウスを使用した(Biogen Idec)。エンドポイントとしてのコラーゲン遺伝子発現の定量分析には、トランスジェニックリポーターマウスを使用した(Biogen Idec)。colIα2遺伝子プロモーターの17kb領域の制御下のルシフェラーゼリポーター遺伝子を運ぶトランスジェニックマウスは、以前に記載した[33]。これらのマウスは、トランスジェニック雄をC57B1/6XDBA/2 F1ハイブリッド雌と交配させて維持する(Jackson Laboratories)。外来遺伝子陽性の子孫(テールルシフェラーゼ発現により評価)を下に概要を示すブレオマイシンチャレンジ実験のために選択した。
ハムスター(Giri Laboratory)
体重が90〜110gの雄ゴールデンシリアンハムスターをSimonsens, Inc.(米国カリフォルニア州ギルロイ)から購入した。ハムスターは、ろ過空気を供給し、温度及び湿度を一定とした施設に4匹の群で収容した。全ての管理は、動物福祉法に関する国立衛生研究所ガイドに準拠した。ハムスターを投与前に1週間施設内で馴化させた。12時間の明/暗サイクルを維持した。
マウス肺を採取し、10%緩衝ホルマリンに入れ、一般的手法に従ってパラフィン組織学検査用に処理した。線維症性病状を伴う肺疾患を有する患者の肺のパラフィン組織切片は、G. Davis(バーモント大学)、R. Lafyatis(ボストン大学)、Ardais Corp.(米国マサチューセッツ州レキシントン)及びAsterand Inc.(米国ミシガン州デトロイト)から入手した。組織切片をキシレン及びエタノールで脱パラフィン処理し、蒸留水で再水和し、次いで、0.45% H2O2を含むメタノールに浸漬した。組織をペプシン(00−3009、Zymed[米国カリフォルニア州サンフランシスコ])と共に培養し、アビジン及びビオチン(SP−2001; Vector Laboratories[米国カリフォルニア州バーリンゲーム])で遮断した。一次抗体を0.1%BSA含有PBSで希釈し、組織を4℃にて一晩培養した。切片を、抗αvβ6 mAbのヒト/マウスキメラ型、2A1[31]、及びマウス組織に対する抗ヒトビオチニル化二次抗体(PK−6103、Vector Laboratories[米国カリフォルニア州バーリンゲーム])と共に培養した。
SV129系(D. Sheppard[UCSF])
マウスには以前に記載した[18]ようにブレオマイシン又は生理食塩水を気管内に滴注した。簡単に述べると、年齢及び性をマッチさせた129/terSVEMS系の8〜12週齢のマウスを特定病原体のない環境で飼育管理した。ブレオマイシン(Mead Johnson[米国ニュージャージー州プリンストン])を滅菌生理食塩水に溶解した(60mL中0.03又は0.05単位)。ブレオマイシン又は生理食塩水は、直接切開によりメトキシフルラン麻酔下で経気管投与した。
C57B1/6系及びコラーゲンリポーターマウス(Biogen IDEC)
100mg/kgケタミン及び10mg/kgキシラジンのIP注射によりマウスを麻酔した。滅菌#15メスを使用して頚部に0.5〜1.0cmの正中線切開を施して、視覚化のために気管を露出させた。気管を露出させ、口腔を経て気管内に噴霧チップを入れた後に、Penn Century微量噴霧装置を使用してブレオマイシンを滴注した。生理食塩水は、対照動物に滴注した。滴注後、滅菌創傷クリップで手術部位を閉じた。術後疼痛に対してブプレノルフィン0.05mg/kgを皮下投与した.
これらのマウスブレオマイシン試験において複数の治療プロトコルを使用して被験物質を評価したため、結果の項で述べるものとする。
ペントバルビタール麻酔下で、ハムスターに0、7及び14日目に生理食塩水(SA;4mL/kg)又はブレオマイシン(BL;6.5U/4mL/kg)をIT滴注した。動物を次の6つの実験群に無作為に分けた。即ち、SA滴注、PBS投与(SA+PBS);BL滴注、PBS投与(BL+PBS);BL滴注、0日目に開始してmu3G9投与(BL+Ab1);BL滴注、7日目に開始してmu3G9投与(BL+Ab2);BL滴注、14日目に開始してmu3G9投与(BL+Ab3);及びBL滴注、0日目に開始して1E6投与(BL+1E6)。動物を28日目に屠殺し、それらの肺を除去し、ヒドロキシプロリン及び脂質過酸化の分析のために処理した。
肺をガラス管(Fisher #14961)に入れた1mLのdH2O中でホモジナイズした。125μLの50%トリクロロ酢酸(TCA)をホモジネートに加え、氷上で20分間培養した。試料を1000rpmで4℃にて5分間遠心分離した。上清を捨て、1mLの12N HClをガラス管中のペレットに加えた。次いで、試料を110℃にて24時間焼いた(ガラスビーカー中)。乾燥ペレットを2mLのdH2Oで再構成した。6つのヒドロキシプロリン標準(Sigma−H6002)を0.25mg/mLから開始して調製した。500μLのクロラミンT(0.5M 酢酸Na及び10%イソプロパノール中1.4%クロラミンT)を含む1.5mL Eppedorf管に、200μLの試料を加え、室温にて20分間培養した。次いで、500μLのEhrlich’s/pDMBA(70%イソプロパノール及び30%過塩素酸中1M p−DMBA(p−ジメチルアミノベンズアルデヒド))を加え、65℃にて15分間培養した。100μLの最終反応溶液を96ウェルプレートに移し、各試料について3回の測定を行い、2時間後に試料を550nmで読み取った。
組織形態計測をエンドポイントとした実験では、屠殺時に各マウスの肺全体を組織学的に評価した。横断切片を切り出し、標準的手順によりマッソンの三色で染色した。各マウスの肺の複数の葉を含む横断切片を選択した。三重染色切片全体を対象として含む高倍率(100倍)視野を写真撮影した(マウスにつき平均約30視野)。各写真を、Metamorph 6.0.5ソフトウェアによりコラーゲン含量(三重染色組織学的切片において青色に見える)について評価した。青色の部位を色閾値により選択し、総組織面積の割合として表した。
肺を採取し、1mLの溶解緩衝液(0.1M KH2PO4−pH7.8及び1mM DL−ジチオトレイトール)中でホモジナイズした。次いで、試料を氷上に10分間置き、4℃にて12000rpmで10分間遠心分離し、次いで、100μLの各試料をWallac Isoplatterに移した。次いで、試料を再び氷上に15分間置いた後、100μLのLuclite基質(Perkin Elmer #601911)を加えた。次いで、ルシフェラーゼ活性をルミノメーターで読み取った。
Inactin(Sigma)の腹腔内注射(IP)によりマウスを安楽死させた。主として鈍的剥離により気管を露出させた。次いで、気管を鋏で2つの軟骨輪の間で開き、23ゲージ鈍端針を気管に挿入した。Schwartz一時クリップ(Roboz)で軽く締め付けて針を所定の位置に保持した。0.8mLのCa2+又はMg2+不含有リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を肺に注入して、BALを実施した。大きい圧力を加えずに液を注射器中に吸引し、氷上の15mLポリプロピレンFalcon管に移した。次いで、処置を繰り返し、過度の陰圧をかけずにBAL液を注射器中に吸引した。試料を氷上で保存し、細胞数の計測、分染のために処理し、BALペレット及び液を採取し、−80℃にて保存した。
ビヒクル対照及び/又はアイソタイプ対照と被験物質との統計的比較を分散分析(ANOVA)を使用して行った。ANOVAを使用してp<0.05の確率で統計的有意差が立証された場合、群間の有意差をDunnetの多重比較検定により評価した。
1. ヒト肺疾患及びブレオマイシンモデルにおけるαvβ6の発現
アップレギュレートしたTGF−β発現及びシグナリングは、線維症性又は炎症性病状を伴う様々なヒト肺疾患において記載された[20、34]。しかし、αvβ6の発現は、線維性炎症性肺疾患の小試料においてのみ記載された[28]。本発明者等は、線維症性及び/又は炎症性変化を有すると特徴付けられた肺疾患を有する患者からの41個の肺組織試料におけるαvβ6の発現を評価した(表16−1)。更に、本発明者等は、癌患者からの肺生検検体の直示的に正常な領域からの肺組織アレイを染色した(Imgenex)。正常肺におけるαvβ6の発現は、免疫組織化学によって殆ど検出されなかった。「正常」肺組織アレイにおける一部の組織切片は、陽性αvβ6染色を示したが、それらの切片のそれぞれが近傍に炎症性病状も有していた。41個の肺試料の全てにおいて、線維症及び/又は炎症性変化を有する領域はαvβ6発現の強いアップレギュレーションを示した(図58)。αvβ6は、顕性線維症の領域の上にある表皮表細胞又は炎症性浸潤巣に隣接する領域に限局化していた。アップレギュレートしたαvβ6の存在は、特発性肺線維症、強皮症性肺疾患及び慢性閉塞性肺疾患を含む線維性炎症性疾患のスペクトルにわたって認められた。
αvβ6が肺線維症のブレオマイシンマウスモデルにおいてもアップレギュレートされたことを確認するために、本発明者等はブレオマイシンの滴注後1、5及び15日目に採取した組織切片上のαvβ6タンパク質の存在を検討するために免疫染色した。5日目には、ブレオマイシンチャレンジにより損傷した肺の領域全体にわたる肺胞上皮でαvβ6発現がアップレギュレートしている(図59)。顕著な線維症の領域が顕在化する15日目には、これらの線維症性部位における肺胞上皮でαvβ6がより強くアップレギュレートされる。
αvβ6(β6ヌル)が遺伝的に欠乏したマウスは、SV129マウス系統におけるブレオマイシン誘発性肺線維症から保護されることが以前に示された[18]。本発明者等は、この同じ系統におけるブレオマイシン誘発性肺線維症の減弱における抗αvβ6モノクローナル抗体、即ちmu3G9の有効性を評価することを追求した。本発明者等の共同研究者であるUCSFのDean Sheppardの施設において一連の4つの実験を行った(表16−2)。0日目にSV129マウスの気管にブレオマイシンを滴注し、ブレオマイシンの滴注後0、15又は30日目に開始して週3回4mg/kgのmu3G9をIP注射した。対照マウスにはPBS又は陰性対照抗体1E6を注射した。1E6は、ヒトLFA−3に対するマウスIgG1抗体であり、マウス抗原に結合しない。マウスを30又は60日目に屠殺し、総組織コラーゲンの尺度であるヒドロキシプロリン含量により線維症を評価した。4つの内の3つの実験において、ブレオマイシン誘発性線維症の減弱における有効性を示唆する、mu3G9投与マウスにおけるヒドロキシプロリンの統計的に有意な減少が認められた(図60)。投与をブレオマイシンの滴注後30日目まで遅延させた場合(図60C)にのみ、mu3G9投与マウスの肺におけるヒドロキシプロリン含量がPBS又はアイソタイプ対照投与マウスと比較して有意に低下しなかった。
ブレオマイシンモデルにおける抗線維症有効性が生存率の改善と一般的に相関しないため、本発明者等はmu3G9投与マウスの生存率が改善すると予想しなかった。しかし、これらのマウスには本発明者等が試験した最長治療期間(46日)であった15日目から60日目まで週3回4mg/kgのmu3G9を投与した(図60D)ため、本発明者等はその実験で試験した群に生存率の差があったかどうかを確認するために解析した。mu3G9を投与したマウスとPBS及び4B4非遮断対照抗体を投与したマウスと比較したところ、総生存率の有意差はなかった(表16−2)。
異なるマウスの系統及び異なる施設におけるmu3G9の抗線維症有効性を検証するために、Biogen Idecにおける一連の実験においてC57Bl6マウス系を使用してmu3G9を評価した。この系統は、ブレオマイシンモデルに頻繁に使用され、滴注後14日目に測定することができる迅速な線維症を発現する。最初の3つの実験で、マウスに0日目にブレオマイシンを気管内に滴注し、ブレオマイシンチャレンジの1日前(−1日目)から開始してmu3G9を週3回投与し、肺の採取のために14日目に安楽死させた。第4の実験では、投与を14日目まで遅延させ、28日目に肺を採取した。これらの実験のそれぞれ(図61)において、mu3G9は、マッソン三重染色組織切片における青色染色領域として組織形態計測により測定した線維症肺組織の割合をPBS投与対照と比較して一貫して低下させた。1E6 mAbを陰性IgG対照として使用した2つの実験の内の1つにおいて、1E6 mAbも線維症組織の割合を有意に低下させた(図61A)。1E6 mAbのこの作用は、ヒドロキシプロリンをエンドポイントとして使用した以前の実験(図60)においても遅延投与(14〜28日目)実験(図61D)においても認められなかった。要約すると、複数の実験で、C57Bl6マウスにおいてブレオマイシンにより誘発される線維症組織の割合の低下におけるmu3G9の有効性が実証された。しかし、組織形態計測エンドポイントの労働集約性のため、本発明者等は線維症を測定するためのより迅速且つ定量的な方法を探求した。
線維症モデルにおけるコラーゲンの発現の定量的読み取りを得るために、ルシフェラーゼリポーター遺伝子がコラーゲンIα2プロモーターの制御下で発現する外来遺伝子を運ぶトランスジェニックマウスを以前に使用した[33];[35]。14日目に、生理食塩水対照と比較したブレオマイシンチャレンジマウスの肺ルシフェラーゼレベルの増加は約10倍であり、このことから、肺ルシフェラーゼレベルはヒドロキシプロリン測定よりはるかに感度が高いエンドポイントである。このシステムを使用して、本発明者等は週1回の投与を使用して3G9抗体の用量調節を行ったが、ヒドロキシプロリン及び三色組織形態計測をエンドポイントとして使用した実験で使用した週3回投与法で4mg/kgを投与したマウスの群を含めた。用量調節を3つの実験で評価し、各実験でPBS投与対照群を設けた(n=6、5及び6、合計n=17)。ルシフェラーゼ測定の実験間の変動を補正するために、各実験における全ての群のルシフェラーゼ値をPBS対照の平均値に対して標準化した。ブレオマイシンチャレンジリポーターマウスのmu3G9投与は、コラーゲンルシフェラーゼリポーターの用量依存的な減少をもたらし(図62)、0.3mg/kgの週1回の投与で有意な有効性が認められ、1〜3mg/kgで最大の有効性が認められた。
本発明者等は線維症の抑制が肺における炎症細胞の主要な亜集団における炎症又は変化の減少に起因していたかどうかを判断するために、ブレオマイシンモデルの2、5、8及び11日目の気管支肺胞洗浄(BAL)細胞集団を分析した。予想通り、生理食塩水滴注マウスと比較すると、ブレオマイシンの気管内投与に起因したBAL細胞数の上昇があった。しかし、時間的経過を通して、アイソタイプ対照抗体1E6を投与したマウスと比較して3G9の0.3、1.0及び3mg/kgの有効量を投与したマウスに認められたBAL細胞の総数、マクロファージ、好中球又はリンパ球の数若しくは割合の有意差はなかった。次に本発明者等は、ヒドロキシプロリン及び組織形態計測エンドポイントを使用して有効性を実証するために最初に使用した週3回の投与を使用して、はるかに高い用量を試験した。マウスに、ブレオマイシンチャレンジに対して−1、+1及び+3日目にm3G9の4、20及び40mg/kgの3用量を投与した。5日目にマウスを安楽死させ、BAL細胞数を分析した。4mg/kgの用量(総投与量12mg/kg)では、再びBAL細胞の総数、マクロファージ、好中球又はリンパ球の数若しくは割合の有意な変化はなかった。20及び40mg/kgの用量(合計60及び120mg/kg)では、PBS対照と比較してマクロファージの数の有意な増加があったが、IgG1対照と比較した場合にはそうでなかった(図62)。40mg/kgの用量で、好中球の総数の変化は有意性に達しなかったが、PBS及びIgG対照と比較してBAL中の好中球の割合の有意な増加があった。非常に高い用量(合計120mg/kg)で起こる好中球の増加は、放射線線維症モデル(実施例15参照)における高用量長期投与(6及び10mg/kg投与、3〜4ヵ月)で認められたものと同様である。要約すると、抗αvβ6抗体は0.3mg/kgと低い用量での週1回の投与でブレオマイシン誘発コラーゲン発現を減弱することができるが、合計12mg/kgまでの用量はこのモデルにおけるBAL細胞集団の有意な変化を有意な変化をもたらさない。より高い用量は、総マクロファージ数及び好中球の割合の増加をもたらすことができる。
本発明者等は、0、7及び14日目に3連続ブレオマイシン投与を気管内に行う、ハムスター肺線維症モデルにおけるmu3G9の有効性を検討した。3群のハムスターに0、7及び14日目に開始して5mg/kgのmu3G9を週3回投与した(週当たり合計15mg/kg)。28日目に動物を屠殺し、ヒドロキシプロリン(図65A)及び脂質過酸化分析(図65B)により線維症について評価した(U. California−Davs[米国カリフォルニア州デービス]で実施された)。意外にも、このモデルにおける線維症の減弱の有効性は認められなかった。7及び14日目に開始してmu3G9を投与したハムスターの群の1群において、ハムスターはPBS及びIgG対照群と比較してヒドロキシプロリンの統計的に有意な増加を示した。脂質過酸化値は、IgG対照群と比較して有意に上昇しなかった。本発明者等は、この明らかな増悪がハムスターの生存に影響を及ぼすかどうかを確認するために、種々の投与群の生存曲線を解析した。0日目に開始して投与したmu3G92マウス(図65CのBL+Ab1群)は、PBS及びIgG対照よりわずかに早期に死亡し始めた。しかし、BL+Ab1生存曲線をPBS及びIgG対照と個別に比較したとき、差は有意でなかった(対数順位検定:p=0.15対PBS及びp=0.25対IgG対照mAb)。mu3G92モノクローナル抗体がハムスターと交差反応するかどうかは不明であり、ハムスターがこのモデルに使用したマウス抗体に対して抗体反応を起こした可能性がある。このモデルにおける転帰の解釈は困難であるため、2つの異なるマウス肺線維症モデル(ブレオマイシン及び放射線誘発)で一貫した有効性が認められたため、有効性に関する異なる用量の評価は遂行しなかった。
概要
肺線維症の動物モデルは、ヒト特発性肺線維症(IPF)の線維症病理の幾つかの側面をモデル化するのに有効である。しかし、どの動物モデルもIPFの精密な病理を正確に模擬しない。更に、IPFにおける疾患の発症及び進行の機序の理解は不完全であるため、複数の疾患モデルにおいて潜在的な治療薬を試験し、線維症の病状の改善の点だけでなく、ヒト疾患に関連すると考えられている分子的経路への介入の点についてもそれらの有効性を評価することは重要である。TGF−β経路は、IPFにおける重要な経路として暗示された。ヒトIPF肺の包括的転写プロファイリングにより、この疾患の主要な特徴が、線維芽細胞の活性化及び増殖並びに細胞外マトリックス分子の発現を含む肺線維症を特徴付ける多くの病理学的過程の推進におけるTGF−βの既知の役割と一致する、活性化TGF−β経路の1つであることが示された。その線維症誘発活性に加えて、TGF−βは重要な抗炎症サイトカインであり、従って、TGF−βの治療的阻害によって、過度の炎症が促進されることなく、線維症が理想的に阻止されるはずである。インテグリンαvβ6は、潜在TGF−β複合体に直接結合し、TGF−βの活性状態への変換に必要である。しかし、αvβ6媒介性TGF−β活性化は一部の組織においてのみ重要であるため、αvβ6機能を完全に欠くマウスは肺にのみ病状を示し、一方、TGF−β欠乏マウスは複数の器官系に炎症を示す。従って、ここで概説する治療戦略は、TGF−β経路の完全な阻害を避けるようにαvβ6機能を遮断し、TGF−βシグナリングの増加に関連する線維症の病状を阻止する有効性を、TGF−βの完全な喪失に伴う炎症を引き起こさない用量で達成することができることを示すことである。こでは、本発明者等は、線維症及び炎症性病状に関連するmRNA及びタンパク質レベルでの分子的変化を特徴付ける。本発明者等は、高用量の抗αvβ6インテグリンモノクローナル抗体mu3G9(臨床候補BG00011のマウス親)が、αvβ6欠乏マウスと一致する肺における炎症性マーカーのmRNA及びタンパク質変化をもたらすことを示す。本発明者等は更に、線維症の減弱に有効な低用量のmu3G9はマウスにおけるこれらの炎症性変化をもたらさないことを示す。
TGF−βサイトカインは、線維芽細胞が最終的に臓器瘢痕化及び不全につながる過剰な細胞外マトリックス(ECM)を産生することを刺激することが知られている線維症誘発性サイトカインである(Roberts 1986)。肺における様々なサイトカインのアデノウイルス及び外来遺伝子過剰発現は、TGF−β1は有意な炎症の非存在下で線維症を促進する能力が独特であることを示すものであった。TGF−β経路における遺伝子のノックアウトマウスモデル(Bonniaud 2004、Munger 1999)及び抗TGF−β剤を使用した多くの試験により、線維症の減弱の尺度としてのTGF−βの阻害の有効性が示された(George, J. 1999; Sharma, K. 1996; Bonnidaud, P. 2004; Zheng, H. 2000; Kasuga, H. 2001; Ziyadeh, F.N. 2000; Laping, N.J. 2003)。2つのサブユニット、即ち、αv及びβ6インテグリンからなるαvβ6インテグリンは、特に肺におけるTGF−β1活性化の重要なレギュレータである。αvβ6インテグリンは、損傷、炎症及び線維症時に上皮細胞上でアップレギュレートされ、潜在TGF−β1複合体に結合してそれを活性形に変換する(Huang 1998; Munger 1999; Busk 1992; Yokoaski 1996; Annes 2002)。αvβ6が潜在TGF−β1に結合することを遮断することは、αvβ6のアップレギュレートされた発現の部位におけるTGF−βの活性化の局所的抑制とそれによる全ての組織におけるTGF−β経路の完全な阻害の潜在的臨床的安全性リスクの回避の方法を提供する。
1. 試薬
αvβ6mAbsを本明細書における他所に記載及び以前に記載した[29]ように生成した。ヒト/マウスキメラ2A1及び3G9 cDNAsを、重鎖の定常領域プライマーCDL−739及び軽鎖のCDL−738を含む各親ハイブリドーマ総RNAsからFirst Strand cDNA合成キット(Amersham/Pharmacia[米国ニュージャージー州ピスカタウェイ])を使用して生成した。重鎖及び軽鎖可変領域は、cDNA合成に使用した同じ3’プライマー及び大部分のマウス抗体遺伝子シグナル配列(請求あり次第入手可能な配列)に特異的な縮重プライマーのプール及びPfu DNAポリメラーゼ(Stratagene[米国カリフォルニア州ラホイヤ])を使用したポリメラーゼ連鎖反応により増幅した。クローン化した重鎖及び軽鎖可変領域を、ヒトIgG1定常領域を含む哺乳動物発現ベクターに結合させた。組換え可溶性マウスTGF−β受容体II−Ig型融合タンパク質(sTGF−βRII−Ig)を以前に記載した[10]ように生成した。研究用mu3G9、1E6及びsTGF−bRII−Ig(リン酸緩衝生理食塩水中精製タンパク質)を全ての実験に使用した。
(a)RNA分析のための正常マウスにおけるmu3G9の投与: 正常C57B16マウスに5mg/kgの可溶性TGFbRII−Ig、FBS又は次の用量のmu3G9を4週間にわたり週1回(1、8、15及び22日目)投与した:0.3、1、3、10及び30mg/kg。投与マウスの1コホートを29日目(最終投与の1週後=無回復)に採取したが、他のコホートは78日目(最終投与の8週後=7週間回復)に採取した。これらの実験は、CD−1系のマウスを試験し、8週間の回復を使用した、mu3G9マウス毒性報告書に記載されている実験と独立して実施した。
過剰量のInactin(Sigma)の腹腔内注射(IP)によりマウスを安楽死させた。主として鈍的剥離により気管を露出させた。次いで、気管を鋏で2つの軟骨輪の間で開き、23ゲージ鈍端針を気管に挿入した。Schwartz一時クリップ(Roboz)で軽く締め付けて針を所定の位置に保持した。0.8mLのCa2+又はMg2+不含有リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を肺に注入して、BALを実施した。大きい圧力を加えずに液を注射器中に吸引し、氷上の15mLポリプロピレンFalcon管に移した。次いで、処置を繰返し、過度の陰圧をかけずにBAL液を注射器中に吸引する。試料を氷上で保存し、細胞数の計測、分染のために処理し、BALペレット及び液を採取し、−80℃にて保存する。
過剰量のInactin(Sigma)の腹腔内注射(IP)によりマウスを安楽死させた。動物に70%ETOHを噴霧し、滅菌鋏を使用して胸骨から頭部に向かって皮膚を切り取る。皮膚を除去したならば、胸骨及び肋骨を切り取り、心臓及び肺を露出させる。肺を摘出し、滅菌ガーゼ片の上にのせて血液産物を除去し、14mLポリプロピレン丸底管17×100mm(Fisher)に速やかに入れる。液体窒素を肺を含むポリプロピレン管に加え、ドライアイス上に置く。肺を−80℃にて保存する。
製造業者のプロトコルに従ってQiazol試薬(Qiagen)を使用して急速凍結肺組織から総RNAを精製した。RNAの質は、Bioanalyzer 2000(Agilent)を使用したキャピラリー電気泳動により確認した。
試料の標識、ハイブリッド形成及び染色は、GeneChip(登録商標)発現分析に関するAffymetrix技術マニュアル(701021 rev 1)(Affymetrix[米国カリフォルニア州サンタクララ])における真核標的調製(Eukaryotic Target Preparation)プロトコルに従って行った。要約すると、5μgの精製総RNAを、200U SuperScript II(カタログ番号18064−022、Invitrogen)及び0.5μgの(dT)−T7プライマー[5’−GGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGAGGCGG(T)24]を使用した45℃にて1時間の20μL第一鎖反応に使用した。第二鎖合成は、40U大腸菌DNAポリメラーゼ(カタログ番号18010−025、Invitrogen)、2U大腸菌RNアーゼH(カタログ番号18021−071、Invitrogen)及び10U大腸菌DNAリガーゼ(カタログ番号18052−019、Invitrogen)を加えた後、16℃にて2時間培養して行った。第二鎖合成反応物を製造業者のプロトコルに従ってGeneChip(登録商標) Sample Cleanup Module(カタログ番号900371、Affymetrix[米国カリフォルニア州サンタクララ])を使用して精製した。BioArray高収率RNA転写標識キット(カタログ番号42655−40、Enzo Life Sciences, Inc.[米国カリフォルニア州バーリンゲーム])を使用して、製造業者のプロトコルに従って精製cDNAを増幅して、70〜120μgのビオチン標識cRNA(相補的RNA)を生成させた。マウスMgU74Av2、MgU74Bv2及びMgU74Cv2 GeneChip(登録商標)プローブアレイを、GeneChip(登録商標)ハイブリッド形成オーブン640(Affymetrix[米国カリフォルニア州サンタクララ])中で製造業者のプロトコルに従って前ハイブリッド形成させた。フラグメント化標識cRNAを、100mM 2−モルホリノエタンスルホン酸、1M [Na+]、20mM EDTA、0.01% Tween 20、0.5mg/mLアセチル化BSA、0.1mg/mLニシン精子DNA、対照オリゴB2並びに対照転写物bioB 1.5pM、bioC 5pM、BioD 25pM及びcre 100pMを含む300μLの1Xハイブリッド形成緩衝液に再懸濁し、製造業者のプロトコルに従ってGeneChip(登録商標)プローブアレイ(Affymetrix[米国カリフォルニア州サンタクララ])とハイブリッド形成させた。ハイブリッド形成GeneChip(登録商標)プローブアレイを洗浄し、ストレプトアビジン−フィコエリトリニン(カタログ番号S866、Molecular Probes[米国オレゴン州ユージーン])を使用して染色し、GeneChip(登録商標) Fluidics Station 400(Affymetrix[米国カリフォルニア州サンタクララ])を使用してビオチニル化抗ストレプトアビジン(BA−0500、Vector Laboratories[米国カリフォルニア州バーリンゲーム])で増幅した。GeneChip(登録商標)プローブアレイをGeneArrayスキャナー(Hewlett Packard[米国オレゴン州コーバリス])を使用してスキャンした。
アレイスキャンをAffymetrix .CELファイルに変換し、得られたデータセット(完全な実験を表す.CELファイルの群)をRobust Microarray Average(RMA)法を使用して標準化した。統計及びクラスタリング解析は、BRB Array Tools v. 3.4.0 - Beta 2 (NCI)、GeneSpring (Agilent)及びSpotfire (Spotfire)データマイニングツールを使用して行った。マイクロアレイの有意性解析(SAM)を使用して、偽発見率(FDR)閾値を0.95信頼限界(CL)で0.01を超えないように設定してPBS投与群と比較して実験的投与の何れかによってシグナル強度が変化したプローブセットを特定した。シグナル強度の少なくとも2倍の変化を示した有意に影響を受けた(FDR<0.01、CL 0.95)プローブセットを選択することにより、必要な場合に更なるフィルタリングを行った。得られた遺伝子の群のプロファイル及び実験条件の分類を解析し、階層的クラスタリングにより視覚化した。Ingenuity経路解析データベース(Ingenuity Systems)を使用して仮想経路(Virtual pathway)解析を行った。
上述の通り採取したBAL液から200μLの分割試料を採取した。これらの分割試料をRules Based Medicine, Inc.(米国テキサス州オースチン)に送り、当社でLuminexに基づく技術を使用してマウスタンパク質の標準パネルについて分析した。
転写物プロファイリング分析の統計解析は、上述の通りである。BAL液中のタンパク質レベルの分析の統計的比較は、ビヒクル対照及び/又はアイソタイプ対照と被験物質の種々の用量との間で一元配置分散分析(ANOVA)を使用して行った。ANOVAを使用してp<0.05の確率で統計的有意差が立証された場合、Dunnetの多重比較検定により群間の有意差を評価した。
1. 正常マウスへのmu3G9の投与の影響:肺転写物分析
CD−1マウスにおける毒性試験の結果により、肺がmu3G9の毒性の標的臓器として特定された。それらの試験で詳細に述べられたように、(αvβ6インテグリンが欠乏している)インテグリンβ6ヌルマウスにおける所見と一致する肺の炎症がmu3G9を投与したマウスで認められる。組織病理検査により評価したこの炎症は、1mg/kgの用量でまれに認められるが、週1回の10mg/kgの用量で一貫して認められる。C57B16系(実施例15及び16において上述した有効性試験に使用した系統)におけるこのような炎症を評価するために、マウスに週1回0.3〜30mg/kgの用量でmu3G9を投与し、RNA及びマイクロアレイ分析のために肺を処理した。
MMP−12は、mu3G9投与マウスの肺における転写物の最大倍率のアップレギュレーションを示す(表17−3)。MMP−12は、β6ヌルマウスの肺における最も高度にアップレギュレートされた転写物として以前に報告された。MMP−12発現とmu3G9の投与との関係を更に解明するために、本発明者等はβ6ヌルマウスの肺から調製したRNAを含むMMP−12転写物の相対的レベルを定量的PCRにより分析した。mu3G9の投与は、10及び30mg/kgで有意であった、MMP−12転写物の用量依存的増加をもたらした。MMP−12の発現の変化倍率は、それらの用量でβ6ヌルマウスで認められたものと同等であった。マイクロアレイ分析の上述した結果と同様に、qPCRによるMMP−12レベルは、3mg/kgでは上昇傾向であったが、0.3及び1mg/kgの用量では変化がなかった。
mu3G9の投与に起因する肺における分子的変化を更に特定するために、本発明者等は0.1〜10mg/kgのmu3G9の用量を4週間投与したマウスの他のコホートのBAL液中の60種のタンパク質のレベルを分析した(表17−8)。タンパク質の分析は、Rules Based Medicine, Inc.(米国テキサス州オースチン)においてluminex(多重タンパク質分析)アッセイにより行った。転写レベルの所見と一致して、肺炎症に関連した複数のタンパク質が10mg/kgの用量を投与したマウスのBAL液中で増加した(表17−9)。更に、これらの変化の幾つかは3mg/kgの用量においてもANOVAにより有意であった。しかし、パネルにおける何れのタンパク質も1 mg/kgの用量まで増加しなかった。
放射線誘発性肺線維症の減弱におけるmu3G9の有効性は、上の実施例15において述べた。それらの試験において採取したBAL液(BALF)試料は、mu3G9を投与した正常マウスのBALFに使用したのと同じマウスパネルを使用した多分析対象タンパク質プロファイリングにより分析した。28週目(13週間投与)及び32週目(17週間投与)時点のBALF分析をここで解析する。ANOVAにより判断したとき有意に変化したタンパク質を表17−11に要約する。正常マウスにおける転写物プロファイリング及びタンパク質結果と同様に、放射線線維症モデルにおいて変化しているタンパク質の大多数は、(3mg/kgで一部は有意であり、全てが傾向を示すが)10mg/kgの用量でのみ有意性に達する。これらのタンパク質の大多数は、肺線維症に関連することが知られているサイトカイン又はケモカインである。10mg/kg mu3G9を投与した正常マウスにおいて2倍以上アップレギュレートされた20種のタンパク質の内の14種(表17−10)は、放射線モデルにおいても一貫してアップレギュレートされている。mu3G9の投与期間及び損傷/炎症状態が異なるにもかかわらず、正常マウスと照射マウスにおける所見の間の一致は顕著である。タンパク質の多くは放射線モデルにおけるより長い投与期間と一致したわずかに高い倍率のアップレギュレーションを示している(表17−12)が、全般的所見はこれらの2つの非常に異なる状況で一致している。更に、正常マウスと照射マウスとでベースラインレベルが異なる(放射線損傷はこれらのタンパク質の大部分をアップレギュレートする)にもかかわらず、これらの炎症マーカーがアップレギュレートされる用量範囲は正常マウスと照射マウスとで同じである。具体的には、それらは正常及び罹患マウスで3及び10mg/kgの用量でアップレギュレートされるが、1mg/kgの用量ではされない(図70で28週目に4つの最も高度にアップレギュレートされたタンパク質により例証される)。従って、放射線モデルにおける薬物標的の発現がはるかにより高い(上の実施例15を参照)にもかかわらず、mu3G9の投与に特異的なBALタンパク質の変化をもたらす用量は両状況で同じである。mu3G9によって誘導されるタンパク質の全てが炎症誘発及び/又は線維症誘発作用を有すると考えられているとは限らないことに注意することは重要である。例えば、CXCLケモカインIP−10/CXCL10はマウスモデルにおいて強力な抗線維症効力を示し、IP−10又はその受容体が欠乏したマウスはブレオマイシンに対して過度の線維症反応を示す。しかし、1mg/kg用量のほぼ最大有効量でこのサイトカイン又は他のサイトカインの一貫した変化は認められず、従って、肺のサイトカイン環境のこれらの変化の何れかがmu3G9の投与の有効性に必要であるということはあり得ない。
Claims (12)
- αvβ6インテグリンに特異的に結合し、かつ配列番号1の重鎖可変ドメイン配列及び配列番号2の軽鎖可変ドメイン配列を含むヒト化抗体。
- αvβ6インテグリンに特異的に結合するヒト化抗体であって、該ヒト化抗体は、配列番号144、配列番号145又は配列番号146の重鎖可変ドメイン配列、及び配列番号139、配列番号140、配列番号141、配列番号142又は配列番号143の軽鎖可変ドメイン配列を含む、ヒト化抗体。
- αvβ6インテグリンに特異的に結合するヒト化抗体であって、該ヒト化抗体は、配列番号146の重鎖可変ドメイン配列、及び配列番号141又は配列番号143の軽鎖可変ドメイン配列を含む、ヒト化抗体。
- αvβ6インテグリンに特異的に結合し、かつ配列番号145の重鎖可変ドメイン配列、及び配列番号140の軽鎖可変ドメイン配列を含む、ヒト化抗体。
- αvβ6インテグリンに特異的に結合し、かつ配列番号146の重鎖可変ドメイン配列、及び配列番号143の軽鎖可変ドメイン配列を含む、ヒト化抗体。
- αvβ6インテグリンに特異的に結合し、かつ配列番号144の重鎖可変ドメイン配列、及び配列番号139の軽鎖可変ドメイン配列を含む、ヒト化抗体。
- 請求項1〜6の何れか1項に記載のヒト化抗体及び薬学的に許容される担体を含む、組成物。
- ヒト被験体において線維症を処置するための組成物であって、請求項1〜6の何れか1項に記載のヒト化抗体の治療有効量を含む、組成物。
- 前記線維症が肺線維症、急性肺傷害、腎線維症、肝線維症、アルポート症候群又は硬皮症である、請求項8に記載の組成物。
- 前記線維症が肺線維症である、請求項8に記載の組成物。
- 前記肺線維症が特発性肺線維症、放射線誘導線維症、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、硬皮症、ブレオマイシン誘導線維症、慢性喘息、珪肺症、アスベスト誘導線維症、急性肺傷害又は急性呼吸器窮迫症である、請求項10に記載の組成物。
- 前記肺線維症が特発性肺線維症である、請求項10に記載の組成物。
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