BRPI0612778B1 - Anticorpo humanizado que se liga especificamente a ?lfav?eta6, seu método de preparação, composição e método in vitro de diagnóstico de um carcinoma que tem maior probabilidade de progredir para um carcinoma invasivo - Google Patents

Abstract

ANTICORPOS HUMANIZADOS ANTI-ALFAvBETA6, MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLÉICO E PEPTÍDEO ISOLADOS, VETOR RECOMBINANTE E COMPOSIÇÃO. A presente invenção está inserida nos campos da biologia celular, imunologia e oncologia. A invenção proporciona anticorpos humanizados que reconhecem as integrinas (Alfa)v(Beta)6, cujos anticorpos compreendem uma região variável de origem não humana e pelo menos uma porção de uma imunoglobulina de origem humana. A invenção proporciona também métodos compreendendo os mesmos, e métodos para tratar, diagnosticar e/ou prevenir várias doenças e distúrbios por administração dos anticorpos anti-(Alfa)v(Beta)6 humanizados da invenção. A invenção ainda refere-se à identificação de expressão diferencial da integrina (Alfa)v(Beta)6 sobre as superfícies das células tumorais e tecidos, o uso desta expressão diferencial na determinação do potencial metastático de células tumorais e métodos de diagnóstico e tratamento/prevenção de metástase de tumor e para eliminação de células tumorais metastáticas residuais usando ligantes, particularmente anticorpos, que se ligam à integrina (Alfa)v(Beta)6.

Description

Antecedentes da Invenção Campo da Invenção

[0001] A presente invenção está inserida nos campos da biologia celular, imunologia e oncologia. Especificamente, a invenção refere-se a anticorpos humanizados que reconhecem as integrinas αvβ6, compreendendo uma região variável de origem não humana e pelo menos uma porção de uma imunoglobulina de origem humana. A invenção refere- se também a processos para sua preparação, a composições farmacêuticas compreendendo os mesmos e a métodos para tratar várias doenças por administração dos anticorpos anti-αvβ6 humanizados. A invenção ainda refere-se à identificação de expressão diferencial da integrina αvβ6 nas superfícies das células tumorais e tecidos, o uso desta expressão diferencial na determinação do potencial metastático de células tumorais e métodos de diagnóstico e de tratamento/prevenção de metástase de tumor e para eliminação de células tumorais metastáticas residuais usando ligantes, particularmente anticorpos, que se ligam à integrina αvβ6.

Técnica Relacionada

[0002] Integrinas são receptores de glicoproteína de superfície celular, que ligam proteínas de matriz extracelular e medeiam as interações célula-célula e célula-matriz extracelular (geralmente referidas como eventos de adesão celular) (Ruoslahti, E., J. Clin. Invest. 87:1-5 (1991); Hynes, R.O., Cell 69:11-25 (1992)). Esses receptores são compostos de cadeias alfa (α) e beta (β) não covalentemente associadas que se combinam para dar uma variedade de proteínas heterodiméricas com distintas especificidades celulares e adesivas (Albeda, S.M., Lab. Invest. 68:4-14 (1993)). Estudos recentes têm implicado certas integrinas na regulação de uma variedade de processos celulares, incluindo adesão, migração, invasão, diferenciação, proliferação, apoptose e expressão de genes celulares (Albeda, S.M., Lab. Invest. 68:4-14 (1993); Juliano, R., Cancer Met. Rev. 13:25-30 (1994); Ruoslathi, E. e Reed, J.C., Cell 77:477478 (1994); e Ruoslahti, E. e Giancotti, F.G., Cancer Cells 1:199-126 (1989); Plow, Haas et al. 2000; vand der Flier e Sonnenberg 2001).

[0003] O receptor αvβ6 é um membro de uma família de integrinas que são expressas como proteínas heterodiméricas de superfície celular (Busk, M. et al, J. Biol. Chem. 267(9):5790-5796 (1992)). Embora a subunidade av possa formar um heterodímero com uma variedade de subunidades (β1, β3, β5, β6 e β8), a subunidade β6 pode ser somente expressa como um heterodímero com a subunidade av. A integrina avβ6 é conhecida como sendo um receptor de superfície celular de ligação de fibronectina, peptídeo associado à latência (LAP) e tenacina C, interagindo com a matriz extracelular através dos sítios de ligação tripeptídicos RGD sobre ela. (Busk, M. et al, J. Biol. Chem. 267:5790-5796 (1992); Weinacker, A. et al, J. Biol. Chem. 269:6940- 6948 (1994); Prieto, A.L. et al, Proc. Natl. Acad. ScL USA 90:10154-10158 (1993)). Embora a integrina avβ6 tenha sido primeiramente identificada e seqüenciada há mais de dez anos, a significância biológica da avβ6, especialmente em doença, está ainda sob investigação. A expressão de avβ6 é restrita às células epiteliais, em níveis relativamente baixos, em tecido saudável e significantemente supra-regulado durante o desenvolvimento, lesão, e cura de ferimentos (Breuss, J.M. et al, J. Histochem. Cytochem. 41:1521-1527 (1993); Breuss, J.M. et al, J. Cell Sci. 108:2241-2251 (1995); Koivisto, L. et al, Cell Adhes. Communic. 7:245- 257 (1999); Zambrano, G. et al, J. Cell Biol. 129(3):853-865 (1995); Hakkinen, L. et a.l, J. Histochem. Cytochem. 48(6): 985-998 (2000)). Um número crescente de relatórios recentes demonstra que αvβ6 é supra-regulada em cânceres de origem epitelial, incluindo carcinoma do cólon (Niu, J. et al., Int. J. Cancer 92:40-48 (2001); Bates, R.C. et al., J. Clin. Invest. 775:339-347 (2005)), câncer do ovário (Ahmed, N. et al., J. Cell Biochem. 84:675-686 (2002); Ahmed, N. et al., J. Histochem. Cytochem. 50:1371-1379 (2002); Ahmed, N. et al., Carcinogen. 23:237-244 (2002)), carcinoma de célula escamosa (Koivisto, L. et al, Exp. Cell Res. 255:1017 (2000); Xue, H. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 288:610-618 (2001); Thomas, G.J. et al., J. Invest. Dermatol. 117:67-73 (2001); Thomas, G.J. et al., Int. J. Cancer 92:641-650 (2001); Ramos, D.M. et al., Matrix Biol. 21:297-307 (2002); (Agrez, M. et al., Br. J. Cancer 81:90-97 (1999); Hamidi, S. et al, Br. J. Cancer 82(8):1433- 1440 (2000); Kawashima, A. et al., Pathol. Res. Pract. 99(2):57-64 (2003)), e câncer da mama (Arihiro, K. et al., Breast Cancer 7:19-26 (2000)). Tem também sido reportado que a subunidade av tem sido envolvida na metástase de tumor e que o bloqueio desta subunidade pode, conseqüentemente, prevenir metástase (para uma revisão, vide Imhof, B. A. et al., em: "Attempts to Understand Metastasis Formation I", U. Günthert e W. Birchmeier, eds., Berlim: Springer-Verlag, pp. 195-203 (1996)).

[0004] A integrina avβ6 tem múltiplas funções reguladoras na biologia da célula tumoral. Estudos recentes demonstraram que os domínios extracelulares e citoplasmáticos da subunidade β6 medeiam diferentes atividades celulares. Os domínios extracelulares e transmembrânicos têm mostrado que medeiam a atividade e adesão de TGF-β (Sheppard, D., Cancer and Metastasis Rev. 24:395-402 (2005); Munger, J.S. et al., Cell 96:319-328 (1999)). O domínio citoplasmático da subunidade β6 contém uma única seqüência de 11 aminoácidos que é importante para mediar a proliferação celular regulada por avβ6, produção de MMP, migração, e pró-sobrevivência (Li, X. et al., J. Biol. Chem. 278(43):41646-41653 (2003); Thomas, G.J. et al., J. Invest. Derm. 117(1):61- 73 (2001); Thomas, G.J. et al., Br. J. Cancer 87(8):859-867 (2002); Janes, S.M. e Watt, F.M., J. Cell Biol 166(3) :419-431 (2004)). A subunidade β6 tem sido clonada, expressa e purificada (Sheppard et al., Patente. US 6.787.322 B2, cuja exposição é aqui incorporada a título de referência em sua totalidade), e anticorpos bloqueadores de função que se ligam seletivamente à integrina αvβ6 têm sido relatados (Weinreb et al., J. Biol. Chem. 279: 17875-17877 (2004), cuja exposição é aqui incorporada a título de referência em sua totalidade). Antagonistas de αvβ6 (incluindo certos anticorpos monoclonais) têm sido também sugeridos como possíveis tratamentos para certas formas de lesão pulmonar aguda (vide Patente US. 6.692.741 B2 e WO 99/07405, cuja exposição é aqui incorporada a título de referência em sua totalidade).

[0005] αvβ6 pode se ligar a vários ligantes incluindo fibronectina, tenascina, e peptídeos 1 e 3 associados à latência (LAP1 e LAP 3), os 278 aminoácidos N-terminais da forma de precursor latente de TGF-β1 através de uma interação direta com um motivo de arginina-glicina-aspartato ("RGD") (Busk, M. et al., J. Biol. Chem. 267(9):5790-5796 (1992); Yokosaki, Y. et al., J. Biol. Chem. 271(39):24144-24150 (1996); Huang, X.Z. et al., J. Cell Sci. 111:2189-2195 (1998); Munger, J.S. et al., Cell 96:319-328 (1999)). A citocina TGF-β is sintetizada como um complexo latente que tem o LAP N-terminal não covalentemente associado à citocina TGF-β C-terminal, ativa, madura. O complexo de TGF-β latente pode se ligar a seu receptor cognato e assim não é biologicamente ativo até ser convertido em uma forma ativa (Barcellos-Hoff, M.H., J Mamm. Gland Biol. l(4):353-363 (1996); Gleizes, P.E. et al., Stem Cells 15(3):190-197 (1997); Munger, J.S. et al., Kid. Int. 57:1376-1382 (1997); Khalil, N., Microbes Infect. 1(15):1255-1263 (1999)). A ligação de αvβ6 ao LAP1 ou LAP3 leva à ativação da forma de precursor latente de TGF-β1 e TGF-β3 (Munger, J.S. et al., Cell 96:319-328 (1999)), proposta como resultado de uma alteração conformacional na complexo latente permitindo que TGF-β se ligue ao seu receptor. Assim, a expressão supra-regulada de αvβ6 pode levar à ativação local de TGF-β, que por sua vez pode ativar uma cascata de eventos a jusante.

[0006] A citocina TGF-β1 é um fator de crescimento pleiotrópico que regula a proliferação celular, diferenciação, e respostas imunes (Wahl, S.M., J. Exp. Med. 180:1587-1590 (1994); Massague, J., Annu. Rev. Biochem. 67:753-191 (1998); Chen, W. e Wahl, S.M., TGF-β: Receptors, Signaling Pathways and Autoimmunity, Basel: Karger, pp. 62-91 (2002); Thomas, D.A. e Massague, J., Cancer Cell 5:369-380 (2005)). O papel que TGF-β1 desempenha no câncer tem dois lados. TGF-β é reconhecido ainda por atividade supressora e inibidora de crescimento, muitos tumores evolvem resistência às atividades supressoras de crescimento de TGF-β1 (Yingling, J.M. et al., Nature Rev. Drug Discov. 3(12): 1011-1022 (2004); Akhurst, R.J. et al., Trends Cell Biol. 11(11):S44- S51 (2001); Balmain, A. e Akhurst, R.J., Nature 428(6980):271-272 (2004)). Em tumores estabelecidos, a expressão e atividade de TGF-β1 têm sido implicadas na sobrevivência, progressão, e metástases do tumor (Akhurst, R.J. et al., Trends Cell Biol. 11(11):S44-S51 (2001); Muraoka, R.S. et al., J. Clin. Invest. 109(12):155l (2002); Yang, Y.A. et al., J. Clin. Invest. 109(12): 16071615 (2002)). É postulado que isso seja mediado por ambos os efeitos autócrinos e parácrinos no ambiente tumor-estromal local, incluindo os efeitos de TGF-β sobre a vigilância imune, angiogênese, e pressão intersticial tumoral aumentada. Agora vários estudos têm mostrado os efeitos antitumorais e antimetastáticos de inibir TGF-β1 (Akhurst, R.J., J. Clin. Invest. 109(12):1533-1536 (2002); Muraoka, R.S. et al., J. Clin. Invest. 109(12):l55l (2002); Yingling, J.M. et al., Nat. Rev. Drug Discov. 3(12): 1011-1022 (2004); Yang, Y.A. et al., J. Clin. Invest. 109(12):l607- 1615 (2002); Haider, S.K. et al., Neoplasia 7(5):509-521 (2005); Iyer, S. et al., Cancer Biol. Ther. 4(3):26l-266 (2005)).

[0007] Expressão aumentada de αvβ6 sobre tumores, particularmente na interface tumor-estromal, pode refletir uma mecanismo único para a ativação local de TGF-β1 e a habilidade de promover sobrevivência, invasão, e metástase do tumor. O alto nível de expressão em metástases humanas leva à suposição de um papel potencial para αvβ6 no estabelecimento de metástases, que é consistente com os relatos anteriores que αvβ6 pode mediar transição epitelial para mesenquimal, invasão de células tumorais in vitro, e expressão correlacionada com metástases em um modelo de camundongo (Bates, R.C., et al., J. Clin. Invest., 115(2):339-347 (2005); Thomas, G.J. et al., Br. J. Cancer 87(8)859-867 (2002); Morgan, M.R. et al., J. Biol. Chem. 279(25):26533- 26539 (2004)).

[0008] Descreveu-se anteriormente a geração de anticorpos monoclonais anti-αvβ6 potentes e seletivos (mAbs) que se ligam a ambas as formas humanas e murinas de αvβ6 e bloqueiam a ligação de αvβ6 a seus ligantes e a ativação mediada por αvβ6 do TGF-β1 (Weinreb, P.H. et al., J. Biol. Chem. 279(17):17875-17887 (2004)). Como também descrito na Publicação de PCT WO 03/100033, aqui incorporada a título de referência em sua totalidade, os anticorpos contra αvβe, incluindo a identificação e análise de resíduos de aminoácidos-chave nas regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de tais anticorpos foram descobertos e caracterizados. Em particular, esses anticorpos de alta afinidade (a) se ligam especificamente a αvβs; (b) inibem a ligação de αvββ ao seu ligante tais como LAP, fibronectina, vitronectina, e tenascina com um valor de IC50 menor que 10D5 (Pedido de Patente Internacional WO 99/07405); (c) bloqueiam a ativação de TGF-β ; (d) contêm certas seqüências de aminoácidos nas CDRs que proporcionam especificidade de ligação para αvβs; (e) se ligam especificamente à subunidade βs; e/ou (f) reconhecem αvβs em procedimentos de imunocoloração, tal como imunocoloração de tecidos embutidos em parafina.

[0009] WO 03/100033 descreve também a constatação que anticorpos que se ligam a αvβ6 podem ser agrupados em classes e subclasses biofisicamente distintas. Uma classe de anticorpos exibe a habilidade de bloquear a ligação de um ligante (por exemplo, LAP) a αvβθ (bloqueadores). Essa classe de anticorpos pode ser ainda dividida em subclasses de bloqueadores dependentes de cátion e bloqueadores independentes de cátions. Alguns dos bloqueadores dependentes de cátion contêm uma seqüência de peptídeos de arginina-glicina-aspartato (RGD), ao passo que os bloqueadores independentes de cátion não contêm uma seqüência de RGD. Uma outra classe de anticorpos exibe a capacidade de se ligar a αvβθ e ainda não bloqueia a ligação de αvβθ a um ligante (não-bloqueadores).

[00010] Além disso, WO 03/100033 refere-se a anticorpos que compreendem cadeias pesadas e cadeias leves, cujas regiões determinantes de complementaridade (CDR) 1, 2 e 3 consistem em certas seqüências de aminoácidos que proporcionam especificidade de ligação para αvβθ. WO 03/100033 proporciona também anticorpos que se ligam especificamente a αvβθ, mas não inibem a ligação de αvβθ a peptídeo associado à latência (LAP), bem como anticorpos que se ligam ao mesmo epítopo.

[00011] WO 03/100033 ainda descreve células de hibridomas θ.1A8, θ.2B10, θ.3G9, θ.8Gθ, θ.2Bl, θ.2Al, θ.2E5, 7.1G10, 7.7G5, e 7.1C5, isoladas de ácidos nucléicos compreendendo seqüências de codificação e polipeptídeos isolados compreendendo seqüências de aminoácidos dos anticorpos anti-αvβθ. Em particular WO 03/100033 descreve seqüências de aminoácidos dos anticorpos anti-αvβθ compreendendo seqüências de polipetídeos de cadeias pesada e leve como anticorpos produzidos pelos hibridomas θ.1A8, θ.3G9, θ.8Gθ, θ.2Bl, θ.2B10, θ.2Al, θ.2E5, 7.1G10, 7.7G5, ou 7.1C5. Vários dos hibridomas foram depositados no American Type Culture Collection ("ATCC"; P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, E.U.A.) sob o Tratado de Budapeste. Em particular, os clones de hibridomas 6.3G9 e 6.8G6 foram depositados em 26 de agosto de 2001, e contêm os números de identificação ATCC PTA-3649 e PTA-3645, respectivamente. Os anticorpos murinos produzidos pelos hibridomas 6.3G9 e 6.8G6 estão sendo ainda explorados na presente invenção quanto ao seu potencial desenvolvimento como anticorpos humanizados.

[00012] O anticorpo monoclonal murino 3G9 é um anticorpo murino, IgG1, isolado do camundongo -/- integrina β6 (Huang et al., J. Cell Biol. 133:921-928 (1996) imunizado com αvβ6 solúvel. O anticorpo 3G9 reconhece especificamente o epítopo da integrina αvβ6 que é expresso em níveis supra-regulados durante lesão, fibrose e câncer (vide, por exemplo, Thomas et al., J. Invest. Dermatology 117:67-73 (2001); Brunton et al., Neoplasia 3:215-226 (2001); Agrez et al., Int. J. Cancer 81:90-97 (1999); Breuss, J. Cell Science 108:2241-2251 (1995)). Ele não se liga a outras integrinas av e apresenta reação cruzada a ambas as moléculas humanas e murinas. O anticorpo monoclonal murino 3G9 tem sido descrito como bloqueador da ligação de avβ6 ao LAP conforme determinação por bloqueio de ligação de ligante tanto a avβ6 como às células que expressam β6, inibindo assim a atividade pró-fibrótica de TGF-β (vide WO 03/100033). Foi também mostrado que inibe a ativação mediada por avβ6 de TGF-β com um valor de IC50 menor que um dos anticorpos avβ6 conhecidos, 10D5 (Huang et al., J Cell Sci. 111 :2189-2195 (1998)).

[00013] O anticorpo monoclonal murino 8G6 é anticorpo kappa murino IgG1, que também reconhece o epítopo de integrina avβ6, conforme descrição em WO 03/100033. O anticorpo monoclonal murino 8G6 é um bloqueador de avβ6, de alta afinidade, dependente de cátion, que exibe a capacidade de inibir ativação de TGF-β mediada por avβ6 com um valor de IC50 menor que 10D5 (vide WO 03/100033).

[00014] Ambos os anticorpos murinos 3G9 e 8g6 foram eficazes em prevenir fibrose do rim e pulmão, conforme descrição em WO 03/100033. Além disso, o anticorpo murino 3G9 foi capaz de inibir eficazmente o crescimento de tumor em um modelo de xenoenxerto de tumor humano, sugerindo o papel potencial de αvβ6 na patologia do câncer e a eficácia de tal bloqueio usando anticorpos direcionados em αvβ6.

[00015] Por conseguinte, é necessário o desenvolvimento de anticorpos αvβ6 que sejam menos antigênicos em seres humanos e que possam ser úteis no tratamento de doenças envolvidas na por meio de de αvβ6. O advento da metodologia de DNA recombinante, tornou possível engenheirar estruturalmente genes de anticorpos e produzir moléculas modificadas de anticorpos com propriedades não obteníveis por tecnologia de hibridoma. Na arena terapêutica, um objetivo dessa metodologia tem sido a redução da imunogenicidade em seres humanos de anticorpos monoclonais de roedores por modificação de sua estrutura de aminoácidos primários. A redução da imunogenicidade de anticorpos terapêuticos é desejável porque a indução de uma resposta imune pode provocar um espectro de efeitos adversos em um paciente, que varia da eliminação acelerada do anticorpo terapêutico, com a conseqüente perda de eficácia, até a anafilaxia fatal no caso mais extremo.

[00016] Uma estratégia para reduzir a imunogenicidade de anticorpos monoclonais estranhos tem sido substituir os domínios constantes de cadeias, leve e pesada, do anticorpo monoclonal com domínios análogos de origem humana, deixando intactos os domínios de regiões variáveis do anticorpo estranho intactos. Os domínios de regiões variáveis das cadeias leves e pesadas são responsáveis pela interação entre o anticorpo e o antígeno. Moléculas de anticorpo quimérico tendo domínios variáveis de camundongos unidos a domínios constantes humanos se ligam usualmente ao anticorpo com a mesma constante de afinidade que o anticorpo do camundongo do qual o quimérico é derivado. Tais anticorpos quiméricos são menos imunogênicos em seres humanos que seus equivalentes integralmente murinos. No entanto, anticorpos que conservam os domínios variáveis murinos inteiros tendem a provocar respostas imunes numa porção substancial de pacientes.

[00017] Era previsível que seres humanos montariam uma resposta imune para domínios variáveis inteiros; assim, esforços para obter domínios variáveis com caráter humano tinham sido iniciados mesmo antes das experiências clínicas de tais anticorpos quiméricos padrão terem sido reportadas. Uma categoria de métodos freqüentemente referida como "humanizante" tem por objetivo converter os domínios variáveis de anticorpos monoclonais murinos em uma forma humana através da construção de, de modo recombinante, de um domínio variável de anticorpo tendo tanto o caráter de camundongo como de seres humano. Categorias humanizantes são baseadas em vários entendimentos consensuais de dados das estruturas dos anticorpos. Em primeiro lugar, domínios variáveis contêm extensões contíguas de seqüência de peptídeos que são conservadas dentro de uma espécie, mas que diferem entre as espécies de evolução remota, tais como camundongos e seres humanos. Em segundo lugar, outras extensões contíguas não são conservadas dentro de uma espécie, mas ainda diferem entre as células produtoras de anticorpos dentro do mesmo indivíduo. Em terceiro lugar, contatos entre anticorpo e antígeno ocorrem principalmente através das regiões não conservadas do domínio variável. Em quarto lugar, a arquitetura molecular dos domínios variáveis de anticorpo é suficientemente similar através das espécies cujas posições dos resíduos de aminoácidos correspondentes entre espécies podem ser identificadas com base na posição sozinha, sem dados experimentais.

[00018] Estratégias humanizadas compartilham a premissa que substituição de resíduos de aminoácidos que são característicos de seqüências murinas com resíduos encontrados nas posições correspondentes de anticorpos humanos reduzirá a imunogenicidade em seres humanos do anticorpo resultante. Contudo, a substituição de seqüências entre espécies resulta usualmente na redução do anticorpo que se liga a seu antígeno. Portanto, a técnica de humanização reside em equilibrar a substituição da seqüência murina original para reduzir a imunogenicidade com a necessidade da molécula humanizada de reter ligação de antígeno suficiente para ser terapeuticamente útil. Esse equilíbrio tem sido tentado com o uso de duas abordagens.

[00019] Em uma abordagem, exemplificada na Patente US 5.869.619, resíduos caracteristicamente humanos são usados no lugar de resíduos de domínio variável murino que são determinados e prognosticados (i) para não desempenhar papel significante na interação com antígenos e (ii) para ser posicionado com duas cadeias laterais que se projetam no solvente. Assim, resíduos exteriores remotos do sítio de ligação de antígeno são humanizados, enquanto os resíduos anteriores, resíduos de ligação de antígenos, e resíduos que formam a interface entre os domínios variáveis permanecem murinos. Uma desvantagem dessa abordagem é que são requeridos dados experimentais bastantes dispendiosos para determinar se o resíduo não desempenha papel químico significante na ligação de antígeno ou será posicionado no solvente em uma estrutura do anticorpo tridimensional.

[00020] Em uma outra abordagem mais geral, exemplificada na Patente US 5.225.539, extensões contíguas de seqüência de peptídeos de domínios variáveis conservadas são substituídas com as extensões correspondentes de um anticorpo humano. Nessa abordagem mais geral, todos os resíduos de domínio variável são humanizados, exceto as regiões não conservadas implicadas na ligação de antígeno. Para determinar extensões contíguas apropriadas para substituição, a Patente US 5.225.539 utilizou uma classificação de seqüências de domínios variáveis de anticorpos que haviam sido desenvolvidas previamente por Wu e Kabat, J Exp Med. 132(2):211-250 (1970).

[00021] Wu e Kabat foram os pioneiros no alinhamento de seqüências de peptídeos de anticorpos, e suas contribuições a este respeito tiveram vários desdobramentos: Em primeiro lugar, através do estudo de similaridades de seqüências entre vários domínios, eles identificaram resíduos correspondentes que em um maior ou menor grau eram homólogos através de todos os anticorpos em todas as espécies vertebradas, visto que eles adotaram estrutura tridimensional similar, desempenharam papéis funcionais similares, interagiram de forma similar com os resíduos vicinais, e existiam em ambientes químicos similares. Em segundo lugar, eles arquitetaram um sistema de numeração de seqüências de peptídeos onde os resíduos de imunoglobulina homólogos foram designados como estando no mesmo número de posição. Aquele versado na técnica pode de forma indubitável designar o que é agora mais comumente chamado de numeração de Kabat, para qualquer seqüência de domínios variáveis, sem se basear em qualquer dado experimental além da própria seqüência. Em terceiro lugar, para cada posição de seqüência numerada por Kabat, Kabat e Wu calcularam a variabilidade, através do que é referido o achado de poucos ou muitos aminoácidos possíveis quando as seqüências de domínios variáveis são alinhadas. Eles identificaram três regiões contíguas da alta variabilidade embutidas em quatro regiões contíguas menos variáveis. Outros pesquisadores haviam previamente observado variabilidade aproximadamente nessas regiões (regiões hipervariáveis) e postularam que a regiões altamente variáveis representavam resíduos de aminoácidos usados para ligação de antígenos. Kabat e Wu demarcaram formalmente resíduos que constituíam essas extensões variáveis, e as designaram como "regiões determinantes de complementaridade" (CDRs), referindo-se à complementaridade química entre anticorpo e antígeno. Um papel na dobradura tridimensional do domínio variável, mas não em reconhecimento de antígeno, foi atribuído às regiões menos variáveis, que são agora denominadas de "regiões de estrutura". Em quarto lugar, Kabat e Wu estabeleceram uma base de dados pública de seqüências de peptídeos de anticorpo e de ácidos nucléicos, que continua a ser mantida e é bem-conhecida daqueles versados na técnica.

[00022] O método de humanização descrito na Patente US 5.225.539, ao usar a classificação de Kabat, resulta em um anticorpo quimérico que compreende CDRs de um anticorpo e regiões de estrutura provenientes de um outro anticorpo que difere da origem da espécie, especificidade, subclasse, ou outras características. Contudo, nenhuma seqüência ou propriedade em particular foi atribuída às regiões de estrutura, certamente, a Patente US 5.225.539 ensinou que qualquer conjunto de estruturas poderia ser combinada com quaisquer grupos de CDRs. Seqüências de estruturas têm, desde então, sido reconhecidas como sendo importantes para conferir a estrutura tridimensional de uma região variável de anticorpo necessária para reter boa ligação de antígeno. Desenvolvimentos subseqüentes no campo têm sido refinamentos dentro do escopo da Patente US 5.225.539 para lidar com perda de avidez por antígeno observado com alguns anticorpos humanizados com relação à avidez dos anticorpos de camundongo correspondentes.

[00023] A Patente US 5.693.761 descreve um refinamento sobre a Patente US 5.225.539 para humanizar anticorpos, e é baseado na premissa que atribui perda de avidez a problemas nos motivos estruturais na estrutura humanizada, que, devido a sua incompatibilidade estérica ou outra incompatibilidade química, interferem na dobradura dos CDRs para a conformação capaz de ligação encontrada no anticorpo de camundongo. Para tentar resolver esse problema, a Patente US 5.693.761 ensina o uso de seqüências de estruturas humanas intimamente homólogas em seqüências de peptídeos lineares para seqüências de estruturas do anticorpo de camundongo a ser humanizado. Por conseguinte, os métodos da Patente US 5.693.761 foca na comparação de seqüências de estrutura entre espécies. Tipicamente, todas as seqüências de domínios variáveis humanos são comparadas a uma particular seqüência de camundongo e é calculada a identidade de percentagem entre os resíduos de estrutura correspondentes. O domínio variável humano com a maior percentagem é selecionado para proporcionar as seqüências de estrutura para humanizar o projeto. A Patente US 5.693.761 ensina também que é importante reter, na estrutura humanizada, certos resíduos de aminoácidos provenientes da estrutura de camundongo crítica para suportar as CDRs em uma conformação capaz de ligação.

[00024] Em outras abordagens, a criticalidade dos resíduos de aminoácidos de estrutura particulares é determinada experimentalmente uma vez que uma construção humanizada de baixa avidez é obtida, por reversão de resíduos simples para a seqüência de camundongos e efetuando ensaios de ligação de antígeno conforme descritos por Riechamnn et al., Nature 332(6162):323-327 (1988). Um outro exemplo de abordagem para identificar a criticalidade dos aminoácidos em seqüências de estruturas é mostrado na Patente US 5.821.337 e Patente US 5.859.205. Essas referências descrevem específicas posições de resíduos de Kabat na estrutura, que, em um anticorpo humanizado pode requerer substituição com o aminoácido de camundongo correspondente para conservar a avidez. Por conseguinte, as estruturas resultantes construídas, que são parte humana e parte de camundongo, exibem ainda freqüentemente imunogenicidade humana o ligação de antígeno diminuída, requerendo assim iterações numerosas na construção da estrutura para obter uma estrutura adequada para usos terapêuticos.

[00025] Existe, portanto, uma necessidade na técnica pelo desenvolvimento de anticorpos αvβ6 que são menos antigênicos em seres humanos. A presente invenção proporciona a geração de anticorpos humanizados que são especificamente reativos com αvβ6. A presente invenção proporciona também métodos para produzir tais anticorpos humanizados ao fornecer anticorpos humanizados que identificam confiavelmente seqüências de estruturas humanas adequadas para suportar regiões CDR não humanas e ainda proporciona anticorpos humanizados que retêm alta ligação de antígeno com baixa imunogenicidade em seres humanos. A presente invenção também proporciona usos de tais anticorpos humanizados reativos com αvβ6 no tratamento, diagnóstico e/ou prevenção de várias doenças e distúrbios. Beve Sumário da Invenção

[00026] A presente invenção é baseada pelo menos em parte na descoberta e caracterização de anticorpos humanizados de alta afinidade contra αvβ6, incluindo a identificação e análise de resíduos de aminoácidos chave nas regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de tais anticorpos, bem como a identificação e análise de resíduos de aminoácidos críticos nas seqüências de estruturas.

[00027] Em uma modalidade, a presente invenção refere-se a anticorpos monoclonais humanizados tendo especificidade para integrinas αvβθ, em que o anticorpo compreende domínios variáveis de cadeias pesada e leve de SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2, respectivamente. Tais anticorpos humanizados são derivados da humanização do anticorpo murino 3G9. Em certas modalidades, os anticorpos humanizados compreendem uma cadeia pesada cujas regiões determinantes de complementaridade (CDR) 1, 2 e 3 são definidas pelos resíduos de aminoácidos 31-35, 50-65 e 98-109, respectivamente, da SEQ ID NO:1. Em certas modalidades, os anticorpos humanizados compreendem uma cadeia leves cujas CDRs 1, 2 e 3 são definidas pelos resíduos de aminoácidos 24-35, 51-57 e 90-98, respectivamente, da SEQ ID NO:2. Em certas modalidades, os anticorpos humanizados compreendem uma cadeia pesada cujas regiões de estrutura (FR) 1, 2, 3 e 4 são definidas pelos resíduos de aminoácidos 1-30, 36-49, 66-97 e 110-120, respectivamente, da SEQ ID NO:1. Em certas modalidades, os anticorpos humanizados compreendem uma cadeia leve cujas regiões de estrutura (FR) 1, 2, 3, e 4 são definidas pelos resíduos de aminoácidos 1-23, 36-50, 58-89 e 99-108, respectivamente, da SEQ ID NO:2.

[00028] Em certas modalidades, os anticorpos humanizados compreendem pelo menos uma das seguintes substituições de aminoácidos na cadeia pesada, que consiste em Q3M e N74S da SEQ ID NO:1. Em certas modalidades, os anticorpos humanizados compreendem pelo menos uma das seguintes substituições de aminoácidos na cadeia leve consistindo em E1Q, L47W, 158V, A560V e Y87F da SEQ ID NO:2.

[00029] Em certas modalidades, o anticorpo humanizado compreende uma versão 1 de cadeia pesada ("HV1"), em que a cadeia pesada consiste em substituições de aminoácidos Q3M e N74S da SEQ ID NO:1. Em certas modalidades, o anticorpo humanizado compreende uma versão 2 de cadeia pesada ("HV2"), em que a cadeia pesada consiste na substituição de aminoácido N74S da SEQ ID NO:1. Em certas modalidades, o anticorpo humanizado compreende um versão 3 de cadeia pesada ("HV3"), em que a cadeia pesada consiste na SEQ ID NO:1.

[00030] Em certas modalidades, o anticorpo humanizado compreende uma versão 1 de cadeia leve ("LV1"), em que a cadeia leve consiste nas substituições de aminoácidos L47W, I58V, A60V e Y87F da SEQ ID NO:2. Em certas modalidades, o anticorpo humanizado compreende uma versão 2 de cadeia pesada ("LV2"), em que a cadeia leve consiste nas substituições de aminoácidos L47W e I58V da SEQ ID NO:2. Em certas modalidades, o anticorpo humanizado compreende uma versão 3 de cadeia leve ("LV3"), em que a cadeia leve consiste na substituição de aminoácidos L47W da SEQ ID NO:1. Em certas modalidades, o anticorpo humanizado compreende uma versão 4 de cadeia leve ("LV4"), em que a cadeia leve consiste nas substituições de aminoácidos E1Q e L47W da SEQ ID NO:2. Em certas modalidades, o anticorpo humanizado compreende uma versão 5 de cadeia leve ("LV5"), em que a cadeia leve consiste em SEQ ID NO:1.

[00031] Em certas modalidades, o anticorpo humanizado compreende um domínio variável de cadeia pesada e leve que compreende HV3, em que a cadeia pesada consiste em SEQ ID NO:1 e LV5, em que a cadeia leve consiste em SEQ ID NO:2.

[00032] Em certas modalidades, os anticorpos humanizados têm CDRs derivadas do anticorpo 6.3G9 (No de Acesso ATCC PTA-3649).

[00033] Em modalidades relacionadas, a presente invenção também se refere a anticorpos monoclonais humanizados tendo especificidade de ligação para integrinas αvβ6, em que os anticorpos compreendem domínios variáveis de cadeias pesada e leve das SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO:4. Tais anticorpos humanizados são derivados da humanização do anticorpo murino 8G6. Em certas modalidades, o anticorpos humanizados compreendem uma cadeia pesada, cujas regiões determinantes de complementaridade (CDR) 1, 2 e 3 são definidas por resíduos de aminoácidos (isto é, com exceção de algumas variações conservativas) 31-35, 50-66 e 99-115, respectivamente, da SEQ ID NO:3. Em certas modalidades, os anticorpos humanizados compreendem uma cadeia leve, cujas CDRs 1, 2 e 3 são definidas pelos resíduos de aminoácidos 24-38, 54-60 e 93-101, respectivamente, da SEQ ID NO:4. Em certas modalidades, os anticorpos humanizados compreendem uma cadeia pesada, cujas regiões de estrutura (FR) 1, 2, 3 e 4 são definidas pelos resíduos de aminoácidos 1-30, 36-49, 67-98, e 116-126, respectivamente, da SEQ ID NO:3. Em certas modalidades, os anticorpos humanizados compreendem uma cadeia leve, cujas FR 1, 2, 3 e 4 são definidas pelos resíduos de aminoácidos 1-23, 39-53, 61-92 e 102-111, respectivamente, da SEQ ID NO:4.

[00034] Em certas modalidades, os anticorpos humanizados compreendem pelo menos uma das seguintes substituições de aminoácidos na cadeia pesada consistindo em A24G, G26S, Q39L, M48I, V68A, R72V e T74K da SEQ ID NO:3. Em certas modalidades, os anticorpos humanizados compreendem pelo menos uma das seguintes substituições de aminoácidos na cadeia leve consistindo em E1D, L46F e Y49K da SEQ ID NO:4.

[00035] Em certas modalidades, o anticorpo humanizado compreende uma versão 1 de cadeia pesada ("HV1"), em que a cadeia pesada consiste nas substituições de aminoácidos A24G, G26S, Q39L, M48I, V68A, R72V e T74K da SEQ ID NO:3. Em certas modalidades, o anticorpo humanizado compreende uma versão 2 de cadeia pesada ("HV2"), em que a cadeia pesada consiste nas substituições de aminoácidos M48I, V68A, R72V e T72V da SEQ ID NO:3. Em certas modalidades, o anticorpo humanizado compreende uma versão 3 de cadeia pesada ("HV3"), em que a cadeia pesada consiste nas substituições de aminoácidos V68A, R72V e T74K da SEQ ID NO:3.

[00036] Em certas modalidades, o anticorpo humanizado compreende uma versão 1 de cadeia leve ("LV1"), em que a cadeia leve consiste nas substituições de aminoácidos E1D, L46F e Y49K da SEQ ID NO:4. Em certas modalidades, o anticorpo humanizado compreende uma versão 2 de cadeia leve ("LV2"), em que a cadeia leve consiste nas substituições de aminoácidos L46F e Y49K da SEQ ID NO:4. Em certas modalidades, o anticorpo humanizado compreende uma versão 3 de cadeia leve ("LV3"), em que a cadeia leve consiste na substituição de aminoácido Y49K da SEQ ID NO:4.

[00037] Em certas modalidades, os anticorpos humanizados têm CDRs derivadas do anticorpo murino 6.8G6. Em certas modalidades, os anticorpos humanizados podem competir por ligação a αvβ6 com o anticorpo murino 8G6.

[00038] A presente invenção engloba também anticorpos humanizados que se ligam ao mesmo epítopo como qualquer um dos anticorpos descritos acima.

[00039] A presente invenção engloba também anticorpos humanizados produzidos por um vetor recombinante compreendendo um ácido nucléico que codificada os ditos anticorpos. Em certas modalidades, o vetor recombinante pode ser um plasmídio selecionado do grupo que consiste em pKJS195 (SEQ ID NO:5), pKJS189 (SEQ ID NO:6) e pKJS196 (SEQ ID NO:7).

[00040] A presente invenção engloba também ácidos nucléicos isolados compreendendo uma seqüência de codificação para qualquer uma das SEQ ID NOs:1-7 e polipeptídeos isolados compreendendo uma seqüência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs:1-7.

[00041] A presente invenção engloba também vetores recombinantes compreendendo os ácidos nucléicos de qualquer um dos anticorpos humanizados descritos acima.

[00042] A presente invenção engloba também células hospedeiras compreendendo os vetores recombinantes que compreendem os ácidos nucléicos de qualquer um dos anticorpos humanizados descritos acima.

[00043] Esta invenção engloba também composições que compreendem um ou mais anticorpos humanizados desta invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em algumas dessas composições, os anticorpos humanizados são conjugados a um agente citotóxico (isto é um agente citotóxico que deteriora a viabilidade e/ou as funções de uma célula), tal como uma toxina ou um radionuclídeo. A composição pode ser administrada a um paciente (por exemplo, um mamífero tal como um ser humano) tendo ou em risco de ter uma doença mediada por αvβ6, de modo a tratar (por exemplo, aliviar, mitigar, reduzir, prevenir, postergar o início de) a doença. Exemplos de tais doenças incluem, mas sem limitação: fibrose (por exemplo, esclerodermia, formação de cicatriz, fibrose hepática, fibrose pulmonar, e fibrose renal); psoríase; câncer (conforme descrito em outro lugar aqui, por exemplo, câncer epitelial; câncer oral, da pele, cervical, ovariano, faríngeo, laríngeo, esofágico, do pulmão, da mama, do rim, pancreático, prostático ou colorretal); síndrome de Alport; lesões agudas e crônicas do pulmão, fígado, rim e outros órgãos internos; e esclerose do pulmão, fígado, rim e outros órgãos internos. Riscos de ter tais doenças podem resultar de predisposição genética; certos estilos de vida, tais como tabagismo e alcoolismo; exposição a poluentes ambientais, tais como asbestos; condições fisiológicas, tais como, diabetes, infecção com o vírus da hepatite (por exemplo, infecção com o vírus da hepatite C), doenças auto-imunes; e tratamentos médicos, tal como terapia de radiação.

[00044] A presente invenção engloba também métodos para preparar qualquer um dos anticorpos humanizados citados acima por cultura de qualquer uma das células hospedeiras mencionadas acima, sob condições apropriadas, para expressão do anticorpo humanizado, em que as cadeias do anticorpo humanizado são expressas e os anticorpos humanizados são produzidos. Em certas modalidades, os métodos ainda compreendem as etapas de isolar os anticorpos humanizados. Em certas modalidades, a célula hospedeira é uma célula CHO.

[00045] Os clones dos hibridomas 6.3G9 e 6.8G6 foram depositados em 16 de agosto de 2001, no American Type Culture Collection ("ATCC"; P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, E.U.A.) sob o Tratado de Budapeste, e têm os números de acesso ATCC PTA-3649 e -3645, respectivamente.

[00046] Um anticorpo humanizado da presente invenção refere-se a um anticorpo inteiro, por exemplo, um anticorpo compreendendo duas cadeias pesadas e duas cadeias leves, ou a um fragmento de ligação de antígeno de um anticorpo inteiro, tais como um fragmento Fab, um fragmento Fab’, um fragmento F(ab’)2 ou um fragmento F(v). Um anticorpo humanizado desta invenção pode ser de qualquer isótipo e subtipo, por exemplo, IgA (por exemplo, IgA1 e Ig A2), IgG (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4), IgE, IgD, IgM, em que as cadeias leves da imunoglobulina podem ser do tipo kappa ou lambda.

[00047] Em algumas modalidades, o anticorpo humanizado da presente invenção pode compreender uma mutação (por exemplo, deleção, substituição ou adição), em uma ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, 5, ou 6) de certas posições na cadeia pesada de modo que a função efetora do anticorpo (por exemplo, a capacidade do anticorpo de se ligar ao receptor Fc ou a um fator de complemento) é alterada sem afetar a capacidade de ligação de antígeno do anticorpo.

[00048] Em outras modalidades, o anticorpo humanizado desta invenção pode conter uma mutação em um resíduo de aminoácidos que é um sítio para glicosilação, de modo que o sítio de glicosilação é eliminado. Tal anticorpo humanizado pode ter funções efetoras clinicamente benéficas reduzidas, ou outras funções indesejadas, enquanto a sua afinidade de ligação de antígeno é retida. Mutação de um sítio de glicosilação pode ser também benéfica para desenvolvimento de processo (por exemplo, expressão e purificação de proteína).

[00049] Em certas modalidades desta invenção, o anticorpo humanizado compreende uma cadeia leve de aglicosila cujas CDRs são derivadas do anticorpo murino 3G9. Em certas modalidades, o anticorpo 3G9 humanizado contém um domínio variável de cadeia leve, em que a região CDR1 contém uma substituição de asparagina (N) para serina (S) no resíduo de aminoácido 26 da SEQ ID NO:2. A região CDR1 de 3G9 murino contém uma asparagina em suma posição de aminoácido. Contudo, a versão humanizada do anticorpo 3G9, todas as cinco versões da cadeia leve (LV1, LV2, LV3, LV4 e LV5), contém serina dentro da região CDR1 de 3G9 nesta posição. Aglicosilação desse sítio em todas as versões da cadeia leve do anticorpo 3G9 humanizado tem mostrado ser benéfica tanto para a expressão da proteína como purificação das cadeias leves. Em outras certas modalidades, o anticorpo 3G9 humanizado contém uma mutação em um sítio de glicosilação que é normalmente requerida para ligação de receptor de Fc normal. Em certas modalidades, o anticorpo 3G9 humanizado contém uma substituição de aminoácidos de asparagina (N) para glutamina (Q). Em certas modalidades, o anticorpo 3G9 humanizado contém a substituição de aminoácidos de N para Q na versão 3 de cadeia pesada (HV3) produzida por um vetor recombinante que compreende o plasmídio pKJS196 (SEQ ID NO:7). Em certas modalidades, a substituição de aminoácidos de N para Q ocorre no resíduo de aminoácido 319 da SEQ ID NO:7. Aglicosilação desse sítio na versão 3 de cadeia pesada (HV3) do anticorpo 3G9 humanizado tem mostrado que remove um sinal de glicosilação requerido para ligação de receptor de Fc normal sem afetar a afinidade de ligação de antígeno do anticorpo humanizado. Em certas modalidades, o anticorpo 3G9 humanizado compreende a versão 3 de cadeia pesada (HV3) produzida por um vetor recombinante que compreende o plasmídio pKJS189 (SEQ ID NO:6) e a versão 5 de cadeia leve (LV5) produzida por um vetor recombinante compreendendo o plasmídio pKJS195 (SEQ ID NO:5). Em certas modalidades, o anticorpo 3G9 humanizado compreende a versão 3 de cadeia pesada de aglicosila (a-HV3) produzida por um vetor recombinante que compreende o plasmídio pKJS196 (SEQ ID NO:7) e a versão 5 de cadeia leve (LV5) produzida por um vetor recombinante que compreende o plasmídio pKJS195 (SEQ ID NO:5).

[00050] Em ainda outras modalidades, as cadeias pesadas ou leves podem conter mutações que aumentam a afinidade ou potência.

[00051] Os anticorpos humanizados da invenção são úteis para tratar qualquer condição clinicamente indesejável ou doença (conforme discutido aqui) que seja mediada por ligação de αvβ6 a seu ligante, tal como LAP e fibronectina. Esses anticorpos humanizados podem ser mais potentes, por meio de maior afinidade ou avidez, e dependência de cátion ou independência de ligação ao ligante, que os anticorpos αvβ6 previamente conhecidos. Em contraste aos anticorpos monoclonais murinos, os anticorpos humanizados desta invenção não causarão a produção de anticorpos de imunoglobulina anticamundongo no paciente, especialmente no corpo humano, mas em vez disso mostram uma prolongada meia-vida no sangue, com uma freqüência reduzida de efeitos colaterais, de modo que pode se esperar que sejam superiores aos anticorpos monoclonais de camundongo na eficácia de tratamento de doenças mediadas por αvβ6.

[00052] Em aspectos adicionais, a presente invenção refere-se a métodos para diagnóstico, tratamento e prevenção de câncer usando ligantes de ligação αvβ6, tais como anticorpos de ligação αvβ6. Em uma modalidade, a presente invenção proporciona métodos para reduzir ou prevenir a metástase de um local do tumor primário para um local secundário em um paciente, que compreende administrar ao paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ou mais ligantes que se ligam a uma ou mais subunidades de integrina αvβ6 sobre uma ou mais células no tumor primário, em que a ligação do ligante à integrina resulta na morte, quimiossensibilidade ou invasividade reduzida da célula tumoral. Em modalidades relacionadas, a invenção proporciona métodos para reduzir ou prevenir a progressão do tumor pré-metastático para um tumor metastático em um paciente, que compreende administrar ao paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ou mais ligantes que se ligam a uma ou mais subunidades de integrina αvβ6 sobre uma ou mais células no tumor pré-metastático, em que a ligação do ligante à integrina resulta na redução ou prevenção de invasão de células do câncer pré- metastático em áreas teciduais que circundam o tumor primário. Em certas de tais modalidades da invenção, a célula tumoral é um carcinoma, tal como um adenocarcinoma. Em modalidades mais particulares, o carcinoma é um carcinoma da mama, um carcinoma do endométrio, um carcinoma pancreático, um carcinoma colorretal, um carcinoma do pulmão, um carcinoma ovariano, um carcinoma cervical, um carcinoma prostático, um carcinoma do fígado, um carcinoma esofágico, um carcinoma da cabeça ou do pescoço, um carcinoma do estômago ou um carcinoma esplênico. Mais particularmente, o carcinoma é um carcinoma da mama (incluindo, mas sem limitação, um carcinoma da mama in situ, tal como carcinoma ductal in situ (DCIS) ou carcinoma lobular in situ (LCIS), um carcinoma do endométrio, um carcinoma pancreático, um carcinoma colorretal, um carcinoma cervical, ou um carcinoma do pulmão.

[00053] Modalidades adequadas de acordo com esse aspecto da invenção usam ligantes de ligação de integrina αvβ6, que são anticorpos de ligação de αvβ6 ou fragmentos de ligação de epítopo αvβ6. De acordo com certas de tais modalidades, os anticorpos são anticorpos monoclonais (que podem ser quiméricos, primatizados ou humanizados), incluindo aqueles descritos na publicação de Pedido de Patente US 2005/0255102 A1, cuja exposição é aqui incorporada a título de referência em sua totalidade. Tais anticorpos adequados incluem, mas sem limitação, anticorpos monoclonais de ligação de αvβ6 designados por 1A8, 3G9, 8G6, 2B1, 2B10, 2A1, 2E5, 1G10, 1C5, 10D5 (depósito ATCC No HN12382) e CSβ6, bem como fragmentos, quimeras e híbridos destes. Particularmente adequados para uso em tais modalidades da invenção são anticorpos monoclonais 3G9 e 8G6. Também particularmente adequados para uso em tais modalidades da invenção são anticorpos monoclonais humanizados, tais como o anticorpo 3G9 humanizado designado como hu3G9 (BG00011) e o anticorpo 8G6 humanizado designado como hu8G6.

[00054] Em certas de tais modalidades terapêuticas da invenção, os ligantes de ligação de αvβ6 (por exemplo, anticorpo de ligação de αvβ6) são conjugados com ou ligados a um ou mais compostos citotóxicos ou agentes que levam a ou causam a morte da célula ou do tecido mediante ligação do conjugado de ligante de ligação de αvβ6-composto tóxico a uma ou mais integrinas αvβ6 sobre a célula ou tecido. Em certas modalidades terapêuticas adicionais da invenção, os ligantes de ligação de αvβ6 (por exemplo, anticorpos de ligação de αvβ6) são administrados a um paciente em conjunto com um ou mais de tais compostos tóxicos ou agentes. Os compostos ou agentes citotóxicos, que podem ser adequadamente usados de acordo com esses aspectos da invenção, incluem, mas sem limitação, agentes citotóxicos, (por exemplo, cisplatina, carboplatina, oxaliplatina, paclitaxel, melfalano, doxorrubicina, metotrexato, 5- fluoruracila, etoposídeo, meclorretamina, ciclofosfamida, bleomicina, caliqueamicina, maitansina, tricoteno, CC1065, cadeia A da difteria, cadeia A da exotoxina de Pseudomonas aeruginosa, cadeia A da ricina, cadeia A da abrina, cadeia A da modecina, alfa-sarcina, uma proteína de Aleuritesfordii, proteínas diantina, proteína de Phytolaca americana, inibidor de Mormodica charantia, curcina, crotina, inibidor de Sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina, tricotecenos, ribonucleases, e desorribonucleases), radioisótopos (tais como 211At, 131I, 125I, 90Y, 186Re, 188Re, 153Sm, 212Bi, 32P e isótopos radioativos de Lu) e enzimas ativadores de pró-fármaco (tais como fosfatase alcalina, arilsulfatase, citosina desaminase, proteases, D- alanilcarbóxi-peptidases, enzimas de clivagem de carboidrato, P- lactamase e penicilina amidase. Em certas modalidades, o um ou mais ligantes de ligação de integrina αvβ6 administrados ao paciente na forma de uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade eficaz de um ou mais dos ligantes de ligação de integrina αvβ6 e um ou mais veículos ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis. O um ou mais ligantes de ligação de integrina αvβ6 e/ou uma ou mais composições farmacêuticas compreendendo o um ou mais ligantes de integrina αvβ6 podem ser administrados ao paciente por qualquer modo adequado de administrar composições farmacêuticas, incluindo, mas sem limitação, administração oral, administração parenteral (incluindo, por exemplo, injeção através da por meio de intramuscular, intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal, ou subcutânea), administração intracraniana, administração transdérmica, administração intrapulmonar e administração intranasal.

[00055] Em modalidades adicionais, a presente invenção proporciona métodos para diagnosticar ou identificar um carcinoma, tal como um adenocarcinoma, que é mais provável de progredir para um carcinoma invasivo, e/ou que seja mais provável de responder ao tratamento com um ligante que se liga a uma ou mais subunidades de integrina αvβ6. Tais métodos adequados podem compreender, por exemplo, (a) obter de um paciente uma amostra de tecido epitelial canceroso compreendendo um tumor ou uma porção deste, e uma amostra de tecido epitelial não canceroso; (b) contatar as amostras de tecido com um ou mais ligantes que se ligam a uma ou mais subunidades de integrina αvβ6; e (c) determinar o nível de expressão da integrina αvβ6 nas amostras de tecido, em que um aumento no nível de expressão de integrina αvβ6 na amostra de tecido canceroso com relação ao nível de expressão de integrina αvβ6 na amostra de tecido não canceroso indica a presença no paciente de um carcinoma que: (a) tem uma probabilidade aumentada de progredir de uma forma in situ ou não invasiva, a uma forma metastática invasiva; e/ou (b) é mais provável de responder ao tratamento com um ou mais dos métodos de tratamento referenciados acima, que se baseiam na ligação de um ligante de ligação de αvβ6, particularmente um ligante de ligação de αvβ6 que é conjugado a ou que é administrado em conjunto com um ou mais compostos ou agentes citotóxicos, tais como aqueles descritos acima. Tais métodos são adequados para diagnosticar ou identificar uma variedade de carcinomas, incluindo, mas sem limitação, aqueles envolvendo os tecidos epiteliais citados acima. Em certas de tais modalidades, o ligante que se liga a uma ou mais subunidades de integrina αvβ6 é uma anticorpo de ligação de integrina αvβ6 (que pode ser um anticorpo monoclonal tal como aqueles descritos acima) ou um fragmento de ligação de epítopo αvβ6 deste. Particularmente adequados para uso em tais métodos de diagnóstico da invenção são ligantes de ligação de αvβ6 (por exemplo, anticorpos) que são detectavelmente marcados, isto é, que compreendem, são conjugados a, ou são ligados com pelo menos um rótulo detectável, tais como um rótulo cromogênico (por exemplo, diaminobenzidina ou ácido 4-hidroxiazobenzeno-2-carboxílico), um rótulo de enzima (por exemplo, malato desidrogenase, estafilococo nuclease, delta-5-esteróide isomerase, álcool de levedura desidrogenase, fosfato de alfa-glicerol desidrogenase, triose fosfato isomerase, peroxidase, fosfatase alcalina, asparaginase, glicose oxidase, β-galactosidase, ribonuclease, urease, catalase, glicose-6-fosfato desidrogenase, glicoamilase ou acetilcolina esterase), um rótulo radioisotópico (por exemplo, 3H, 111In, 125I, 131I, 32P, 35S, 14C, 51Cr, 57To, 58Co, 59Fe, 75Se, 152Eu, 90Y, 67Cu, 217Ci, 211At, 212Pb, 47Sc, e 109Pd), um rótulo isotópico não radiativo (por exemplo, 157Gd, 55Mn, 162Dy, 52Tr, 56Fe, 99mTc e 112In), um rótulo fluorescente (por exemplo, um rótulo 152Eu, um rótulo de fluoresceína, um rótulo de isotiocianato, um rótulo de rodamina, um rótulo de ficoeritrina, um rótulo de ficocianina, um rótulo aloficocianina, um rótulo de Proteína Fluorescente Verde (GFP), um rótulo de o-ftaldeído ou um rótulo de fluorescamina), um rótulo tóxico (por exemplo, um rótulo da toxina da difteria, um rótulo de ricina e um rótulo da toxina da cólera), um rótulo quimioluminescente (por exemplo, um rótulo de luminol, rótulo de isoluminol, rótulo de éster de acridínio aromático, rótulo de imidazol, rótulo de sal de acridínio, rótulo de éster de oxalato, rótulo de luciferina, rótulo de luciferase e rótulo de aequorina.um rótulo X- radiográfico (por exemplo, bário ou césio), um rótulo de spin (por exemplo, deutério) e um rótulo de agente de contraste de ressonância magnética nuclear (por exemplo, Gd, Mn e ferro).

[00056] Em modalidades adicionais, a invenção proporciona métodos para eliminar células tumorais metastáticas positivas para αvβ6 em um paciente, compreendendo administrar ao paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ou mais ligantes que se ligam a uma ou mais subunidades de integrina αvβ6 sobre uma ou mais células tumorais metastáticas positivas para αvβ6, em que a ligação do ligante à integrina resulta na morte, quimiossensibilização ou invasividade diminuída da célula tumoral metastática. Tais métodos são adequados para eliminar uma variedade de células tumorais metastáticas em um paciente, tais como aquelas produzidas de carcinomas metastáticos, incluindo, mas sem limitação, aquelas que envolvem tecidos os epiteliais citados acima. Modalidades adequadas de acordo com esse aspecto da invenção usam ligantes de ligação de integrina αvβ6, que são anticorpos de ligação de αvβ6 ou seus fragmentos de ligação de epítopo αvβ6, particularmente os anticorpos monoclonais, ou variantes ou fragmentos destes, descritos acima. Em certas modalidades terapêuticas da invenção, os ligantes de ligação de αvβ6 (por exemplo, anticorpos de ligação de αvβ6) são conjugados com ou ligados a um ou mais compostos ou agentes citotóxicos que levam a, ou causam, a morte da célula ou tecido mediante ligação do conjugado de ligante de ligação de αvβ6-composto tóxico a uma ou mais integrinas αvβ6 sobre a célula ou tecido. Em modalidades terapêuticas adicionais da invenção, os ligantes de ligação de αvβ6 (por exemplo, anticorpos de ligação de αvβ6) são administrados a um paciente em conjunto com um ou mais compostos ou agentes citotóxicos. Os compostos ou agentes citotóxicos que podem ser adequadamente usados de acordo com esses aspectos da invenção incluem, mas sem limitação, os agentes citotóxicos, radioisótopos e enzimas ativadoras de pró-fármaco descritos acima. De acordo com esse aspecto da invenção, o ligante de ligação de integrina αvβ6, ou uma composição farmacêutica compreendendo o ligante e um ou mais veículos ou excipientes farmacêuticos, pode ser administrada ao paciente de acordo com os modos de administração descritos acima.

[00057] Em modalidades adicionais, a invenção proporciona métodos para eliminar células tumorais positivas para αvβ6, residuais, de um paciente seguinte à excisão cirúrgica de um tumor de um tecido ou órgão do paciente, compreendendo administrar ao paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ou mais ligantes que se ligam a uma ou mais subunidades de integrina αvβ6 sobre uma ou mais células tumorais residuais no tecido ou órgão, em que a ligação do ligante à dita integrina resulta na morte, quimiossensibilidade ou invasividade diminuída da célula tumoral. Tais métodos são adequados para eliminar uma variedade de células tumorais metastáticas em uma variedade de tecidos do paciente, tais como aquelas produzidas de carcinomas, incluindo, mas sem limitação, aquelas envolvendo os tecidos epiteliais citados acima. Modalidades adequadas de acordo com esse aspecto da invenção usam ligantes de ligação de integrina αvβ6, que são anticorpos de ligação de αvβ6 ou fragmentos de ligação de epítopo αvβ6 destes, particularmente os anticorpos monoclonais, ou variantes ou fragmentos destes, descritos acima. Em certas de tais modalidades terapêuticas da invenção, os ligantes de ligação de αvβ6 (por exemplo, anticorpos de ligação de αvβ6) são conjugados com ou ligados a um ou mais compostos ou agentes citotóxicos que levam a, ou causam a morte da célula ou tecido mediante ligação do conjugado de ligante de ligação de αvβ6-composto tóxico a uma ou mais integrinas αvβ6 sobre a célula ou tecido. Os compostos ou agentes citotóxicos, que podem ser adequadamente usados de acordo com este aspecto da invenção incluem, mas sem limitação, os agentes citotóxicos, radioisótopos e enzimas ativadoras de pró-fármaco descritas acima.

[00058] Outras modalidades preferidas da presente invenção tornar- se-ão aparentes para aquele com conhecimento ordinário à luz dos seguintes desenhos e descrição da invenção, e das reivindicações.

Breve Descrição dos Desenhos

[00059] A figura 1 é um ensaio ELISA de ligação de variantes de 3G9 quimerizadas, purificadas para αvβ6. As placas revestidas com αvβ6 solúvel foram incubadas com ou hibridoma purificado derivado do anticorpo 3G9 murino, anticorpo 3G9 quimérico purificado (m3G9) (ch3G9), ou anticorpo 3G9 quimérico, purificado, contendo uma substituição de N para S dentro do sítio de glicosilação ligado a N na primeira CDR da cadeia leve (ch3G9S). Depois de lavar com tampão de lavagem, as placas foram incubadas com IgG anticamundongo conjugado com peróxido (para o material derivado de hibridoma) ou IgG antihumano (para os anticorpos quiméricos) seguido por lavagem com tampão de lavagem. As placas foram relveladas com solução de TMB, as reações foram interrompidas com ácido sulfúrico e ensaiadas com um leitor de placa em A450. Não houve diferença significante detectável entre as duas formas de anticorpo 3G9 quimérico.

[00060] A figura 2 exibe os resultados mostrando a expressão de variantes humanizadas de 3G9 de células 293E transfectadas usando o Ensaio Easy Titer (Pierce). Os sobrenadantes das células 293E transitoriamente transfectadas foram ensaiadas para título de anticorpo pelo método Easy Titer seguindo o protocolo do fabricante (Pierce). A expressão de diferentes variantes do anticorpo 3G9 humanizado foi analisada. As variantes de 3G9 contendo a versão 1 da cadeia leve são pobremente expressas, enquanto as variantes contendo a versão 2 da cadeia leve são expressas em altos níveis. Há uma tendência à expressão maior com humanização crescente.

[00061] A figura 3 mostra os resultados da análise de FACS das variantes do anticorpo hu-3G9 se ligando às células SW480 que expressam integrina αvβθ conforme determinação por ensaio de citometria de fluxo. Células SW480 foram colhidas por tripsinização, lavadas e ressuspensas em tampão de FACS. 2 x 105 células foram então incubadas sobre gelo por 1 hora em tampão de FACS contendo o sobrenadante transfectante, os títulos do qual foram determinados pelo métodos Easy Titer de acordo com o protocolo do fabricante (Pierce). Depois da incubação, as células foram lavadas com tampão de FACS e ressuspensas em tampão de FACS contendo IgG antihumano conjugado com ficoeritrina (Jackson ImmunoResearch) e incubadas em gelo por 30 minutos. As células foram então lavadas e ressuspensas em 200 μL de tampão de FACS. A ligação do anticorpo secundário marcado foi monitorada por citometria de fluxo. Todas as versões humanizadas testadas se ligaram às células SW480 pelo menos tão bem quanto 3G9 quimérico. Variantes contendo a versão 2 da cadeia leve excederam significantemente a atividade do 3G9 quimérico. O anticorpo Hu-BHA10 do receptor de anti-linfotoxina-beta serviu como controle negativo.

[00062] A figura 4 mostra a análise de FACS das versões 2-5 do anticorpo hu-3G9 que se ligam às células FDCP1-β6. A análise de FACS foi efetuada como descrito na figura 3 exceto que as células FDCP1-β6 foram usadas no lugar das células SW480. A versão 5 da variante inteiramente humanizada (H3/L5) se ligou melhor a FDCP1-β6 que outras versões de humanização.

[00063] A figura 5 exibe a análise de FACS das versões 2-5 do anticorpo hu-3G9 se ligando às células FDCP1-β6. A análise de FACS foi efetuada conforme descrita na figura 4, usando variantes de humanização de 3G9 purificado. A versão 5 de variante inteiramente humanizada (H3/L5) se ligou significantemente melhor à FDCP1-β6 que todas as outras versões humanizadas.

[00064] A figura 6 é um ensaio ELISA de ligação das versões 2-5 do anticorpo hu-3G9 purificado se ligando a αvβ6. O ELISA de ligação foi efetuado conforme descrito na figura 1. A versão 5 de 3G9 humanizada (H3/L5) parece se ligar a αvβ6 de modo ligeiramente melhor que os outros derivados do anticorpo.

[00065] A figura 7 é um ELISA de bloqueio das versões 2-5 do anticorpo hu-3G9 purificadas se ligando a αvβ. Placas foram revestidas com ou 0,3 μg/mL de LAP ou 2,5 μg da proteína de fusão LAP-Fc e incubadas a 4°C, durante a noite. A solução de revestimento foi removida e as placas foram bloqueadas, lavadas, e incubadas com uma mistura de αvβ6 biotinilado e os derivados de 3G9 conforme indicação na legenda da figura, em presença de cálcio e magnésio. A placa foi lavada novamente e incubada com conjugado de extravidina-raiz forte peroxidase (Sigma). Proteína ligada foi detectada usando-se substrato de TMB seguido por detecção em um leitor de placa a A450. A versão 5 de 3G9 humanizado (H3/L5) parece bloquear a ligação de αvβ6 ao LAP de modo ligeiramente melhor que outros derivados do anticorpo.

[00066] A figura 8 exibe os resultados de um ensaio de adesão celular das versões 2-5 do anticorpo hu-3G9. Placas de microtítulo foram revestidas com 50 μL/mL de LAP, a 4°C, durante a noite. As placas foram então lavadas e bloqueadas. Células FDCP1-β6 (5 x 106 células/mL) foram retiradas dos frascos de cultura, marcadas com corante fluorescente (Calceína-AM, Molecular Probes, Eugene, OR) e ressuspensas em um tampão de ensaio. As placas foram incubadas com os anticorpos purificados indicados acima, e as células FDCP1-β6 marcadas em presença de cálcio e magnésio. A placa foi lavada e a fluorescência devida às células capturadas na placa fora registradas. O percentual de ligação foi determinado por comparação da fluorescência das células totais com aquela das células ligadas. A versão 5 de 3G9 humanizado (H3/L5) parece bloquear a ligação de células que expressam αvβ6 ao LAP ligeiramente melhor que outros derivados do anticorpo.

[00067] A figura 9 é uma representação esquemática do mapa de plasmídio pKJS195 e a seqüência de cadeia leve da versão 5 de 3G9. Esse plasmídio contém a cadeia leve da versão 5 (LV5) de 3G9 e os genes de resistência à neomicina. O cassete de expressão de cadeia leve contém o promotor precoce imediato de CMV humano e o primeiro intron (contendo uma deleção pequena), bem como a seqüência de poliadenilação de hormônio de crescimento humano.

[00068] A figura 10 é uma representação esquemática do mapa de o plasmídio pKJS195 e a seqüência de cadeia pesada da versão 3 de 3G9. Esse plasmídio contém a cadeia pesada da versão 3 (HV3) de 3G9 e genes de desidrofolato redutase (dhfr). O cassete de expressão de cadeia pesada contém o promotor precoce imediato de CMV humano e primeiro intron (contendo uma pequena deleção), bem como a seqüência de poliadenilação de hormônio de crescimento humano. O cassete de expressão de dhfr contém o promotor precoce de SV40 e seqüência de poliadenilação de SV40.

[00069] A figura 11 é uma representação esquemática do mapa de o plasmídio pKJS196 e a seqüência de cadeia pesada da versão 3 de aglicosila-3G9. Esse plasmídio contém a cadeia pesada de versão 3 de aglicosila-3G9 (a-HV3) e genes dhfr. Essa construção é idêntica a pKJS189 exceto por uma substituição de N319Q que abole um sítio de glicosilação ligado a N na região constante da cadeia pesada.

[00070] A figura 12 mostra os resultados da montagem e expressão de hu-3G9 CHO transitoriamente transfectados em células CHO usando o Ensaio Easy Titer (Pierce). O ensaio Easy Titer foi efetuado como descrito na figura 2 de acordo com o protocolo do fabricante (Pierce). Vetores da versão 5 do 3G9 do tipo selvagem (H3/L5) e aglicosila-humanizado (a-H3- L5) foram transitoriamente transfectados em células CHO para demonstrar a montagem eficaz e secreção do 3G9 humanizado dessas células. Ambas as formas de anticorpos hu3G9 são igualmente montadas e expressas em células CHO.

[00071] A figura 13 é um compósito de fotomicrografias mostrando os níveis de expressão de αvβ6 (áreas escuras) em certos carcinomas humanos que metastatizaram para o linfonodo (figuras 13A-3D) ou para o pulmão (figuras 13E-13F), dos sítios tumorais primários indicados.

[00072] A figura 14 é um compósito de fotomicrografias mostrando os níveis de expressão de αvβ6 (áreas escuras) em certos carcinomas humanos que metastatizaram do sítio tumoral primário indicado para o sítio tumoral metastático indicado.

[00073] A figura 15 é um compósito de fotomicrografias mostrando os níveis de expressão de αvβ6 (áreas escuras) observados nos tumores de carcinoma do endométrio, primários (figuras 15A, 15C), e em metástases de linfonodos emparelhados (figuras 15B, 15D).

[00074] A figura 16 é um compósito de fotomicrografias mostrando os níveis de expressão de αvβ6 (áreas escuras) observados em amostras de tumor da mama humano. Figura 16A: expressão em amostra de tumor primário de paciente com carcinoma ductal in situ (DCIS). figura 16B: expressão em amostra de tumor primário de paciente com carcinoma da mama invasivo.

[00075] A figura 17 é um compósito de fotomicrografias mostrando os níveis de expressão de αvβ6 (áreas escuras) observados em amostras emparelhadas de tumores de adenocarcinoma ductal pancreático, primários e metastáticos, de três pacientes diferentes. figuras 17A-17C: expressão em amostras de tumor primário de três pacientes diferentes. As figuras 17D-17F: expressão em metástases de linfonodos emparelhados desses mesmos três pacientes. figuras 17G-17H: expressão em tecido pancreático normal obtido de dois dos três pacientes.

[00076] A figura 18 é um compósito de fotomicrografias mostrando os níveis de expressão de αvβ6 (áreas escuras) observados em amostradas emparelhadas de tumores de adenocarcinoma pancreático, primários e metastáticos, de cinco pacientes diferentes. figuras 18A-18E: expressão em amostras de tumor primário de cinco pacientes diferentes, três com tumores caracterizados como adenoescamosos (figuras 18A-18C), e dois com tumores caracterizados como fracamente diferenciados (figuras 18D- 18E). figuras 18F-18J: expressão em metástases de linfonodos emparelhados desses mesmo cinco pacientes. figuras 18K-18L: expressão em tecido pancreático normal, obtida de dois dos cinco pacientes.

[00077] A figura 19 demonstra a capacidade de um anticorpo monoclonal anti-αvβ6 (3G9) em inibir o crescimento de tumor no modelo de xenoenxerto de camundongo BxPC-3 de câncer pancreático humano. Figura 19A: fotomicrografia de uma seção do tumor de xenoenxerto colorido por meio de imunoistoquímica com um anticorpo monoclonal anti- avβ6 (3G9). Figura 19B: curvas de crescimento do tumor de xenoenxerto BxPC-3 durante o tratamento com αvβ6 mAB 3G9 (▲), proteína de fusão TGFbRII-Fc-Ig (▼), ou veículo de PBS (■). Figura 19C: plotagem de dispersão dos tamanhos de tumores individuais no fim do estudo (dia 66).

[00078] Figura 20 é uma série de gráficos em barras demonstrando os efeitos de um anticorpo monoclonal anti-αvβ6 (3G9), e de um conjugado solúvel de receptor de TGF-β-fragmento de anticorpo (sTGF-βRII-Fc), sobre migração de transmatriz, invasão e produção da metaloproteinase 9 da matriz (MMP9) por células VB6 expressando β6 (transfectadas com β6) e células transfectadas mock. Figuras 20A e 20B: migração (figura 20A) ou invasão (figura 20B) de células através da matriz celular. "Unt": células não tratadas; "3G9": células tratadas com 10 μg/mL de anticorpo monoclonal anti-αvβ6 3G9; "sTGFbR-Fc": células tratadas com 10 μg/mL de conjugado solúvel de TGF-βRII-Fc. Barras abertas: células transfectadas com e expressando integrina β6 (células VB6); barras fechadas: células transfectadas mock não expressando integrina β6 (células C1). Figura 20C: produção de MMP9 (ng/mL) por células C1 ou VB6 que eram não tratadas (barras abertas), tratadas com 10 μg/mL de 3G9 (barras hachuradas) ou tratadas com 10 μg/mL do conjugado de sTGF-βRII-Fc (barras fechadas).

[00079] A figura 21 é uma fotomicrografia de uma seção imunoistoquímica demonstrando a expressão de αvβ6 (áreas escuras) em células tumorais invadindo o estroma em um modelo de xenoenxerto de LIM1863. Coloração com queratina anti-humana sobre diversas seções (não mostradas) confirmou que essas células eram derivadas de tumor (isto é LIM1863) epitelial humano.

[00080] As figuras 22A-22F mostram os efeitos de αvβ6 mAb 3G9 e proteína de fusão, solúvel, recombinante TGFbRII-Fc-Ig no crescimento de tumor e invasão estromal no modelo de tumor de xenoenxerto LIM1863. Figura 22: curvas de crescimento de tumor de xenoenxerto LIM1863 durante o tratamento com αvβ6 mAB 3G9 (▲), proteína de fusão TGFvRII- Fc-Ig solúvel (▼), ou veículo de PBS (■). Figura 22CB: plotagem de dispersão dos tamanhos de tumores individuais no fim do estudo (dia 52). Figura 22C: quantificação de áreas positivas para αvβ6 através das seções do tumor inteiro. Figuras 22D-22F: fotomicrografias mostrando a coloração representativa de αvβ6 tumores colhidos de cada grupo de tratamento indicado.

[00081] Figuras 23A-23D são histogramas de análises classificadoras de células ativadas com fluorescência (FACS) de várias linhagens de células tratadas com 3G9 mAB murino ou um mAb de controle, e demonstrando o nível de ligação de m3G9 a linhagens de células NHP expressando αvβ6 (A, Vero; B, LLC-MK2; C, 12MBr6; D, 4MBr5).

[00082] As figuras 24A-24B são curvas de titulação demonstrando o nível de ligação de 3G9 murino às linhagens de células NHP expressando avβ6; B. 4MBr5).

[00083] A figura 25 é um gráfico de barras demonstrando a adesão das linhagens de células NHP que expressam αvβ6 ao LAP (A, 12MBr6; B 4MBr5).

[00084] As figuras 26A-26B são curvas de titulação demonstrando a inibição por m3G9 de adesão de linhagens de células NHP expressando αvβ6 ao LAP (A, 12MBr6; B, 4MBr5).

[00085] A figura 27 é um gráfico de barras demonstrando a ativação de TGFβ latente por linhas de células humanas e primatas expressando αvβ6.

[00086] A figura 28 é uma curva demonstrando a inibição da ativação de TGFβ por m3G9 sobre linhagens de células SW480β6 e 4MBr5.

[00087] A figura 29 é uma série de fotomicrografias demonstrando a imunocoloração de αvβ6 em doença renal humana. (A) Seções de rim humano congelado imunocoloridas com um αvβ6 mAb (vermelho) e uma mAb de pan-citoqueratina (verde). (B) Seções de rim humano embutidas em parafina imunocoloridas com um αvβ mAb.

[00088] A figura 30 demonstra a imunocoloração de αvβ6 de rins de camundongos Col4A3 +/- e Col4A3 -/-. Figura 30A: fotomicrografia de seções de rim congeladas secas de de camundongos ColA4A3 +/- com 7 semanas de idade e camundongos Col4A3 -/- imunocoloridas com um avβ6 mAb (vermelho) e um mAb de pan-citoqueratina (verde). Figura 30B: Seções de rim embutidas em parafina de camundongos Col4A3 +/- e Col4A3 -/-, com 4 e 8 semanas de idade, imunocoloridas com um αvβ6 mAb. Figura 30C: gráfico de barras demonstrando a quantificação de imunocoloração de αvβ6 em rins de camundongos Col4A3 +/- e Col4A3 - /- com 4, 7 e 8 semanas de idade (n=3).

[00089] A figura 31 demonstra a especificidade da ligação de αvβ6 mAb. Figura 31A: Análise de citometria de fluxo de αvβ6 mAbs (3G9, 8G6, 8B3), mAb anti-av (RMV-7), mAbs de controle negativo (1E6 e MOPC21), e controle de isótipo (IgG1de rato) ligando às células NIH3T3 e NIH3T3b6. Figura 31B: imunocoloração de seções de rim Col4A3 -/- e Col4A3-/-; β6- /- com mAb anti-avβ6 (3G9 humano/quimérico). Figura 31C: imunocolora- ção de seções de rim Col4A3 -/- e Col4A3-/-; β6-/- com anticorpo policlonal anti-av.

[00090] Figura 32 demonstra a imunocoloração de SMA em rins Col4A3 -/- com vários tratamentos. Figura 32A: imunocoloração de SMA (vermelho) e laminina (verde) em rins em mostrada para camundongos Col4A3 -/- tratados, com 3 a 8,5 semanas de idade e camundongos Col4A3+/- com idades não emparelhadas, não tratados. É mostrada a imunocoloração (córtex e medula) de uma seção representativa para cada grupo de tratamento (n = 8 para cada grupo). Figuras 32B e 32C: quantificação de SMA em rins de camundongos Col4A3+/- não tratados e camundongos Col4A3-/- tratados com vários agentes de 3 a 7 semanas de idade ou de 3 a 8,5 semanas de idade. É mostrado o percentual de imunocolaração positiva para córtex (32B) e medula (32C) com relação ao tamanho total da imagem. Valor de N para cada grupo de tratamento designado na plotagem de dispersão (* - p<0,01, ** = p<0,05, *** = p<0,001 comparando os grupos de tratamento para mAb de controle negativo, 1E6, de controle negativo, tratados).

[00091] As figuras 33A e 33B são plotagens de dispersão representando análise Taqman de níveis de mRNA de colágeno 1a1 (figura 33A), e colágeno 1a2 (figura 33B). RNA foi isolado de rins de camundongos COL4A3-/-, não tratados, ou tratados, com 7 semanas de idade, e camundongos Col4A3+/- não tratados com 7 semanas de idade.

[00092] A figura 34 é um par de plotagens de dispersão demonstrando imunocoloração por SMA de rins Col4A3-/- com tratamento retardado com mAb. Camundongos Col4A3+/-, 8,5 semanas, não tratados; Col4A3-/-, 6 semanas, não tratados; Col4A3-/- de 8,5 semanas, não tratados; e Col4A3-/- de 8,5 semanas, tratados com 1E6 e 3G9, 6 semanas a 8,5 semanas. Os valores de N designados na plotagem de dispersão. * = p<0,006, comparando ao controle negativo 1E6, camundongos Col4A3- /-, tratados. ** = p<0,02 comparando tratamento a camundongos Col4A3-/-, 6 semanas, não tratados.

[00093] A figura 35 mostra os Padrões de expressão gênica e modulação nos rins de camundongos Col4A3-/-, 7 semanas de idade. São mostrados 395 probesets (conjuntos de sonda molecular) da GeneChip selecionados para variação de 2 vezes ou mais entre os grupos do tipo selvagem (WT) e Alport (UN), não tratados, em p<0,01. As colunas dos padrões de exibição do mapa de calor dos níveis de expressão gênica para grupos experimentais individuais. Cada coluna representa 395 valores de intensidade de sinais dos conjuntos de sonda normalizados para um único grupo experimental de cinco camundongos. Alterações na expressão gênica através das condições experimentais são refletidas na variação de cor conforme mostrado pelo Colorbar. Um clustering hierárquico bidimensional foi realizado para explorar as relações (mostradas pelo dendograma) entre os grupos experimentais.

[00094] As figuras 36A-36DD são gráficos de barras demonstrando a anotação funcional de genes dependentes de αvβ6 associados à doença renal em rins Col4A3-/-. Análise de Percursos de Ingenuidade (IPA) foi realizada separadamente nas listas de conjuntos de sonda correspondentes aos genes superexpressos ou subexpressos nos rins de Alport em comparação com o tipo selvagem. As listas usadas para IPA foram subconjuntos dos 395 conjuntos de sonda originalmente selecionados quanto à variação significante (>2 vezes, p<0,01) entre os grupos Alport e tipo selvagem. Mostradas, em ordem de classificação, estão as listas de funções biológicas (A,C) e percursos canônicos (B,D) associados aos genes superexpressos (A,B) e infra-modulados (C,D) nos rins de Alport de camundongo com 7 semanas de idade.

[00095] As figuras 37A-37C são representações esquemáticas de análise de subconjunto e de rede de genes diferencialmente expressos em rins Col4A3-/- e modulados por tratamento de bloqueio com αvβ6 mAb. Figura 37A: Diagrama de Venn das listas de conjuntos de sonda. As áreas dos círculos de Venn, suas uniões, e interseções são proporcionais aos números de conjuntos de sonda nas listas correspondentes. Figuras 37 B, 37C: As redes reguladores de maior escore inferidas das listas de conjuntos de sonda (>variação de 2 vezes entre rins Alport tratados e naive, p<0,05) afetados pelos mAbs 3G9 bloqueadores de αvβ6 (figura 37B) e 8G6 (figura 37c). As extremidades das redes mostram direções de interações entre os genes mostrados como os nodos e dispostos de acordo com sua localização celular.

[00096] Figura 38 mostra a análise imunoistoquímica e Taqman da expressão de TGF-β1. Coloração mostrada para uma seção representativa de cada grupo de tratamento. Figura 38A: Seções de rim de camundongos Col4A3+/- e Col4A3-/- tratados com agentes indicados imunocoloridos para expressão de TGF-β1. Figura 38B: Análise Taqman de níveis de mRNA de TGF-β1 nos grupos de tratamento.

[00097] A figura 39 mostra coloração Tricrômica para expressão de colágeno em rins. Coloração em camundongos, 10 semanas de idade, Col4A3+/+;β6+/+, Col4A3-/-;β6+/+, e Col4A3-/-;β6-/-. Seções teciduais representativas são mostradas para regiões do córtex (figura 39A) e medulares (figura 39B) dos rins.

[00098] Figuras 40A e 40B são plotagens de dispersão que mostram imunocoloração de SMA com titulação de dose do tratamento com 3G9. A análise quantitativa de imunocoloração de SMA é mostrada para regiões glomerulares (córtex) (figura 40A), e intersticiais (medula) (figura 40B) de rins depois do tratamento com doses designadas de mu3G9, ou 10 mg/kg de mu1E6 (controle de IgG), 3 vezes por semana, de 3 a 7 semanas de idade. ED50 para córtex = 0,4 mg/kg; ED50 para medula = 0,3 mg/kg. As linhas horizontais representam os valores médios.

[00099] A figura 41 é uma série de fotomicrografias demonstrando a análise imunoistoquímica de expressão de αvβ6 em rim normal e rim depois de UUO. Figura 41A: Rim, não lesionado, normal; figura 41B: 7 dias depois de UUO; figura 41C: 10 dias depois de UUO; figura 41D: 14 dias depois de UUO.

[000100] A figura 42 é uma série de fotomicrografias demonstrando que a supra-regulação de αvβ6 ocorre em 18 semanas pós-radiação. Camundongos C57BL/6 irradiados com 14 Gy foram sacrificados em pontos de tempo indicados e seções de pulmão coloridas com o anticorpo anti-β6.

[000101] A figura 43 é um par de fotomicrografias demonstrando que a expressão de αvβ6 supra-regulada persiste em áreas de fibrose. Seções de pulmão foram coloridas para expressão de β6 como na figura 1. As seções eram de camundongos sacrificados nas 24 semanas (esquerda) ou 27 semanas (direita) depois da irradiação com 14 Gy. Ambas as seções mostram lesões fibróticas com numerosas células epiteliais expressando altos níveis de αvβ6. No epitélio não fibrótico adjacente, a expressão de αvβ6 permanece alta nas 24 semanas, mas é muito menos evidente pelas 27 semanas.

[000102] A figura 44 é uma série de fotomicrografias demonstrando que camundongos Itgb6-/- são protegidos da fibrose pulmonar induzida por radiação. Camundongos Itgb6+/+ e Itgb6-/- (base C57BL/6) foram expostos à radiação torácica de 14 Gy. Depois de 27 semanas, os camundongos foram sacrificados e os pulmões esquerdos foram coloridos com tricromo de Masson. Pulmões representativos são mostrados; no total, 21/23 camundongos Itgb6+/+ tinham fibrose evidente, enquanto nenhum dos 17 camundongos Itgb6-/- tinham fibrose.

[000103] A figura 45 é um gráfico de barras demonstrando que os camundongos Itgb6-/- são protegidos de fibrose pulmonar induzida por radiação, conforme medição por hidroxiprolina. O teor de colágeno nos pulmões Itgb6+/+ irradiados é significantemente maior que aquele dos pulmões Itgb6+/+ não irradiados e de pulmões Itgb6-/- irradiados e não irradiados (p<0,03 versus Itgb6+/+ irradiado, N = 5-6 para cada grupo).

[000104] A figura 46 é um gráfico de linhas demonstrando que a ausência de integrina αvβ6 não afeta a sobrevivência depois da irradiação do pulmão. Grupos de camundongos Itgb6+/+ e Itgb6-/- foram irradiados com 14 Gy. Curvas de sobrevivência para os dois grupos não diferem significantemente (WT = Itgb6+/+, KO = Itgb6-/-).

[000105] A figura 47 é uma plotagem de dispersão mostrando as medições da fibrose pulmonar em camundongos recebendo 3G9, TGFβR solúvel ou Ab IP de controle sacrificados 27 semanas pós-irradiação. Fibrose pulmonar é prevenida nos camundongos que estavam recebendo 1 mg/kg/semana de 3G9. Cada ponto representa um camundongo individual, as barras representam as médias. Não houve diferença na fibrose entre o grupo de 0,3 mg/kg e o grupo de controle. O grupo de 1 mg/kg apresentou fibrose significantemente menor que os controles. Os grupos de 10 mg/kg e de receptor de TGFβ solúvel apresentaram menos fibrose, mas as diferenças de controle não foram significantes.

[000106] A figura 48 é uma plotagem de dispersão mostrando as medições de fibrose pulmonar em todos os camundongos (camundongos sacrificados, camundongos moribundos, e camundongos encontrados mortos de 20 a 26 semanas pós-irradiação) que estavam recebendo 3G9, TGFβR ou Ab IP de controle. Os dados são apresentados como na figura 47. Não houve diferença na fibrose entre os camundongos de 0,3 mg/kg e o grupo de controle. Os grupos de 1 mg/kg, 10 mg/kg, e de receptor de TGFβ tinham significantemente menos fibrose que os controles.

[000107] A figura 49 é um gráfico de barras mostrando as contagens diferenciais de células do BAL de camundongos que estavam recebendo 3G9, TGFβR solúvel ou Ab IP de controle sacrificados 26 semanas pós- irradiação.

[000108] A figura 50 é um gráfico de linhas demonstrando que os camundongos irradiados com 14 Gy, que estavam recebendo injeções de anticorpo 3G9 IP tiveram sobrevivência similar à do controle. A análise de sobrevivência foi realizada em todos os grupos como uma análise compósita (p = 0,088, C = controle, 0,3 = 0,3 mg/kg, 1 = 1 mg/kg, SoIR = receptor de TGFβ solúvel, 10 = 10 mg/kg.

[000109] A figura 51 é um gráfico de barras mostrando medições de fibrose em camundongos tratados com 3G9 (1, 3, 6, ou 10 mg/kg), semanalmente, SC. São mostrados resultados separados para todos os camundongos (camundongos encontrados mortos/moribundos e sacrificados), camundongos sacrificados em 28 ou 32 semanas, e camundongos encontrados mortos/moribundos. Fibrose significantemente aumentada está presente nos controles em comparação com todos os grupos de anticorpos (p<0,05 para todas as doses versus controles).

[000110] A figura 52 é um gráfico de barras mostrando contagens diferenciais de células do BAL de camundongos que estavam recebendo 3G9 ou Ab de controle, SC, sacrificados 28 ou 32 semanas pós-irradiação. Doses de 3G9 de 3, 6 e 10 mg/kg resultam em percentagens significantemente aumentadas de ambos os neutrófilos e linfócitos (p<0,05 para todas as comparações).

[000111] A figura 53 é uma série de fotomicrografias mostrando a Aparência das células do BAL em camundongos de controle versus os tratados com 3G9. Macrófagos alveolares normais são vistos em citospina de controle. As células do BAL dos camundongos tratados com 1 mg/kg de 3G9 são similares aos controles. Em uma dose de 3 mg/kg, numerosos macrófagos espumosos grandes se tornaram evidentes. (Macrófagos similares são vistos em camundongos Itgb6-/-). Em doses maiores (6 mg/kg e, mostradas aqui, 10 mg/kg), aumentaram os números de neutrófilos (pontas das setas) e linfócitos são evidentes, bem como alguns fragmentos celulares.

[000112] A figura 54 é um gráfico de linhas mostrando curvas de sobrevivência de Kaplan-Meier para coorte de camundongos sacrificados 28 semanas pós-irradiação.

[000113] A figura 55 é um gráfico de linhas mostrando as curvas de sobrevivências de Kaplan-Meier para coorte de camundongos sacrificados 32 semanas pós-irradiação.

[000114] A figura 56 é um gráfico de barras demonstrando que a razão em massa de RV/LV é aumentada nos camundongos que morreram entre 29-32 semanas pós-irradiação, em comparação com os camundongos que sobreviveram às 32 semanas pós-irradiação. Os corações dos camundongos foram fixados em formalina. O ventrículo direito (RV) foi dissecado para separação do ventrículo esquerdo mais septo (LV), e os tecidos foram pesados. Sete camundongos não irradiados da mesma linhagem foram usados como controles. As barras representam médias +/- DESVIO PADRÃO. Os dados para os camundongos irradiados são mostrados para todos os camundongos (tratados com anticorpo de controle 1E6 ou com qualquer dose de 3G9), camundongos tratados com anticorpo de controle 1E6, e camundongos tratados com qualquer dose de 3G9. Os números de camundongos foram como a seguir: camundongos não irradiados, N = 7; camundongos tratados com 1E6; sobreviveram N = 10, morreram N = 5; camundongos tratados com 3G9: sobreviveram, N = 8, morreram N = 9. A razão de RV/LV não foi significantemente diferente de controles não irradiados em camundongos que sobreviveram. Em contraste, a razão de RV/LV foi significantemente aumentada em camundongos que morreram (todos os camundongos e os subconjuntos de 1E6 e 3G9) em comparação com os camundongos não irradiados (P<0,02). Também, a razão de RV/LV foi significantemente aumentada nos camundongos que morreram (todos os camundongos e os subconjuntos 1E6 e 3G9) em comparação com os grupos de camundongos equivalentes que sobreviveram (P<0,007).

[000115] A figura 57 é um par de fotomicrografias mostrando pulmões de camundongos encontrados mortos que haviam sido tratados com anticorpo de controle (1E6), esquerda, ou com o anticorpo anti-αvβ6 (3G9, 1 mg/kg/semana), direita. Observem áreas periféricas com ausências de eritrócitos nas paredes alveolares. Essa aparência é consistente com a perda de perfusão.

[000116] A figura 58 é uma série de fotomicrografias mostrando a expressão de αvβ6 em doença pulmonar humana, demonstrando que a expressão de αvβ6 é fortemente supra-regulada em doença pulmonar humana. Seções de tecido em parafina de pulmão humano e de camundongo foram imunocoloridas com anticorpo específico de αvβ6 para visualizar níveis relativos de expressão em pulmão normal (figura 58A) e doente: Fibrose pulmonar idiopática (figura 58B), doença pulmonar intersticial difusa (figura 58C) e doença pulmonar intersticial difusa (figura 58D). A coloração é representativa do nível de supra-regulação nas quarenta e uma amostras de pacientes diferentes mostradas abaixo na Tabela 16/1 (Exemplo 16).

[000117] A figura 59 é uma série de fotomicrografias mostrando que a expressão de αvβ6 é o modelo de fibrose pulmonar por bleomicina, demonstrando que a expressão de αvβ6 é fortemente supra-regulada no modelo de camundongo de fibrose pulmonar induzida por bleomicina. As seções de tecidos em parafina do pulmão do camundongo foram imunocoloridas com um anticorpo específico de αvβ6 para visualizar níveis relativos de expressão em pulmão instilado com bleomicina.

[000118] A figura 60 é uma série de gráficos de barras mostrando o efeito do tratamento com mu3G9 no teor de hidroxiprolina pulmonar em camundongos SV129 tratados com bleomicina. Cada camundongo recebeu 4 mg/kg de mu3G9 (bloqueador de αvβ6 mAb), 1E6 (IgG1 de controle) nos três primeiros experimentos mostrados para os vários períodos de tratamentos listados. No quarto período, cada camundongo recebeu PBS, 4 mg/kg de mu3G9 (bloqueador de αvβ6 mAb), 4B4 (não bloqueador de αvβ6 mAb), ou 8G6 (um segundo bloqueador de αvβ6 mAb), três vezes por semana, por 15 a 60 dias depois do tratamento com bleomicina. Barras de erros representam erros padrão. Desvios médios de padrão dos grupos são fornecidos no Apêndice A do Exemplo 16.

[000119] A figura 61 é uma série de gráficos de barras mostrando o efeito do tratamento com mu3G9 no teor de colágeno (histomorfometria) em camundongos C57B16 tratados com bleomicina. Os camundongos receberam 3 doses por semana de mu3G9 (bloqueador de αvβ6 mAb), 8G6 (um segundo bloqueador de αvβ6 mAb), 1E6 (mAb IgI de controle) ou sTGFbR (receptor de TGF-β solúvel - controle positivo para inibição de TGF-β). Nos três primeiros experimentos mostrados (figuras 61A, 61B e 61C), os camundongos foram tratados começando no dia 1 antes do desafio com bleomicina e foram eutanizados no dia 14. Nos dois primeiros experimentos (figuras 61 e 61B), doses de cada agente foram de 4 mg/kg, enquanto no terceiro experimento (figura 61C) a dose de mu3G9 foi variada conforme mostrado. No experimento final (figura 61D), os camundongos foram tratados começando nos 14 dias depois do desafio com bleomicina e foram eutanizados no dia 28. Seções histológicas foram coloridas com tricromo, imageadas, e a área do tecido colorido de azul (contendo colágeno) foi calculada como a percentagem da área total do tecido usando o software Metamorph. Barras de erros representam erros padrão. Médias e desvios padrão dos grupos são fornecidos no Apêndice B do Exemplo 16. * = significantemente diferente do grupo tratado com PBS por ANOVA.

[000120] A figura 62 é um gráfico de barras mostrando mu3G9 na fibrose pulmonar por bleomicina usando camundongos repórter de colágeno. Bleomicina foi instilada intratraquealmente nos camundongos repórter de colágeno-luciferase. Os camundongos foram tratados, começando no dia antes da lesão com bleomicina, uma vez na semana por duas semanas com PBS, 5 mg/kg de TGF-bRIII-Ig solúvel, ou mu3G9 em doses de 0,1, 0,3, 1,0, 3 e 10 mg/kg. Um grupo adicional de camundongos tratados 3 vezes na semana com 4 mg/kg de mu3G9 foi também incluído (3X 4 mg/kg). Camundongos Sham foram instilados com solução salina intratraqueal e tratados com PBS. O teor de luciferase no pulmão ensaiado no dia 14. Barras de erros representam erros padrão. Médias e desvios padrão dos grupos são fornecidos no Apêndice C do Exemplo 16. * = significantemente diferente do grupo tratado com PBS por ANOVA.

[000121] A figura 63 é uma série de gráficos de linhas mostrando o curso de tempo para avaliar o efeito de doses eficazes baixas de mu3G9 nas populações de células principais do BAL em camundongos desafiados com bleomicina. Os camundongos foram instilados com bleomicina nos pulmões no dia 0. Os camundongos foram tratados com PBS, mu3G9 em doses de 0,3, 1,0 e 3,0 mg/kg ou IgGI de controle (1E6) em uma dose de 1,0 mg/kg nos dias -1 e +6. Os camundongos foram sacrificados nos dias 2, 5, 8 e 11 e os pulmões foram coletados e avaliados para contagens de células totais do BAL. As populações de macrófagos, neutrófilos e linfócitos foram analisadas por coloração diferencial de citospinas. As médias e os desvios padrão dos grupos são fornecidos no Apêndice C do Exemplo 16.

[000122] A figura 64 é uma série de gráficos de barras mostrando o efeito de altas doses de mu3G9 nas populações de células principais do BAL em camundongos desafiados com bleomicina. Os camundongos foram instilados com bleomicina nos pulmões no dia 0. Os camundongos foram tratados com PBS, mu3G9 em doses de 4, 20 e 40 mg/kg ou IgG1 mAb de controle (1E6) em doses de 20 e 40 mg/kg nos dias -1, +1 e +3. Os camundongos foram sacrificados no dia 5, e os pulmões foram coletados e avaliados para as contagens totais de células do BAL. Populações de macrófagos, neutrófilos e linfócitos foram analisadas por coloração diferencial de citospinas. As médias e desvios padrão dos grupos são fornecidos no Apêndice C do Exemplo 16. * = p<0,05 relativo aos controles desafiados com bleomicina, tratados com PBS, mas não relativo aos controles tratados com 1E6, IgG1 mAb.

[000123] A figura 65 mostra a falta de eficácia de mu3G9 em um modelo de bleomicina de doses múltiplas em hamsters. Os hamsters foram instilados com bleomicina (BL) ou solução salina (SA) nos pulmões nos dias 0, 7 e 14. Os hamsters foram tratados com PBS, mu3G9 (Ab1), ou IgG1 de controle (1E6) começando no dia 0. Grupos adicionais foram tratados com mu3G9 no dia 7 (Ab2) ou no dia 14 (Ab3). Todos os anticorpos foram administrados três vezes por semana em uma dose de 5 mg/kg. Os hamsters que sobreviveram foram sacrificados no dia 28 e os pulmões foram coletados e avaliados quanto ao teor de hidroxiprolina (figura 65AA) e peroxidação lipídica (figura 65B). Barras de erros representam erros padrão. A sobrevivência dos hamsters através do estudo de blemomicina em doses múltiplas (figura 65C). Não foi observada diferença significante na sobrevivência dos hamsters tratados com mu3G9 em comparação com grupos de controle tratados com PBS ou IgG. Os desvios médios e padrão dos grupos estão mostrados no Apêndice C do Exemplo 16.

[000124] A figura 66 mostra os perfis de intensidades de sinais normalizados para os genes identificados como significantemente afetados pelos tratamentos experimentais. Os camundongos tratados com 5 mg/kg de sTGFbRII-Ig (sR) ou com PBS ou com mu3G9 nas doses especificadas entre 0,3 e 30 mg/kg nos dias 1, 8, 15 e 22 e foram eutanizados no dia 29 (sem período de recuperação) ou no dia 78 (período de recuperação de 7 semanas). RNA foi preparado dos pulmões dos camundongos tratados e os transcritos analisados.

[000125] A figura 67 mostra os perfis da expressão de gene para os genes mostrando uma tendência ascendente em 3 mg/kg de 3G9 no grupo de tratamento. Os camundongos foram tratados com 5 mg/kg de sTGFbRII-Ig (sR) ou com PBS ou com mu3G9 nas doses especificadas entre 0,3 e 30 mg/kg nos dias 1, 8, 15 e 22 e foram eutanizados no dia 29 (sem período de recuperação) ou no dia 28 com um período de recuperação de 7 semanas). RNA foi preparado dos pulmões dos camundongos tratados e os transcritos analisados.

[000126] A figura 68 é um par de gráficos de barras mostrando a anotação de IPA de genes significantemente afetados por mu3G9.

[000127] As figuras 69A e 69 B são mapas de redes mostrando esquematicamente as redes reguladoras que são afetadas por mu3G9 no pulmão do camundongo.

[000128] A figura 70 é um gráfico de barras mostrando a resposta de dose do transcrito MMP-12 ao tratamento com mu3G9.

[000129] A figura 71 é uma série de plotagens de dispersão de níveis de proteínas no fluido do BAL em camundongos normais e irradiados.

[000130] A figura 72 é uma série de plotagens de dispersão mostrando as proteínas que são supra-reguladas por fibrose induzida por radiação e que são sub-reguladas por tratamento com mu3G9 em 28 semanas. Descrição Detalhada da Invenção

[000131] A menos que definido de outra forma aqui, todos os termos científicos e técnicos usados aqui têm os mesmos significados como comumente entendidos por aquele com versado na técnica à qual esta invenção pertence. Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos aqui possam ser usados na prática ou testes da presente invenção, os métodos e materiais preferidos são descritos abaixo. Exemplos de métodos e materiais são descritos abaixo, embora métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos aqui possam também ser usados na prática da presente invenção. Todas as publicações e outras referências mencionadas aqui estão incorporadas a título de referência em sua totalidade. Em caso de conflito, o presente relatório descritivo, incluindo definições, controlará. Os materiais, métodos, e exemplos são somente ilustrativos e não pretendem ser limitativos. Em todo este relatório descritivo, a palavra "compreender" ou variações tais como "compreende" ou "compreendendo" serão entendidas como incluindo um número inteiro estabelecido ou grupo de números inteiros, mas não excluindo qualquer outro número inteiro ou grupo de números inteiros.

Definições

[000132] Cerca de: Como usado aqui, quando em referência a qualquer valor numérico, o termo "cerca de" significa um valor de ±10% do valor estabelecido (por exemplo, "cerca de 50°C" engloba uma faixa de temperaturas de 45°C a 55°C, inclusive; similarmente, "cerca de 100mM" engloba uma faixa de concentrações de 90mM a 110mM, inclusive).

[000133] Antagonista: Como usado aqui, o termo "antagonista" refere- se a um composto, molécula, porção ou complexo que reduz, substancialmente reduz ou inibe completamente os efeitos biológicos e/ou fisiológicos da integrina αvβ6 em uma célula, tecido ou organismo. Antagonistas, que podem ser ligantes para αvβ6, podem realizar tais efeitos em uma variedade de modos, incluindo, mas sem limitação, competir com um outro ligante por ligação a αvβ6 sobre a superfície da célula, interagir com αvβ6 de tal modo a reduzir, reduzir substancialmente ou inibir a capacidade da integrina de se ligar a outros ligantes; ligar-se a e induzir uma alateração conformacional em αvβ6 da superfície celular, de modo que a integrina assume uma estrutura à qual outros ligantes não mais podem se ligar (ou podem ser ligar somente com afinidade/ou eficácia reduzida ou substancialmente reduzida); induzir uma alteração fisiológica (por exemplo, aumento dos complexos sinalizadores intracelulares; aumento dos inibidores transcricionais; redução da expressão de αvβe na superfície celular; etc.) em células, tecidos ou organismos de modo que a ligação de outros ligantes ou o sinal fisiológico induzido por tais ligantes mediante ligação à αvββ na células, é reduzido, reduzido substancialmente ou inibido completamente; e outros mecanismos pelos quais antagonistas podem efetuar suas atividades, que serão familiares àquele versado na técnica. Como àquele versado na técnica entenderá, um antagonista pode ser uma estrutura similar a uma outra porção de ligação de αvββ (por exemplo, um ligante de ligação de αvβ6) que antagoniza (por exemplo, o antagonista pode ser uma muteína, variante, fragmento ou derivado do agonista), ou pode ter uma estrutura integralmente não relacionada.

[000134] Ligado: Como usado aqui, o termo "ligado" refere-se à ligação ou união que pode ser covalente, por exemplo, por acoplamento químico, ou não covalente, por exemplo, interações iônicas, interações hidrofóbicas, pontes de hidrogênio, etc. Ligações covalentes podem ser, por exemplo, éster, éter, fosfoéster, tioéster, tioéter, uretano, amida, amina, peptídeo, imida, hidrazona, hidrazida, ligações carbono-enxofre, ligações carbono-fósforo, e similares. O termo "ligado" é mais amplo e inclui termos tais como "acoplado", "conjugado" e "unido".

[000135] Conjugado/conjugação: Como usado aqui, "conjugado" refere- se ao produto de ligação covalente de uma porção, por exemplo, uma substância química ou radioisótopo, a um ligante que se liga a αvβ6, um anticorpo que se liga a αvβ6 ou fragmento deste. "Conjugação" refere-se à formação de um conjugado como definido na sentença anterior. Qualquer método usado normalmente por aqueles versados na técnica de conjugação de substância química ou radioisótopos para materiais biologicamente ativos, tais como proteínas ou polipeptídeos (incluindo anticorpos), pode ser usado na presente invenção.

[000136] Doença, distúrbio, condição: Como usados aqui, os termos "doença" ou "distúrbio" referem-se a qualquer condição de um ser humano ou animal incluindo tumores, câncer, alergias, vícios, auto-imunidade, infecção, envenenamento ou comprometimento da função mental ou corporal. "Condições", como usado aqui, inclui doenças e distúrbios, mas também se refere aos estados fisiológicos. Por exemplo, fertilidade é um estado fisiológico, mas não uma doença ou distúrbio. As composições da invenção adequadas para prevenir gravidez por reduzir a fertilidade seriam, portanto, descritas como tratamento de uma condição (fertilidade), mas não um tratamento de um distúrbio ou doença. Outras condições são entendidas por aqueles com versado na técnica.

[000137] Quantidade Eficaz: Como usado aqui, o termo "quantidade eficaz" refere-se a uma quantidade de um dado composto, conjugado ou composição que é necessária ou suficiente para realizar um efeito biológico desejado. Uma quantidade eficaz de um dado composto, conjugado ou composição, de acordo com os métodos da presente invenção, seria a quantidade que atingiria este resultado selecionado, e tal que uma quantidade pode ser determinada como questão rotineira por aquele versado na técnica, usando ensaios que são conhecidos da técnica e/ou que estão descritos aqui, sem necessidade de experimentação indevida. Por exemplo, uma quantidade eficaz para tratar ou prevenir metástase de câncer poderia ser aquela quantidade necessária para prevenir migração e invasão de uma célula tumoral através da membrana basal ou através de uma camada endotelial in vivo. O termo é também sinônimo de "quantidade suficiente". A quantidade eficaz, para qualquer aplicação pode variar dependendo de fatores tais como a doença, distúrbio ou condição que está sendo tratada, a composição particular que está sendo administrada, a por meio de de administração, o tamanho do paciente, e/ou a gravidade da doença ou condição. Aquele com versado na técnica pode determinar, empiricamente, a quantidade eficaz de um composto particular, conjugado ou composição da presente invenção, de acordo com as instruções fornecidas aqui, sem necessidade de experimentação indevida.

[000138] Um ou uma: Quando os termos "um" e "uma" são usados neste relatório descritivo, eles significam "pelo menos um(a)" ou "um(a) ou mais", a menos que de outro modo indicado. Como tais, os termos "um(a)", "um(a) ou mais", e pelo menos um(a)" podem ser usados intercambiavelmente.

[000139] Peptídeo, polipeptídeo, proteína: Como usado aqui, o termo "polipeptídeo" tem o objetivo de englobar um "polipeptídeo" no singular, bem como "polipeptídeos" no plural, e refere-se a uma molécula composta de monômeros (aminoácidos) linearmente ligados por ligação amida (também conhecidas como ligações peptídicas). O termo "polipeptídeo" refere-se a qualquer cadeia ou cadeia de dois mais aminoácidos, e não se refere a um comprimento específico do produto. Assim, peptídeos, dipeptídeos, tripeptídeos, oligopeptídeos, "proteína", "cadeia de aminoácido", ou qualquer outro termo usado para fazer referência a uma cadeia ou cadeias de dois ou mais aminoácidos, estão incluídos na definição de "polipeptídeo", e o termo "polipeptídeo" pode ser usado em vez de, ou intercambiavelmente com quaisquer destes termos. O termo "polipeptídeo" tem também o objetivo de se referir aos produtos de modificação pós-expressão do polipeptídeo, incluindo, sem limitação, glicosilação, acetilação, fosforilação, amidação, derivatização por grupos protetores/bloqueadores conhecidos, clivagem proteolítica, ou modificação por aminoácidos de ocorrência não natural. Um polipeptídeo pode ser derivado de uma fonte biológica natural ou se produzido por tecnologia recombinante, mas não é necessariamente traduzido de uma designada seqüência de ácidos nucléicos. Ele pode ser gerado de qualquer maneira, inclusive por síntese química. De acordo com esta definição, os polipeptídeos usados na presente invenção podem ser de um tamanho de cerca de 3 ou mais, 5 ou mais, 10 ou mais, 20 ou mais, 20 ou mais, 25 ou mais, 50 ou mais, 75 ou mais, 100 ou mais, 200 ou mais, 500 ou mais, 1.000 ou mais, ou 2.000 ou mais aminoácidos. Os polipeptídeos podem ter uma estrutura tridimensional definida, embora eles não tenham necessariamente esta estrutura. Os polipeptídeos com uma estrutura tridimensional definida são referidos como dobrados, e polipeptídeos, que não possuem uma estrutura tridimensional definida, mas de preferência adotam um número grande de conformações diferentes, e são referidos como desdobrados. Como usado aqui, o termo glicoproteína refere-se a uma proteína acoplada a pelo menos uma porção carboidrato que é ligada à proteína por meio de uma cadeia lateral contendo oxigênio ou contendo nitrogênio de um resíduo de aminoácido, por exemplo um resíduo serina ou um resíduo asparagina. Polipeptídeos preferidos usados de acordo com a invenção incluem polipeptídeos que são ligantes ou que se ligam a uma integrina αvβ6 na superfície de uma célula, incluindo, mas sem limitação, anticorpos (especialmente anticorpos monoclonais) que reconhecem e se ligam a um ou mais epítopos sobre αvβ6.

[000140] Por um polipeptídeo "isolado" ou um fragmento, variante, ou derivativo deste deve ser entendido um polipeptídeo que não está em seu ambiente natural. Nenhum nível particular de purificação é requerido. Por exemplo, um polipeptídeo isolado por ser removido de seu meio nativo ou natural. Polipeptídeos e proteínas recombinantemente produzidos expressos em células hospedeiras são considerados isolados para o propósito de presente invenção assim como os polipeptídeos nativos ou recombinantes que tenham sido separados, fracionados, ou parcial ou substancialmente purificados por qualquer técnica adequada.

[000141] Também incluídos como polipeptídeos da presente invenção está fragmentos, derivados, análogos, ou variantes dos polipeptídeos acima ou qualquer combinação deles. Os termos "fragmento", "variante", "derivado" e "análogo", quando se referindo a anticorpos anti-αvβ6 ou polipeptídeos de anticorpo incluem quaisquer polipeptídeos que retêm pelo menos algumas das propriedades de ligação de antígeno do anticorpo correspondente ou polipeptídeo, isto é, aqueles polipeptídeos que retêm a habilidade de se ligar a um ou mais epítopos em uma integrina avβ6. Fragmentos de polipeptídeos da presente invenção incluem fragmentos proteolíticos, bem como fragmentos de deleção, além de fragmentos de anticorpos específicos discutidos em outro lugar aqui. Variantes de anticorpos anti-αvβ6 e polipeptídeos de anticorpos úteis de acordo com a presente invenção incluem fragmentos conforme descritos acima, e também polipeptídeos com seqüências de aminoácidos alteradas devido às substituições, deleções, ou inserções de aminoácidos. Variantes podem ocorrer naturalmente ou podem não ocorrer naturalmente. As variantes que não ocorrem naturalmente podem ser produzidas usando técnicas de mutagênese conhecidas da área. Polipeptídeos variantes podem compreender substituições, deleções ou adições conservativas ou não conservativas de aminoácidos. Derivados de anticorpos anti-αvβ6 e polipeptídeos de anticorpos úteis de acordo com a presente invenção são polipeptídeos que tenham sido alterados de modo a exibir características adicionais não encontradas no polipeptídeo nativo. Exemplos incluem proteínas de fusão. Polipeptídeos variantes podem ser também referidos aqui como "análogos de polipeptídeos". Como usado aqui, um "derivado" de um anticorpo anti-αvβ6 ou polipeptídeo de anticorpo refere-se a um polipeptídeo em questão tendo um ou mais resíduos quimicamente derivatizados por reação de um grupo lateral funcional. Também incluídos como "derivados" são aqueles peptídeos, que contêm um ou mais derivados de aminoácidos que ocorrem naturalmente dos vinte aminoácidos padrão. Por exemplo, 4-hidroxiprolina pode substituir a prolina; 5-hidroxilisina pode substituir a lisina; 3-metilhistadina pode substituir a histidina; homosserina pode substituir a serina; e ornitina pode substituir a lisina.

[000142] Substancialmente, substancial: Como usado aqui, a conjugação de uma proteína é dita não interferir "substancialmente" com a habilidade da proteína de se ligar ao(s) seu(s) receptor(es) se a taxa e/ou quantidade de ligação de uma proteína conjugada a um receptor não forem menores que cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 87%, cerca de 98%, cerca de 99% ou cerca de 100% ou mais, da taxa de ligação e/ou da quantidade da citocina, quimiocina, fator de crescimento ou hormônio de polipeptídeo, correspondente, que não tenha sido conjugados.

[000143] Tratamento: Como usados aqui, os termos "tratamento", "tratar" e "tratando" se referem à profilaxia e/ou terapia, particularmente em que o objetivo da invenção é prevenir ou retardar (diminuir) uma alteração fisiológica indesejada ou distúrbio, tal como a progressão de esclerose múltipla. Estudos clínicos benéficos ou desejados incluem, mas sem limitação, alívio dos sintomas, diminuição da extensão da doença, estado estabilizado (isto é, não piorando) da doença, retardação e desaceleração da progressão da doença, atenuação ou mitigação do estado doentio, e remissão (se parcial ou total), se detectáveis ou não detectáveis. "Tratamento" pode significar também o prolongamento da sobrevivência em comparação com a sobrevivência esperada se não estiver recebendo tratamento. Aqueles que necessitam de tratamento incluem aqueles já com a condição ou distúrbio, bem como aqueles inclinados a terem a condição ou distúrbio ou aqueles onde a condição ou distúrbio é para ser prevenido. Por "sujeito", ou "indivíduo", ou "animal", ou "paciente", ou mamífero" deve ser entendido qualquer paciente, particularmente um paciente mamífero, para quem diagnóstico, prognóstico, ou terapia é desejada. Pacientes mamíferos incluem seres humanos e outros primatas, animais domésticos, animais de criação, animas de zoológico, animais para esporte, ou animais de estimação tais como cachorros, gatos, porquinhos-da-índia, coelhos, ratos, camundongos, cavalos, gado, vacas e similares.

Revisão

[000144] Esta invenção refere-se a anticorpos humanizados que são específicos para a integrina αvβ6. Descritos aqui estão vários métodos para produzir os anticorpos desta invenção. Métodos que são conhecidos na técnica, mas não estão especificamente descritos aqui, estão também dentro do escopo desta invenção.

[000145] A presente invenção também se baseia, pelo menos em parte, nas constatações que a integrina αvβ6 é expressa diferencialmente sobre as superfícies de células tumorais, em que ela é expressa em quantidades aumentadas nas células tumorais que são metastáticas ou têm um potencial metastático maior com relação aos níveis de expressão observados nas células tumorais que não são metastáticas ou que têm um potencial metastático menor. Para analisar essa expressão diferencial, a invenção usa ligantes, particularmente anticorpos (e mais particularmente os anticorpos humanizados proporcionados pela presente invenção), que se ligam à integrina αvβ6. Em outras modalidades, a invenção proporciona também métodos que usam identificação dessa expressão diferencial na determinação do potencial invasivo e/ou metastático de células tumorais e na identificação daqueles carcinomas, tais como certos adenocarcinomas e carcinomas in situ (inclusive DCIS e LCIS), que podem ter maior probabilidade de progredir para carcinomas invasivos ou metastáticos. A invenção proporciona também métodos para identificar aqueles tumores onde a células que produzem o tumor têm mais probabilidade de responder ao tratamento com um ou mais ligantes que se ligam à integrina αvβ6. A invenção proporciona também métodos de diagnóstico e tratamento/prevenção de metástase tumoral, e para eliminação de células tumorais metastáticas residuais depois da excisão cirúrgica dos tumores.

Anticorpos Humanizados

[000146] Em uma modalidade, os anticorpos proporcionados pela presente invenção são anticorpos monoclonais, que, em uma modalidade preferida, são versões humanizadas de anticorpos anti-αvβ6 cognatos derivados de outras espécies. Um anticorpo humanizado é um anticorpo produzido por tecnologia de DNA recombinante, onde alguns ou todos os aminoácidos de uma cadeia leve ou pesada da imunoglobulina humana, que não são requeridas para ligação de antígeno (por exemplo, as regiões constantes e as regiões de estrutura dos domínios variáveis), são usados para substituir os aminoácidos correspondentes da cadeia leve ou pesada do anticorpo não humano cognato. A título de exemplo, uma versão humanizada de um anticorpo murino para um dado antígeno tem em ambas de suas cadeias pesadas e leves (1) regiões constantes de um anticorpo humano; (2) regiões de estrutura provenientes dos domínios variáveis de um anticorpo humano; e (3) CDRs provenientes do anticorpo murino. Quando necessário, um ou mais resíduos nas regiões de estrutura humana podem ser alteradas para resíduos nas posições correspondentes no anticorpo murino de modo a conservar a afinidade de ligação do anticorpo humanizado pelo antígeno. Essa alteração é algumas vezes chamada de "retromutação". Anticorpos humanizados são, em geral, menos prováveis de elicitar uma resposta imune em seres humanos em comparação com anticorpos humanos quiméricos, porque os anteriores contêm consideravelmente menos componentes não humanos.

[000147] Métodos adequados para produzir os anticorpos humanizados da presente invenção são descritos em, por exemplo, EP 0 239 400 (Winter); Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyem et al., Science 239: 1534-1536 (1988); Queen et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86:10029 (1989)); Patente US 6.180.370; e Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3833 (1989); cujas exposições são aqui incorporadas a título de referência em suas totalidades. Geralmente, o transplante de CDRs murinas (ou outras de não-humano) em um anticorpo humano é conseguido como a seguir. Os cDNAs que codificam domínios variáveis de cadeias pesadas e leves são isolados de um hibridoma. As seqüências de DNA dos domínios variáveis, incluindo as CDRs, são determinadas por seqüenciamento. Os DNAs que codificam as CDRs são transferidos para as regiões correspondentes de um domínio variável de cadeias pesada ou leve de anticorpo humano que codifica a seqüência por mutagênese direcionada a sítios. Então os segmentos de genes de regiões constantes humanos de um isótipo desejado (por exemplo, yl para CH e K para Cl) são adicionados. Os genes de cadeias leve e pesada humanizados são co-expressos em células hospedeiras mamíferas (por exemplo, células CHO ou NSO) para produzir anticorpo humanizado solúvel. Para facilitar a produção em larga escala de anticorpos, é freqüentemente desejável produzir tais anticorpos humanizados em biorreatores contendo células que expressam anticorpos, ou produzir mamíferos transgênicos (por exemplo, cabras, vacas, ou carneiros) que expressam o anticorpo no leite (vide, por exemplo, Patente US 5.827.690).

[000148] Às vezes, a transferência direta de CDRs para uma estrutura humana leva a uma perda de afinidade de ligação com antígeno do anticorpo resultante. Isso porque em alguns anticorpos cognatos, certos aminoácidos dentro das regiões de estrutura interagem com as CDRs e assim influenciam a afinidade de ligação com antígeno total do anticorpo. Em tais casos, deve ser crítico introduzir "retromutação" (supra) nas regiões de estrutura do anticorpo aceptor de modo a reter a atividade de ligação de antígeno do anticorpo cognato.

[000149] A abordagem geral de produzir retromutações é conhecida da técnica. Por exemplo, Queen et al. (supra), Co et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 88:2869-2873 (1991), e WO 90/07861 (Protein Design Labs Inc.) descrevem uma abordagem que envolve duas etapas-chave. Em primeiro lugar, as regiões de estruturas variáveis humanas são escolhidas por análise computadorizada para homologia de seqüências de proteínas, ótima, à estrutura de região variável do anticorpo murino variável. Então, a estrutura terciária da região murino variável é modelada pelo computador de modo a visualizar os resíduos de aminoácidos da estrutura que são prováveis de interagir com as CDRs murinas, e estes resíduos de aminoá- cidos murinos são então sobrepostos à estrutura humana homóloga.

[000150] Sob essa abordagem de duas etapas, existem vários critérios para desenhar anticorpos humanizados. O primeiro critério é usar como o aceptor humano a estrutura de uma imunoglobulina humana particular que é usualmente homóloga à imunoglobulina doadora não humana, ou usar uma estrutura de consenso de vários anticorpos humanos. O segundo critério e usar o aminoácido doador em vez do aceptor se o resíduo de aceptor humano é incomum e o resíduo doador é típico para as seqüências humanas em um resíduo específico da estrutura. O terceiro critério é usar o resíduo de aminoácidos de estrutura doador em vez do aceptor nas posições imediatamente adjacentes às CDRs.

[000151] Pode se usar também uma abordagem diferente conforme descrita, por exemplo, por Tempest, em Biotechnology (9: 266-271 (1991). Nessa abordagem as estruturas de regiões variáveis derivadas de cadeias leves e pesadas NEWN e REI, respectivamente, são usadas para enxertia de CDR sem introdução de radicais de resíduos de camundongo. Uma vantagem de se usar essa abordagem é que as estruturas tridimensionais das regiões variáveis NEWM e REI são conhecidas de cristalografia de raio X e assim as interações específicas entres as CDRs e os resíduos das estruturas da regiões variáveis podem ser prontamente modeladas.

[000152] Os presentes inventores prepararam o cDNA da região variável de cadeia pesada do anticorpo e os cDNAs da região variável da cadeia leve a partir de mRNAs isolados dos vários hibridomas 6.3G9 e 6.8G6, conforme descrição no WO 03/100033. Esses hibridomas produzem anticorpos monoclonais de camundongo da classe de IgG1 que se ligam à integrina αvβ6. Vetores de expressão de anticorpo humano quimérico foram construídos por inserção do cDNA em um vetor de expressão contendo região constante de cadeia pesada de anticorpo humano ou seqüências que codificam a região constante de cadeia leve de anticorpo humano. Tais vetores foram então introduzidos nas células animais para efetuar a produção de anticorpos humanos quiméricos anti- αvβ6. Dentre os anticorpos quiméricos produzidos, verificou-se que os anticorpos humanos quiméricos anti-αvβ6, 3G9 e 8G6, reagem com a integrina αvβ6 e mostram atividade de bloqueio.

[000153] Usando as abordagens descritas acima, as versões humanizadas dos anticorpos quiméricos 3G9 e 8G6 foram geradas. Para o anticorpo 3G9, isso envolveu a clonagem das regiões variáveis de cadeias leves e pesadas de 3G9 murino, conforme descrição nos Exemplos aqui. Os cDNAs que codificam as regiões variáveis de 3G9 murino das cadeias leves e pesadas foram então usados para construir vetores para expressão de quimeras murino-humanas, onde as regiões variáveis de 3G9 murino foram ligadas às regiões constantes de IgG1 humano (para a cadeia pesada) e kappa humano (para a cadeia leve), conforme descrição nos Exemplos aqui. Expressão dos vetores de expressão de 3G9 da cadeia leve e da cadeia pesada seguinte à transfecção para células 293-EBNA indicou que as células transfectadas de 3G9 quimérico sintetizaram e montaram eficazmente as cadeias pesadas e leves e secretaram anticorpo (vide Exemplo 2). Além disso, uma forma de aglicosila-mutante do anticorpo 3G9 quimérico foi criada também. Uma substituição de aminoácido de uma asparagina (N) para uma serina (S) dentro de um sítio de glicosilação N-ligado na primeira CDR da cadeia leve do 3G9 mostrou que aperfeiçoa bastante a expressão de proteína e a purificação sem alterar a afinidade de ligação (figura 1).

[000154] De modo a produzir anticorpos 3G9 humanizados, os domínios de estruturas aceptoras humanas foram escolhidos por emparelhamento de homologia com as seqüências da germe-linha humana. Para a cadeia leve, verificou-se que as estruturas aceptoras L6 humanas são as mais homólogas e para a cadeia pesada, as estruturas aceptoras 3-7 humanas são as mais homólogas, conforme descrição no Exemplo 3. Usando essas estruturas aceptoras humanas escolhidas, os domínios variáveis das cadeias leves e pesadas foram desenhados e várias variantes/versões de cada foram geradas e expressas (Exemplo 4).

[000155] A presente invenção descreve os anticorpos 3G9 humanizados como compreendendo um domínio variável de cadeia pesada da SEQ ID NO:1 e domínio variável de cadeia leve da SEQ ID NO:2. SEQ ID NO: 1 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYWMSWVRQAPGKGLE WVASISSGGRMYYPDTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAV YYCARGSIYDGYYVFPYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 2 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSVSSSYLYWYQQKPGQAPRL LIY STSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCHQWSTYPPT FG GGTKVEIK

[000156] Diferentes variantes/versões das cadeias pesadas e leves de 3G9 foram geradas com diferentes graus com retromutações para determinar que combinação produziu o melhor anticorpo humanizado com afinidade de ligação superior e atividade de bloqueio para αvββ. Das cinco versões diferentes das cadeias leves as três versões diferentes de cadeias pesadas geradas, o emparelhamento da versão 3 da cadeia pesada (HV3) de 3G9 com a versão 5 da cadeia leve (LV5) de 3G9 gerou o melhor corpo humanizado (Exemplo 4). Essa versão 5 de 3G9 humanizado (H3/L5) é produzida por expressão do vetor recombinante para versão 3 da cadeia pesada (H3) compreendendo o plasmídio pKJS189 (SEQ ID NO:6) em combinação com o vetor recombinante para a versão 5 da cadeia leve (LV5) compreendendo o plasmídio pKJS195 (SEQ ID NO:5). SEQ ID NO: 6 1263 ATG GAC TTC GGC CTG AGC TGG GTG TTC CTG GTG CTG GTG CTG AAG GGC GTG CAG TGC GAG GTG CAG CTG GTG GAG AGC GGC GGC 1 Met Asp Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Leu Val Leu LyB Gly Val GIn Cys GIu Val GIn Leu Val GIu Ser Gly Gly 1347 GGC CTG GTG CAG CCC GGC GGC AGC CTG AGG CTG AGC TGC GCC GCC AGC GGC TTC ACC TTC AGC CGC TAC GTG ATG AGC TGG GTG 29 GIy Leu VaI GIn Pro GIy GIy Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser GIy Phe Thr Phe Ser Arg Tyr VaI Met Ser Trp VaI 1431 CGC CAG GCC CCC GGC AAG GGC CTG GAG TGG GTG GCC AGC ATC AGC AGC GGA GGC CGC ATG TAC TAC CCC GAC ACC GTG AAG GGC 57 Arg GIn Ala Pro GIy Lys GIy Leu GIu Trp VaI Ala Ser lie Ser Ser GIy GIy Arg Met Tyr Tyr Pro Asp Thr VaI LyB GIy 1515 CGC TTC ACC ATC AGC CGC GAC AAC GCC AAG AAC AGC CTG TAC CTG CAG ATG AAC AGC CTG CGC GCC GAG GAC ACC GCC GTG TAC 85 Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu GIn Met Asn Ser Leu Arg Ala GIu Asp Thr Ala VaI Tyr 1599 TAC TGC GCC CGC GGC AGC ATC TAC GAC GGC TAC TAC GTG TTC CCC TAC TGG GGC CAG GGC ACC CTG GTG ACC GTG AGC TCC GCC 113 Tyr Cys Ala Arg GIy Ser lie Tyr Asp GIy Tyr Tyr VaI Phe Pro Tyr Trp GIy GIn GIy Thr Leu VaI Thr VaI Ser Ser Ala 1683 AGC ACC AAG GGC CCC AGC GTG TTC CCC CTG GCC CCC AGC AGC AAG AGC ACC AGC GGC GGC ACC GCC GCC CTG GGC TGC CTG GTG 141 Ser Thr Lys GIy Pro Ser VaI Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser GIy GIy Thr Ala Ala Leu GIy Cys Leu VaI 1767 AAG GAC TAC TTC CCC GAA CCG GTG ACG GTG TCG TGG AAC TCA GGC GCC CTG ACC AGC GGC GTG CAC ACC TTC CCG GCT GTC CTA 169 Lys Asp Tyr Phe Pro GIu Pro VaI Thr VaI Ser Trp Asn Ser GIy Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 1851 CAG TCC TCA GGA CTC TAC TCC CTC AGC AGC GTG GTG ACC GTG CCC TCC AGC AGC TTG GGC ACC CAG ACC TAC ATC TGC AAC GTG 197 GIn Ser Ser GIy Leu Tyr Ser Leu Ser Ser VaI VaI Thr VaI Pro Ser Ser Ser Leu GIy Thr GIn Thr Tyr He Cys Asn VaI 1935 AAT CAC AAG CCC AGC AAC ACC AAG GTG GAC AAG AAA GTT GAG CCC AAA TCT TGT GAC AAG ACT CAC ACA TGC CCA CCG TGC CCA 225 Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys VaI Asp Lys Lys VaI GIu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr HiB Thr Cys Pro Pro Cys Pro 2019 GCA CCT GAA CTC CTG GGG GGA CCG TCA GTC TTC CTC TTC CCC CCA AAA CCC AAG GAC ACC CTC ATG ATC TCC CGG ACC CCT GAG 253 Ala Pro GIu Leu Leu GIy GIy Pro Ser VaI Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met He Ser Arg Thr Pro GIu 2103 GTC ACA TGC GTG GTG GTG GAC GTG AGC CAC GAA GAC CCT GAG GTC AAG TTC AAC TGG TAC GTG GAC GGC GTG GAG GTG CAT AAT 281 VaI Thr Cys VaI VaI VaI Asp VaI Ser His GIu Asp Pro GIu VaI Lys Phe Asn Trp Tyr VaI Asp GIy VaI GIu VaI His Asn 2187 GCC AAG ACA AAG CCG CGG GAG GAG CAG TAC AAC AGC ACG TAC CGT GTG GTC AGC GTC CTC ACC GTC CTG CAC CAG GAC TGG CTG 309 Ala Lys Thr Lys Pro Arg GIu Glu GIn Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg VaI VaI Ser VaI Leu Thr VaI Leu His GIn Asp Trp Leu 2271 AAT GGC AAG GAG TAC AAG TGC AAG GTC TCC AAC AAA GCC CTC CCA GCC CCC ATC GAG AAA ACC ATC TCC AAA GCC AAA GGG CAG 337 Asn GIy Lys GIu Tyr Lys Cys Lys VaI Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro He GIu Lys Thr He Ser Lys Ala Lys Gly GIn 2355 CCC CGA GAA CCA CAG GTG TAC ACC CTG CCC CCA TCC CGG GAT GAG CTG ACC AAG AAC CAG GTC AGC CTG ACC TGC CTG GTC AAA 365 Pro Arg GIu Pro GIn Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp GIu Leu Thr Lys Aan GIn VaI Ser Leu Thr Cys Leu VaI Lys 2439 GGC TTC TAT CCC AGC GAC ATC GCC GTG GAG TGG GAG AGC AAT GGG CAG CCG GAG AAC AAC TAC AAG ACC ACG CCT CCC GTG TTG 393 GIy Phe Tyr Pro Ser Asp He Ala VaI GIu Trp GIu Ser Asn GIy GIn Pro GIu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro VaI Leu 2523 GAC TCC GAC GGC TCC TTC TTC CTC TAC AGC AAG CTC ACC GTG GAC AAG AGC AGG TGG CAG CAG GGG AAC GTC TTC TCA TGC TCC 421 Asp Ser Asp GIy Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr VaI Asp Lys Ser Arg Trp GIn GIn GIy Asn VaI Phe Ser Cys Ser 2607 GTG ATG CAT GAG GCT CTG CAC AAC CAC TAC ACG CAG AAG AGC CTC TCC CTG TCT CCC GGT 449 VaI Met His GIu Ala Leu His Asn His Tyr Thr GIn Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro GIy SEQ ID NO: 5 1263 ATG GAC TTC CAG GTG CAG ATC TTC AGC TTC CTG CTG ATC AGC GTG AGC GTG ATC ATG AGC CGC GGC GAG ATC GTG CTG ACC CAG 1 Met Asp Phe GIn VaI GIn lie Phe Ser Phe Leu Leu He Ser VaI Ser VaI He Met Ser Arg GIy GIu He VaI Leu Thr GIn 1347 AGC CCC GCC ACC CTG AGC CTG AGC CCC GGC GAG AGG GCC ACC CTG AGC TGC AGC GCC AGC AGC AGC GTG AGC AGC AGC TAC CTG 29 Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro GIy GlU Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser VaI Ser Ser Ser Tyr Leu 1431 TAC TGG TAC CAG CAG AAG CCC GGC CAG GCC CCC AGG CTG CTG ATC TAC AGC ACC AGC AAC CTG GCC AGC GGC ATC CCC GCC CGC 56 Tyr Trp Tyr GIn GIn Lys Pro GIy GIn Ala Pro Arg Leu Leu He Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser GIy He Pro Ala Arg 1515 TTC AGC GGC AGC GGC AGC GGC ACC GAC TTC ACC CTG ACC ATC AGC AGC CTG GAG CCC GAG GAC TTC GCC GTG TAC TAC TGC CAC 83 Phe Ser GIy Ser GIy Ser GIy Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Ser Leu GIu Pro GIu Asp Phe Ala VaI Tyr Tyr Cys His 1599 CAG TGG AGC ACC TAC CCC CCC ACC TTC GGC GGC GGC ACC AAG GTG GAG ATC AAG CGT ACG GTG GCT GCA CCA TCT GTC TTC ATC 110 GIn Trp Ser Thr Tyr Pro Pro Thr Phe GIy GIy GIy Thr Lys VaI GIu He Lys Arg Thr VaI Ala Ala Pro Ser VaI Phe He 1633 TTC CCG CCA TCT GAT GAG CAG TTG AAA TCT GGA ACT GCC TCT GTT GTG TGC CTG CTG AAT AAC TTC TAT CCC AGA GAG GCC AAA 137 Phe Pro Pro Ser Asp GlU GIn Leu Lys Ser GIy Thr Ala Ser VaI VaI Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg GlU Ala Lys 1767 GTA CAG TGG AAG GTG GAT AAC GCC CTC CAA TCG GGT AAC TCC CAG GAG AGT GTC ACA GAG CAG GAC AGC AAG GAC AGC ACC TAC 164 VaI GIn Trp Lys VaI Asp Asn Ala Leu GIn Ser GIy Asn Ser GIn GIu Ser VaI Thr GlU GIn Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 1851 AGC CTC AGC AGC ACC CTG ACG CTG AGC AAA GCA GAC TAC GAG AAA CAC AAA GTC TAC GCC TGC GAA GTC ACC CAT CAG GGC CTG 191 Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr GIu Lys His Lys VaI Tyr Ala Cys GlU VaI Thr His GIn GIy Leu 1935 AGC TCG CCC GTC ACA AAG AGC TTC AAC AGG GGA GAG TGT 218 Ser Ser Pro VaI Thr Lys Ser Phe ABπ Arg GIy GlU Cys

[000157] Uma outra versão do anticorpo da versão 5 (H3/L5) de 3G9 humanizado foi também gerada na qual a cadeia pesada foi mutada para remover o sítio de glicosilação na região constante, que mostrou ser requerida para ligação de receptor de Fc normal (Exemplo 5). Essa forma aglicosila do anticorpo 3G9 humanizado (a-H3/L5) é produzida por substituição de um resíduo de aminoácidos asparagina (N) com uma glutamina (Q) na região constante da versão 3 da cadeia pesada (H3). O anticorpo (a-H3/L5) 3G9 aglicosila-humanizado é produzido pela expressão do vetor recombinante para a versão 3 da cadeia pesada aglicosila (a-H3) compreendendo o plasmídio pKJS196 (SEQ ID NO:7) em combinação com o vetor recombinante para a versão 5 da cadeia leve (L5) compreendendo o plasmídio pKJS195 (SEQ ID NO:5; vide acima). SEQ ID NO: 7 1263ATG GAC TTC GGC CTG AGC TGG GTG TTC CTG GTG CTG GTG CTG AAG GGC GTG CAG TGC GAG GTG CAG CTG GTG GAG AGC GGC GGC 1Met Asp Phe GIy Leu Ser Trp VaI Phe Leu VaI Leu VaI Leu Lys GIy VaI GIn Cys GIu VaI GIn Leu VaI GIu Ser GIy GIy 1347 GGC CTG GTG CAG CCC GGC GGC AGC CTG AGG CTG AGC TGC GCC GCC AGC GGC TTC ACC TTC AGC CGC TAC GTG ATG AGC TGG GTG 29 GIy Leu VaI GIn Pro GIy GIy Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser GIy Phe Thr Phe Ser Arg Tyr VaI Met Ser Trp VaI 1431 CGC CAG GCC CCC GGC AAG GGC CTG GAG TGG GTG GCC AGC ATC AGC AGC GGA GGC CGC ATG TAC TAC CCC GAC ACC GTG AAG GGC 57 Arg GIn Ala Pro GIy Lys GIy Leu GIu Trp VaI Ala Ser He Ser Ser GIy GIy Arg Met Tyr Tyr Pro Asp Thr VaI Lys GIy 1515 CGC TTC ACC ATC AGC CGC GAC AAC GCC AAG AAC AGC CTG TAC CTG CAG ATG AAC AGC CTG CGC GCC GAG GAC ACC GCC GTG TAC 85 Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu GIn Met Asn Ser Leu Arg Ala GIu Asp Thr Ala VaI Tyr 1599 TAC TGC GCC CGC GGC AGC ATC TAC GAC GGC TAC TAC GTG TTC CCC TAC TGG GGC CAG GGC ACC CTG GTG ACC GTG AGC TCC GCC 113 Tyr Cys Ala Arg GIy Ser He Tyr Asp GIy Tyr Tyr VaI Phe Pro Tyr Trp GIy GIn GIy Thr Leu VaI Thr VaI Ser Ser Ala 1683 AGC ACC AAG GGC CCC AGC GTG TTC CCC CTG GCC CCC AGC AGC AAG AGC ACC AGC GGC GGC ACC GCC GCC CTG GGC TGC CTG GTG 141 Ser Thr Lys GIy Pro Ser VaI Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser GIy GIy Thr Ala Ala Leu GIy Cys Leu VaI 1767 AAG GAC TAC TTC CCC GAA CCG GTG ACG GTG TCG TGG AAC TCA GGC GCC CTG ACC AGC GGC GTG CAC ACC TTC CCG GCT GTC CTA 169 Lys Asp Tyr Phe Pro GIu Pro VaI Thr VaI Ser Trp Asn Ser GIy Ala Leu Thr Ser GIy VaI His Thr Phe Pro Ala VaI Leu 1851 CAG TCC TCA GGA CTC TAC TCC CTC AGC AGC GTG GTG ACC GTG CCC TCC AGC AGC TTG GGC ACC CAG ACC TAC ATC TGC AAC GTG 197 GIn Ser Ser GIy Leu Tyr Ser Leu Ser Ser VaI VaI Thr VaI Pro Ser Ser Ser Leu GIy Thr GIn Thr Tyr He Cys Asn VaI 1935 AAT CAC AAG CCC AGC AAC ACC AAG GTG GAC AAG AAA GTT GAG CCC AAA TCT TGT GAC AAG ACT CAC ACA TGC CCA CCG TGC CCA 225 Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys VaI Asp Lys Lys VaI GlU Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 2019 GCA CCT GAA CTC CTG GGG GGA CCG TCA GTC TTC CTC TTC CCC CCA AAA CCC AAG GAC ACC CTC ATG ATC TCC CGG ACC CCT GAG 253 Ala Pro GIu Leu Leu GIy GIy Pro Ser VaI Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met He Ser Arg Thr Pro GlU 2103 GTC ACA TGC GTG GTG GTG GAC GTG AGC CAC GAA GAC CCT GAG GTC AAG TTC AAC TGG TAC GTG GAC GGC GTG GAG GTG CAT AAT 281 VaI Thr Cys VaI VaI VaI Asp VaI Ser His GIu Asp Pro GIu VaI Lys Phe Asn Trp Tyr VaI Asp GIy VaI GIu VaI His Asn 2187 GCC AAG ACA AAG CCG CGG GAG GAG CAG TAC CAG AGC ACG TAC CGT GTG GTC AGC GTC CTC ACC GTC CTG CAC CAG GAC TGG CTG 309 Ala Lys Thr Lys Pro Arg GIu GIu GIn Tyr GIn Ser Thr Tyr Arg VaI VaI Ser VaI Leu Thr VaI Leu His GIn Asp Trp Leu 2271 AAT GGC AAG GAG TAC AAG TGC AAG GTC TCC AAC AAA GCC CTC CCA GCC CCC ATC GAG AAA ACC ATC TCC AAA GCC AAA GGG CAG 337 ABn GIy Lys GIu Tyr Lys Cys Lys VaI Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie GIu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys GIy GIn 2355 CCC CGA GAA CCA CAG GTG TAC ACC CTG CCC CCA TCC CGG GAT GAG CTG ACC AAG AAC CAG GTC AGC CTG ACC TGC CTG GTC AAA 3Í5 Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp GIu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 2439 GGC TTC TAT CCC AGC GAC ATC GCC GTG GAG TGG GAG AGC AAT GGG CAG CCG GAG AAC AAC TAC AAG ACC ACG CCT CCC GTG TTG 393 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp He Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 2523 GAC TCC GAC GGC TCC TTC TTC CTC TAC AGC AAG CTC ACC GTG GAC AAG AGC AGG TCG CAG CAG GGG AAC GTC TTC TCA TGC TCC 421 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 2607 GTG ATG CAT GAG GCT CTG CAC AAC CAC TAC ACG CAG AAG AGC CTC TCC CTG TCT CCC GGT 449 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

[000158] Abordagens similares foram usadas no desenho do anticorpo 8G6 humanizado (Exemplo 7). Três versões da cadeia leve variável e da cadeia pesada variável de 8G6 foram desenhadas, com a primeira versão contendo a maioria das retromutações e a terceira versão contendo a minoria (a maioria dos "humanizados") (Exemplo 5). SEQ ID NO: 75 (cadeia leve hu8G6 versão 1 ) DIVLTQSP ATLSLSPGERATLSCRASQSVSTSSYSYMYWYQQKPGQAP RFLIKYASNLESGIP ARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHNWEI PFTFGGGTKVEIK SEQ ID NO: 76 (cadeia leve hu8G6 versão 2 ) EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSTSSYSYMYWYQQKPGQAP RFLIKYASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHNW EI PFTFGGGTKVEIK SEQ ID NO: 77 (cadeia leve hu8G6 versão 3) ErVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSTSSYSYMYWYQQKPGQAP RLLIKYASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHNW EI PFTFGGGTKVEIK SEQ ID NO: 78 (cadeia pesada hu8G6 versão 1) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKGSSYTFTDYAMHWVRLAPGQGLE WIGVISTYYGNTNYNQKFKGRATMTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAV YYCARGGLRRGDRPSLRYAMDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 79 (cadeia pesada hu8G6 versão 2) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYAMHWVRQAPGQGL EWIGVISTYYGNTNYNQKFKGRATMTVDKSISTAYMELSRLRSDDTA VYYCARGGLRRGDRPSLRYAMDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 80 (cadeia pesada hu8G6 versão 3) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYAMHWVRQAPGQGL EWMGVISTYYGNTNYNQKFKGRATMTVDKSISTAYMELSRLRSDDTA VYYCARGGLRRGDRPSLRYAMDYWGQGTLVTVSS

Outras Porções

[000159] Como descrito com mais detalhes abaixo, os anticorpos monoclonais humanizados desta invenção podem compreender ainda outras porções para efetuar as funções desejadas. Por exemplo, os anticorpos humanizados podem incluir uma porção toxina (por exemplo, toxóide do tétano ou ricina) ou um radionuclídeo (por exemplo, 111In ou 90Y) para destruir células-alvo pelos anticorpos (vide, por exemplo, Patente US 6.307.026). Os anticorpos humanizados podem compreender uma porção (por exemplo, biotina, porções fluorescentes, porções radiativas, marcador de histidina ou outros marcadores de peptídeos) para facilidade de isolamento ou de detecção. Os anticorpos humanizados podem compreender também uma porção (por exemplo, biotina, porções fluorescentes, porções radioativas, marcador de histidina ou outros marcadores de peptídeo) para facilitar isolação ou detecção. Os anticorpos humanizados podem também compreender uma porção que pode prolongar sua meia-vida no soro, por exemplo, uma porção polietileno glicol (PEG).

[000160] Uma variedade de agentes quimioterapêuticos pode ser acoplada ao anticorpo humanizado de direcionamento. Preferivelmente, um anticorpo humanizado que internalize mediante ligação seria melhor, contudo, o uso de anticorpos humanos não internalizadores não é excluído. Por exemplo, o uso de conjugados de anticorpo-fármaco que se ligam a uma superfície de células tumorais libera o fármaco dentro do tumor e na vizinhança das células tumorais e difusão ou transporte para a célula podem produzir atividade tumoral dependendo do fármaco usado. A lista de fármacos que poderiam ser usados para preparar os conjugados é extensiva e aquele versado na técnica saberia fazer as modificações químicas no composto desejado de modo a efetuar reações mais convenientes daquele composto com a finalidade de preparar os conjugados da invenção. Por exemplo, o fármaco poderia ser acoplado por meio de ligantes liberáveis que são diferencialmente mais estáveis no soro e ainda liberam o fármaco ativo dentro da célula tumoral. Vários mecanismos de liberação poderiam ser usados, dependendo do fármaco específico. Exemplos desses mecanismos de liberação incluem o uso de hidrazonas sensíveis a ácido, ligantes sensíveis a redox, por exemplo, dissulfeto e ligantes de peptídeos proteoliticamente clivados. Os seguintes são alguns dos fármacos representativos de várias classes diferentes: (A) agentes alquilantes. Alguns exemplos específicos desses fármacos são ciclofosfamida, clorambucila, bussulfano, melfalano e nitrosouréia. (B) agentes antimetabólitos e antiproliferativos, tais como antraciclinas, fármacos da vinca, mitomicinas, bleomicinas, nucleosídeos, pteridinas, endiinas. Exemplos são adriamicina, daunorrubicina, doxorrubi- cina, aminopterina, metotrexato, mitomicina C, actinomicina-D, 5- fluoruracila, 6-mercaptopurina, citosina-arabinosídeo, taxol, taxano, citocalasina B, colchicina e puromicina-etoposídeo, melfalano, vimblas- tina, vincristina, caliqueamicina, derivados de maitansinas, e derivados de dolistatina. (C) hormônios e antagonistas de hormônios tais como corticosteróides, progestinas, e estrogênios.

[000161] Pró-fármacos são definidos como fármacos que existem em uma forma química "menos potente" quando ligados ao anticorpo, que, no entanto, sob internalização, são clivados enzimaticamente para produzir uma forma de fármaco mais potente. Essa mesma aplicação pode ser feita aos conjugados de anticorpo que não internalizam, por exemplo, clivagem enzimática ocorre na superfície da célula tumoral e o fármaco é liberado no ambiente do tumor imediato e assimilado pela célula tumoral. Alguns exemplos disso são fármacos contendo fosfatos, sulfatos, e peptídeos.

[000162] Ligação de toxinas protéicas biologicamente ativas, tais como cadeia A da ricina, toxina da difteria, shigatoxina, tétano, ou uma enzima tóxica é uma outra forma de conjugado de anticorpo contemplado por esta invenção. Tais conjugados podem ser preparados usando métodos químicos de conjugação ou usando técnicas de engenharia genética que permitem expressão direta da construção de anticorpo-toxina, que são prontamente conhecidas daquele versado na técnica.

[000163] Os anticorpos monoclonais humanizados desta invenção podem compreender também outras porções tais como radionuclídeos. Para os propósitos de radioimunoterapia, o uso de anticorpos αvβ6 humanizados para direcionar radioisótopos terapêuticos no tratamento de câncer é contemplado por esta invenção. A lista de isótopos relevantes pode incluir, mas sem limitação, 90Y, 125I, 131I, 123I, 111In, 105Rh, 153Sm, 67Cu, 67Ga, 166Ho, 177Lu, 186Re e 188Re. Também contemplados são isótopos alfa-emissores tais como 211At e 212Bi. Os métodos de ligação de isótopos são variados e dependem do isótopo específico usado. Aquele versado na técnica estaria familiarizado com e seria capaz de determinar o método químico de conjugação para qualquer ligação de isótopo específico.

[000164] Para os propósitos de radioimunodiagnóstico, os anticorpos avβ6 humanizados pode proporcionar a oportunidade de se efetuar o imageamento e realizar a dosimetria para o câncer-alvo e/ou órgão/tecido doente de qualquer doença particular. Isso seria útil para confirmar a localização para os sítios tumorais conhecidos, bem como possibilitar a dosagem otimizada da administração terapêutica. Em particular, radioisótopos de pósitron (por exemplo, 86Y) além do isótopo-gama puro 99MTc poderiam ser administrados durante a administração terapêutica.

[000165] As aplicações de radioimunoterapia/radioimunodiagnóstico não estão limitadas ao uso de anticorpos não internalizadores. Existem exemplos do uso eficaz de anticorpos internalizadores para isótopos rótulos particularmente com isótopos que são retidos na célula como um quelato depois do catabolismo. Por exemplo, anticorpos marcados com 90Y preparados usando queladores de alta afinidade tal como MX- DTPA ou CHX-DTPA.

[000166] Quaisquer dos conjugados de anticorpo acima incluem também o uso de fragmentos Fab, F(ab’)2, scFvs, minicorpos, construções de anticorpos com domínio CH2 deletado, e mutantes de FcRn. Esses fragmentos de Ab ou construções modificadas genéricamente têm diferentes propriedades farmacocinéticas, de penetração de tumor, e de localização de tumor provenientes de IgG intacto, que podem produzir vantagens em aplicações particulares. Por exemplo, Fab de depuração mais rápida pode ser útil para aplicações em diagnóstico para usos em radioimunodiagnóstico. Por outro lado, para radioimunoterapia ou marcação de fármacos, um veículo de marcação com um t12 sérico mais longo pode ser mais eficaz. Condições Mórbidas e Modelos Animais

[000167] Os anticorpos humanizados da invenção são úteis no diagnóstico e tratamento, incluindo prevenção, de doenças mediadas por αvβ6. Por exemplo, esses anticorpos humanizados podem ser usados para tratar fibrose (por exemplo, fibrose pulmonar, lesão pulmonar aguda, fibrose renal, Síndrome de Alport, e esclerodermia), e outras doenças e distúrbios descritos em outro lugar, aqui, por bloqueio da ativação de TGF-β ou bloqueio da ligação de αvβ6 a quaisquer outros ligantes, tais como fibronectina, vitronectina, e tenascina. Em particular, os anticorpos humanizados desta invenção podem ser usados para tratar doenças pulmonares associadas à lesão/fibrose, tais como, mas sem limitação, fibrose pulmonar idiopática, fibrose induzida por radiação, doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), esclerodermia, fibrose induzida por bleomicina, asma crônica, silicose, fibrose induzida por asbestos, lesão pulmonar aguda e angústia respiratória crônica, (incluindo induzida por pneumonia bacteriana, induzida por trauma, induzida por pneumonia viral, induzida por ventilador, induzida por sepse não pulmonar e induzida por aspiração). Os anticorpos humanizados desta invenção podem ser também usados para tratar nefropatias crônicas associadas à lesão/fibrose tais como, mas sem limitação, lúpus, diabetes, esclerodermia, nefrite glomerular, esclerose glomerular segmental focal, nefropatia por IgA, hipertensão, aloenxerto e doença de Alport. Os anticorpos humanizados podem ser também úteis para tratar fibrose do intestino, esclerodermia, fibrose induzida por radiação. Os anticorpos humanizados desta invenção podem ser usados, também, para tratar fibrose hepática tal como, mas sem limitação, fibrose induzida por lesão no ducto biliar. Outras indicações, que os anticorpos desta invenção podem ser úteis para tratar, incluem fibrose da cabeça e do pescoço, fibrose induzida por radiação, formação de cicatriz corneana, LASIX, transplante da córnea, trabeculectomia, formação de cicatriz hipertrófica, fibrose induzida por queimadura, fibrose cirúrgica, sarcoidose, psoríase e lesão/fibrose da medula espinal.

[000168] Como descrito em detalhes abaixo, diferentes de doenças ou condições fibróticas, os anticorpos humanizados da invenção são úteis no tratamento de câncer e metástase de câncer (incluindo crescimento e invasão de tumor), particularmente cânceres epiteliais. Um subconjunto de cânceres epiteliais compreende carcinoma de célula escamosa, por exemplo, cânceres da cabeça e pescoço (incluindo oral, laríngeo, faríngeo, esofágico), da mama, do pulmão, da próstata, cervical, do cólon, pancreático, da pele (carcinomas de células basais) e ovarianos. Nossos estudos usando os novos anticorpos monoclonais αvβ6 demonstraram que αvβ6 é altamente expressa em muitos cânceres epiteliais na extremidade principal dos tumores. Os novos anticorpos podem ser também usados para outras doenças mediadas por αvβ6, incluindo psoríase.

[000169] A eficácia dos anticorpos da invenção pode ser testada em vários modelos animais, alguns dos quais estão descritos nos exemplos não limitativos abaixo. Modelos de camundongo para fibrose pulmonar incluem fibrose pulmonar induzida por bleomicina (Pitter et al., J. Clin. Invest. 107(12):1537-1544 (2001); e Munger et al., supra) e induzível por irradiação (Franko et al., Rad. Res. 140:347-355 (1994)). Em camundongos tratados com bleomicina, a expressão de αvβ6 aumenta nas células alveolares epiteliais dos pulmões. Contudo, camundongos de knockout β6 são protegidos de lesão e fibrose induzidas por bleomicina.

[000170] Modelos de camundongo para fibrose renal incluem camundongos COL4A3 -/- (vide, por exemplo, Cosgrove et al., Amer. J. Path., 157:1649-1659 (2000), camundongos com lesão induzida por adriami- cina (Wang et al., Kidney International 58: 1797-1804 (2000); Deman et al., Nephrol Dial Transplant 16: 147-150 (2001)), camundongos db/db (Ziyadeh et al., PNAS USA 97:8015-8020 (2000)), e camundongos com obstrução ureteral unilateral (Fogo et al., Lab Investigation 81: 189A (2001); e Fogo et al., Journal of the American Society of Nephrology 12:819A (2001)). Em todos estes modelos, os camundongos desenvolvem lesão e fibrose renal que podem progredir para insuficiência renal. αvβ6 é supra-regulada no revestimento epitelial dos túbulos ascendentes e descendentes dos rins dos camundongos COL4A3 -/-, camundongos tratados com adriamicina, e camundongos que sofrem de obstrução ureteral unilateral. É provável que expressão de αvβ6 também aumente em uma variedade de modelos de lesão renal.

[000171] Como é também descrito em detalhes abaixo, anticorpos monoclonais anti-αvβ6 podem ser igualmente testadas quanto à sua capacidade para inibir o crescimento, progressão, e metástase de tumor em tais modelos animais como os modelos de crescimento de tumor in vivo e metástase. Vide, por exemplo, Rockwell et al., J. Natl. Cancer Inst. 49:735 (1972); Guy et al., Mol. Cell Biol. 12:954 (1992); Wyckoff et al., Cancer Res. 60:2504 (2000); e Oft et al., Curr. Biol. 8:1243 (1998). Ligantes αvβ6 importantes em câncer podem incluir TGF-β, que está envolvido em metástase (para revisão vide Akhurst et al., Trends in Cell Biology 11:S44-S51 (2001)), fibronectina e vitronectina.

[000172] A eficácia dos tratamentos dessa invenção pode ser medida por várias ferramentas de diagnóstico disponíveis, incluindo exame físico, testes sangüíneos, medições de proteinúria, níveis de creatinina e depuração da creatinina, testes de função pulmonar, níveis de nitrogênio da uréia no sangue plasmático (BUN), observação e classificação de formação de cicatriz ou lesões fibróticas, deposição de matriz extracelular tais como colágeno, actina e fibronectina da musculatura lisa, testes de função dos rins, ultra-som, imageamento de ressonância magnética (MRI) e varredura por CT.

Composições Farmacêuticas

[000173] A presente invenção proporciona composições farmacêuticas, que compreendem um ou mais anticorpos humanizados da presente invenção, ou derivados farmaceuticamente aceitáveis destes, opcionalmente com veículo farmaceuticamente aceitável. O termo "veículo", como usado aqui, inclui adjuvantes e veículos aceitáveis conhecidos.

[000174] De acordo com esta invenção, as composições farmacêuticas podem estar na forma de uma preparação injetável estéril, por exemplo, uma suspensão aquosa ou oleaginosa injetável estéril. Essa suspensão pode ser formulada de acordo com técnicas conhecidas na técnica usando agentes dispersantes, molhantes, e de suspensão.

[000175] As composições farmacêuticas desta invenção podem ser dadas via oral, tópica, intravenosa, subcutânea, intraperitoneal, intramuscular, intramedular, intra-articular, intra-sinovial, intraesternal, intratecal, intra-hepática, ou intracraniana, conforme desejado, ou simplesmente via local em sítios de inflamação ou crescimento de tumor. As composições farmacêuticas desta invenção podem ser também administradas por inalação através do uso de, por exemplo, um nebulizador, um inalador de pó seco ou um inalador com dosador.

[000176] A dosagem e a taxa de dose dos anticorpos desta invenção eficazes para produzir os efeitos desejados dependerão de uma variedade de fatores, tais como a natureza da doença a ser tratada, o tamanho do paciente, a meta do tratamento, a composição farmacêutica específica usada, e o critério do médico responsável pelo tratamento. Os níveis de dosagem de entre cerca de 0,001 e cerca de 100 mg/kg de peso corporal por dia, por exemplo, entre cerca de 0,1 e cerca de 50 mg/kg de peso corporal por dia, do composto de ingrediente ativo são úteis. Por exemplo, um anticorpo da invenção será administrado em uma dosagem que varia de cerca de 0,01 mg/kg de peso corporal/dia a cerca de 20 mg/kg de peso corporal/dia, por exemplo, variando de cerca de 0,1 mg/kg de peso corporal/dia a cerca de 10 mg/kg de peso corporal/dia, e em intervalos de a cada um a quatorze dias. Em uma outra modalidades, o anticorpo é administrado em uma dose de cerca de 0,3 a 1 mg/kg de peso corporal , quando administrado intraperitone- almente. Em ainda uma outra modalidade, o anticorpo é administrado em uma dose de cerca de 5 a 12,5 mg/kg de peso corporal, quando administrado intravenosamente. Em uma modalidade, uma composição de anticorpo é administrada em uma quantidade eficaz para proporcionar um nível plasmático de anticorpo de pelo menos 1 mg/mL.

[000177] Outras dosagens adequadas e regimes e modos de administração serão familiares àqueles versados; outros serão ainda descritos em detalhes adicionais abaixo. Ligantes Que Se Ligam à Integrina αvβ6

[000178] Em uma modalidade adicional, a presente invenção é também direcionada a métodos para identificar células cancerosas metastáticas, ou para prognosticar o potencial metastático em um tumor (isto é a probabilidade que as células no tumor sofrerão metástase do sítio do tumor primário para um sítio secundário ou metastático, in vivo), por determinação do nível de expressão da integrina αvβ6 pelas células, em que um aumento da expressão superficial celular de αvβθ indica que a célula cancerosa está mais propensa a ser metastática. Em modalidades relacionadas, a invenção é direcionada a métodos para eliminar células tumorais residuais que expressam αvβ6, particularmente células tumorais metastáticas, seguinte à intervenção médica para remover um tumor (por exemplo, excisão cirúrgica do tumor, ou redução quimioterapêutica ou radioterapêutica ou ablação do tumor). Em modalidades adicionais relacionadas, a invenção proporciona métodos para identificar formas não invasivas de carcinoma, particularmente de adenocarcinoma ou carcinomas in situ (tal como carcinoma ductal in situ (DCIS) ou carcinoma lobular in situ (LCIS) da mama), que são mais prováveis de progredirem para uma forma invasiva ou metastática. Certas de tais modalidades compreendem determinar o nível de expressão de integrina αvβ6 em células de carcinoma, ou no mioepitélio que circunda o carcinoma, em seções de tecido obtidas de um paciente que sofre de tal carcinoma, em que um nível aumentado de expressão de integrina αvβ6 com relação às amostras de tecido não tumoral (idealmente, a partir do mesmo órgão no mesmo paciente) indica que o carcinoma é mais provável de progredir para uma forma invasiva ou metastática de câncer em algum momento, no futuro próximo. Em cada uma de tal modalidade, a invenção se baseia na identificação ou exploração da expressão aumentada de αvβ6 em células tumorais, cuja identificação é obtida por contato do tecido, tumor ou células tumorais com um ou mais ligantes que se ligam à integrina αvβ6 no tecido, tumor ou células tumorais. Em certas modalidades, o tecido, tumor ou células tumorais são tecidos de carcinoma, tumores ou células tumorais, incluindo aqueles de carcinomas tais como adenocarcinomas. Em modalidades mais particulares, o carcinoma é um carcinoma da mama, carcinoma do endométrio, carcinoma pancreático, carcinoma colorretal, carcinoma do pulmão, carcinoma ovariano, carcinoma cervical, carcinoma prostático, carcinoma do fígado, carcinoma esofágico, carcinoma da cabeça e do pescoço, carcinoma do estômago e carcinoma esplênico. Mais particularmente, o carcinoma é um carcinoma da mama (incluindo, mas sem limitação, carcinoma da mama in situ, tal como carcinoma ductal in situ (DCIS) ou carcinoma lobular in situ (LCIS)), carcinoma do endométrio, carcinoma pancreático, carcinoma colorretal, carcinoma cervical, ou carcinoma do pulmão.

[000179] Em certas modalidades da invenção, os ligantes que se ligam a αvβ6 são antagonistas de αvβ6. Tais antagonistas incluem, mas sem limitação, anticorpos, que especificamente se ligam a αvβ6; anticorpos que se ligam especificamente a β6; anticorpos que se ligam a av, anticorpos que se ligam a ligantes para αvβ6; ligantes para αvβ6; ácidos nucléicos anti-sentido; e peptídeo, não peptídeo, e análogos peptidomiméticos de tais ligantes.

[000180] Em certas de tais modalidades da presente invenção, o ligante que se liga à integrina avβ6 é um anticorpo que se liga à avβ6, ou fragmentos que se ligam à integrina avβ6, variantes, ou derivativos destes. Tais anticorpos podem se ligar a uma subunidade da integrina (por exemplo, anticorpos que se ligam a um epítopo localizado na subunidade av ou a um epítopo que está localizado na subunidade β6), ou a ambas as subunidades (por exemplo, anticorpos que se ligam a um epítopo que está localizado em uma região do heterodímero de integrina que seliga em ponte a ambas as subunidades αv e β6). A menos que se referindo especificamente a anticorpos de tamanho inteiro, tais como anticorpos de ocorrência natural, o termo "anticorpos αvβ6" engloba anticorpos de tamanho inteiro, bem como fragmentos de ligação de αvβ6, variantes, análogos, ou derivados de tais anticorpos, por exemplo, anticorpo de ocorrência natural ou moléculas de imunoglobulina ou moléculas de anticorpos engenheiradas ou fragmentos que se ligam ao antígeno de um modo similar às moléculas de anticorpo. Os anticorpos podem ser sintéticos, monoclonais, ou policlonais e podem ser feitos por técnicas bem-conhecidas da área. Para aplicações terapêuticas, anticorpos monoclonais "humanos" tendo regiões constantes e variáveis humanas são freqüentemente preferidos de modo a minimizar a resposta imune de um paciente contra o anticorpo. Tais anticorpos podem ser gerados por imunização de animais transgênicos, que contêm genes da imunoglobulina humana (vide, Jakobovits et al., Ann N.Y. Acad. Sci. 764:525-535 (1995)). Em conexão com anticorpos sintéticos e semi-sintéticos, tais termos devem ser entendidos como abrangendo, mas sem limitação, fragmentos de anticorpos, anticorpos deslocados por isótipo, anticorpos humanizados (por exemplo, camundongo-humano, humano-camundongo, e similares), híbridos, anticorpos tendo especificidades plurais, moléculas similares a anticorpos sintéticos inteiros, e similares.

[000181] Os termos "anticorpo" e "imunoglobulina" são usados aqui de forma intercambiável. Um anticorpo ou imunoglobulina compreende pelo menos o domínio variável de uma cadeia pesada, e compreende normalmente pelo menos os domínios variáveis de uma cadeia pesada e uma cadeia leve. Estruturas básicas de imunoglobulina em sistemas de vertebrados são relativamente bem-entendidas. Vide, por exemplo, Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratoy Press, 2a Edição, 1988). Como será entendido por aqueles com versado na técnica, os termos "anticorpo" e "imunoglobulina" compreendem várias amplas classes de polipeptídeos que podem ser distinguidos bioquimicamente. Aqueles versados na técnica apreciarão que as cadeias pesadas são classificadas como gama, mu, alfa, delta, ou épsilon (y, μ, α, δ, ε) com algumas subclasses dentre elas (por exemplo, y1 - y4). É a natureza dessa cadeia que determina a "classe" do anticorpo como IgG, IgM, IgA, IgG, ou IgE, respectivamente. As subclasses de imunoglobulina (isótipos), por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, etc. são bem-caracterizadas e são conhecidas por conferirem especialização funcional. As versões modificadas de cada uma dessas classes e isótipos são prontamente discerníveis por aquele versado na técnica em vista da presente exposição e, por conseguinte, estão dentro do escopo da presente invenção.

[000182] Anticorpos que se ligam a αvβ6, ou a fragmentos de ligação de αvβ6, variantes ou derivados destes, que são úteis para uso na presente invenção incluem, mas sem limitação, anticorpos policlonais, monoclonais, multiespecíficos, humanos, humanizados, primatizados, ou quiméricos, anticorpos de cadeia simples, fragmentos de ligação de epítopo, por exemplo, Fab, Fab’ e F(ab’)2, Fd, Fvs, Fvs de cadeia simples (scFv), anticorpos de cadeia simples, Fvs ligado a dissulfeto (sdFv), fragmentos compreendendo um domínio VL ou VH, fragmentos produzidos por uma biblioteca de expressão de Fab, e anticorpos anti- idiotípicos (anti-Id) (incluindo, por exemplo, anticorpos Id a anticorpos anti-αvβ6 descritos aqui). Moléculas de ScFv são conhecidas na técnica e são descritas, por exemplo, na Patente US 5.892.019. Moléculas de imunoglobulina ou de anticorpos podem ser de qualquer tipo (por exemplo, IgG, IgE, IgD, IgA, e IgY), classe (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) ou subclasses da molécula de imunoglobulina.

[000183] Fragmentos de anticorpos, incluindo anticorpos de cadeia simples, podem compreender a(s) região(regiões) sozinha(s) ou em combinação com a integridade ou uma porção dos seguintes: região de articulação, domínios CH1, CH2, e CH3. Também incluídos na presente invenção estão fragmentos de ligação de antígeno compreendendo também qualquer combinação de região(regiões) com uma região de articulação, domínios CH1, CH2, e CH3. Anticorpos ou fragmentos específicos destes para uso nos métodos de diagnóstico e terapêuticos descritos aqui podem ser de qualquer origem animal incluindo pássaros e mamíferos. Preferivelmente, os anticorpos são anticorpos humanos, murino, de rato, de burro, de coelho, de cabra, de porquinho-da-índia, de lhama, de cavalo, bovinos ou de galinha. Mais preferivelmente, os anticorpos são anticorpos humanos, humanizados ou primatizados, ou anticorpos quiméricos, particularmente anticorpos monoclonais. Como usado aqui, anticorpos "humanos" incluem anticorpos tendo a seqüência de aminoácidos de uma imunoglobulina humana e incluem anticorpos isolados de bibliotecas de imunoglobulina humana ou de animais transgênicos para uma ou mais imunoglobulinas humanas e que não expressam imunoglobulinas endógenas, conforme descrição abaixo e, por exemplo, na Patente US 5.939.598 por Kucherlapati et al. Como usado aqui, o termo "anticorpo quimérico" será entendido como significando qualquer anticorpo, em que a região ou sítio imunorreativo é obtido ou derivado de uma primeira espécie e a região constante (que pode ser intacta, parcial ou modificada de acordo com a presente invenção) é obtida de uma segunda espécie. Em modalidades preferidas, a região ou sítio de ligação ao alvo provirá de uma fonte não humana (por exemplo, camundongo ou primata) e a região constante é humana.

[000184] Anticorpos particularmente preferidos para uso de acordo com a presente invenção são anticorpos monoclonais anti-αvβ6 tais como aqueles descritos por Weinreb et al., em J. Biol. Chem. 279(17):17875-17877 (2004) (cuja exposição é aqui incorporada a título de referência em sua totalidade), incluindo os anticorpos monoclonais 6.8G6 ("8G6") e 6.3G9 ("3G9") descritos aí. Anticorpos adicionais que se ligam a αvβ6 e que, portanto, são adequados para uso de acordo com a presente invenção incluem anticorpos (ou fragmentos, variantes ou derivados destes) que se ligam à subunidade β6 da integrina αvβ6 (e que são portanto considerados "anticorpos anti-β6"), tais como aqueles descritos por Weinacker et al., em J. Cell Biol. 269:1-9 (1994), que é aqui incorporado a título de referência em sua totalidade; e na Patente US 6.692.741 B2, que é aqui incorporada a título de referência em sua totalidade, particularmente nas colunas 2-3 e 7-8 desta, incluindo o anticorpo monoclonal designado 10D5 (depósito ATCC No HB12382, depositado em 6 de agosto de 1997, American Type Culture Collection, P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108) (vide Patente US 6.692.741, coluna 3 linhas 7-13 e colunas 7-8) e CSβ6 (vide Patente US 6.692.741, colunas 7-8). Modalidades adequadas de acordo com esse aspecto da invenção usam ligantes de ligação de integrina αvβ6, que são anticorpos anti-αvβ6 ou seus fragmentos de ligação de epítopo αvβ6. Anticorpos adicionais adequados para uso de acordo com esse aspecto da invenção incluem, mas sem limitação, os anticorpos monoclonais de ligação de αvβ6 descritos na publicação de Pedido de Patente US 2005/0255102 A1, cuja exposição é aqui incorporada em sua totalidade, incluindo aqueles aí designados como 3G9, 8G6, 1A8, 2B1, 2B10, 2A1, 2E5, 1G10, 7G5, 1C5, bem como fragmentos, quimeras e híbridos destes. Anticorpos particularmente adequados para uso de acordo com a presente invenção são os anticorpos monoclonais 2B1, 3G9 e 8G6.

[000185] Em algumas modalidades, os anticorpos compreendem as mesmas seqüências de polipeptídeos de cadeias pesadas e leves como um anticorpo produzido por um hibridoma 6.1A8, 6.3G9, 6.8G6, 6.2B1, 6.2B10, 6.2A1, 6.2ES, 6.2E5, 7.1G10, 7.7G5, ou 7.1C5. Anticorpos particularmente adequados para uso de acordo com a presente invenção são anticorpos monoclonais que compreendem as mesmas seqüências de polipeptídeos de cadeias pesadas e leves como os anticorpos 2B2 produzidos pelo hibridoma 6.2B1 (depósito ATCC No PTA-36346, depositado em 16 de agosto de 2001, American Type Culture Collection, P.O Box 1549, Manassas, VA 20108), os anticorpos 8G6 produzidos pelo hibridoma 6.8G6 (depósito ATCC No PTA-3645, depositado em 16 de agosto de 2001, American Type Culture Collection, P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108) e os anticorpos 3G9 produzidos pelo hibridoma 6.3G9 (Depósito ATCC No PTA-3649, depositado em 16 de agosto de 2001, American Type Culture Collection, P.O Box 1549, Manassas, VA 20108) (vide Pedido Publicado US 2005/0255102 A1, cuja exposição é aqui incorporada a título de referência em sua totalidade, particularmente na página 1, parágrafo 008; na página 2, parágrafos 0032 e 0036; e nos Exemplos nas páginas 6-14), e o anticorpo designado como 10D5 (secretando o hibrodoma, cujo anticorpo foi depositado em 6 de agosto de 1997, como depósito ATCC No HB12382, American Type Culture Collection, P.O Box 1549, Manassas, VA 20108) (vide Patente US 6.692.741, cuja exposição foi aqui incorporada a título de referência em sua totalidade, particularmente na coluna 3 linhas 7-13, e nas colunas 7-8).

[000186] Em algumas modalidades, os anticorpos compreendem uma cadeia pesada cujas regiões determinantes de complementaridade (CDR) 1, 2 e 3 consistem essencialmente (isto é, com exceção de algumas variações conservativas) das seqüências mostradas na Tabela I abaixo. Em certas de tais modalidades, os anticorpos compreendem uma cadeia pesada cuja CDR1 consiste essencialmente em qualquer uma das SEQ ID Nos:101-105, cuja CDR2 consiste essencialmente em qualquer uma das SEQ ID NOs:106-111; e cuja CDR3 consiste essencialmente em qualquer uma das SEQ ID NOs:112-117; e/ou uma cadeia leve cujas CDRs 1, 2 e 3 consistem essencialmente em qualquer uma das SEQ ID NOs:118-123, 124-127, e 128-133, respectivamente

[000187] Em outras modalidades relacionadas, os anticorpos mono- clonais de acordo com a presente invenção são anticorpos quiméricos, isto é aqueles em que um anticorpo cognato de uma espécie (por exemplo, murino, rato ou coelho) é alterado por tecnologia de DNA recombinante de modo que parte ou todas as regiões de articulação e/ou constantes das cadeias pesadas e/ou leves são substituídas com os componentes correspondentes de um anticorpo proveniente de uma outra espécie (por exemplo, humana). Geralmente, os domínios variáveis do anticorpo engenheirado permanecem idênticos ou substancialmente assim para os domínios variáveis do anticorpo cognato. Tal anticorpo engenheirado é chamado de um anticorpo quimérico e é menos antigênico que o anticorpo cognato quando administrado a um indivíduo da espécie da qual a região de articulação e/ou constante é derivada (por exemplo, um ser humano). Métodos para produzir anticorpos quiméricos são bem-conhecidos da técnica.

[000188] Em outras modalidades relacionadas, os anticorpos mono- clonais de acordo com a presente invenção são anticorpos integralmente humanos. Métodos para produzir tais anticorpos monoclonais integralmente humanos são bem-conhecidos na técnica (vide, por exemplo, US 2005/0255102 A1, página 4, parágrafos 0069-0070, que é aqui incorporado a título de referência).

[000189] Em outras modalidades relacionadas, os anticorpos mono- clonais usados de acordo com a invenção são versões humanizadas de anticorpos anti-αvβ6 cognatos derivados de outras espécies. Um anticorpo humanizado é um anticorpo produzido por tecnologia de DNA recombinante, em que alguns ou todos os aminoácidos de uma cadeia leve ou pesada de imunoglobulina humana que não são requeridos para ligação de antígeno (por exemplo, as regiões constantes e as regiões de estrutura dos domínios variáveis) são usados para substituir os aminoácidos correspondentes provenientes da cadeia leve ou da cadeia pesada do anticorpo não humano, cognato. A título de exemplo, uma versão humanizada de um anticorpo murino para um dado antígeno tem, em ambas de sua cadeia pesada e cadeia leve: (a) regiões constantes de um anticorpo humano; (b) regiões de estrutura dos domínios variáveis de um anticorpo humano; e (c) CDRs do anticorpo murino. Quando necessário, um ou mais resíduos nas regiões de estrutura humana podem ser alteradas para resíduos nas posições correspondentes de modo a conservar a afinidade de ligação do anticorpo humanizado para o antígeno. Essa alteração é algumas vezes chamada de "retromutação". Os anticorpos humanizados são geralmente menos prováveis de elicitar uma resposta imune em comparação com os anticorpos humanos quiméricos porque os primeiros contêm consideravelmente menos componentes humanos. Métodos para produzir tais anticorpos monoclonais humanizados são bem-conhecidos da técnica (vide, por exemplo, US 2005/0255102 A1, páginas 4 e 5, parágrafos 0072-0077, que são aqui incorporados a título de referência).

[000190] Em tais modalidades adicionais, os anticorpos humanizados compreendem uma ou mais CDRs na cadeia pesada e/ou leve que são derivadas das CDRs correspondentes na cadeia pesada e/ou cadeia leve de um anticorpo diferente. Um exemplo não limitativo adequado de tal anticorpo é um anticorpo 3G9 humanizado compreendendo uma CDR1 de cadeia leve que tem a seqüência da CDR1 de cadeia leve derivada do anticorpo 2B1 (SEQ ID NO:20) em vez da seqüência da CDR1 da cadeia leve para o anticorpo 3G9 depositado (SEQ ID NO:21). Tal anticorpo 3G9 humanizado tendo uma seqüência de CDR1 de cadeia leve estabelecida na SEQ ID NO:20 é desenhada aqui como hu3G9 (ou BG00011). Um outro exemplo não limitativo adequado de tal anticorpo é um anticorpo 8G6 humanizado compreendendo uma CDR1 de cadeia leve que tem a seqüência da CDR1 de cadeia leve derivada do anticorpo 2B1 (SEQ ID NO:20) em vez da seqüência da CDR1 de cadeia leve para o anticorpo 8G6 depositado (SEQ ID NO:18). Tal anticorpo 8G6 humanizado tendo uma seqüência de CDR de cadeia leve estabelecida na SEQ ID NO:20 é designada aqui como hu8G9. Exemplos adicionais de tais anticorpos derivados, em que uma mais das CDRs de cadeia pesada e/ou cadeia leve foram substituídas com uma ou mais CDRs correspondentes de cadeia pesada e/ou cadeia leve de um outro anticorpo, e que são adequados para uso de acordo com a presente invenção, serão prontamente aparentes para aqueles versado na técnica em vista das seqüências mostradas na Tabela I e as instruções proporcionadas aqui. Métodos adequados para preparar tais anticorpos humanizados, incluindo tais anticorpos humanizados derivados, são familiares para aqueles versado na técnica e são mostrados, por exemplo, no Pedido de Patente Publicado US 2005/0255102 A1, cuja exposição é aqui incorporada a título de referência em sua totalidade. Conjugados e Outras Modificações de Ligantes de Ligação de αvβ6

[000191] Em certas modalidades, os ligantes, por exemplo, os anticorpos que se ligam a αvβ6 podem ser usados em forma não conjugada. Em outras modalidades, os ligantes, por exemplo, os anticorpos, que se ligam a αvβ6, por exemplo, a um rótulo detectável, um fármaco, pró- fármaco ou um isótopo.

[000192] Em certos métodos da invenção descrita aqui mais detalhadamente abaixo, tais métodos para detectar expressão de αvβ6 em células ou tecidos como uma medida do potencial metastático de células tumorais, ou como um modo de identificar carcinomas in situ (por exemplo, DCIS ou LCIS) em tecidos, os ligantes de ligação de αvβ6 (por exemplo, anticorpos) são conjugados a um ou mais rótulos detectáveis. Para tais usos, os ligantes de ligação de αvβθ, por exemplo, anticorpos de ligação de αvβθ, podem ser detectavelmente marcados por ligação covalente ou não covalente de um agente cromogênico, enzimático, radioisotópico, isotópico, fluorescente, tóxico, quimioluminescente, de contraste de ressonância magnética nuclear ou outro rótulo.

[000193] Exemplos de rótulos cromogênicos adequados incluem diaminobenzidina e ácido 4-hidroxiazo-benzeno-2-carboxílico.

[000194] Exemplos de rótulos de enzima adequados incluem malato desidrogenase, estafilococo nuclease, A-5-esteróide isomerase, álcool de levedura desidrogenase, fosfato de α-glicerol desidrogenase, triose fosfato isomerase, peroxidase, fosfatase alcalina, asparaginase, glicose oxidase, β-galactosidase, ribonuclease, urease, catalase, glicose-θ- fosfato desidrogenase, glicoamilase e acetilcolina esterase.

[000195] Exemplos de rótulos radioisotópicos adequados incluem 3H, 111In, 125I, 131I, 32P, 35S, 14C, 51Cr, 57To, 58Co, 59Fe, 75Se, 152Eu, 90Y, θ7Cu, 217Ci, 211At, 212Pb, 47Sc, 109Pd, etc. 111In é um isótopo preferido quando imageamento in vivo é usado, pois ele evita o problema de desalogenação dos ligantes de ligação a αvβθ marcados com 125I ou 131I pelo fígado. Além disso, esse radionucleotídeo tem uma energia de emissão gama mais favorável para o imageamento (Perkins et al., Eur. J. Nucl. Med. 10:296-301 (1985); Carasquillo et al., J. Nucl. Med. 28:281-287 (1987)). Por exemplo, 111In acoplado a anticorpos monoclonais com 1-(P-isotiocianatobenzil)-DOTA mostrou pouca absorção em tecidos tumorais, particularmente o fígado, e, portanto, intensifica a especificidade da localização tumoral (Esteban et al., J. Nucl. Med. 28:861-870 (1987)).

[000196] Exemplos de rótulos isotópicos não radiativos incluem 157Gd, 55Mn, 162Dy, 52Tr, e 56Fe.

[000197] Exemplos de rótulos fluorescentes adequados incluem um rótulo de 152Eu, um rótulo de fluoresceína, um rótulo de isotiocianato, um rótulo de rodamina, um rótulo de ficoeritrina, um rótulo de ficocia- nina, um rótulo de aloficocianina, um rótulo de Proteína Fluorescente Verde, um rótulo de o-ftalaldeído, e um rótulo de fluorescamina.

[000198] Exemplos de rótulos de toxina adequados incluem toxina da difteria, ricina, e toxina da cólera.

[000199] Exemplos de rótulos quimioluminescente incluem rótulo de luminol, rótulo de isoluminol, rótulo de éster de acridínio aromático, rótulo de imidazol, rótulo de sal de acridínio, rótulo de éster de oxalato, rótulo de luciferina, rótulo de luciferase e rótulo de aequorina.

[000200] Exemplos de agentes de contraste de ressonância magnética nuclear incluem núcleos de metal pesado, tais como Gd, Mn, e ferro.

[000201] Técnicas típicas para ligar os rótulos descritos acima a ligante de ligação de αvβ6, por exemplo, anticorpos de ligação de αvβ6, são proporcionados por Kennedy et al., Clin. Chim. Acta 70:1-31 (1976), e Schurs et al., Clin. Chim. Acta 81:1-40 (1977). Técnicas de acoplamento mencionadas no último compreendem o método de glutaraldeído, o método de periodato, o método de dimaleimida, o método de éster de m-maleimidobenzil-N-hidróxi-succinimida, todos os quais são aqui incorporados a título de referência.

[000202] Para uso em certas abordagens terapêuticas da invenção, tal como ablação de células tumorais residuais seguinte à cirurgia, ou prevenção de metástase, os ligantes de ligação de αvβ6 podem ser conjugados a um ou mais fármacos, pró-fármacos ou isótopos. Tais conjugados preferidos compreendem um ou mais ligantes, por exemplo, um ou mais anticorpos ou fragmentos, derivados ou variantes destes, que se ligam a αvβ6, conjugados a um ou mais agentes citotóxicos; tais conjugados são úteis nos métodos de tratamento ou prevenção de metástase tumoral proporcionados pela invenção. De acordo com certas de tais modalidades da invenção, o ligante de ligação de αvβ6, por exemplo, anticorpo, é conjugado a um agente citotóxico. Agentes citotóxicos, por exemplo, quimioterapêuticos úteis na geração de conjugados de ligante de ligação de αvβ6-agente citotóxico são bem- conhecidos na técnica, e incluem, mas sem limitação, cisplatina, carboplatina, oxaliplatina, paclitaxel, melfalano, doxorrubicina, metotre- xato, 5-fluoruracila, etoposídeo, meclorretamina, ciclofosfamida, e bleomicina. Outros agentes quimioterapêuticos adequados para uso de acordo com esse aspecto da invenção são bem-conhecidos e serão familiares àquele versado na técnica.

[000203] O uso de conjugados de uma ou mais ligantes de ligação de αvβθ, por exemplo, um ou mais anticorpos de ligação de αvβθ, e uma ou mais toxinas de moléculas pequenas, tais como caliqueamicina, maitansina (Patente US 5.208.020), tricoteno, e CC1065, é também contemplado aqui. Em uma modalidade da invenção, o ligante de ligação de αvβθ é conjugado a uma ou mais moléculas de maitansina (por exemplo, cerca de 1 a cerca de 10 moléculas de maitansina por ligante de ligação de αvβ6). Maitansina pode, por exemplo, ser convertida em May-SS-Me, que pode ser reduzida para May-SH3 e reagida com ligantes de ligação de αvβ6 modificado (Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992)) para gerar um conjugado de maitansinóide-ligante de ligação de αvβ6.

[000204] Alternativamente, o ligante de ligação de αvβ6 pode ser conjugado a uma ou mais moléculas de caliqueamicina. A família de caliqueamicina de antibióticos é capaz de produzir rupturas em DNA de duplo filamento em concentrações sub-picomolares. Análogos estruturais de caliqueamicina, que podem ser usados, incluem, mas sem limitação, y11, α21, a31, N-acetil-y11, PSAG e Φ11 (Hinman et al., Cancer Research 53: 3336-3342 (1993) e Lode et al., Cancer Research 58: 2925-2928 (1998)).

[000205] Toxinas enzimaticamente ativas e fragmentos destas, que podem ser usadas para produzir conjugados com um ou mais ligantes de ligação de αvβ6, por exemplo, um ou mais anticorpos de ligação de αvβ6, incluem cadeia A da difteria, fragmentos ativos não ligantes da toxina da difteria, cadeia A da exotoxina (proveniente de Pseudomonas aeruginosa), cadeia A da ricina, cadeia A da abrina, cadeia A da modeccina, alfa-sarcina, proteínas de Aleuritesfordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII, e PAP-S), inibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inibidor de Sapoanaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina,e os tricotecenos. Vide, por exemplo, WO 93/21232 publicado em língua inglesa em 28 de outubro de 1993, cuja descrião é aqui incorporada a título de referência, em sua totalidade. Mitansinóides podem ser também conjugados a um ou mais ligantes de αvβ6, por exemplo, um ou mais anticorpos de ligação de αvβ6.

[000206] A presente invenção contempla ainda ligantes de ligação de avβ6 conjugados com um composto tendo atividade nucleolítica (por exemplo, uma ribonuclease ou uma DNA endonuclease tal como desoxirribonuclease; DNase).

[000207] Uma variedade de isótopos radiativos está também disponível para a produção de ligantes de ligação de αvβ6 para uso em métodos terapêuticos da invenção. Exemplos incluem 211At, 131I, 125I, 90Y, 186Re, 188Re, 153Sm, 212Bi, 32P e isótopos radiativos de Lu.

[000208] Conjugados dos ligantes de ligação de αvβe e agentes citotóxicos podem ser preparados usando uma variedade de agentes de acoplamento tais como propionato de N-succunimidil-3-(2-piridiltiol) (SPDP), succinimidil-4-(N-maleimidometil)cicloexano-I-carboxilato, iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (tal como cloridrato de adipimidato de dimetila), ésteres ativos (tal como suberato de dissuccinimidila), aldeídos (tal como glutaraldeído), compostos de his-azido (tal como bis(p-azidobenzoil) hexanodiamina), derivados de bis-diazônio (tal como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilenodiamina), dissocia- natos (tal como 2,6-diisocianato de tolieno), e compostos de flúor bis- ativos (tal como 1,5-diflúor)-2,4-dinitrobenzeno). Por exemplo, uma imunotoxina de ricina pode ser preparada conforme descrição por Vitetta et al., Science 238: 1098 (1987). O ácido 1-isotiocianatobenzil-3- metildietileno triaminopentaacético marcado com 14C (MX-DPTA) é um exemplo de agente quelante para conjugação de radionucleotídeo ao ligante de ligação de αvβ6. Vide WO 94/11026. O ligante pode ser um "ligante clivável" facilitador de liberação do fármaco citotóxico na célula. Por exemplo, um ligante ácido-lábil, ligante sensível à peptidase, ligante de dimetila ou ligante contendo dissulfeto (Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992)) pode ser usado.

[000209] Alternativamente, uma proteína de fusão compreendendo um ligante de ligação de αvβ6 e agente citotóxico pode ser feita, por exemplo, por técnicas recombinantes ou síntese de peptídeo.

[000210] Em ainda uma outra modalidade, o ligante de ligação de αvβ6 pode ser conjugado a um "receptor" (tal como estreptavidina) para uso em "pré-marcação", em que o conjugado de ligante de ligação de αvβ6-receptor é administrado ao paciente, seguido por remoção de um conjugado não ligado da circulação usando um agente de depuração e então administração de um ligante (por exemplo, avidina) que é conjugado a um agente citotóxico (por exemplo, um radionuclídeo).

[000211] Os ligantes de ligação de αvβ6 da presente invenção podem também ser conjugados com uma enzima ativadora de pró-fármaco, que converte um pró-fármaco (por exemplo, um agente quimioterapêutico de peptidila, vide WO 81/01145) em um fármaco ativo. Vide por exemplo, WO 88/07378 e a Patente US 4.975.278. O componente enzimático de tais conjugados inclui qualquer enzima capaz de agir em um pró-fármaco de tal modo a convertê-lo em sua forma citotóxica mais ativa.

[000212] Enzimas que são úteis no método desta invenção incluem, mas sem limitação, fosfatase alcalina útil para converter pró-fármacos contendo fosfato em fármacos livres; arilsulfatase útil para converter pró-fármacos contendo sulfato em fármacos livres; citosina desaminase útil para converter 5-fluorcitosina atóxica no fármaco anticâncer, 5- fluoruracila; proteases, tais como Serratia protease, termolisina, subtilisina, carboxipeptidases e catepsinas (tais como catepsinas B e L), que são úteis para converter pró-fármacos contendo peptídeos em fármacos livres; D-alanilcarboxipeptidases, úteis para converter pró- fármacos que contêm substituintes D-aminoácidos; enzimas clivadoras de carboidrato tais como O-galactosidase e neuraiminidase útil para converter pró-fármacos glicosilados em fármacos livres; P-lactamase útil para converter fármacos derivatizados com P-lactans em fármacos livres; e penicilina amidases, tal como penicilina V amidase e penicilina G amidase, úteis para converter fármacos derivatizados em seus nitrogênios de amina com os grupos fenoxiacetila ou fenilacetila, respectivamente, em fármacos livres.

[000213] As enzimas podem ser covalentemente ligadas ao ligante de ligação de αvβ6 por técnicas bem-conhecidas na área, tal como o uso dos reagentes de reticulação heterobifuncionais. Alternativamente, proteínas de fusão compreendendo pelo menos a região de ligação de antígeno de um ligante de ligação de αvβ6 da invenção ligada a pelo menos uma porção funcionalmente ativa de uma enzima podem ser construídas usando técnicas de DNA recombinante bem-conhecidas na área (vide, por exemplo, Neuberger et al., Nature 312: 604-608 (1984)). Diagnóstico e Prognósticos das Doenças

[000214] Foi verificado que as células de certos tumores que são metastáticos expressam níveis significantemente aumentados de integrina αvβe quando em comparação com células que são menos metastáticas ou não metastáticas. Além disso, os presentes inventores descobriram que em certas formas de carcinoma in situ, por exemplo, carcinoma ductal in situ (DCIS) ou carcinoma lobular in situ (LCIS) da mama, o mioepitélio que circunda o tumor expressa níveis significante- mente aumentados de integrina αvβ6 com relação às células tumorais do carcinoma e com relação ao tecido de mama normal. Assim, a invenção proporciona um método útil para diagnosticar o potencial metastático de uma célula tumoral, incluindo tumores de carcinomas tal como um adenocarcinoma. Em modalidades mais particulares, o carcinoma é um carcinoma da mama, um carcinoma do endométrio, um carcinoma pancreático, um carcinoma colorretal, um carcinoma do pulmão, um carcinoma ovariano, um carcinoma cervical, um carcinoma prostático, um carcinoma do fígado, um carcinoma esofágico, um carcinoma da cabeça ou do pescoço, um carcinoma do estômago ou um carcinoma esplênico. Mais particularmente, o carcinoma é um carcinoma da mama (incluindo, mas sem limitação, um carcinoma da mama in situ, tal como carcinoma ductal in situ (DCIS) ou carcinoma lobular in situ (LCIS), um carcinoma do endométrio, um carcinoma pancreático, um carcinoma colorretal, um carcinoma cervical, ou um carcinoma do pulmão.

[000215] Métodos, de acordo com este aspecto da invenção, envolvem ensaiar o nível de expressão de αvβ6 nas células tumorais ou no mioepitélio em uma amostra de tecido, e comparar esses níveis de expressão com um nível de expressão de αvβ6 padrão (por exemplo, em células normais, células não metastáticas, ou tecido normal, preferivelmente obtidos do mesmo animal, tal como um paciente humano), em que um aumento da expressão de αvβ6 em um tumor ou nas células deste é indicativo de um potencial invasivo e/ou metastático maior daquelas células tumorais ou de suas células, ou em que um aumento da expressão de αvβ6 no mioepitélio que circunda um tumor ou cluster de células epiteliais em uma seção tecidual é indicativo da presença de um carcinoma in situ, por exemplo, DCIS ou LCIS, que é mais provável de se tornar invasivo e potencialmente formar metástases.

[000216] Se um diagnóstico de câncer já foi feito de acordo com métodos convencionais, a presente invenção é útil como um indicador prognóstico, por meio de que as células tumorais exibindo níveis aumentados de expressão de αvβ6 serão preditas como tendo maior probabilidade de se tornarem invasivas e metastatizarem a partir do sítio de tumor primário para um sítio metastático distal. Similarmente, se um diagnóstico suspeito de um carcinoma in situ foi realizado de acordo com métodos convencionais (por exemplo, detecção mamográfica de nódulos calcificados na mama), a presente invenção é útil como um indicador confirmatório, por meio do que o tecido que foi submetido à biópsia da área de calcificação exibindo níveis aumentados de expressão de αvβ6 no mioepitélio indica a presença de um carcinoma in situ, por exemplo, DCIS ou LCIS, que se tornarão invasivos e podem responder ao tratamento com αvβ6 mAb. Com base em tais resultados prognósticos e diagnósticos, o médico responsável pelo tratamento pode então ajustar o regime de tratamento de acordo, proporcionando assim detecção mais cedo de uma condição pré-metastática ou pré- cancerosa e assim uma resultado clínico mais favorável para o paciente.

[000217] Por "ensaiando os níveis de expressão de αvβ6" deve ser entendido medir ou avaliar qualitativa e quantitativamente os níveis de avβ6 em uma primeira amostra biológica (por exemplo, uma amostra de tumor, uma biópsia de tecido, ou aspirado, etc.) tanto diretamente (por exemplo, por determinação ou avaliação da quantidade absoluta de αvβ6na amostra) como relativamente (por exemplo, por comparação do nível de expressão de αvβ6 em uma primeira amostra biológica com aquele em uma segunda amostra biológica). Preferivelmente, o nível de αvβ6 na primeira amostra biológica é medido ou avaliado e comparado com aquele em um padrão tirado de uma segunda amostra biológica obtida de um indivíduo que não tem câncer ou lesão pré-cancerosa. Como será apreciado por aquele versado na técnica, uma vez que um nível de expressão de αvβ6 padrão é conhecido para um dado tecido não canceroso, ele pode ser usado repetidamente como um padrão para comparação.

[000218] Por "amostra biológica" deve ser entendido qualquer amostra biológica obtida de um indivíduo (tal como um paciente), linhagem celular, cultura de tecido, ou de outra fonte, que pode conter células ou produtos celulares, tal como matriz extracelular. Tais amostras biológicas incluem tecidos e células do corpo, incluindo leucócito, ovário, próstata, coração, placenta, pâncreas, fígado, baço, pulmão, mama, tecidos da cabeça e do pescoço (por exemplo, tecidos orais, faríngeos, linguais e laríngeos), tecidos do endométrio, cólon (ou colorretal), cervical, do estômago e umbilicais, que podem expressar αvβ6. Métodos para obter biópsias de tecidos e fluidos corporais de mamíferos são bem-conhecidos na técnica. Os mamíferos preferidos incluem macacos, gatos, cachorros, vacas, porcos, cavalos, coelhos e seres humanos. Particularmente preferidos são os seres humanos.

[000219] Ensaio dos níveis de expressão de αvβ6 em uma amostra biológica pode ser feito usando qualquer método conhecido da técnica. Preferidas para ensaio dos níveis de expressão de αvβ6 em uma amostra biológica são as técnicas imunobiológicas. Por exemplo, expressão de αvβ6 em tecido pode ser estudada com métodos imunoistológicos clássicos. Nesses, o reconhecimento específico é proporcionado por um ligante primário, por exemplo, um anticorpo (policlonal ou monoclonal), que se ligada a αvβ6. Esse ligante primário pode ser marcado, por exemplo, com um rótulo fluorescente, quimioluminescente, fosforescente, enzimático ou radioisotônico. Alternativamente, esses métodos da invenção podem usar um sistema de detecção secundário no qual um segundo ligante que reconhece e se liga ao ligante de ligação de αvβ6, por exemplo, um assim chamado anticorpo "secundário", que reconhece e se liga a um primeiro anticorpo de ligação de αvβ6, é detectavelmente marcado como descrito acima. Como resultado, uma coloração imunoistológica da seção de tecido para exame patológico é obtida. Alternativamente, os tecidos e amostras de células podem também ser extraídos, por exemplo, com uréia e detergente neutro, para a liberação de proteína αvβ6 para o ensaio Western blot ou dot/slot (Jalkanen, M., et al., J. Cell. Biol. 101:976-985 (1985); Jalkanen, M., et al., J. Cell Biol. 105:3087-3096 (1987)) para quantificação direta, com relação a um tecido padrão ou amostra de célula conhecidos como tendo níveis mais baixos de expressão de αvβ6.

[000220] Como notado acima, os métodos da presente invenção são úteis para detectar cânceres metastáticos em mamíferos, para determinar o potencial metastático de uma célula tumoral (isto é predizer a probabilidade que uma dada célula tumoral metastatizará do sítio tumoral primário para um sítio metastático distal), e para determinar a probabilidade que um carcinoma não invasivo ou in situ progredirá para um carcinoma invasivo ou metastático. Em particular, os métodos da invenção são úteis para detectar cânceres invasivos e/ou metastáticos de células epiteliais (isto é carcinomas invasivos e/ou metastáticos), incluindo tecidos da mama, ovário, próstata, fígado, pulmão, pâncreas, cólon (ou colorretal), tecidos da cabeça e do pescoço (por exemplo, tecidos orais, linguais e laríngeos) do endométrio, da cérvice, estômago e baço. Particularmente adequados para detecção pelos métodos da presente invenção são os adenocarcinomas metastáticos, incluindo, mas sem limitação, carcinomas do pulmão, carcinomas pancreáticos, carcinomas colorretais, carcinomas cervicais, carcinomas do pulmão, carcinomas in situ, tal como certo carcinoma ductal in situ (DCIS) ou carcinoma lobular in situ (LCIS) da mama, que têm probabilidade elevada para progredir para um fenótipo invasivo e/ou metastático. A identificação e o tratamento precoces de tais carcinomas estão associados a um melhor prognóstico de longo prazo para os pacientes. Por exemplo, foi reportado que se deixado não tratado, uma proporção significante de tumores DCIS se tornam invasivos e podem levar a cânceres metastáticos que têm um prognóstico bem mais pobre (vide Sakorafas, G.H., e Tsiotou, A.G.H., Cancer Treatment Rev. 26:103-125 (2000)).

[000221] Por conseguinte, a presente invenção contempla métodos para tratar ou prevenir cânceres metastáticos por identificação das lesões pré-invasivas ou carcinomas em pacientes, e tratar o paciente para eliminar a lesão pré-invasiva antes que ela tenha a oportunidade de evoluir para uma forma invasiva. Tais métodos compreendem, por exemplo, (a) obter uma amostra de tecido que é suspeita de conter um câncer ou uma lesão pré-invasiva, e uma amostra de tecido que não contém nem câncer nem lesão pré-invasiva (preferivelmente do mesmo tecido ou órgão que aquele suspeito de conter câncer ou lesão pré- invasiva); (b) contatar as amostras de tecido com um ou mais ligantes de ligação de αvβ6, tais como um ou mais anticorpos de ligação de αvβ6 ou fragmentos destes, sob condições que favoreçam a ligação do um ou mais ligantes de ligação de αvβ6 às integrinas αvβ6 no qualquer que seja o tecido presente; e (c) detectar o nível ou padrão de ligação do(s) ligante(s) de ligação de αvβ6 ao tecido, em que um aumento da ligação localizada do ligante de ligação de αvβ6 no mioepitélio que circunda uma hiperplasia (por exemplo, um tumor) com relação à ligação na própria hiperplasia (ou células desta), ou um aumento do nível de ligação do ligante de ligação de αvβ6 na amostra de tecido contendo a lesão cancerosa ou pré-invasiva com relação à ligação na amostra de tecido não canceroso (ou células deste), é indicativo de carcinoma que é mais provável de se tornar invasivo e potencialmente metastatizar. Em outras modalidades relacionadas, a invenção contempla métodos para reduzir ou prevenir a progressão de um tumor pré-metastático ou pré- invasivo para um tumor metastático ou invasivo em um paciente, compreendendo a administração ao paciente de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ou mais ligantes que se ligam a uma ou mais subunidades de integrina αvβ6 em uma ou mais células no tumor pré-metastático ou pré-invasivo, em que a ligação do ligante à integrina resulta na redução ou prevenção de uma invasão de células do câncer pré-metastático ou pré-invasivo em áreas teciduais que circundam o tumor primário.

[000222] Tecidos e órgãos adequados dos quais as amostras podem ser obtidas para uso de acordo com estes métodos da invenção incluem, mas sem limitação, os tecidos epiteliais descritos em algum lugar aqui. Cânceres e tumores que podem ser vantajosamente tratados ou prevenidos de acordo com tais métodos da invenção incluem, mas não são necessariamente limitados a, carcinomas, particularmente adenocarcinomas, incluindo os carcinomas e adenocarcinomas descritos em detalhes em algum lugar aqui. Uma vez que um carcinoma tenha sido detectado de acordo com os métodos da invenção, ele pode ser então eliminado do paciente por meio de cirúrgica, quimioterapêutica, radiológica ou outros métodos de terapia de câncer que são bem-conhecidos da técnica e que, portanto, serão familiares àqueles versados. Alternativamente, tal carcinoma pode ser eliminado usando os métodos de tratamento da presente invenção, por administração ao paciente, ou aos órgãos ou tecidos do paciente, de um ou mais ligantes de ligação de αvβ6, tal como um ou mais anticorpos de ligação de αvβ6 ou fragmentos destes. Em certos exemplos não limitativos de tais modalidades, o um ou mais ligantes de ligação de αvβ6 foram conjugados com um ou mais compostos ou agentes citotóxicos conforme descrito em detalhes acima. Em exemplos não limitativos adicionais de tais modalidades, o um ou mais ligantes de ligação de αvβ6, tal como um ou mais anticorpos de ligação de αvβ6 ou fragmentos destes, são administrados a um indivíduo, tal como um paciente, em conjunto com um ou mais compostos ou agentes citotóxicos conforme descrição detalhada acima.

[000223] Em modalidades relacionadas, a invenção contempla determinar o potencial metastático de um tumor ou célula cancerosa por medição da expressão de αvβ6 pelo tumor ou célula cancerosa. Em tais modalidades, as amostras de tumor ou célula são obtidas de um paciente conforme descrição acima e são ensaiadas de acordo com os métodos descritos aqui para o nível de expressão de αvβ6 no tumor ou célula cancerosa. Tais métodos preferidos incluem imunoistoquímica, usando anticorpos de ligação de αvβ6 (ou fragmentos, variantes ou derivados destes), tais como aqueles descritos aqui. De acordo com esses métodos da invenção, há uma correlação direta entre o nível de expressão de αvβ6 pelo tumor ou célula cancerosa e o potencial metastático do tumor ou célula cancerosa: um aumento da expressão de αvβ6 por um tumor ou célula cancerosa indica que aquele tumor ou célula cancerosa é provável de metastatizar para um local secundário do sítio de tumor primário. Logo, o nível de expressão de αvβ6 por um tumor ou célula cancerosa pode ser usado como um indicador prognóstico do potencial metastático de um tumor ou célula cancerosa, que pode auxiliar pacientes com câncer e seus médicos a tomar as decisões apropriadas de tratamento com base na presente ou futura agressividade ou invasividade, prevista, do câncer.

[000224] Além de ensaiar níveis de expressão de αvβ6 em uma amostra biológica obtida de um indivíduo, tal como uma amostra de tecido ou de célula tumoral, o nível e padrão de expressão de αvβ6 podem ser também detectados in vivo por imageamento. Em tais métodos da invenção, um ou mais ligantes de ligação de αvβ6, por exemplo, um ou mais anticorpos de ligação de αvβ6, são detectável- mente marcados com um ou mais rótulos adequados para imageamento in vivo. Rótulos ou rótulos adequados para imageamento in vivo incluem aqueles detectáveis por radiografia X, RMN ou ESR. Para radiografia X, os rótulos incluem radioisótopos tais como bário e césio, que emitem radiação detectável, mas não são manifestamente prejudiciais ao paciente. Rótulos adequados para RMN e ESR incluem aqueles com spin característico detectável tal como deutério.

[000225] Um ligante se ligando a αvβ6, por exemplo, um anticorpo de ligação de αvβ6 ou anticorpo deste, que tenha sido marcado com uma porção de imageamento detectável apropriada, tal como um radioi- sótopo (por exemplo, 131I, 112In, 99mTc), uma substância radiopaca, ou um material detectável por ressonância magnética nuclear, é introduzida (por exemplo, via parenteral, subcutânea ou intraperitoneal) no mamífero a ser examinado para câncer ou carcinoma in situ. Será entendido na técnica que o tamanho do paciente e o sistema de imageamento usado determinarão a quantidade da porção de imageamento necessária para produzir imagens para diagnóstico. No caso de uma porção de radioisótopo, para um paciente humano, a quantidade de radioatividade injetada variará normalmente de cerca de 5 a 20 milicuries de 99cTc. O ligante de αvβ6 marcado, por exemplo, anticorpo ligação de αvβ6 ou fragmento de anticorpo, acumular-se-á preferencialmente no local das células ou tecidos que contêm ou expressam integrina αvβ6. O imageamento de tumor in vivo é então obtido como descrito por S.W. Burchiel et al., "Immunopharmacokinetics of Radiolabelled Antibodies and Their Fragments" (Capítulo 13 em Tumor Imaging: The Radiochemical Detection of Cancer, S.W. Burchiel e B.A. Rhodes, eds. Masson Publishing Inc. (1982)). Usos Terapêuticos de Ligantes de Ligação de αvβ6

[000226] Em modalidades adicionais da invenção, ligantes de ligação de αvβθ, tais como anticorpos de ligação de αvβ6 ou fragmentos destes, podem ser usados em regimes terapêuticos para tratar animais afligidos com certas doenças, particularmente com certos carcinomas tais como aqueles descritos em algum lugar aqui. Tais métodos da invenção são úteis para tratar câncer e eventos associados, incluindo crescimento de tumor, metástase e angiogênese. Particularmente receptivos a tal tratamento são aquelas doenças ou cânceres que são caracterizados por níveis aumentados de expressão de αvβθ nos tecidos ou células de um mamífero que sofre da doença e que são responsivos aos tratamentos que alvejam os tecidos ou células que expressam elevados níveis de αvβ6 e eliminam aqueles tecidos ou células. Doenças que são particularmente tratáveis por esses métodos incluem cânceres metastáticos de tecidos epiteliais (isto é carcinomas metastáticos e/ou adenocarcinomas), incluindo mama, ovário, próstata, fígado, pulmão, pâncreas, cólon, tecidos da cabeça e do pescoço (por exemplo, tecidos orais, faríngeos, linguais e laríngeos), endométrio, cérvice, estômago e baço. Particularmente adequados para o tratamento por esses métodos da presente invenção são carcinomas do endométrio, pâncreas, cólon (por exemplo, carcinomas colorretais), cérvice, pulmão e mama (incluindo carcinoma ductal in situ (DCIS) e carcinoma lobular in situ (LCIS) da mama). Mamíferos preferidos para tratamento incluem macacos, gatos, cachorros, vacas, porcos, cavalos, coelhos e seres humanos. Particularmente preferidos são os seres humanos.

[000227] Em certas de tais regimes terapêuticos, os métodos da invenção são adequados para eliminar células tumorais residuais, por exemplo, de células metastáticas residuais, seguinte à remoção, tratamento ou erradicação de um tumor por uma abordagem diferente. Por exemplo, tais métodos da invenção podem ser usados para eliminar células tumorais residuais ou células metastáticas que podem permanecer no paciente seguinte à excisão cirúrgica de um tumor, ou erradicação do tumor por métodos tais como irradiação, quimioterapia e similares. Em tais regimes terapêuticos, os métodos da invenção podem compreender administrar os ligantes de ligação de αvβ6, por exemplo, os anticorpos de ligação de αvβ6 ou fragmentos destes, a um paciente antes, durante, e/ou seguinte à ablação cirúrgica, radiológica e/ou quimioterapêutica do tumor.

[000228] Em modalidades relacionadas, como descritas acima, a invenção proporciona métodos para reduzir ou prevenir a progressão de um tumor pré-metastático para um tumor metastático em um paciente, compreendendo administrar ao paciente uma quantidade terapêutica-mente eficaz de um ou mais ligantes que se ligam a uma ou mais subunidades de integrina αvβ6 em uma ou mais células no tumor pré- metastático, em que a ligação do ligante à integrina resulta na redução ou prevenção da invasão de células do câncer pré-metastático nas áreas de tecido que circundam o tumor primário.

[000229] Ao efetuar esses métodos terapêuticos da invenção, os ligantes de ligação de αvβ6, tais como anticorpos de ligação de αvβ6 ou fragmentos destes, podem ser administrados aos pacientes na forma de formulações terapêuticas (que são também aqui referidas de modo intercambiável e equivalente como composições farmacêuticas). As formulações terapêuticas dos ligantes de ligação de αvβ6 usados de acordo com a presente invenção são preparados para armazenagem por mistura de um ligante de ligação de αvβ6 tendo o grau desejado de pureza com veículos, excipientes ou estabilizantes, opcionais, farmaceuticamente aceitáveis (Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16a Edição, Osol, A. Ed. (1980)), por exemplo, na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Além dos compostos farmacológica-mente ativos tais como os ligantes de ligação de αvβ6, as composições usadas nos métodos terapêuticos da invenção podem conter um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis compreendendo excipi- entes e auxiliares que facilitam o processamento dos compostos ativos nas preparações que podem ser usadas farmaceuticamente. As preparações farmacêuticas da presente invenção são fabricadas em um modo que é conhecido per se, por exemplo, por meio de processos convencionais de misturamento, granulação, fabricação de drágeas, dissolução, ou liofilização. Assim, as preparações farmacêuticas para uso oral podem ser obtidas por combinação dos compostos ativos com excipientes sólidos, triturando, opcionalmente, a mistura resultante e processando a mistura de grânulos, depois de adicionar auxiliares adequados, se desejado ou necessário, para obtenção de comprimidos ou núcleos de drágeas.

[000230] Excipientes adequados são, em particular, cargas tais como sacarídeos, por exemplo, lactose ou sacarose, manitol ou sorbitol, preparações de celulose e/ou fosfatos de cálcio, por exemplo, fosfato de tricálcio ou hidrogeno-fosfato de cálcio, bem como ligantes, tal como pasta de amido, usando, por exemplo, amido de milho, amido de trigo, amido de arroz, amido de batata, gelatina, tragacanto, metil celulose, hidroxipropil metilcelulose, carboximetilcelulose sódica, e/ou polivinil pirrolidona. Se desejado, agentes desintegradores podem ser adicionados, tais como os amidos mencionados acima e também carboximetil-amido, polivinil pirrolidona reticulada, ágar, ou ácido algínico ou um sal deste, tal como alginato de sódio. Auxiliares são, acima de tudo, agentes reguladores de fluxo e lubrificantes, por exemplo, sílica, talco, ácido esteárico ou sais destes, tais como estearato de magnésio ou estearato de cálcio, e/ou polietileno glicol. Núcleos de drágeas são proporcionados com revestimentos adequados, que, se desejado, são resistentes aos sucos gástricos. Com essa finalidade, soluções concentradas de sacarídeo podem ser usadas, que podem conter opcionalmente goma arábica, talco, polivinil pirrolidona, polietileno glicol, e/ou dióxido de titânio, soluções de laca e solventes orgânicos adequados ou misturas de solventes. De modo a produzir revestimentos resistentes aos sucos gástricos, soluções de preparações de celulose adequadas, tal como ftalato de acetilcelulose ou ftalato de hidroxipropilmeticelulose, são usadas. Produtos corantes ou pigmentos podem ser adicionados aos comprimidos ou revestimentos de drágea, por exemplo, para identificação ou de modo a caracterizar combinações de doses de compostos ativos.

[000231] Outras preparações farmacêuticas que podem ser usadas oralmente incluem cápsula de encaixe por pressão feitas de gelatina, bem como cápsulas moles vedadas feitas de gelatina e um plastificante tal como glicerol ou sorbitol. As cápsulas de encaixe por pressão podem conter os compostos ativos na forma de grânulos que podem ser misturados com cargas tal como lactose, aglutinantes tais como amidos, e/ou lubrificantes tal como talco ou estearato de magnésio e, opcional-mente, estabilizantes. Nas cápsulas macias, os compostos ativos são preferivelmente dissolvidos ou suspensos em líquidos adequados tais como óleos graxos ou parafina líquida. Além disso, estabilizantes podem ser adicionados.

[000232] Formulações adequadas para administração parenteral incluem soluções aquosas dos compostos ativos em forma solúvel em água, por exemplo, sais solúveis em água e soluções alcalinas. Sais alcalinos podem incluir sais de amônio preparados, por exemplo, com Tris, hidróxido de colina, bis-Tris-propano, N-metilglucamina, ou arginina. Além disso, podem ser administradas suspensões dos compostos ativos como suspensões para injeção oleosa, apropriadas. Solventes ou veículos lipofílicos adequados incluem óleos graxos, por exemplo, óleo de gergelim, ou ésteres de ácidos graxos sintéticos, por exemplo, oleato de etila ou triglicerídeos ou polietileno glicol-400 (os compostos são solúveis em PEG-400). Suspensões de injeção aquosa podem conter substâncias que aumentam a viscosidade da suspensão, por exemplo, carboximetil celulose sódica, sorbitol e/ou dextrano. Opcionalmente, a suspensão pode também conter estabilizantes.

[000233] Os compostos da presente invenção podem ser administrados ao olho em animais e seres humanos como gotas, ou dentro de ungüentos, géis, lipossomas, ou discos de polímero biocompatível, péletes ou transportados em lentes de contato. A composição intraocular pode conter também um veículo oftálmico fisiologicamente compatível conforme aqueles versados na técnica podem selecionar usando critérios convencionais. Os veículos podem ser selecionados dos veículos oftálmicos conhecidos, que incluem, mas sem limitação, água, poliéteres tal como polietileno glicol 400, polivinilas tais como poli(álcool vinílico), povidona, derivados de celulose tais como carboximetilcelulose, metilcelulose e hidroxipropil metilcelulose, derivados de petróleo tais como óleo mineral e petrolato branco, gorduras animais tal como lanolina, gorduras vegetais, tal como óleo de amendoim, polímeros de ácido acrílico tal como gel de carboxilpolimetileno, polissacarídeos tais como dextranos e glicosamina- glicanos tais como cloreto de sódio e cloreto de potássio, cloreto de zinco e tampão tal como bicarbonato de sódio ou lactato de sódio. Moléculas de alto peso molecular podem também ser usadas. Conservantes fisiologia- camente compatíveis, que não inativam os compostos da presente invenção na composição incluem álcoois tal como clorobutanol, cloreto de benzalcônio e EDTA ou qualquer outro conservante apropriado conhecidos daqueles versados na técnica.

[000234] Formulações liofilizadas de anticorpos adaptadas para administração subcutânea estão descritas na Patente 6.267.958, cuja descrição é aqui incorporada a título de referência em sua totalidade. Tais formulações liofilizadas podem ser reconstituídas com um diluente adequado para uma alta concentração de proteína e a formulação reconstituída pode ser administrada subcutaneamente ao paciente a ser tratado aqui.

[000235] Os ligantes de ligação de αvβ6 podem ser também embutidos em microcápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial, por exemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulose ou de gelatina e microcápsulas de poli(metacrilato de metila), respectivamente, em sistemas de distribuição de fármacos coloi- dais (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Tais técnicas são descritas na Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16a Edição, Osol, A. Ed. (1980).

[000236] Preparações de liberação constante com ligantes de ligação de αvβ6 podem ser preparadas. Exemplos adequados de preparações de liberação constante incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos contendo o ligante de ligação de αvβ6, cujas matrizes estão na forma de artigos conformados, por exemplo, filmes, ou microcápsulas. Exemplos de matrizes de liberação constante incluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli(metacrilato de 2- hidroxietila), ou poli(álcool vinílico)), polilactídeos (Patente US 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutâmico e L-glutamato de y-etila; etileno-acetato de vinila não degradável, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradáveis, tal como LUPRON DEPOT® (microesferas injetáveis compostas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico e acetato de leuprolídeo), e poli(ácido D-(-)-3-hidroxibutírico.

[000237] As formulações a serem usadas na administração in vivo devem ser estéreis. Isso é prontamente obtido por filtração através de membranas de filtração estéreis.

[000238] O ligante de ligação de αvβ6 pode ser administrado ao indivíduo ou paciente por quaisquer meios adequados, incluindo, parenteral, intrapulmonar, intracraniano, transdérmico e intranasal. Infusões parenterais incluem administração intramuscular, intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal, ou subcutânea. Além disso, o ligante de ligação de αvβ6 pode ser adequadamente administrado por infusão pulsada, por exemplo, com doses declinantes do ligante de ligação de αvβ6. Preferivelmente, a dosagem é dada por injeções, mais preferivelmente por injeções intravenosas ou subcutâneas, dependendo em parte de se a administração é breve ou crônica.

[000239] Em certos exemplos de modalidades da invenção, os ligantes de ligante de αvβ6 são administrados ao paciente (por exemplo, intravenosamente) em uma dosagem de entre cerca de 1 mg/m2 e cerca de 500 mg/m2. Por exemplo, o ligante de ligação de αvβ6 pode ser administrado em uma dosagem de cerca de 1 mg/m2, 2 mg/m2, 3 mg/m2, 4 mg/m2, 5 mg/m2, 10 mg/m2, 15 mg/m2, 20 mg/m2, 25 mg/m2, 30 mg/m2, 35 mg/m2, 40 mg/m2, 45 mg/m2, 50 mg/m2, 55 mg/m2, 60 mg/m2, 65 mg/m2, 70 mg/m2, 75 mg/m2, 80 mg/m2, 85 mg/m2, 90 mg/m2, 95 mg/m2, 100 mg/m2, 105 mg/m2, 110 mg/m2, 115 mg/m2, 120 mg/m2, 125 mg/m2, 130 mg/m2, 135 mg/m2, 140 mg/m2, 145 mg/m2, 150 mg/m2, 155 mg/m2, 160 mg/m2, 165 mg/m2, 170 mg/m2, 175 mg/m2, 180 mg/m2, 185 mg/m2, 190 mg/m2, 195 mg/m2, 200 mg/m2, 205 mg/m2, 210 mg/m2, 215 mg/m2, 220 mg/m2, 225 mg/m2, 230 mg/m2, 235 mg/m2, 240 mg/m2, 245 mg/m2, 250 mg/m2, 255 mg/m2, 260 mg/m2, 265 mg/m2, 270 mg/m2, 275 mg/m2, 280 mg/m2, 285 mg/m2, 290 mg/m2, 295 mg/m2, 300 mg/m2, 305 mg/m2, 310 mg/m2, 315 mg/m2, 320 mg/m2, 325 mg/m2, 330 mg/m2, 335 mg/m2, 340 mg/m2, 345 mg/m2, 350 mg/m2, 355 mg/m2, 360 mg/m2, 365 mg/m2, 370 mg/m2, 375 mg/m2, 380 mg/m2, 385 mg/m2, 390 mg/m2, 395 mg/m2 ou 400 mg/m2.

[000240] O ligante de ligação de αvβ6 pode ser administrado de acordo com uma ampla variedade de esquemas de dosagem. Por exemplo, o ligante de ligação de αvβ6 pode ser administrado uma vez ao dia por uma quantidade predeterminada de tempo (por exemplo, quatro a seis semanas, ou mais), ou de acordo com um esquema semanal (por exemplo, um dia por semana, dois dias por semana, três dias por semana, quatro dias por semana, cinco dias por semana, seis dias por semana ou sete dias por semana) por uma quantidade predeterminada de tempo (por exemplo, de quatro a oito semanas, ou mais). Um exemplo específico de um esquema de dosagem "uma vez por semana" é a administração do ligante de ligação de αvβ6 nos dias 1, 8, 15 e 22 do período de tratamento. Em modalidades alternativas, o ligante de ligação de αvβ6 pode ser administrado intermitentemente por um período de meses. Por exemplo, o ligante de ligação de αvβ6 pode ser administrado semanalmente por três semanas consecutivas bianualmente (isto é, repetir o esquema de dosagem semanal a cada seis semanas). Será apreciado que tais regimes de administração podem ser continuados por prolongados períodos (da ordem de anos) para manter efeitos terapêuticos benéficos proporcionados pelos tratamentos iniciais. Em ainda outras modalidades, tal terapia de manutenção pode ser efetuada seguindo um regime de dosagem agudo planejado para reduzir os sintomas imediatos da condição cancerosa, metastática ou de carcinoma in situ.

[000241] A quantidade de ligante de ligação de αvβ6 administrada de cada vez por todo o período de tratamento pode ser a mesma; alternativamente, a quantidade administrada de cada vez durante o período de tratamento pode variar (por exemplo, a quantidade administrada em um dado tempo pode ser maior ou menor que a quantidade administrada previamente). Por exemplo, doses dadas durante a terapia de manutenção podem ser menores que aquela administrada durante a fase aguda do tratamento. Esquemas de dosagem apropriados dependendo das circunstâncias específicas serão aparentes para aqueles versados na técnica.

[000242] Em certas modalidades da invenção, múltiplos tipos ou espécies de ligantes de ligação de αvβ6 são combinados com uns com os outros e administrados a um paciente para tratar uma ou mais condições cancerosas, metastáticas ou de carcinoma in situ. Por exemplo, a invenção contempla a administração de dois ou mais diferentes anticorpos de ligação de αvβ6 a um paciente, tais como aqueles descritos aqui. Quando ligantes de ligação de αvβ6 múltiplos são administrados a um paciente, os ligantes de ligação de αvβ6 diferentes podem ser administrados juntos em uma única composição farmacêutica, ou, mais preferivelmente, podem ser administrados seqüencialmente em dosagens separadas. A quantidade eficaz de tais outros agentes depende da quantidade de ligantes de ligação de αvβ6 presente na formulação, o tipo de doença ou distúrbio ou tratamento, e outros fatores.

[000243] A presente invenção inclui também métodos para tratar condições cancerosas, metastáticas ou de carcinoma in situ que compreendem administrar a um paciente um primeiro agente em conjunto com um segundo agente, em que o primeiro agente é um ligante de ligação de αvβ6 e o segundo agente é um agente que é útil para tratar uma ou mais condições cancerosas, metastáticas ou de carcinoma in situ, mas que não é necessariamente um ligante de ligação de αvβ6. Por administrar um primeiro agente "em conjunto com" um segundo agente deve ser entendido que o primeiro agente pode ser administrado ao paciente antes de, simultaneamente com, ou após, administrar o segundo agente ao paciente, de modo que ambos os agentes são administrados ao paciente durante o regime terapêutico. Por exemplo, de acordo com certas de tais modalidades da invenção, um ligante de ligação de αvβ6 é administrado a um paciente em conjunto, isto é antes, simultaneamente com, ou após a administração de um antagonista de um ou mais receptores de integrina (por exemplo, α1β1, a4β1, avβ8, avβ5, a5β1, etc.) ao paciente, incluindo anticorpos, antagonistas de polipeptídeo e/ou antagonistas de pequenas moléculas específicos para um ou mais receptores de integrina (por exemplo, α1 β 1, a4β1, avβ8, avβ5, a5β1, etc.), que são conhecidos na técnica.

[000244] Em certas modalidades desse aspecto da invenção, o segundo agente que é administrado em conjunto com um ligante de ligação de αvβ6 é, por exemplo, um esteróide, um composto citotóxico (incluindo aqueles descritos em algum lugar aqui), um radioisótopo (incluindo aqueles descritos em algum lugar aqui), uma enzima ativadora de pró-fármaco (incluindo aqueles descritos em algum lugar aqui), colchicina, oxigênio, um antioxidante (por exemplo, N- acetilcisteína), um quelador de metal (por exemplo, tetratiomolibdato), IFN-β, IFN-y, alta-antitripsina e similares. Segundos agentes ou compostos adicionais que podem ser administrados a um paciente em conjunto com um ou mais primeiros agentes, tais como um ou mais ligantes de ligação de αvβ6, para fins terapêuticos, de acordo com este aspecto da invenção, serão familiares àqueles versado na técnica; o uso de tais segundos agentes ou compostos adicionais é, portanto, considerado como sendo englobado pela presente invenção.

[000245] Serão prontamente aparentes para aquele versado nas técnicas relevantes que outras modificações ou adaptações aos métodos e aplicações descritos aqui são óbvias e podem ser efetuadas sem se desviar do escopo da invenção ou de qualquer modalidade desta. Tendo agora descrito a presente invenção em detalhes, a mesma será mais claramente entendida por referência aos seguintes exemplos, que são incluídos aqui com os propósitos somente de ilustração e não têm o objetivo de limitar a invenção.

Exemplos Exemplos 1: Clonagem das Regiões Variáveis de mu3G9

[000246] RNA celular total de células de hibridoma murino 3G9 foi preparado usando-se o mini-kit Qiagen RNeasy seguindo o protocolo recomendado pelo fabricante. DNA complementar que codifica as regiões variáveis das cadeias pesadas e leves foi clonado por RT-PCR do RNA celular total usando o kit First Strand cDNA Synthesis Amersham/Pharmacia seguindo o protocolo recomendado pelo fabricante, usando hexâmeros aleatórios para sensibilização.

[000247] Os iniciadores usados para amplificação por PCR do domínio de cadeia variável pesada de imunoglobulina de 3G9 foram: 5' AGGTCTAGAAYCTCCACACACAGGRRCCAGTGGATAGAC 3' (SEQ ID NO: 8); 5' GGGGATATCCACCATGRACTTCGGGYTGAGCTKGGTTTT 3' (SEQ ID NO: 9); (S=C/G, M=A/C, R=A/G, K=G/T, W=A/T, e Y=CT) .

[000248] A reação consistiu em uma fusão inicial a 95°C, por 2,5 minutos, seguido por 10 ciclos de fusão a 94°C, por 30 segundos, anelando a 60°C menos 1°C por ciclo, por 45 segundos, e elongação a 68°C, por 1 minuto usando a Advantage Taq DNA polimerase da Clontech. A reação continuou por 10 ciclos adicionais de fusão a 94°C, por 30 segundos, anelando a 55°C por 45 segundos, elongação a 68°C por 1 minuto, e uma elongação final de 9 minutos, a 68°C. As reações foram purificadas usando o kit de purificação por PCR Qiagen Qiaquick seguindo o protocolo do fabricante. As extremidades do DNA amplificado por Advantage Taq foram polidos para gerar extremidades cegas com T7 DNA polimerase em presença de excesso de dNTPs. Os produtos de PCR de gene de região variável de cadeia pesada de 3G9 purificados e cegos foram subclonados em um vetor de clonagem pCR4Blunt-TOPO da Invitrogen usando seu kit de clonagem TOPO seguindo o protocolo recomendado pelo fabricante. Os subclones de RT-PCR da cadeia pesada foram designados pKJS062.

[000249] O gene de domínio variável da cadeia pesada de 3G9 foi amplificado com os iniciadores: 5' GCGTCTAGAACTGGATGGTGGGAGATGGA 3' (SEQ ID NO: 10); 5' GGGGATATCCACCATGGATTTTCAGGTGCAGATTTTCAG S' (SEQ ID NO: 11).

[000250] A reação consistiu em uma fusão inicial a 95°C, por 2,5 minutos, seguido por 6 ciclos de fusão a 94°C, por 30 segundos, anelando a 60°C menos 1°C por ciclo, por 45 segundos, e elongação a 68°C, por 2 minutos usando a Advantage Taq DNA polimerase da Clontech. A reação continuou por 24 ciclos adicionais de fusão a 94°C, por 30 segundos, anelando a 54°C por 45 segundos, elongação a 68°C, por 2 minutos e uma elongação final de 10 minutos a 68°C. Um décimo da reação foi usada como um modelo por um segundo ciclo de amplificação com Pfu DNA polimerase (Stratagene). A reação consistiu em uma fusão inicial a 95°C, por 2,5 minutos, seguida por 20 ciclos de fusão a 94°C, por 30 segundos, anelando a 55°C, por 45 segundos, e elongação a 72°C, por 1 minuto. Os produtos de reação compreendiam gel purificado usando o kit de extração de gel Qiagen Qiaquick seguindo o protocolo recomendado pelo fabricante. Os produtos de PCR de gene de região variável da cadeia leve de 3G9 purificados foram subclonados em vetor de clonagem de pCR4Blunt-TOPO da Invitrogen usando seu kit de clonagem TOPO. Os subclones de RT-PCR da cadeia leve foram designados pKJS054.

[000251] Inserções provenientes de subclones independentes múltiplos de ambos pKJS054 e pKJS062 foram seqüenciados. Em ambos os casos, as seqüências de inserções dos subclones independentes múltiplos eram idênticos. Análises Blast das seqüências de domínios variáveis confirmaram sua identidade de imunoglobulina. O domínio variável da cadeia pesada de 3G9 é um membro do subgrupo IIID murino. A região variável de cadeia leve de 3G9 é um membro do subgrupo IV kappa murino.

Exemplo 2: Construção e Expressão de ch3G9

[000252] cDNAs que codificam as regiões variáveis de 3G9 murino das cadeias pesas e leves foram usados para construir vetores para expressão de quimeras murino-humanas (ch3G9), nas quais as regiões variáveis de mu3G9 foram ligadas à IgG1 humano e regiões constantes kappa.

[000253] Para construção da quimera de cadeia pesada, o fragmento de EcoRI de 508 bp proveniente do plasmídio pKJS062 de domínio variável da cadeia pesada de 3G9 foi subclonado no sítio EcoRI do vetor de clonagem pNN09 derivado de pUC desfosforilado, linearizado. Essa etapa adicionou sítios NotI flanqueadores no plasmídio resultante, pKJS093. A seqüência de cadeia pesada no plasmídio pKJS093 foi confirmada por seqüenciamento de DNA. O sítio doador de fatia seguido imediatamente por um sítio de restrição HindIII foi adicionado ao plasmídio pKJS093 imediatamente a jusante da seqüência de codificação de regiões variáveis por mutagênese direcionada a sítio com oligonucleotídeos mutagênicos: 5' CTGTCTCTGCAGGTAAGCTTACACCCCCATCTG 3' (SEQ ID NO: 12), 5' CAGATGGGGGTGTAAGCTTACCTGCAGAGACAG 3' (SEQ ID NO: 13)

[000254] usando kit de mutagênese Quickchange da Stratagene seguindo o protocolo recomendado pelo fabricante. Essa etapa gerou o plasmídio pKJS116. O fragmento de domínio variável da cadeia pesada de NotI-HindIII de 0,48 kb desvio padrão pKJS116 e o fragmento de HindIII-NotI de 1,22 kb do plasmídio pEAG964, contendo uma região constante de IgG1 humano, foram subclonados no sítio NotI do plasmídio pCH269 derivado do vetor de expressão EBV (Invitrogen) de pCEP4, produzindo o plasmídio pKJS136.

[000255] Para construção da quimera de cadeia leve, o fragmento de EcoRi de 474 pares de base do plasmídio pKJS054 de domínio variável de cadeia leve de 3G9 foi subclonado no sítio EcoRI do vetor de clonagem pNN09 desfosforilado, linearizado adicionando sítios NotI flanqueadores no plasmídio resultante,pKJS112. A seqüência de cadeia leve no plasmídio pKJS112 foi confirmada por seqüenciamento de DNA. Um sítio de restrição BgIII foi adicionado ao plasmídio pKJS112 imediatamente a jusante da seqüência de codificação de região variável por mutagênese direcionada por sítio com oligonucleotídeos mutagênicos: 5' GGCACCAAGCTGGAGATCTAACGGGCTGATGCTGC 3' (SEQ ID NO: 14), 5' GCAGCATCAGCCCGTTAGATCTCCAGCTTGGTGCC 3' (SEQ ID NO: 15)

[000256] usando o kit de mutagênese Quickchange da Stratagene gerando o plasmídio pKJS132. O fragmento de domínio variável de cadeia leve de NotI-BgIII de 453 bp do pKJS132 e o fragmento de BeII- NotI de 678 bp do plasmídio pEAG963 contendo um domínio constante da cadeia leve kappa humano, foram subclonados no sítio NotI do plasmídio pCH269 derivado do vetor de expressão EBV (Invitrogen) de pCEP4, produzindo o plasmídio pKJS141. Foi observado durante a clonagem de mu3G9 que a primeira CDR da cadeia leve continha uma seqüência de sinais de glicosilação (NXT S). Um único ciclo de mutagênese direcionada a sítio Quickchange com os oligonucleotídeos: 5' GGAACTTACACTTGAGCTGGCACTGCATGTCAAGG 3' (SEQ ID NO: 16), 5' CCTTGACATGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTCC 3' (SEQ ID NO: 17), convertendo o motivo NSS em SSS e criando o vetor de expressão pKJS157, removeu essa seqüência de sinais de glicosilação. A seqüência de regiões variáveis da cadeia leve de pKJS157 foi confirmada por seqüenciamento de DNA.

[000257] Os vetores de expressão (pKJS141 ou pKJS157 da cadeia leve e pKJS136 da cadeia pesada) foram co-transfectados nas células 293-EBNA e as células transfectadas foram testadas quanto à secreção e especificidade de anticorpo. Células transfectadas com o vetor vazio e as células co-transfectadas com vetores de expressão EBV para chM92 (um mAb específico de CD154 molecularmente clonado) serviram como controles. Análise de título de anticorpos, usando o kit Easy Titer de Pierce, seguindo o protocolo recomendado pelo fabricante, e análise Western blot (desenvolvida com anticorpos de cadeias pesadas e cadeias leves anti-humanas) de meios condicionados indicaram que as células transfectadas de ch3G9 sintetizaram e montaram eficazmente cadeias pesadas e leves e secretaram anticorpo. Um ensaio ELISA contra αvβ6 demonstrou que ch3G9 ligou a αvβ6 similarmente a mu3G9 enquanto chM92 não.

[000258] Como mostrado na figura 1, 3G9 quimérico (ch3G9; indicado pelo símbolo triangular) e uma forma mutante aglicosila do 3G9 quimérico contendo uma substituição N para S dentro de um sítio de glicosilação ligado a N na primeira CDR da cadeia leve (ch3G9S; indicado pelo símbolo quadrado) produzidos de transfecções transitórias em larga escala foram purificados e demonstraram similar ligação a αvββ em um ensaio ELISA. A remoção do sítio de glicosilação dentro da CDR1 do domínio variável de cadeia leve mostrou que aperfeiçoa a expressão e purificação de proteína sem alterar ou afetar a afinidade de ligação do anticorpo.

Exemplo 3: Construção das versões 1,2 & 3 de hu3G9

[000259] O desenho dos domínios variáveis reconformados para produzir 3G9 humanizado (hu3G9) foi feito como a seguir. O domínio variável da cadeia leve de 3G9 corresponde a kappa 3 humano, e o domínio variável de cadeia pesada corresponde ao subgrupo 3 pesado humano. A escolha das estruturas de aceptor humano foi por emparelhamento de homologia com seqüências de germe-linha humana usando o programa IgBLAST: L6 humana (com a região J derivada de JK4 humano) para a cadeia leve e 3-7 humanas (com a região J derivada de JH4 humano) para a cadeia pesada. Três versões de cada uma das cadeias leves e pesadas variáveis, reconformadas, foram desenhadas conforme mostradas na Tabela 1. A primeira versão contém a maioria da retromutações para as seqüências doadoras murino, enquanto a terceira versão contém a minoria (isto é as mais "humanizadas"). As regiões de CDR dos domínios variáveis das cadeias pesadas e leves, conforme mostradas na Tabela I, abaixo, estão sendo definidas pelo sistema de classificação de numeração de Kabat, convencional. Contudo, a numeração das seqüências é representada com base no posicionamento linear relativo das diferentes seqüências com respeito uma às outras. TABELA 1 - Seqüências de Cadeias Pesadas e Leves para hu3G9 Tabela 1a - Seqüências de Cadeias Pesadas

[000260] As versões 1 e 2 da cadeia pesada de huEG9 e as versões 1, 2, e 3 da cadeia leve foram feitas sinteticamente por ligação de uma composição de oligonucleotídeos do filamento superior fosforilados, mantidos em justaposição por oligonucleotídeos de filamento inferior, com Taq DNA ligase (New England Biolabs). As reações foram incubadas através de 15 ciclos de 1 minuto a 94°C, 1 minuto a 55°C - 1°C por ciclo e 65°C por 4 minutos gerando um molde de DNA de filamento simples incluindo os sítios de restrição 5’ (NotI e BamHI), seqüências de sinais, as regiões variáveis, e se estendendo até (cadeia leve) ou nos domínios constantes (cadeia pesada) para o primeiro sítio de restrição único, potencial (BsiWI para a cadeia leve de AgeI para a cadeia pesada). Os iniciadores para os genes sintéticos são descritos abaixo. Os moldes de gene foram amplificados por PCR com Pfu DNA polimerase (Stratagene) usando oligos: 5' GCTGACAGCGGCCGCGGGATCCAC 3' (SEQ ID NO: 18), e 5' GCTCACGGTCACCGGTTCGGGG 3' (SEQ ID NO: 19) para a cadeia pesada e 5' GCTGACAGCGGCCGCGGGATCCAC 3' (SEQ ID NO: 20) e 5' GGAAGATGAACACACTGGGTGCGG 3 ' (SEQ ID NO: 21) para a cadeia leve

[000261] para gerar DNA de filamento duplo. As reações consistiram em uma fusão inicial de 95°C, por 2,5 minutos, seguidas por 16 ciclos de fusão a 94°C, por 30 segundos, anelando a 64°C, por 30 segundos, e elongação a 72°C, por 1 minuto. Os produtos de reação foram purificados com gel usando o kit de extração com gel Qiagen Quiaquick, seguindo o protocolo recomendado pelo fabricante.

[000262] A versão 1 da cadeia pesada foi criada sinteticamente a partir dos seguintes oligonucleotídeos fosforilados 5’ de filamento superior: 5'GCTGACAGCGGCCGCGGGATCCACCATGGACTTCGGCCTGAGC TGGGTGTTCCT GGTGCTGGTGCTGAAGGGCGTGCAGTGCGAGGTGATGCTGGTG GAGAGCGGCGG C 3' (SEQ ID NO: 22), 5'GGCCTGGTGCAGCCCGGCGGCAGCCTGAGGCTGAGCTGCGCC GCCAGCGGCTT CACCTTCAGCCGCTACGTGATGAGCTGGGTGCGCCAGGCCCCCG GCAAGGGCCTG GAGTGGGTGGCCAG 3' (SEQ ID NO: 23), 5'CATCAGCAGCGGAGGCCGCATGTACTACCCCGACACCGTGAAG GGCCGCTTCA CCATCAGCCGCGACAGCGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATG AACAGCCTGC GCGCCGAGGAC 3' (SEQ ID NO: 24), 5'ACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGCGGCAGCATCTACGACGGCT ACTACGTGTTC CCCTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCTCCGCCAG CACC 3' (SEQ ID NO: 25), 5'AAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCA CCAGCGGCGG CACCGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAAC CGGTGACCGTG AGC 3' (SEQ ID NO: 26).

[000263] Esses oligos foram mantidos em justaposição pelos seguintes oligonucleotídeos não fosforilados do filamento inferior que se sobrepõem aos oligonucleotídeos do filamento superior justapostos por cerca de 15 bp. Os oligonucleotídeos do filamento inferior são: 5'GCTGCACCAGGCCGCCGCCGCTCTCC 3" (SEQ ID NO: 27), 5' CCGCTGCTGATGCTGGCCACCCAC 3" (SEQ ID NO: 28), 5' GCAGTAGTACACGGCGGTGTCCTCGGCGCG 3" (SEQ ID NO: 29), 5' GCTGGGGCCCTTGGTGCTGGCGG 3" (SEQ ID NO: 30).

[000264] A Versão 2 da cadeia pesada foi criada sinteticamente a partir dos seguintes oligonucleotídeos fosoforilados 5’ do filamento superior: 51GCTGACAGCGGCCGCGGGATCCACCATGGACTTCGGCCTGAG CTGGGTGTTCCT GGTGCTGGTGCTGAAGGGCGTGCAGTGCGAGGTGCAGCTGGTG GAGAGCGGCGG C 3' (SEQ ID NO: 31) 5'GGCCTGGTGCAGCCCGGCGGCAGCCTGAGGCTGAGCTGCGCC GCCAGCGGCTT CACCTTCAGCCGCTACGTGATGAGCTGGGTGCGCCAGGCCCCCG GCAAGGGCCTG GAGTGGGTGGCCAG 3' (SEQ ID NO: 32), 5'CATCAGCAGCGGAGGCCGCATGTACTACCCCGACACCGTGAAG GGCCGCTTCA CCATCAGCCGCGACAGCGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATG AACAGCCTGC GCGCCGAGGAC 3' (SEQ ID NO: 33), 5'ACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGCGGCAGCATCTACGACGGCT ACTACGTGTTC CCCTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCTCCGCCAG CACC 3' (SEQ ID NO: 34), 5'AAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCA CCAGCGGCGG CACCGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAAC CGGTGACCGTG AGC 3' (SEQ ID NO: 35).

[000265] Esses oligos foram mantidos em justaposição pelos seguintes oligonucleotídeos não fosforilados do filamento inferior que se sobrepõem aos oligonucleotídeos do filamento superior justapostos por cerca dd 15 bp. Os oligonucleotídeos do filamento inferior são: 5' GCTGCACCAGGCCGCCGCCGCTCTCC 3" (SEQ ID NO: 36), 5' CCGCTGCTGATGCTGGCCACCCAC 3" (SEQ ID NO: 37), 5’GCAGTAGTACACGGCGGTGTCCTCGGCGCG 3" (SEQ ID NO: 38), 5' GCTGGGGCCCTTGGTGCTGGCGG 3" (SEQ ID NO: 39)

[000266] Vetores de expressão para as versões 1 e 2 das cadeias pesadas de hu3G9 foram feitos por subclonagem dos fragmentos de domínios variáveis da cadeia pesada NotI-AgeI de 538 bp, incluindo os primeiros 105 bp da região constante de IgG1 humano, as partir das variantes de humanização geradas sinteticamente e o fragmentos AgeI/BamHI de 919 bp do plasmídio pKJS160, contendo o restante da região constante de IgG1 humano, em pKJS160 digerido com NotI/BamHI (idêntico ao vetor de expressão pCH269 de EBC derivado de pCEP4 (Invitrogen) produzindo os vetores de expressão da cadeia pesada pKJS166 (versão 1) e pKJS167 (versão 2).

[000267] A versão 3 da cadeia pesada foi criada realizando-se um único ciclo de mutagênese direcionada a sítios Quickchange no plasmídio pKJS167 com oligonucleotídeos: 5'CCATCAGCCGCGACAACGCCAAGAACAGCCTG 3' (SEQ ID NO: 40), e 5' CAGGCTGTTCTTGGCGTTGTCGCGGCTGATGG 3' (SEQ ID NO: 41).

[000268] O plasmídio de cadeia pesada de versão 3 resultante foi designado como pKJS168. As seqüências de cDNA da região variável nos plasmídios resultantes foram confirmadas por seqüenciamento de DNA.

[000269] A Versão 1 da cadeia leve foi criada sinteticamente a partir dos seguintes oligonucleotídeos fosforilados 5’ do filamento superior: 5'GCTGACAGCGGCCGCGGGATCCACCATGGACTTCCAGGTGCAG ATCTTCAGCTT CCTGCTGATCAGCGTGAGCGTGATCATGAGCCGCGGCGAGATCG TGCTGACC 3 ' (SEQ ID NO: 42), 5'CAGAGCCCCGCCACCCTGAGCCTGAGCCCCGGCGAGAGGGCC ACCCTGAGCTG CAGCGCCAGCAGCAGCGTGAGCAGCAGCTACCTGTACTGGTACC AGCAGAAGCC CGGCCAGGCC 3' (SEQ ID NO: 43), 5'CCCAGGCTGTGGATCTACAGCACCAGCAACCTGGCCAGCGGCG TGCCCGTGCGC TTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAG CAGCCTGGAGC CCGAGGAC 3' (SEQ ID NO: 44), 5'TTCGCCGTGTACTTCTGCCACCAGTGGAGCACCTACCCCCCCAC CTTCGGCGGC GGCACCAAGGTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCACCCAGTGT GTTCATCTTCC 3' (SEQ ID NO: 45).

[000270] Esses oligos foram mantidos em justaposição pelos seguintes oligonucleotídeos não fosforilados do filamento inferior que se sobrepõem aos oligonucleotídeos do filamento superior justapostos por cerca de 15 bp. Os oligonucleotídeos do filamento inferior são: 5'GCGGGGCTCTGGGTCAGCACGATC 3" (SEQ ID NO: 46), 5’CCACAGCCTGGGGGCCTGGCCG 3" (SEQ ID NO: 47), 5'GTACACGGCGAAGTCCTCGGGCTC 3" (SEQ ID NO: 48).

[000271] A versão 2 da cadeia leve foi criada sinteticamente a partir dos seguintes oligonucleotídeos fosforilados 5’ do filamento superior: 5'GCTGACAGCGGCCGCGGGATCCACCATGGACTTCCAGGTGCAG ATCTTCAGCTT CCTGCTGATCAGCGTGAGCGTGATCATGAGCCGCGGCGAGATCG TGCTGACC 3 ' (SEQ ID NO: 49), 5'CAGAGCCCCGCCACCCTGAGCCTGAGCCCCGGCGAGAGGGCC ACCCTGAGCTG CAGCGCCAGCAGCAGCGTGAGCAGCAGCTACCTGTACTGGTACC AGCAGAAGCC CGGCCAGGCC 3' (SEQ ID NO: 50), 5'CCCAGGCTGTGGATCTACAGCACCAGCAACCTGGCCAGCGGCG TGCCCGCCCGC TTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAG CAGCCTGGAGC CCGAGGAC 3' (SEQ ID NO: 51), 5'TTCGCCGTGTACTACTGCCACCAGTGGAGCACCTACCCCCCCA CCTTCGGCGGC GGCACCAAGGTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCACCCAGTGT GTTCATCTTCC 3' (SEQ ID NO: 52).

[000272] Esses oligos foram mantidos em justaposição pelos seguintes oligonucleotídeos não fosforilados do filamento inferior que se sobrepõem aos oligonucleotídeos justapostos do filamento superior por cerca de 15 bp. Os oligonucleotídeos do filamento inferior são: 5'GCGGGGCTCTGGGTCAGCACGATC 3" (SEQ ID NO: 53), 5'CCACAGCCTGGGGGCCTGGCCG 3" (SEQ ID NO: 54), 5' GTACACGGCGAAGTCCTCGGGCTC 3" (SEQ ID NO: 55).

[000273] A versão 3 da cadeia leve foi criada sinteticamente a partir dos seguintes oligonucleotídeos fosforilados 5’ do filamento superior: 5'GCTGACAGCGGCCGCGGGATCCACCATGGACTTCCAGGTGCAG ATCTTCAGCTT CCTGCTGATCAGCGTGAGCGTGATCATGAGCCGCGGCGAGATCG TGCTGACC 3' (SEQ ID NO: 56), 5'CAGAGCCCCGCCACCCTGAGCCTGAGCCCCGGCGAGAGGGCC ACCCTGAGCTG CAGCGCCAGCAGCAGCGTGAGCAGCAGCTACCTGTACTGGTACC AGCAGAAGCC CGGCCAGGCC 3' (SEQ ID NO: 57), 5'CCCAGGCTGTGGATCTACAGCACCAGCAACCTGGCCAGCGGCA TCCCCGCCCGC TTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAG CAGCCTGGAGC CCGAGGAC 3' (SEQ ID NO: 58), 5'TTCGCCGTGTACTACTGCCACCAGTGGAGCACCTACCCCCCCA CCTTCGGCGGC GGCACCAAGGTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCACCCAGTGT GTTCATCTTCC 3' (SEQ ID NO: 59).

[000274] Esses oligos foram mantidos em justaposição pelos seguintes oligonucleotídeos não fosforilados do filamento inferior que se sobrepõem aos oligonucleotídeos do filamento superior justapostos por cerca de 15 bp. Os oligonucleotídeos do filamento inferior são: 5' GCGGGGCTCTGGGTCAGCACGATC 3" (SEQ ID NO: 60), 5' CCACAGCCTGGGGGCCTGGCCG 3" (SEQ ID NO: 61), 5' GTACACGGCGAAGTCCTCGGGCTC 3" (SEQ ID NO: 62).

[000275] Vetores de expressão para as versões 1, 2 e 3 das cadeias leves de hU3G9 foram feitos por subclonagem dos fragmentos de domínios variáveis de cadeia leve NotI/BsiWI a partir das variantes de humanização geradas sinteticamente e o fragmento BsiWI/BamHi de 324 bp a partir de pKJS162, contendo a região constante kappa de imunoglobulina humana, no pKJS161 digerido com NotI/BamHI (também idêntico ao vetor de expressão pCH269 de EBV derivado de pCEP4 (Invitrogen)). Os plasmídios resultantes foram designados como pKJS172 (versão 1), pKJS173 (versão 2), e pKJS174 (versão 3).

Exemplo 4: Expressão das Versões 1, 2 & 3 de hu3G9 e Construções das Versões 4 e 5

[000276] Todas as possíveis combinações de vetores de expressão quiméricos de cadeias pesadas e leves foram co-transfectadas em células 293-EBNA (16 combinações). As células transfectadas foram testadas para secreção de anticorpo e especificidade. Análise de Western blot (detecção com anticorpos antihumanos de cadeias pesadas e leves) e análise Easy Titer (Pierce) de meio condicionado indicaram que as células transfectadas com hu3G9 sintetizaram e secretaram eficazmente as cadeias pesadas e leves e que os níveis de expressão pareceram aumentar com a humanização crescente dos anticorpos. Como mostrado na figura 2, as variantes contendo a versão 1 da cadeia leve expressaram fracamente, enquanto as variantes contendo a versão 2 da cadeia leve são expressas em níveis maiores, sugerindo que a humanização crescente tende à maior expressão.

[000277] Análise FACS de células SW480 expressando αvβ6 coloridas com meio condicionado de células transfectadas indicaram que a humanização da cadeia pesada de 3G9 não teve impacto negativo sobre a capacidade do anticorpo de se ligar às células que expressam αvβ6, com a versão 3 da cadeia pesada (versão enxertada com CDR) tendo atividade de ligação crescente em comparação com as versões 1 e 2 (figura 3). Análise FACS também demonstrou que variantes de hu3G9 mAb contendo a versão 3 da cadeia leve se ligou ligeiramente menos que as variantes contendo a versão 2 de cadeia leve de hu3G9, embora ambas as versões pareceram se ligar pelo menos tão bem quanto 3G9 quimérico (figura 3). Existem somente diferenças de 2 e 1 aminoácido entre as cadeias leves da versão 2 e 3, respectivamente, e 3G9 enxertado com CDR. Já que essas versões da cadeia leve tinham atividade de ligação similar a αvβ6 como 3G9 quimérico, duas versões adicionais foram criadas para determinar se a atividade de ligação poderia ser aperfeiçoada ou se a versão enxertada com CDR seria funcional.

[000278] A versão 4 explorou os efeitos da substituição da glutamina para ácido glutâmico na posição 1 da cadeia leve e a versão 5 é uma cadeia leve de 3G9 enxertada com CDR (Tabela 1). Para examinar as contribuições individuais de cada dessas alterações, foram construídos novos vetores de expressão de cadeia leve. O plasmídio pKJS186, a variante E1Q da cadeia leve da versão 3, foi feito por mutagênese direcionada a sítios do plasmídio pKJS174 com os oligonucleotídeos: 5'GTCAGCACGATCTGGCCGCGGCTCATGATC 3' (SEQ ID NO: 63) e 5' GATCATGAGCCGCGGCCAGATCGTGCTGAC 3' (SEQ ID NO: 64)

[000279] usando kit de mutagênese Quickchange da Stratagene e é designado como versão 4 de cadeia leve. O plasmídio pKJS188, a cadeia leve de 3G9 enxertada com CDR, foi feito por mutagênese direcionada a sítios de plasmídio pKJS174 como oligonucleotídeos: 5'CCCAGGCTGCTGATCTACAGCACC 3' (SEQ ID NO: 65) e 5'GGTGCTGTAGATCAGCAGCCTGGG 3' (SEQ ID NO: 66)

[000280] e é designado como versão 5 de cadeia leve. Essas versões da cadeia leve foram confirmadas por seqüenciamento e então co- transfectadas em células 293-EBNA com versões 2 ou 3 de cadeia pesada. Análise FACS indicou que a versão 3 de cadeia pesada e a versão 5 de cadeia leve, o par completamente enxertado com CDR, ligaram às células de expressão de αvβe de modo igual ou melhor que qualquer outro par de variantes humanizado (figura 4). O pareamento de pKJS168 e pKJS188 foi designado como versão 5 de hu3G9 (H3/L5).

[000281] Co-transfecções de células 293-EBNA com as versões 2-5 de ch3G9 e hu3G9 foram raspadas e o meio condicionado foi colhido. O anticorpo foi purificado em Proteína A-Sepharose e mAbs purificados foram ensaiados quanto à atividade. A ligação a αvβ6 foi determinada por análise FACS na linhagem celular FDCP1-β6 (figura 5), ELISA (figura 6), e bloqueio de αvβ6 biotinilado a LAP (figura 7). A ordem de classificação da atividade de ligação era versão 5 (H3/L5) > versão 3 (H3/L3) = ch3G9 = versão 2 (H2/L2). Bloqueio de adesão das células FDCP1-β6 mediada por αvβ6 a LAP é mostrado na figura 8. A ordem de classificação de bioatividade era ch3G9 = versão 5 (H3/L5) = versão 2 (H2/L2)> versão 3 (H3/L3). Devido ao fato da versão 5 ser mais humanizada que a versão 2, ela foi selecionada para a geração de uma linhagem de célula CHO estável.

[000282] O DNA e as seqüências de proteínas correspondentes das versões diferentes de domínios variáveis pesados (versões 1, 2, 3, e 5) e leves de hu3G9 (versões 1-5) são mostrados na Tabela 2. (a) uma FR humana derivada da FRI de VH3-7; (b) seqüências de cadeias pesadas de CDR1 de 3G9 murino; (c) uma FR2 humana derivada da FR2 de VH3-7; (d) seqüências de cadeias pesadas de CDR2 de 3G9 murino; (e) uma FR humana derivada da FR3 de VH3-7; (f) uma FR3 humana derivada da FR3 de VH3-7; (g) seqüências de cadeias pesadas de CDR3 de 3G9; e (h) uma FR4 humana derivada de uma seqüência de estruturas de consenso presente em uma grande maioria de anticorpos humanos com a seguinte seqüência: WGQGTLVTVSS.

[000283] Para os domínios variáveis de cadeia leve, as seqüências compreendem: (a) uma FR1 humana derivada da FR1 de L6; (b) a seqüência de cadeias leves de CDR1 de 3G9 murino com uma substituição de aminoácido de asparagina (N) para serina (S); (c) uma FR2 humana derivada da FR2 de L6; (d) a seqüência de cadeias leves de CDR2 de 3G9 murino; (e) uma FR humana derivada da FR3 de L6; (f) a seqüência de cadeia leves de CDR3 de 3G9 murino; e (g) uma FR4 humana derivada de uma seqüência de estruturas de consenso presente em uma grande maioria de anticorpos humanos com a seguinte seqüência: FGGGTKVEIK. TABELA 2 - Seqüências de Cadeias Pesadas e Leves de Domínios Variáveis de hu3G9 cadeia leve da versão 1 de hu3G9 (SEQ ID NO:67)

Exemplo 5: Construção de Vetores de Expressão de CHO Estáveis para Versão 5 do hu3G9 tipo selvagem e aglicosila

[000284] Os vetores EBV descritos acima contêm UTRS 5’ e 3’ estranhas que são indesejáveis. Vetores de expressão de CHO estáveis foram criadas para versão 3 de cadeia pesada de hu3G9 e versão 5 de cadeia leve (H3/L5), coletivamente denominadas versão 5, em que as seqüências estranhas foram removidas. Adicionalmente, um vetor de cadeia pesada aglicosila foi criado para remover interações potenciais entre o anticorpo 3G9 expresso e receptores de Fc gama.

[000285] O vetor de expressão de CHO estável da cadeia pesadas foi criado por ligação do fragmento BamHi de 723 pares de base de pKJS188 ao fragmento de vetor digerido com BamHi neo-contendo 6188 pares de base de pKJS077 (PDM-64-0213) gerando o plasmídio pKJS195, conforme mostrado na figura 9.

[000286] O vetor de expressão CHO estável da cadeia pesada foi criado ligando inicialmente o fragmento BamHI de 1449 pares de base a partir do pKJS168 no fragmento de vetor digerido com BamHI de 6051 pares de base de pKJS078 (PDM-64-O2-13) para remover os sítios de restrição NotI que flanqueiam a seqüência de codificação de cadeia pesada e gerando pKJS171. Para remover geneticamente o resíduo de lisina C-terminal da cadeia pesada codificada por pKJS171, o fragmento BsrG1 de 2190 pares de base para Xba1 de pKJS171 foi reposto com o fragmento BsrG1 de 2187 pares de base para Xba1 de pKJS078 (PDM- 64-02-13) gerando pKJS189. O plasmídio pKJS189 representa o vetor de expressão CHO estável de hu-3G9 do tipo selvagem contendo dhfr, conforme mostrado na figura 10. Para gerar a forma aglicosila da cadeia pesada, o fragmento AgeI/BsrG1 de 587 pares de base de pKJS189 foi reposto com o fragmento Age1/BsrG1 de 587 pares de base de pCR076 gerando pKJS196. Esse vetor representa o vetor de expressão CHO estável de aglicosila-hu3G9 contendo dhfr, contendo uma substiuição de N319Q que remove o sinal de glicosilação requerido para ligação de receptor de Fc normal, conforme mostrado na figura 11.

[000287] As seqüências de DNA das inserções de cDNA de BamHI nos pKJS189, pKJS196, e pKJS195 foram confirmadas. Os vetores de expressão foram co-transfectados em células CHO e as células transfectadas foram testadas quanto à secreção de anticorpos. O ensaio de detecção de anticorpo humano Easy-Titer (Pierce) do meio condicionado indicou que as células transfectadas sintetizaram e secretaram, eficazmente, as cadeias pesadas e leves dos vetores de expressão CHO, conforme mostrado na figura 12.

[000288] Assim, existem dois potenciais sítios de glicosilação que podem ser modificados no anticorpo hu-3G9 sem afetar a afinidade de ligação do anticorpo: (1) nos domínios variáveis da cadeia leve de hu-3G9 dentro da região de CDR1 no resíduo de aminoácido 26 da SEQ ID NO:2, onde uma substituição de asparagina (N) para serina (S) remove o sítio de glicosila- ção que aperfeiçoa a expressão e purificação (este sítio é modificado em todas as cinco versões das seqüências de domínios variáveis de cadeia pesada); e (2) na região constante da versão 3 de cadeia pesada de hu- 3G9, em que uma substituição de asparagina (N) para glutamina (Q) remover um sítio de glicosilação para ligação de receptor de Fc.

Exemplo 6: Linhagens de Células CHO Expressando a Versão 5 de hu3G9

[000289] Os plasmídios de expressão pKJS189, pKJS196 e pKJS195 para a versão 5 de 3G9 foram transfectadas em células CHO. A expressão da versão 5 de hu3G9 (H3/L5) e a versão 5 de hu3G9 aglicosilada (a-H3/L5) mostrou especificidade de ligação para αvββ.

Exemplo 7: Desenho da Humanização do Anticorpo 8G6 Anti-αvββ

[000290] No desenho dos anticorpos humanizados, as regiões determinantes de complementaridade (CDRs) contêm os resíduos mais prováveis de se ligarem a antígeno e devem ser retidas no anticorpo remodelado. CDRs são definidas pela seqüência de acordo com Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Edição, U.S. Dept. Health and Human Services, U.S. Govt. Priniting Office (1991). As CDRs se enquadram nas classes canônicas (Chothia et al., Nature, 342:877-883 (1989)) onde os resíduos chave determinam, em uma grande extensão, a conformação estrutural da alça de CDR. Esses resíduos ficam quase sempre retidos no anticorpo remodelado. As CDRs da cadeia pesada e leve foram classificadas em classes canônicas como a seguir: Cadeia Leve: Cadeia Pesada: L1: 15 resíduos Classe 4 H1: 5 resíduos Classe 1 L2: 7 resíduos Classe 1 H2: 17 resíduos Classe 2 L3: 9 resíduos Classe 1 H3: 17 resíduos Sem classe canônica

[000291] Os resíduos canônicos importantes para essas classes estão indicados na Tabela 3. Todos os resíduos canônicos são como descritos pelas regras. Não existem classes canônicas para a alça H3. Tabela 3

H3 Sem Classificação Canônica

[000292] As cadeias leves e pesadas foram comparadas com as seqüências de consenso para subgrupos de camundongos e seres humanos (Kabat et al., 1991) usando o programa FASTA.

[000293] A cadeia leve variável de 8G6 é um membro do subgrupo Kappa 3 de camundongo com uma identidade de 81,250% em sobreposição com 112 aminoácidos e a cadeia peasada variável de 8G6 é um membro do subgrupo 2a de camundongos com uma identidade de 71,318% em uma sobreposição com 129 aa. A cadeia leve variável de 8G6 corresponde ao subgrupo Kappa 4 humano com 65,487% de identidade com uma sobreposição de 113 aa. A cadeia pesada variável de 8G6 corresponde ao subgrupo 1 humano com 58,955% de identidade com sobreposição de 134 aa. Os resíduos de interface de empacotamento de VH/VL são conservados, exceto para uma F não usual na posição 50 de aminoácido na cadeia leve (da SEQ ID NO:4) e uma L na posição 39 de aminoácido na cadeia pesada (da SEQ ID NO:3).

[000294] Modelação da estrutura das regiões variáveis foi realizada como a seguir. As cadeias leves e pesadas foram alinhadas contra uma cópia local da mais recente base de dados PDB para determinar as armações estruturais a serem usadas para construir os modelos tridimensionais das cadeias leves e pesadas. Usando FASTA, verificou- se que a cadeia leve de 8G5 tinha 90,001% de identidade de seqüência com uma sobreposição de 111 aa para N10 Fab murino (1NSN; resolução de 2,9 A). Verificou-se que a cadeia pesada de 8G6 tinha 80,952% de identidade de seqüência com uma sobreposição de 126 aminoácidos para Fab de JEL42 murino (2JEL; Resolução de 2,5 A). O molde estrutural integral foi obtido por combinação da cadeia pesada de 2JEL e da cadeia leve de 1NSN. Usando um empacotamento de modelação molecular Modeler 5,0 (Accelrys Inc.), as estruturas tridimensionais das cadeias leves e pesadas foram construídas usando a estrutura de molde. O dez moldes de homologia foram criados, e o melhor deles em termos de energia de Modeler foi selecionado. Análise Procheck mostrou que não havia resíduos em uma região desautorizada do mapa phi/psi.

[000295] Ao desenhar as regiões variáveis remodeladas, foi feita uma tentativa de encontrar as seqüências de anticorpos humanos expressas mais similares para uso como estruturas de anticorpo. Para encontrar as seqüências expressas mais próximas, foi realizada uma busca para as estruturas humanas expressas mais homólogas na base de dados NCB1 NR, base de dados TrEMBL e a base de dados Kabat. Para seqüências das cadeias leves e pesadas, foram efetuadas duas buscas (com CDR mascarada e não mascarada). A seleção das seqüências expressas mais adequadas inclui verificar a identidade das seqüências de resíduos canônicos e interfaciais, bem como verificar as similardades nos comprimentos da alça da CDR. A fonte do anticorpo é também um fator determinante. Anticorpos previamente humanizados são excluídos. Para as buscas nas bases de dados NCB1 NR e TrEMBL, foi usado BLAST, e para a busca na base de dados Kabat, foi usado FASTA.

[000296] A cadeia leve expressa mais similar foi encontrada na base de dados Kabat (kabat id 026520 AC21B’CL: Ohlin et al., Mol. Immunol., 33:47-56 (1996)). Esse é um scFv amplificado por PCR de exibição de fago, mas é 100% idêntico à germe-linha L6 nas regiões de estrutura. Para a cadeia pesada, foi selecionada a estrutura humana gi|392715 da base de dados NR em NCB1. Ela é 100% idêntica à germe-linha VH1-2 nas regiões de estrutura. Ambas as seqüências foram procuradas contra a base de dados de seqüências de germe-linha (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblst/), e isto resultou nas seguintes germe-linhas selecionadas: L6 para a cadeia leve, e 1-2 para a cadeia pesada.

[000297] O procedimento mais importante na humanização dos anticorpos monoclonais é a identificação de retromutações de resíduos de estrutura humana para camundongo. A experiência mostrou que isto é especialmente importante para reter resíduos canônicos, resíduos de empacotamento de interface, e resíduos murino incomuns, que estão próximos ao sítio de ligação. Em geral, os resíduos localizados dentro de 6 Â de quaisquer do resíduos de CDR não precisam ser analisados intimamente quanto a potenciais efeitos na conformação das CDRs.

[000298] Três versões da cadeia remodelada leve variável de 8G6 e as três versões da cadeia remodelada pesada variável de 8G6 foram desenhadas. A primeira versão contém a maioria das retromutações e a terceira versão contém a minoria (isto é as mais "humanizadas"). A Tabela 4 exibe as seqüências de domínios variáveis da cadeia pesada e leve para os anticorpos 8G6 (hu8G6). Tabela 4 - Seqüências de Cadeias Pesada e Leve para hu8G6 Tabela 4a - Seqüências da Cadeia Pesada

[000299] As seqüências de proteínas das diferentes versões dos domínios variáveis pesados (versões 1, 2 e 3) e leves (versões 1, 2 e 3) de hu8G6 estão mostrados na Tabela 5. Para os domínios variáveis de cadeia pesada, as seqüências compreendem: (a) uma FR1 derivada da FR1 de VH1-2; (b) a seqüência da cadeia pesada da CDR1 do 8G6; (c) uma FR2 humana derivada da FR2 de VH1-2; (d) a seqüência da cadeia pesada de CDR2 de 8G6; (e) uma FR3 humana derivada da FR3 de VH1-2; (f) a seqüência da cadeia pesada da CDR3 de 8G6; e (g) uma FR4 derivado de uma seqüência de estruturas de consenso que é 100 idêntica à estrutura humana gi|392715 da base de dados NR e está presente em uma grande maioria de anticorpos humanos com a seguinte seqüência: WGQTLVTVSS.

[000300] Para os domínios variáveis de cadeia leve, as seqüências compreendem: (a) uma FR1 humana derivada de L6; (b) a seqüência da cadeia leve da CDR1 de 8G6 murino; (c) uma FR2 humana derivada da FR2 de L6; (d) a seqüência da cadeia leve da CDR2 de 8G6 murino; (e) uma FR3 derivada da FR3 da L6; (f) a seqüência da cadeia leve da CDR3 de 8G6 murino; e (g) uma FR4 humana derivada de uma seqüência de estruturas de consenso presente em uma grande maioria de anticorpos humanos com a seguinte seqüência: FGGGTKVEIK. TABELA 5 - Seqüências de Cadeias Leves e Pesadas dos Domínios Variáveis de hu8G6 cadeia pesada hu8G6 versão 1 (SEQ ID NO:78)

[000301] A seguir são descritas as retromutações na cadeia leve variável remodelada:

[000302] E1D - Esta tem mostrado influenciar a conformação de CDR/ ligação de antígeno (Kolbinger et al., Protein Eng., 8:971-980 (1993)). No modelo, ela pode interagir com a cadeia principal ou cadeias laterais de S26, Q27 e/ou E93 nas CDRs L1 e L2. Ela é removida nas versões 2 e 3 já que a substituição é conservativa.

[000303] L46F - Esta é um resíduo de interface de empacotamento VH/VL. Ela também aparece à direita e embaixo do resíduo E55 da CDR-L2. Ela é removida na versão 3.

[000304] Y49K - Esta é adjacente à CDR-L2 e parece estar interagindo com o resíduo E55 no modelo. Essa tem a probabilidade de ser uma retromutação muito importante e, portanto, não é removida.

[000305] A seguir são descritas as retromutações na cadeia pesada variável remodelada:

[000306] A24G - Essa é um resíduo canônico para CDR-H1. Mutação conservativa. Removida na versão 2.

[000307] G26S - Essa é um resíduo canônico para CDR-H1. Mutação conservativa. Removida na versão 2.

[000308] Q39L - Essa é um resíduo de interface de empacotamento. Tem uma interação bastante limitada com a cadeia leve e, portanto, é removida na versão 2. M481 - esta é uma retromutação comum. No modelo, ela pode interagir com Y59 e F63 na CDR-H2. É dispensada na versão 3. V68A - Este resíduo está localizado abaixo da CDR-H2, possivelmente interagindo com Y59 e F63.

[000309] R72V - Este é um resíduo canônico para CDR-H2 T74K. Esse resíduo está localizado debaixo da CDR-H2, possivelmente interagindo com Y53 ou contatando diretamente o antígeno.

Exemplo 8: internalização do anticorpo αvββ

[000310] Anticorpos que são internalizados por células oferecem uma vantagem para certas indicações clínicas tal como câncer, porque os anticorpos podem ser então conjugados com toxinas, compostos radioativos ou outros agentes anticâncer para direcionar seletivamente e inibir o crescimento de células cancerosas. A capacidade dos anticorpos anti-αvββ de serem internalizados foi previamente descrita em WO 03/100033, aqui incorporado, a título de referência, em sua totalidade. WO 03/100033 descreve que a internalização foi observada para anticorpos monoclonais dependentes de cátion (miméticos de ligante contendo RGD) tais como 6.8G6 e 6.1A8. Contudo, não foi observada internalização para mAbs independentes de cátion, tais como 6.3G9, 7.1C5 e 6.4B4. A capacidade de um anticorpo de ser internalizado por células, tal como 8G6, acarreta a vantagem de acoplar o anticorpo internalizante com porções/agentes terapêuticos para permitir a distribuição das porções/agentes na célula. Por exemplo, fármaco ou porções de toxina podem ser conjugados ao anticorpo internalizante 8G6. Contudo, essa mesma aplicação pode ser aplicada aos anticorpos não internalizantes, tal como 3G9, em que uma porção química pode ser conjugada a tais anticorpos para permitir a distribuição para a superfície da célula de um alvo (por exemplo, superfície da célula tumoral).

EXEMPLO 9: αvβ6 é Altamente Expressa em Metástase Relativa a Tumores Primários

[000311] Nos presentes experimentos, foi estabelecido o estudo da expressão de αvβ6 em uma variedade de cânceres de origem epitelial e em lesões metastáticas e para determinar se o bloqueio da função de αvβ6 mAbs inibiria o crescimento de tumores que expressam αvβ6 in vivo. Avaliou-se a atividade antitumoral in vitro e in vivo de nosso αvβ6 mAbs antihumanos em um carcinoma faríngeo humano, Detroit62, e comparou-se este à atividade antitumoral in vivo de TβRII:Fc. Os dados suportam um papel em câncer humano para αvβ6 e potencial para intervenção terapêutica com bloqueio de função de αvβ6 mAbs. A. Materiais e Métodos:

[000312] Para imunoistoquímica, seções de tecido foram desparafini- zadas em xileno e etanol, reidratadas em água destilada, e então imersas em metanol com 0,45% de H2O. Os tecidos foram incubados com pepsina (00-3009), Zymed, São Francisco, CA) e bloqueados com avidina e biotina (SP-2001: Vector Laboratories, Burlingame, CA). O anticorpo primário foi diluído em solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo 0,1% de albumina de soro bovino (BSA) e os tecidos foram incubados durante a noite a 4°C. Para imunocoloração de β6 em tecido de xenoenxerto de camundongo, seções foram incubadas com uma forma quimérica humana/camundongo do mAb anti-αvβ6, 2A1 (Weinreb, P.H. et al., J. Biol. Chem. 279(17):17875-17887 (2004), e um anticorpo secundário, biotinilado, antihumano (PK-6103, Vector Laboratories, Burlingame, CA). Para imunocoloração de β6 em tecido humano, seções foram incubadas com 2A1 murino e um anticorpo secundário biotinilado anticamundongo (PK-6102, Vector Laboratories). Complexo de avidina-biotina-raiz forte peroxidase (Kit Vector, PK-6102) foi aplicada às seções, incubadas por 30 minutos à temperatura ambiente, e substrato de 3,3’-diaminobenzidina (DAB) foi preparado conforme instruções (SK-4100, Vector Laboratories) e aplicado às seções, por cinco minutos, à temperatura ambiente. Seções de tecido foram coloridas com Hematoxilina de Mayer, por 1 minuto e rinsadas em água e PBS. B. Resultados: 1. Expressão de αvβ6 em Metástases

[000313] Imunocoloração de αvβ6 foi avaliada em uma variedade de metástases tumorais, 78% das metástases (43/55) foram positivamente imunocoloridas, mostrando coloração intensa na maioria das metástases (figura 13A-F; figuras 14A-I). Verificou-se que esse resultado é um aumento do percentual de imunocoloração positiva em que somente os cânceres da cabeça e do pescoço, cervicais e pancreáticos mostraram um nível equivalente de expressão (Tabela 1): Tabela 1: Expressão de αvβ6 em Tumores Humanos (imunoistoquímica)

2. Expressão de αvβ6 em Tumores do Endométrio e Metástases Emparelhadas com os Pacientes

[000314] Como notado na Tabela 1, acima, imunocoloração de αvβ6 foi positiva em 53% dos tumores do endométrio examinados. Com poucas exceções, a coloração era mais proeminente em regiões mais invasivas de tumores de grau mais alto. Três amostras de tumor primário haviam emparelhado com a metástase de linfonodo. Em dois desses casos, a imunocoloração foi significantemente maior nas metástases de linfonodos com relação ao tumor primário emparelhado (comparar figura 15A com a figura 15B, e a figura 15C com a figura 15D). No terceiro caso, a imunocoloração foi alta em ambas as metástases de linfonodo e o tumor primário emparelhado (dados não mostrados). O percentual de coloração de epitélio tumoral positivo em αvβ6 nos três tumores primários era de 10%, 20% e 90%, respectivamente, enquanto o percentual no epitélio tumoral positivo para αvβ6 positivo nos linfonodos metastáticos emparelhados era 80%, 100% e 100%, respectivamente. No endométrio normal, a coloração ficou confinada a células ocasionais na camada da superfície, bem como em cistos. 3. Expressão de αvβ6 em Amostras de Tumor da Mama Humano Invasivo

[000315] Mais que 100 amostras de câncer da mama humano foram avaliadas quanto ao nível de expressão de αvβ6 usando imunoisto- química, de acordo com os procedimentos descritos acima em Materiais e Métodos. Em vários casos de carcinoma ductal in situ (DCIS), a expressão de αvβ6 foi limitada ao mioepitélio circundando o tumor e não observada no próprio tumor (vide, por exemplo, BrCa19, figura 16A). Contudo, em vários casos de carcinoma da mama invasivo, αvβ6 foi expressa também no tumor (vide, por exemplo, BrCa23, figura 16B).

[000316] Há evidência de que a expressão de genes específicos em células de tecido da mama (células epiteliais, células mioepiteliais, e fibroblastos) é alterada em comparação com o tecido de mama normal, para tecido de mama contendo um tumor não invasivo tal como DCIS, para um tecido de mama contendo um carcinoma de mama invasivo (Alinen, M. et al., Cancer Cell 6:17-32 (2004); Burstein, H.J. et al., N. Engl. J. Med. 350:1430-1441 (2004)). Muitas dessas alterações de expressão de genes foram detectadas nas células mioepiteliais. É possível que a expressão da integrina αvβ6 no mioepitélio (tanto no tecido normal como no DCIS) proporcione um microambiente, talvez através da ativação localizada de TGF-β, suportando a viabilidade tumoral, e promovendo a progressão de um tumor invasivo. Um modelo in vivo de DCIS que pode progredir para um carcinoma invasivo, tal como MCF10DCIS. Com (Miller, F.R. et al., J. Natl. Canc. Inst. 92:11851186 (2000)), proporcionaria um método para avaliar a expressão de αvβθ dentro do contexto de um tumor da massa progressivo. Poder-se- ia avaliar a expressão de αvβ6 no mioepitélio no estágio precoce não invasivo do tumor e expressão de αvβ6 conforme o tumor progride para um fenótipo invasivo in vivo. Esse modelo permitiria também que se testasse o papel funcional de αvβ6 usando αvβ6 mAbs de bloqueio e também testar a eficácia de mAbs anti-αvβ6. 4. Expressão de αvβ6 em Amostras de Tumores Pancreáticos Humanos, Metástases Emparelhadas com Pacientes e Modelo de Xenoenxerto de Camundongo de Tumor Pancreático Invasivo

[000317] Como notado na Tabela 1, a imunocoloração de αvβ6 foi positiva em 80% dos tumores pancreáticos humanos. Quando amostras de tumores pancreáticos humanos de oito pacientes diferentes foram examinadas por imunoistoquímica, a coloração foi proeminente em regiões invasivas de tumores de alto grau (figuras 17A-17C; 18A-18E). As amostras de tumores primários tinham também metástases de linfonodos emparelhadas (figuras 17D-17F; 18F-18J), que também demonstraram forte coloração de αvβθ, suportando a noção que células positivas para αvβ6 haviam disseminado do sítio de tumor primário. Em pâncreas normal (figuras 17G-17H; 18K-18L), a coloração ficou confinada a células ocasionais na camada da superfície.

[000318] Para subseqüentemente examinar as influências da expressão de αvβ6 na invasão de células tumorais, usou-se um xenoenxerto de tumor de camundongo BxPC-3 como um modelo de adenocarcinoma pancreático humano. Os animais foram implantados (dia 0) subcutaneamente no flanco com 5 x 106 células/camundongo, suspensas em solução salina estéril, usando uma injeção de 0,1 mL/camundongo. No dia 30, os camundongos com tumores estabelecidos (~60-100 mm3) foram emparelhados em pares para cada três grupos de tratamento (PBS; mAb 3G9; proteína de fusão de Il-Ig de receptor de TGF-β solúvel (solTGFβRII-Fc)) para todos os estudos. Os agentes de teste foram administrados aos camundongos por meio de intraperitoneal em um esquema de tratamento de 3 vezes por semana. Os camundongos foram injetados com 3G9 a 10 mg/kg, solTGFβRII-Fc a 2 mg/kg, ou PBS (controle negativo). O crescimento do tumor foi medido duas vezes na semana e o volume do tumor foi estimado de acordo com a fórmula: [(largura)2 x comprimento]/2. Os tumores dos grupos de tratamento foram excisados, fixados em 10% de paraformaldeído, embutidos em parafina e seccionados para análise imunoistoquímica usando o mAb 6.2A1 quimérico v6 não bloqueador.

[000319] O tratamento com mAB 3G9 anti-αvβe teve efeito direto no crescimento do tumor (figuras 19B, 19C), com crescimento do tumor significantemente reduzido depois de cerca de 48 dias de tratamento com o anticorpo. O nível de inibição de crescimento observado com solTGFβRII-Fc foi algo inferior àquele observado para 3G9. Esses resultados indicam que o mAb 3G9 anti-αvββ inibe o crescimento do tumor em um modelo de xenoenxerto de câncer pancreático humano, e sugerem que tais anticorpos bloqueadores devem ser úteis em inibir o crescimento do tumor, e por extensão da invasão do tumor, em adenocarcinomas pancreáticos humanos primários.

EXEMPLO 10: mAbs de Bloqueio de Função de αvβ6 Inibem Migração de Célula Tumoral, Invasão e Produção de MMP de Células Tumorais que Expressam αvβ6

[000320] O anticorpo monoclonal de bloqueio de αvβ6 (mAb) 3G9 (Weinreb. P.H. et al., J. Biol. Chem. 279(17):17875-17887 (2004)), e TGF-βRII-Ig (Cosgrove, D. et al., Am. J. Pathol. 157(5):1649-1659 (2000)), foram avaliados quanto à sua habilidade de bloquear a capacidade de células transfectadas com β6 de invadir, migrar, e produzir metaloproteinase de matriz 9 (MMP-9) in vitro. Essas atividades foram monitoradas como se cada uma tivesse sido associada à invasão e migração de células tumorais. Os efeitos de 3G9 e TGF-βRII-Ig foram avaliados usando células parentes não transfectadas (C1) e um derivado transfectado com β6 de células C1 (VB6).

[000321] Ensaio de Migração e Invasão. Células escamosas de carcinoma foram crescidas em meios KGM como previamente descrito (Thomas, G.J. et al., J. Invest. Derm. 117(1):67-73 (2001). Para medir a migração, usou-se placas FLUOROBLOK® e inserções (BD Biosciences; Bedford, MA) de acordo com as instruções do fabricante. Em resumo, as cavidades vazias foram preenchidas com meios KGM ou KGM isento de soro como controle negativo. As células foram colhidas em meios isentos de soro com anticorpo e pré-incubadas em meios isentos de soro com anticorpo. 50.000 células foram adicionadas à inserção, que foi então colocada dentro das cavidades e incubada por 24 horas, a 37°C, em uma incubadora de cultura de tecido. Depois da incubação, as células e os meios foram removidos do topo da inserção. As células que migraram para a parte de baixo do filtro foram quantificadas por marcação com 2 μg/mL de Calceína (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA), por 1 hora e medição da fluorescência em modo de leitura de fundo. O percentual de inibição foi calculado como o decréscimo do número de células migradas em presença do anticorpo em comparação com os meios sozinhos. A invasão foi medida de um modo similar, usando inserções de FLUROBLOK revestidos com MATRIGEL® e incubação por 48 horas.

[000322] Quantificação de Produção de MMP. Células, em meios contendo 1% de FBS, foram cultivadas em cavidades revestidos com MATRIGEL (BD Biosciences) pelo tempo indicado. Os sobrenadantes foram colhidos, centrifugados para remover os fragmentos de células, e congelados até serem ensaiados. Os níveis de MMP foram quantificados por ELISA (R&D Systems, Minneapolis, MN). Resultados:

[000323] Como mostrado nas figuras 20A-20C, o mAb 3G9 de bloqueio de αvβ6 inibiu significantemente a migração, invasão e produção de MMP-9 por células VB6 in vitro. O bloqueio da atividade de TGF-β com TGF-βRII-Ig recombinante também inibiu a invasão e produção de MMP-9 por células VB6 (figuras 20B e 20C), mas não afetou sua migração (figura 21A). Esses dados mostram uma diferença funcional distinta comparando o bloqueio de função de αvβ6 versus bloqueio de atividade de TGF-β. Essa conclusão é consistente com a capacidade de αvβ6 de mediar tanto a adesão como a migração celular através da ligação à fibronectina, bem como a ativação de precursor latente TGF-β (Sheppard, D., Cancer Metast. Rev. 24:395-402 (2005)).

Exemplo 11: αvβ6 mAb Inibe a Invasão Estromal em Modelo de Xenoenxerto de Câncer Colorretal Humano (LIM1863) 1. antecedente

[000324] Um novo modelo de carcinoma de cólon, LIM1863, foi recentemente caracterizado (Bates, R.C. e Mercurio, A.M., Mol. Biol. Cell 14:1790-1800 (2003); Bates, R.C, et al., J. Clin. Invest. 115(2):339- 347 (2005)). In vitro, células LIM1863 cresceram em uma cultura de suspensão em esferóides 3D (organóides) bem-diferenciados. Contudo, depois de exposição a TGF-β e TNFα, essa linhagem de célula se converte em um fenótipo de monocamada migratório, com alterações morfológicas características de uma transição epitelial para mesen- quimal (EMT), tipificada pela perda de E-caderina. Essa transição é acompanhada por um aumento significante da expressão de αvβ6. In vivo, as células LIM1863 são tumorigênicas quando injetadas subcutaneamente no flanco de camundongos NUS (Bates, R.C. et al., J. Clin. Invest. 115(2):339-347 (2005)). Como demonstrado na figura 6, as células LIM1863 exibem um marcante padrão de expressão de αvβ6 (id.). Especificamente, a expressão de αvβ6 é particularmente proeminente nas células que parecem ter invadido a massa de tumor primário no estroma tumoral. Essa constatação é coerente com a noção que essas células têm sofrido transição epitelial mesenquimal (EMT) que foi previamente descrita (vide id.).

[000325] Portanto, escolheu-se usar as células LIM1863 como um modelo de xenoenxerto de câncer colorretal humano para examinar o possível envolvimento de αvβ6 na invasão estromal neste modelo. 2. Materiais e Métodos

[000326] As células LIM1863 foram crescidas como organóides em RPMI-1640 (GIBCO, Invitrogen Corp., La Jolla, CA) suplementado com 5% de soro de bezerro fetal (FCS). Os organóides LIM1863 (aproximadamente 8 x 106 células) foram inoculadas subcutaneamente nos flancos de camundongos fêmeas nus. Todos os estudos com animal foram aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) da Biogen Idec. Os camundongos foram tratados por injeção intraperitoneal três vezes na semana com 10 mg/kg de anticorpo monoclonal murino 3G9 específico anti-αvβ6 (Weinreb, P.H. et al., J. Biol. Chem. 279(17):1785-17887 (2004)), 2 mg/kg de proteína de fusão TGF-βRII-Ig, solúvel, recombinante (Cosgrove, D. et al., Am. J. Pathol. 157(5):1649-1659 (2000)), ou controle de veículo (PBS). Os volumes de tumor foram medidos nos pontos de tempo correspondentes usando um calibrador, e o volume de tumor foi calculado usando a fórmula (L x W2)/2. Xenoenxertos foram colhidos sete semanas mais tarde, e seções fixadas com formalina e embutidas em parafina foram usadas para imunoistoquímica, que foi realizada conforme descrição acima no Exemplo 9 (figura 21). Resultados

[000327] mAb anti-αvβ6 3G9 e/ou TGF-βRII-Ig solúvel, recombinante, não exerceram nenhum efeito direto no crescimento do tumor (figuras 22A, 22B). Contudo, esses ligantes inibiram significantemente a invasão estromal de células LIM1863 por aproximadamente 80% (figura 22C), conforme avaliação por quantificação das áreas de células tumorais positivas para αvβ6 dentro do estroma (figura 22D-22F), realizada por um patologista cego para o tratamento..

EXEMPLO 12: Afinidade e Bioatividade de 6.3GA9 murino (m3G9) para Integrina αvβ6 Expressa em Células de Primatas Não Humanos

[000328] SUMÁRIO. A afinidade e a bioatividade do anticorpo monoclonal 6.3G9 (m3G9) de bloqueio anti-αvβ6 em integrina αvβ6 de primata não humano (NHP) foram determinadas através de uma variedade de métodos in vitro. Usando classificação de células ativadas por fluorescência (FACS), as linhagens de células de NHP expressando altos níveis de αvβ6 foram identificadas a partir de 2 espécies diferentes (12MBr6 do macaco verde africano, e 4MBr5 do macaco rhesus). m3G9 ligado a αvβ6 expressa em 12MBr6 e 4BBr5 com valores de ED50 de 0,030 μg/mL e 0,38 μg/mL, respectivamente. m3G9 também inibiu a ligação de 12MBr6 e 4MBr5 ao peptídeo (LAP) associado à latência de TGFμβ1 com valores de IC50 de 0,22 μg/mL e 0,29 μg/mL, respectivamente. Finalmente, m3G9 bloqueou a habilidade da linhagem de célula 4MBr5 de ativar TGFβ latente, conforme determinação usando um ensaio de co-cultura com células epiteliais de pulmão de mink responsivas a TGFβ expressando estavelmente uma porção do promotor de inibidor 1 ativador de plasminogênio (TMLC), com um valor de IC50 de 0,31μg/mL.

[000329] INTRODUÇÃO. O propósito desse estudo foi de determinar a afinidade e a bioatividade do anticorpo monoclonal anti-αvβ6 6.3G9(m3G9) para integrina αvβ6 expressa em células de primata não humano (NHP). m3G9 é o precursor murino do anticorpo monoclonal humanizado hu3G9 (BG0001). Esse anticorpo murino tem um reagente marcado com integrina αvβ6 específico, com alta afinidade.1 m3G9 se liga a seu alvo, a integrina αvβ6, com alta afinidade (KD = 16 pM), inibe a ligação de αvβ6 expressa em célula a ligantes (peptídeo associado à latência (LAP) de TGFβ 1 e fibronectina), e bloqueia a capacidade de αvβ6 de ativar TGFβ latente.1 O anticorpo requer a presença tanto de av como de subunidades β6 para ligação, e não foi observada nenhuma reatividade cruzada a outras integrinas relacionadas (avβ3, avβ3, avβ5, avβ3, e aIIbβ3), indicando que m3G9 é altamente específico para avβ6.1

[000330] Integrinas β6 murinas e humanas têm um alto grau de similaridade de seqüências (identidade de 89,5%)2, assim como as integrinas av murinas e humanas (92,8% de identidade)3. A seqüência de avβ6 de NHP não foi determinada, mas seria também esperado que compartilhasse um alto nível de identidade de seqüências.

[000331] De modo a determinar a afinidade de m3G9 para avβ6 de NHP, a ligação foi medida por FACS. A capacidade de m3G9 de bloquear adesão celular a LAP de TGFβ 1 humano foi avaliada em um ensaio de adesão celular. Finalmente, a capacidade de m3G9 de bloquear a ativação mediada por avβ6 de NHP de TGFβ latente foi determinada usando um ensaio de co-cultura. Materiais e Métodos

[000332] Reagentes. Os anticorpos monoclonais de camundongo 6.3G9 (m3G9) e 6.4B4 foram gerados e purificados conforme descrito na ref. 1 e acima. LAP (LAP) humano recombinante foi adquirido da R&D Systems (catálogo No 246-LP). A linhagem de células SW480 (adenocarcinoma colorretal humano) transfectada com β6 humano (SW480β6) foi fornecida por Dean Sheppard (UCSF). Linhagens de Células de NHP. As seguintes linhagens de células foram obtidas da American Type Culture Collection (ATTCC):

[000333] Classificação de Células Ativadas por Fluorescência (FACS). As células foram colhidas por tripsinização, lavadas uma vez com solução salina tamponada com fosfato, e então ressuspensas em tampão de FC (PBS, 2% de FBS, 0,1% de NaN3, CaCl2 1mM, e MgCl2 1 mM). 1 x 106 células foram então incubadas com 10 μg/mL de m3G9 em gelo por 0,5 h em um total de 50 μL de tampão FC. Depois da incubação, as células foram lavadas duas vezes com tampão FACS gelado (PBS, 2% de FBS, 0,1% de NaN3) e ressuspensas em 100 μL de tampão FC contendo uma diluição 1:200 de IgG de anticamundongo de cabra conjugado com Alexa488 (Jackson ImmunoResearch) e incubadas no gelo por 30 minutos. As células foram lavadas duas vezes com tampão FC gelado e ressuspensas em 100 μL de tampão FC e 50 μL de 4% de paraformaldeído. Ligação do anticorpo secundário marcado foi monitorada por citometria de fluxo (Biogen Idec Research Core Facility).

[000334] Ensaio de Adesão Celular. Uma placa de microtitulação de 96 cavidades foi revestida com 50 μL/cavidade de 0,5 μL de LAP diluído em bicarbonato de sódio 50mM, pH 9,2, a 4°C durante a noite. A placa foi lavada duas vezes com PBS (100 μL), bloqueada com BSA a 1% em PBS (100 μL/cavidade) por 1 hora, a 25°C, e lavada duas vezes com 100 μL/cavidade de tampão de ensaio (Tris 50mM, pH 7,5, NaCl 150mM, CaCl2 1mM, MgCl2 1mM). Células 12MBr6 ou 4MBr5 (4-12 x 106 células/mL) foram incubadas com corante fluorescente 2μM (BCECF-AM, Sondas Moleculares) em tampão de ensaio com agitação suave em banho de água, por 15 minutos, coletadas por centrifugação, e ressuspensas em tampão de ensaio para 4-12 x 106 células/mL. Para células individuais da placa lavada foram adicionados 25 μL de m3G9, duas vezes concentrado e 25 μL de células marcadas, e a placa foi incubada a 25°C por 0,5 hora. A placa foi lavada de 4 a 6 vezes com tampão de ensaio (100 μL/cavidade) e o corante fluorescente, devido às células capturadas na placa, foi registrada em um leitor de placas de fluorescência com 96 cavidades (CytoFluor Série 4000, Perspective Biosystems). O percentual de ligação foi determinado por comparação da fluorescência antes da etapa de lavagem final (isto é todas as células adicionadas) àquela depois da lavagem (isto é células ligadas).

[000335] Ensaio de co-cultura. TMLC (linhagem de células epiteliais do pulmão de mink Mv 1 Lu, estavelmente transfectadas com proteína de inibidor 1 ativador de palsminogênio)4 foram crescidas em DMEM + 10% de soro bovino fetal com 2mM de L-glutamina, penicilina- estreptomicina e 200 μg/mL de G418. As células foram elevadas dos frascos com PBS + EDTA 5mM, lavadas com PBS + 0,1% de BSA, contadas por hemocitômetro e plaqueadas em placas de 96 cavidades. Células de expressão de αvβe foram armazenadas em gelo por 2 horas enquanto TMLC eram plaqueadas em placas de 96 cavidades a 104 células/cavidade em DMEM + 0,1% de FBS e deixadas aderirem a 37°C, depois do que as TMLC foram lavadas com DMEM + 0,1% de BSA. Os anticorpos monoclonais foram diluídos em DMEM + 0,1% de BSA, adicionados às células de expressão de αvβ6 e pré-incubados por 20 minutos à temperatura ambiente. As células de expressão de αvβ6 foram então adicionadas às TMLC a 4 x 104/cavidade em DMEM + 0,1% de BSA (100 μL/cavidade). As placas foram incubadas por 20 horas a 37°C, em uma incubadora umidificada, enriquecida com CO2. O sobrenadante foi descartado e reposto com 100 μL de PBS + Ca+2 1mM e Mg-2 1mM. As células foram lisadas e luciferase foi detectada com um kit LucLite (Perkin Elmer Life Sciences, Boston, MA) usando um luminômetro de microplaca (luminômetro de microplaca Tropix TR717, Perkin Elmer Life Sciences). Resultados:

[000336] 1. Afinidade por ligação e bloqueio de potência de 6.3G9 de camundongo (m3G9) para integrina αvβ6 de primata. De modo a estudar a afinidade de m3G9 por integrina αvβ6 de primata não humano (NHP), quatro linhagens de células de NHP foram obtidas de ATCC. Uma triagem inicial (figura 23) indicou que a expressão de αvβ6 era maior nas linhagens de células 12MBr6 e 4MBr5, de modo que estas duas linhagens foram usadas para a caracterização de m3G9. Um anticorpo de não bloqueio de αvβ6, 6.4B4, também se ligou à 12MBr6 e 4MBr5 com uma intensidade de fluorescência média similar à observada para m3G9.

[000337] 1.1 Ligação à integrina expressa na célula (FACS). A ligação de m3G9 à 12MBr6 e 4MBr5 foi medida usando classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) conforme descrição em Materiais e Métodos. Uma titulação inteira de m3G9 foi realizada em cada linhagem de células, e uma ED50 (concentração de anticorpo dando um sinal semimáximo) foi determinada usando regressão não linear. Os valores de ED50 para 12MBr6 e 4MBr5 foram 0,30 μg/mL (figura 24A) e 0,38 μg/mL (figura 24B), respectivamente.

[000338] 1.2. Adesão celular a LAP. As habilidades de 12MBr 6 e 4MBr 5 de se ligarem ao LAP foram demonstradas usando um ensaio de adesão celular. Essa adesão foi bloqueada por m3G9, mas não por uma proteína de controle (BSA) ou por um anticorpo não bloqueador de αvβ6 (6.4B4) (figura 25). A potência de m3G9 para bloquear essa interação foi avaliada por medição da dependência de concentração de inibição em cada linhagem de célula (figura 26). Desses experimentos, uma IC50 (concentração de anticorpo dando inibição semi-máxima). Os valores de IC50 para 12MBr6 e 4MBr5 eram de 0,22 μg/mL e 0,29 μg/mL, respectivamente.

[000339] 1.3. Ativação de TGFβ (Ensaio de Co-cultura). As capacidades de 12MBr6 e 4MBr5 para ativar TGFβ latente foram determinadas usando um ensaio de co-cultura, em que as células são incubadas com células repórter epiteliais de pulmão de mink responsivas a TGFβ que expressam estavelmente uma porção do promotor de inibidor 1 ativador de plasmino- gênio (TMLC) (figura 27). A expressão de αvβ6 não é suficiente para promo-ver TGFβ, já que diferenças na sinalização intracelular e/ou na produção de TGFβ latente impactarão também a atividade neste ensaio. Dessas duas linhagens de célula, somente a de 4MBr5 foi eficaz na ativação de TGFβ latente, enquanto a de 12MBr5 não mostrou nenhum efeito. A ativação foi também observada usando a linha de célula de controle positivo SW480β6, uma linhagem de células de carcinoma de cólon humano transfectada com β6. A linhagem de célula de controle não parental não transfectada (SW480) não mostrou ativação, como se esperava.

[000340] A capacidade de m3G9 de bloquear ativação de TGFβ por 4MBr5 foi medida no mesmo experimento. A ativação de TGFβ foi bloqueada pela adição de m3G9 em 1 μg/mL ou 10 μg/mL, mas não pela adição do anticorpo 6.4B4 anti-αvβ6 não bloqueador. O efeito inibidor sobre as células 4MBr5 de m3G9 nestas concentrações foi similar ao observado usando a linhagem de células SW480β6. Em um experimento separado, foi determinada a dependência de dose de inibição de m3G9 de ativação de TGFβ mediada por 4MBr5 (figura 28). Os valores de IC50 para 4MBr5 e SW480β6 foram 0,31 μg/mL e 0,37 μg/mL, respectivamente.

[000341] 2. Comparação de Afinidade por m3G9 Através das Espécies. Os dados gerados para ligação e atividade de m3G9 em camundongo. «vβe de NHP e humano estão sumarizados na Tabela a seguir. A primeira coluna na Tabela mostra as ED50s de ligação determinadas por FACS. Em cada caso, a ED50 medida era <0,38 μg/mL (2,5 nM). A segunda coluna na Tabela mostra a IC50 para inibição de adesão celular por m3G9. Em cada caso, m3G9 bloqueou a adesão celular com uma IC50 de <0,29 μg/mL (1,9nM). A terceira coluna na Tabela mostra a IC50 para inibição da ativação de TGFβ mediada por αvββ, conforme determinada usando-se o ensaio de co-cultura. A linhagem de células do NHP 4MBr5 mostrou atividade celular similar à linhagem de células humanas SW480β6 (valores de IC50 de 0,40 de 0,24 μg/mL, respectivamente).

[000342] Comparação da atividade de m3G9 usando linhagens de células de camundongo, de NHP e humanas

a ref. 1 b n.d. não determinada 3. referências 1. Weinreb, P.H. et al, J. Biol. Chem, 2004, 279, 17875-87. 2. Arend, LJ. et al., J Am. Soc. Nephrol. 2000, 11,2297-305. 3. Wada, J. et al., J. Cell Biol., 1996, 132, 1161-76. 4. Abe, M. et al, Anal. Biochem., 1994, 216, 276-84.

EXEMPLO 13: Efeitos de mAbs anti-αvββ murinos em camundongos de Alport (Col4A3-/-)

[000343] SUMÁRIO: αvβ6 é uma integrina induzível por TGF-β que é preferencialmente expressa em sítios de remodelação epitelial e tem mostrado ligar e ativar precursor latente TGF-β. Aqui, mostrou-se que αvβ6 é superexpressa em epitélio de rim humano na glomerulonefrite membranosa, diabetes melito, nefropatia por IgA, síndrome de Goodpasture, e epitélio renal de Alport. Para avaliar o papel regulador potencial de αvβ6 na doença renal, temos estudado os efeitos de αvβ6mAbs bloqueador de função e ablação genética da subunidade β6 em fibrose renal em camundongos Col4A3-/-, um modelo de camundongo de síndrome de Alport. A expressão de αvβ6 em rins de camundongo de Alport foi observada principalmente em células epiteliais tubulares corticais e correlacionadas com a progressão de fibrose. O tratamento com mAb bloqueador de αvβ6 inibiu o acúmulo de fibroblastos ativados e deposição de matriz de colágeno intersticial. Inibição similar de fibrose renal foi observada em camundongos de Alport com deficiência de β6. A caracterização de transcritos de rim mostrou que mAbs bloqueadores de αvβ6 inibiram significantemente alterações associadas a tecidos do rim na expressão de mediadores fibróticos e inflamatórios. Padrões similares de modulação de transcritos foram produzidos com tratamento com TGF-β RII sugerindo funções reguladoras compartilhadas de αvβ6 e TGF-β. Essas constatações demonstram que αvβ6 pode contribuir para a regulação da fibrose renal e sugerem esta integrina como sendo um alvo terapêutico potencial. INTRODUÇÃO:

[000344] Fibrose progressiva é um processo comum que leva ao desenvolvimento da doença renal para o estágio final promovido por remodelação epitelial, ativação de fibroblastos, inflamação e reorganização de interações celulares com a matriz extracelular (ECM). Mecanismos moleculares que contribuem para esses eventos e incluem a regulação errônea do eixo TGF-β, remodelação de ECM aberrante, e expressão e função alteradas de receptores de adesão celular da superfamília de integrinas 1-5. Estudos recentes têm revelado importantes funções reguladoras de várias integrinas e moléculas associadas em células epiteliais renais e mesenquimais 3,6-8.

[000345] Dentre as integrinas cuja expressão é fortemente aumentada na doença renal é a integrina αvβ6induzivel por TGF-β5’9’10. A expressão de αvβ6 está geralmente restrita às células epiteliais, onde ela é expressa em baixos níveis em tecidos adultos normais durante o desenvolvimento, lesão, e neoplasia9’11-13. Embora αvβ6 seja expressa em níveis relativamente baixos em rim adulto saudável, sua expressão é proeminente no desenvolvimento do rim de camundongo, particularmente nos túbulos proximais, alça de Henle, e coleta de dutos11,12,14. Recentemente, expressão elevada de αvβ6 foi reportada para várias formas de patologia do rim humano10.

[000346] Consistente com a expressão aumentada de αvβ6 in vivo durante a remodelação de tecido, a expressão da integrina αvβ6 em células epiteliais cultivadas pode ser induzida por citocinas que regulam a remodelação epitelial, inclusive EGF e TGF-β5,9. Além disso, superex- pressão de β6 na pele de camundongos transgênicos tem mostrado que provoca a formação de ferimentos crônicos espontâneos15 sugerindo que avβ6 pode desempenhar um importante papel na regulação da remodelação de tecido epitelial.

[000347] Ligantes conhecidos para αvβ6 incluem fibronectina, tenascina, e os peptídeos 1 e 3 associados à latência (LAP1 e LAP3), os fragmentos N-terminal das formas de precursor latente de TGF-β1 e - β316-19. Como resultado da ligação a estes ligantes, αvβ6 pode mediar a adesão celular, disseminação, migração e ativação de TGF-β latente. TGF-β é sintetizado como uma proteína latente que é clivada e secretada com o LAP N-terminal não covalentemente associado à citocina TGF-β C-terminal, ativa, madura. O complexo de TGF-β latente não pode se ligar ao seu receptor cognato e assim permanece biologicamente inativo até ser convertido na forma ativa por um dos vários mecanismos que incluem clivagem por proteases, exposição a pH baixo ou radiação ionizante, e alterações conformacionais no complexo latente permitindo que ele se ligue a seus receptores cognatos20-22. Uma alteração ativadora conformacional pode ser induzida por αvβ6 envolvendo ligação direta da integrina a um motivo RGD contido nos LAP1 e LAP3. Essa ligação converte o precursor de TGF-β em um estado competente por ligação de receptor17,19. Essas constatações sugerem que a supra-regulação de expressão de αvβ6 na superfície das células epiteliais pode levar à ativação local de TGF-β seguida da ativação parácrina de eventos dependentes de TGF-β em células bystander. Isso incluiria a possibilidade de efeitos indiretos, a jusante, sobre a atividade de TGF-β, que poderiam ser mediados por alteração de inflamação e fibrose inicialmente nos sítios de expressão de αvβ6.

[000348] Já que o TGF-β tem sido implicado como um regulador central de fibrose renal, formulamos a hipótese que sua ativação local por αvβ6 pode ser um importante processo no início e progressão de doença renal, e bloqueio de uma função do αvβ6 poderia suprimir o desenvolvimento de fibrose renal. Nos estudos descritos aqui, mostramos que αvβ6 é altamente supra-regulado em um modelo de camundongo de fibrose renal e em amostras de rim humano com patologia fibrótica. Usando um modelo de camundongos Col4A3-/-, um modelo de doença renal progressiva similar àquela observada na síndrome de Alport humana, mostramos que mAbs bloqueando a ligação de ligante e as funções de ativação de TGF-β de αvβ623, bem como a ablação genética de β6, inibem potencialmente tanto a fibrose glomerular como a tubulointersticial e retardam a destruição da arquitetura dos tecidos do rim. Mostrou-se que embora a integrina αvβ6 tenha restringido expressão no rim às células epiteliais tubulares, ela pode proporcionar efeitos protetores em sítios distais no tecido. Essas constatações fazem surgir a possibilidade que os efeitos antifibróticos podem ser também mediados através dos efeitos extra-renais indiretos além dos efeitos diretos de bloqueio de αvβ6 nas células epiteliais tubulares. Estudos de tratamento retardados indicam que o bloqueio terapêutico de αvβ6 não somente inibe a progressão da fibrose renal, mas tem também o potencial de permitir a resolução de lesões fibróticas existentes. A análise de assinaturas moleculares associadas à progressão de doença renal e afetadas por inibição de αvβ6 indica que o impacto terapêutico dos anticorpos bloqueadores de αvβ6 é similar àquele do bloqueio de TGF-β sistêmico e está mecanicamente relacionado à atividade reduzida de TGF-β. Esses dados sugerem que αvβ6 está envolvido na regulação de fibrose renal e poderia proporcionar um novo alvo molecular para sua modulação terapêutica. MATERIAIS E MÉTODOS:

[000349] 1. Reagentes. αvβ6 mAbs foram gerados como previamente descritos aqui23. cDNAs de 2A1 e 3G9 quiméricos humanos/camundongo foram gerados a partir dos RNAs totais de hibridomas parentes respectivos com iniciadores de região constante CDL-739 para a cadeia pesada e CDL-738 para a cadeia leve usando o kit de Síntese de cDNA do Primeiro Filamento (Amersham/Pharmacia, Piscataway, NJ). Os genes de região variável de cadeia pesada e leve foram amplificados pela reação em cadeia de polimerase usando os mesmos 3 iniciadores usados para a síntese de cDNA e uniões de iniciadores degenerados para a maioria das seqüências de sinais de genes de anticorpos murinos (seqüências disponíveis mediante solicitação) e Pfu DNA polimerase (Stratagene, La Jolla, CA). Regiões variáveis de cadeias leves e pesadas clonadas foram ligadas a vetores de expressão de mamíferos com regiões constantes de IgG1 humano. Proteína de fusão de receptor de TGF-β tipo II murino-Ig (rsTGF-βrll-Ig) foi gerada como previamente descrito7 e adquirida da R&D Systems (532-R2, Minneaplois, MN). Os anticorpos foram adquiridos conforme indicado. mAb pan-anti-citoqueratina (C-11) conjugado com FITC, Sigma-Aldrich (F3418, St. Louis, MO); mAb de cadeia B1 anti-laminina (LT3), Chemicon (MAB1928, Temecula, CA); mAb anti-αv conjugado com ficoeritrina (PE) (RMV7), Chemicon (CBL1346P), anti-αv de coelho, Chemicon (AB1930); IgG1 de rato-PE, BD Biosciences (553925, San Jose, CA); e actina antimusculatura lisa (SMA)-Cy3, Sigma-Aldrich (C6198). Identificamos anti-TGF-β policlonal de coelho, Santa Cruz Biotechnology (sc-146, Santa Cruz, CA) como um anticorpo que se liga preferencialmente a seções de xenoenxerto de células 293 expressando uma forma constitutivamente ativa de TGF-β em comparação com seções de xenoenxerto de células 293 expressando TGF-β latente24.

[000350] 2. Animais. Camundongos Col4A3+/- de linhagem 129Sv/J foram obtidos de Dr. Dominique Cosgrove (Boy’s Town National Research Hospital, Omaha, NE) e reproduzidos para gerar camundongos Col4A3-/- para estudos de injeção. Camundongos Beta6- /- de linhagem 129SV foram obtidos do Dr. Dean Sheppard (University of Califórnia, San Francisco, CA) e cruzados com camundongos Col4A3+/-. Todos os animais foram alojados em Biogen Idec e todos os estudos com animais foram aprovados e efetuados de acordo com o Institutional Animal Care and Use Committee.

[000351] 3. Citometria de Fluxo. Células NIH3T3 (NIH3T3b6) estáveis transfectadas com β6 murino foram geradas conforme descrito previamente23. As células foram colhidas por tripsinização, lavadas em PBS, e ressuspensas em tampão de FC (IX PBS, 2% de FBS, 0,1% de NaN3, CCl2 1mM, e MgCl2 1mM). 0,2 x 105 células foram incubadas em gelo por 1 hora em tampão de FC contendo anticorpos primários purificados em um volume total de 100 μL. Depois da incubação, as células foram lavadas duas vezes com tampão de FC gelado e ressuspensas em 100 μL de tampão de FC contendo 5 μg/mL de IgG anticamundongo de burro conjugado com PE (Jackson ImmunoResearch). Para monitoramento da expressão de av, as células forma incubadas com um av anticamundongo de rato conjugado com PE (RMV-7) e um controle de IgG1 de rato conjugado com PE. As células foram lavadas duas vezes com tampão de FC gelado e ligação do anticorpo secundário marcado foi monitorada por citometria de fluxo. Imunoistoquímica. Seções de tecido foram desparafinizadas em xileno e etanol, reidratadas em água destilada, e então imersas em metanol contendo 0,45% de H2O. Os tecidos foram incubados com pepsina (003009, Zymed, San Francisco, CA) e bloqueados com avidina e biotina (SP-2001; Vector Laboratories, Burlingame, C). Anticorpo primário foi diluído em PBS contendo 0,1% de BSA e os tecidos foram incubados durante a noite, a 4°C. Para imunocoloração de β6 em tecido de camundongo, as seções foram incubadas com uma forma quimérica humana/camundongo do mAb anti-avβ6, 2AI23, e um anticorpo biotinilado antihumano (PK-6103, Vetor Laboratories, Burlingame, CA). Para imunocoloração de β6 em tecido humano, as seções foram incubadas com 2A1 murino23, e um anticorpo secundário biotinilado anticamundongo (PK-6102, Vector Laboratories). Complexo de avidina- biotina-raiz forte peroxidase (Vector Kit, PK-6102) foi aplicada às seções, incubadas por 30 minutos à temperatura ambiente, e substrato de 3,3’-diaminobenzidina (DAB) foi preparado conforme instruções (SK- 4100, Vector Laboratories) e aplicado às seções por 5 minutos, à temperatura ambiente. Seções de tecido foram coloridas com Hematoxilina de Mayer por 1 minuto e rinsadas em água e PBS.

[000352] Seções de tecido congeladas embutidas em Composto O.C.T. (Cat. No 4583, Sakura Tokyo, Japão) foram fixadas em acetona e bloqueadas com 0,5% de caseína/0,05% de timerosal em PBS. Para imunocoloração de β6 em tecido, as seções foram incubadas com 2A1 murino23 e um anticorpo secundário de Alexa flúor 594 anticamundongo (A-11032, Sondas Moleculares Eugene, Oregon). Para imunocoloração de β6 em tecido de camundongo, as seções foram incubadas com uma forma quimérica de camundongo humano de 2A1 e um anticorpo secundário conjugado com Alexa flúor 594 antihumano (A-11014, Sondas Moleculares). Para imunocoloração de laminina e av, foi usado um anticorpo secundário conjugado com Alexa Flúor 88 de anti-rato (A- 11006, Sondas Moleculares). Todos os outros anticorpos foram diretamente conjugados como indicado previamente. Todas as imagens foram tomadas em 20X com exceção da figura 2A, que foi tomada em 40X. Todas as amostras de tecido humano foram obtidas sob aprovação de revisão institucional local e aprovação do paciente.

[000353] 5. Quantificação de imunoistoquímica. Imunocoloração de SMA foi quantificada usando MetaMorph v5.0 (Universal Imaging Corporation, Sunnyvale, CA) e expressa como percentual positivo com relação ao tamanho de imagem total. Para cada animal, imagens de 20X de pelo menos 5 seções corticais e 1 a 5 medulares foram analisadas. Análise estatística dos grupos de tratamento foi efetuada usando ANOVA.

[000354] 6. Tratamento de camundongos Col4A3-/- com mAb e rsTGF-βRII-Ig. Camundongos Col4A3+/- em um background 129Sv/J foram reproduzidos para gerar camundongos Col4A3-/-. Os camundongos foram injetados intraperitonealmente com proteínas, três vezes na semana, a partir das 3 semanas de idade até 7 ou 8,5 semanas de idade, conforme indicado. mAbs foram injetados intraperitoneal- mente em 4 mg/kg e rsTGF-βRII-Ig foi injetado em 2 mg/kg. Os camundongos foram submetidos à eutanásia e os rins coletados para RNA e imunocoloração. Todos os estudos com animais foram aprovados e efetuados de acordo com o Institutional Animal Care and Use Committee.

[000355] 7. Purificação de RNA total e síntese de cDNA.

[000356] Os rins foram homogeneizados diretamente em TRIzol (15596-018, Invitrogen, Carslbad, CA) e RNA extraído de acordo com o protocolo do fabricante com extração adicional com 1 mL de fenol:clorofórmio:álcool isoamílico ácido em 25:24:1, pH 6,6. O RNA total purificado foi re-suspenso em H2O tratada com pirocarbonato de dietila (DEPC) (Ambion Inc, Austin, TX) e 260 e 280 registrados (Spectra max Plus, Molecular Sieves, Sunnyvale, CA). DNA residual foi removido usando 5 unidades de grau de amplificação de DNase I (cat No 18068015, Invitrogen) a 20°C, por 15 minutos. cDNA foi gerado usando um kit de arquivo de cDNA de alta capacidade de acordo com o protocolo do fabricante (cat No 4322171, Applied Biosystems Inc., Foster City, CA).

[000357] 8. Desenho de iniciadores, sondas, e moldes padrão de oligonucleotídeos para Taqman. Iniciadores de oligonucleotídeos e sondas Taqman MGB foram designados de seqüências de consenso Affymetrix usando Primer Express versão 2.0.0 (Applied Biosystems Inc.). Sondas Taqman MGB foram desenhadas com um corante de repórter fluorescente (FAM) ligado covalentemente em 5’ e um ("minor Groove binder")/finalizador não fluorescente, ("Non-Fluorescentre Quenquer") (MGBNF), ligado covalentemente à extremidade 3’. Moldes padrão de oligonucleotídeos foram desenhados pela adição de 10 bp de seqüência específica de genes para as extermidades 5’ e 3’ do amplicon. Iniciadores purificados por HPLC de fase reversa e moldes padrão de oligonucleotídeos foram adquiridos da Biosearch Technologies INC., Novato, CA. Iniciadores purificados por HPLC e sonda para gliceraldeído -3-fosfato desidrogenase (GAPDH) murino foram sintetizados em Biogen Idec [CATGGCCTTCCGTGTTCCTA, GCGGCACGTCAGATCC, 6FAM-CCCCAATGTGTCCGTC].

[000358] 9. Ciclo térmico Taqman. Reações de PCR em quadriplicata para amostras e padrões foram submetidas a ciclos em um ciclador térmico 7900HT (Applied Biosystems Inc.) sob as seguintes condições: 50°C por 2 minutos (digestão com uracil N-desglicosilase), 95°C, 10 minutos (ativação Taq polimerase termoestável), e 40 ciclos de 95°C por 15 segundos e 60°C por 60 segundos. A emissão de fluorescência foi coletada cada 7 segundos para a duração da corrida para cada cavidade de reação. Quantidades de transcritos relativas foram determinadas para cada amostra por comparação à curva padrão de oligonucleotídeos usando o software Sequence Detection (Applied Biosystems Inc.).

[000359] 10. Marcação, hibridização e varredura de sonda para caracterização de transcritos. Marcação, hibridização e coloração de amostras foram efetuadas de acordo com o protocolo Preparação de Alvo Eucariótico no Affymetrix Technical Manual (701021, rev. 1) para Análise de Expressão GeneChip® (Affymetrix, Santa Clara, CA). Em resumo, 5 μg de RNA total purificado foi usado em 20 μL de reação de primeira filamento com 200 U de SuperScript II (cat3, 18064-022, Invitrogen) e 0,5 μg de iniciador (dT)-T7 [5’- GGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGAGGCGG(T)24], a 42°C, por 1 hora. A síntese da segundo filamento foi efetuada pela adição de 40 U de DNA Polimerase de E. coli (cat No 18010-25, Invitrogen), 2 U de RNase H de E. coli (cat No 18021-071, Invitrogen) e 10 U de DNA Ligase de E. coli (cat No 18052-019, Invitrogen) seguida por incubação a 16°C, por 2 horas. A reação de síntese do segundo filamento foi purificado usando o Módulo de Limpeza de Amostra GeneChip® de acordo com o protocolo do fabricante (cat No 900371, Affymetrix, Santa Clara, CA). cDNA purificado foi amplificado usando kit de marcação de transcrição de RNA, com alto rendimento, BioArray (cat No 42655-40, Enzo Life Scinces, Inc., Parmingdale, NY) de acordo com o protocolo do fabricante para produzir 7-120 μg de cRNA marcado com biotina (RNA complementar). Conjunto de sondas MgU74Av2, MgU74Bv2, e MgU74Cv2 de camundongo GeneChip® foi pré- hibridizado em uma Forno de Hibridização 640 GeneChip® (Affymetrix, Santa Clara, CA) de acordo com o protocolo do fabricante. cRNA marcado fragmentado foi re-suspenso em 300 μL de tampão de hibridização 1X contendo ácido 2-morfolinometanossulfônico, [Na+] 1M, EDTA 20Mm, Tween 20, 0,01%, 0,5 mg/mL de BSA Acetilado, 0,1 mg/mL de DNA de esperma de arenque, oligo de controle B2, e transcritos de controle bioB 1,5 pM, bioC 5 pM, bioD 25 pM, e cre 100 pM, e hibridizado para conjuntos de sondas GeneChip® de acordo com o protocolo do fabricante (Affymetrix, Santa Clara, CA). Os conjuntos de sondas GeneChip® hibridizados foram lavagens e coloridos usando Estreptavidina-Ficoeritrinina (cat No S866, Molecular Probes, Eugene, OR) e amplificados com antiestreptavidina biotinilada (BA-0500, Vector Laboratories, Burlingame, CA) usando Fluidics Station 400 GeneChip® (Affymetrix, Santa Clara, CA). Os conjuntos de sondas GeneChip® foram escaneados usando Escaner GeneArray (Hewlett Packard, Corvallis, OR).

[000360] 11. Análise de dados de caracterização de transcritos. Os conjuntos escaneados foram convertidos em arquivos CEL Affymetrix, e o conjunto de dados resultante (grupos de arquivos CEL representando o experimento completo) foi normalizado usando o Método Robusto de Médias de Microarray (RMA). Análises estatísticas e de agrupamento ("clustering") foram feitas usando ferramentas de exploração de dados GeneSpring (Agilent) e Spotfire (Spotfire). Usando uma filtragem ANOVA de duas etapas e variação de expressão para identificar conjuntos de sonda, cuja identidade foi alterada por tratamento experimental em comparação com o grupo Col4A3-/- não tratado em p<0,05 e pelo menos 2 vezes. Similarmente, transcritos associados a doenças foram selecionados quanto à expressão diferencial entre os grupos Col4A3-/-nulos não tratados e as virgens de tipo selvagem usando o valor de coorte estatístico de p,0,02 e o valor de cutoff de variação de expressão de sinal de 2. Os perfis do grupo resultante de genes e o grupo de condições experimentais foram analisados e visualizados por clustering hierárquico. A análise de caminho virtual foi realizada usando a base de dados Ingenuity Pathway Analysis (Ingenuity Systems). RESULTADOS:

[000361] 1. Expressão de αvββ em amostras de rim humano com patologia fibrótica. Vários tipos diferentes de doença renal humana, associada à patologia inflamatória/fibrótica, têm mostrado uma expressão aumentada correspondente de TGF-β no tecido de rim25-27. Usando análise imunoistoquímica, examinou-se expressão de αvββ em amostras de biópsia de rim humano associadas à inflamação crônica e fibrose como um mecanismo potencial levando à ativação aumentada de TGF-β (figura 29A e figura 29B). Amostras de tecidos provenientes de glomerulonefrite membranosa, diabetes melito, nefropatia por IgA, síndrome de GoodPasture, Alport, e Lúpus, todos mostraram coloração proeminente de αvββ na revestimento epitelial de túbulos dilatados e lesionados. Em contraste, as amostras de rins morfologicamente normais (carcinoma renal e tecido normal), mostraram imunocoloração ocasional em túbulos. Coloração glomerular estava ausente em todas as amostras de rim analisadas. Essa constatação é consistente com relatos prévios que αvβ6 é expresso em baixos níveis em epitélio adulto saudável, mas é supra-regulado durante a lesão de tecido e reparo10,11,13,15,17.

[000362] 2. Expressão de αvβ6 nos rins de camundongos Col4A3-/- está correlacionada com a progressão de fibrose renal. Camundongos Col4A3-/-, um modelo de camundongo de doença de Alport humana, desenvolvem glomerulonefrite progressiva levando ao acúmulo de ECM em ambas as regiões glomerulares e intersticiais do rim acompanhada por aumentada expressão de vários rótulos padrão de fibrose29,29. Foi previamente reportado que o tratamento de camundongos Col4A3-/- com rsTGF-βRII-Ig leva à inibição de fibrose renal7. Rins de camundongos Col4A3-/- começam a mostrar sinais histológicos de fibrose em aproximadamente 5 a 6 semanas de idade. A doença progride rapidamente com a idade e os camundongos morrem de insuficiência renal em aproximadamente 11 semanas. Camundongos Col4A3+/- heterozigotos não desenvolvem glomerulonefrite e seus rins são histologicamente indistinguíveis daqueles de animais da mesma ninhada do tipo selvagem. Para examinar a dinâmica da expressão de αvβ6 em rins de camundongos Col4A3+/-, e Col4A3-/- (Alport) de idade crescente, realizamos análise imunoistoquímica da expressão de αvβ6 em rins isolados de camundongo de 4, 7 e 8 semanas de idade (figuras 30A-C). Com quatro semanas de idade, ocorreu expressão ocasional de avβ6 em túbulos de rins de ambos os camundongos Col4A3+/- e Col4A3-/-. Em torno de 7 semanas, a expressão de αvβ6 foi marcadamente aumentada nas células epiteliais tubulares de camundongos Col4A3-/-, mas não nos rins de Col4A3+/-. Essa expressão aumentada de αvβ6 foi persistente nos camundongos Col4A3-/- acima de 8 semanas de idade. Também observamos um aumento da intensidade de coloração nas células epiteliais dos túbulos dilatados e danificados nos camundongos Col4A3-/- (Alport) de 6 semanas de idade, que foi acompanhada por um aumento significante da área de tecido de rim mostrando forte expressão de αvβ6. A expressão aumentada durante o período de 7-8 semanas de idade coincidiu com rápida progressão da fibrose renal em camundongos Col4A3-/-. Em contraste, somente expressão mínima de αvβ6, e um leve aumento dependente de idade detectável de sua intensidade de imunocoloração foram detectados nos rins de camundongos Col4A3+/- por todo o tempo. Já que a expressão de αvβ6 em rins de camundongos Col4A3-/- se correlacionou com a progressão da fibrose, desejou-se determinar se o bloqueio da função de αvβ6 poderia inibir a iniciação e a progressão de lesões fibróticas.

[000363] 3. Especificidade de ligação de mAbs a αvβ6 nos rins de camundongos Col4A3-/-. Reportou-se previamente a geração de mAbs anti-avβ623 potentes e seletivos, incluindo mAbs que se ligam a αvβ6 sem afetar sua capacidade de se ligar a ligantes (mAbs não bloqueadores) e mAbs que bloqueiam tanto a ligação de ligante como a ativação de TGF- β mediada por αvβ6 (mAbs bloqueadores). Para verificar se mAbs bloqueadores de αvβ6 usados para estudos in vivo eram seletivos para ligação à integrina αvβ6, efetuou-se análise FACS (figura 31A) comparando a ligação do αvβ6 mAbs com células NIH3T3 parentes não transfectadas e com as células NIH3TE transfectadas com cDNA de β6 murino (NIH3T3B6). Enquanto um mAb anti-av de controle, RMV7, coloriu ambas as células NIH3T3 não transfectadas e expressando αvβ6, os mAbs anti-avβ6 se ligaram seletivamente somente às células NIH3T3b6. Para confirmar a especificidade de ligação de avβ6 em rins, geramos uma forma quimérica humana/camundongo do avβ6 de bloqueio, 3G9, e comparou-se o padrão de imunocoloração produzido com um anticorpo monoclonal anti-av de coelho (figuras 31B e 31C). A forma murino quimérica e original de 3G9 mostrou afinidades de ligação ao alvo comparáveis conforme determinação por FACS e ELISA (dados não mostrados). A forma quimérica de 3G9 imunocoloriu especificamente células epiteliais tubulares em rins de camundongos Col4A3-/- e não mostraram imunocoloração de seções de rim de camundongos Col4A3-/- cruzados com camundongos β6-/- (Col4A3-/- ;β6-/-). Imunocoloração de rins com o anticorpo anti-αv não revelou diferenças significantes entre os camundongos Col4A3-/- ou camundongos Col4A3-/-;β6-/-.

[000364] 4. Tratamento de camundongos Col4A3-/- (Alport) com mAbs anti-αvβ6 inibe a fibrose renal. Para determinar o envolvimento funcional potencial de αvβ6 na regulação da fibrose renal, testou-se a habilidade de αvβ6 mAbs de bloqueio de afetar a iniciação e progressão dos lesões fibróticas avançadas. Para avaliar os efeitos preventivos de bloqueio de αvβ6, camundongos Col4A3-/- foram tratados a partir de 3 semanas a 7 semanas de idade ou a partir de 3 semanas a 8,5 semanas de idade com dois αvβ6 mAbs de bloqueio diferentes, 3G9 ou 8G6; um αvβ6 mAb de não bloqueio, 6.8B3, ou um mAb de controle negativo emparelhado com isótipo, 1E6. Para referência de fenótipo e para monitorar os efeitos de inibição de TGF-β sistêmico, esses estudos incluíram também camundongos Col4A3-/- tratados com rsTGFβRII-Ig. Rins foram coletados para avaliação histológica e para isolar RNA. As marcas de destaque histológicas de fibrose bem como a expressão de SMA foram dramaticamente aumentadas nos rins Col4A3-/- em 7 e 8,5 semanas em comparação com rins de camundongos Col4A3+/- de idades emparelhadas. Os rins de camundongos Col4A3-/- tratados com mAb de controle negativo apresentaram um mesângio fibrótico glomerular e expandido e uma formação crescente da cápsula de Bowman (figura 32A, 1E6). Esses rins mostraram também ativação acentuada de miofibroblastos e fibrose intersticial que foi associada à lesão e dilatação epitelial tubular. Tratamento de camundongos Col4A3- /- com αvβ6 mAbs de bloqueio, 6.3G9 ou 6.8G6, reduziu drasticamente a lesão glomerular e intersticial e fibrose, resultando em conservação de modo geral considerável da arquitetura do rim (figura 32A, 3G9 e 8G6). Esses efeitos dos αvβ6 mAbs de bloqueio foram acompanhados da redução da expressão de SMA por >65% nos glomérulos e por >90% na regiões intersticiais (figuras 32B e 32C). O efeito dos mAbs de bloqueio na expressão de SMA nos glomérulos sugere que enquanto a expressão da integrina αvβ6 está restrita às células epiteliais tubulares, o bloqueio de sua função pode ter efeitos em sítios mais distantes no tecido. O que poderia ser mediado pelo menos em parte devido aos efeitos sistêmicos indiretos dos αvβ6 mAbs de bloqueio. Não foi observado nenhum efeito na progressão da fibrose nos rins dos camundongos Col4A3-/- injetados com o αvβ6 mAb de bloqueio, 8B3. Consistente com a inibição previamente reportada de fibrose renal por meio de bloqueio de TGF-β 7,30-33, o tratamento de camundongos Col4A3-/- com rsTGFβRII-Ig produziu a inibição da fibrose renal similar àquela produzida por αvβ6 mAbs de bloqueio, conforme julgado pelas alterações na aparência histológica e teor de SMA dos tecidos de rim. Os efeitos de mAbs de bloqueio de αvβ6 na expressão de SMA foram igualados pela redução dos níveis totais no tecido do rim de mRNA no colágeno 1a1 e colágeno 1a2 (figuras 33A e 33B). O tratamento dos camundongos Col4A3-/- com 3G9, 8G6, ou rsTGF-βRII-Ig causou uma significante redução da abundância de mRNA no colágeno 1a1 e colágeno 1a2, ao passo que o αvβ6 mAb de não bloqueio e mAb de controle de isótipo não mostraram nenhum efeito significante nos níveis destes transcritos.

[000365] Para testar o impacto do bloqueio de αvβ6 na fibrose renal avançada, estudou-se os efeitos de mAbs de bloqueio de αvβ6 na fibrose renal em camundongos Col4A3-/- com seis semanas de idade, em cujo tempo a patologia do rim é manifestada por lesão e acúmulo mensuráveis de fibroblastos ativados positivos para SMA. Os camundongos foram tratados com mAb de bloqueio de αvβ6, 3G9, ou com um mAb de controle de isótipo, 1E6, por 2,5 semanas e então sacrificados com 8,5 semanas de idade. A quantificação de imunocoloração de SMA revelou um decréscimo na presença de fibroblastos positivos para SMA nos rins dos camundongos Col4A3-/- tratados com 3G9 em comparação com camundongos tratados com mAb de controle de isótipo (figura 34A). De igual importância, a intensidade e área de imunocoloração de SMA com tratamento com 3G9 retardado foram diminuídas em comparação com o nível de SMA observado no início de tratamento (6 semanas). O tratamento retardado dos camundongos Col4A3-/- com 3G9 induziu uma acentuada reversão da patologia, incluindo uma redução significante nos túbulos danificados e fibrose no interstício em comparação com os rins isolados de camundongos Col4A3-/- tratados com 1E6.

[000366] Esses resultados sugerem que o bloqueio terapêutico de avβ6 não somente inibe a progressão da fibrose renal, como também permite a resolução de lesões fibróticas existentes.

[000367] 5. Regulação de expressão de gene de rim pelo mAbs anti- αvβ6. Para obtenção de maior discernimento dos mecanismos da doença associados à função de αvβ6, realizamos uma análise Affymetrix GeneChip de expressão de genes em tecidos de rim dos camundongos do tipo selvagem e Alport. Um grupo de genes com expressão alterada nos rins Col4A3-/- foi identificado como 395 conjuntos de sonda GeneChip mostrando pelo menos uma diferenca média de 2 vezes em intensidade de sinal normalizado entre rins do tipo selvagem emparelhados em idade com os Col4A3-/- de 7 semanas de idade em p,0,01 (figura 31). Anotação funcional dos genes expressos diferencialmente foi realizada usando a ferramenta Ingenuity Pathway Analysis (IPA) e tem indicado associação predominante de genes superexpressos nos rins Col4A3-/- com funções de leucócitos de inflamação e regulação, ao passo que os genes cuja expressão foi diminuída foram associados primariamente à regulação metabólica (figura 36).

[000368] O tratamento dos animais com mAbs de bloqueio de αvββ atenuou a expressão diferencial de um subconjunto de genes em rins Col4A3-/-. Usamos a análise de variância (Welch ANOVA) para identificar transcritos afetados pelos tratamentos experimentais em p<0,05 e subseqüentemente filtrados os conjuntos de sonda resultantes para selecionar aqueles que mostram pelo menos uma diferença de duas vezes em intensidade de sinal em resposta a um tratamento. Esse procedimento rendeu 56, 42, e 28 conjuntos de sonda afetados significantemente pelos 3G9, 8G6, e TGFβRII-Fc, respectivamente. Esses grupos de conjuntos de sonda mostraram uma sobreposição considerável e cada um dos grupos representou um subconjunto inteiramente incluído dos 395 correspondentes aos transcritos diferencialmente expressos em rins Col4A3-/- (figura 37A). Observou- se modulação similar de expressão de gene pelos mAbs de bloqueio de αvββ 3G9 e 8G6 (figura 35, figura 37A) previamente mostrada como pertencendo a duas classes bioquímicas diferentes23. Nem o mAb anti- αvββ 8B3 de não bloqueio nem o mAb de controle de isótipo 1E6 tiveram um efeito significante na expressão gênica. Portanto, o impacto dos αvββ mAbs na expressão gênica do rim era provável devido ao bloqueio da função de αvββ em vez da ativação da sinalização de integrina ou a eventos não específicos. Não observou-se efeitos significantes do αvββ mAb de bloqueio 3G9 na expressão gênica no tecido de rim do tipo selvagem normal. Essa observação sugeriu que os efeitos de mAbs de bloqueio de αvββ observados nos experimentos refletiram primariamente as funções reguladoras específicas da doença de αvββ.

[000369] Para explorar as relações potenciais dos genes modulados por αvβ6 mAbs com as principais vias reguladoras, submetemos as listas de genes respectivas à análise em rede reguladora virtual usando o software IPA (figura 37). IPA compara as listas de genes proporcionadas como entrada para um para uma base de dados curada de interações físicas e reguladores conhecidas dentre os genes e proteínas. Essa análise produz uma lista classificada e configurações individuais das vias reguladoras que são mais prováveis de serem refletidas por uma dada lista de genes modulados. Embora as listas de genes modulados por 3G9 e 8G6 não tenham sido completamente idênticas. IPA revelou as redes dependentes de TGFβ como a redes reguladoras de classificação mais alta afetadas por 3G9 (figura 37A), bem como por 8G6 (figura 37B). Consistente com essa constatação, o clustering hierárquico dos perfis médios da expressão gênica dos grupos experimentais tem demonstrado similarmente entre os padrões de modulação de genes por αvβ6 mAbs e por rsTGFβRII-Ig (figura 35).

[000370] 6. Bloqueio de expressão de αvβ6 reduz expressão de TGFβ nos rins Col4A3-/-. Para determinar se a fibrose renal diminuída, detectada com tratamento com mAb 3G9 e 8g6, estava associada à expressão de TGF-β diminuída, seções de rim foram imunocoloridas com um mAb anti-TGF-β 1 (figura 38A). O mAb que foi usado para imunocoloração foi um que se ligasse preferencialmente às seções de tecido expressando constitutivamente TGF-β ativo versus TGF-β latente (dados não mostrados)24. O tratamento dos camundongos com 3G9 ou com 9G6 causou uma redução significante na imunocoloração de TGF- β1 em ambas as regiões intersticiais e glomerulares dos rins. Essas alterações na expressão de TGF-β foram acompanhadas por alterações análogas nos níveis totais no tecido do rim de mRNA de TGF-β (figura 38B). O padrão de imunocoloração de TGF-β1 indicou que embora a expressão de αvβ6 estivesse restrita ao revestimento epitelial dos túbulos do rim, a inibição da função de αvβ6 poderia levar à expressão diminuída de TGF-β em sítios distais tais como as regiões glomerulares, que não são imediatamente adjacentes às áreas de expressão de αvβ6. Isso pode sugerir que embora αvβ6 possa servir como um desencadeador inicial da ativação local de TGF-β , ele poderia produzir também efeitos reguladores de longa extensão no TGF-β . Um possível mecanismo de tais efeitos de longa extensão poderia ser baseado na capacidade de TGF-β de ativar sua própria expressão em um modo autócrino ou parácrino levando à expansão das áreas de tecido que expressam TGF-β . Também se inclui a possibilidade de uma inibição local inicial de ativação de TGF-β por bloqueio de αvβ6 interferir com o processo de inflamação e fibrose, que poderia então diretamente inframodular a atividade de TGF-β.

[000371] 7. Ablação Genética do gene de β6 nos camundongos Col4A3-/-. Para validar as constatações dos experimentos com mAb, produziu-se camundongos nocaute ("Knockout mice"), duplo, Col4A3 e β6 (Col4A3-/-;β6-/-). Exame histológico dos rins de camundongos Col4A3-/-;β6+/-, e Col4A3-/-;β6-/- com idade emparelhada confirmaou os resultados obtidos em estudos com mAbs de bloqueio de αvβ6. Houve uma significante redução da imunocoloração de SMA de rins provenientes de camundongos Col4A3-/-;β6-/- de 7 a 10 semanas de idade em comparação com camundongos Col4A3-/-;β6+/- com idade emparelhada (dados não mostrados). Isto foi acompanhado por um drástico decréscimo na fibrose nas regiões glomerulares e intersticiais dos rins (figura 39). Isso é demonstrado por uma redução da expressão de colágeno e uma arquitetura bem conservada dos rins como observado em rins coloridos com tricromo-de Masson de Col4A3-/-;β6- /- de 10 semanas de idade em comparação com rins de idade emparelhada provenientes de camundongos Col4A3-/-;β6+/-. A consistência dos efeitos antifibróticos observados com tratamento com αvβ6 mAbs de bloqueio em comparação com a ablação genética da função de β6 indica que o tratamento com mAb é uma abordagem eficaz para bloquear a função de αvβ6 in vivo.

[000372] 7. Resposta à dose de inibição por 3G9 de fibrose renal em camundongos Col4A3-/-. Os camundongos Col4A3-/- foram tratados 3 x por semana com concentrações crescentes de 3G9. Os camundongos foram tratados a partir de 3 semanas de idade a 7 semanas de idade e então sacrificados. Análise imunoistoquímica de SMA foi analisada tanto no córtice como nas regiões medulares do rim. A titulação da dose demonstrou que 3G9 inibiu a expressão de SMA com uma ED50 de 0,3 a 0,4 mg/kg nos camundongos Col4A3-/- (figura 40). DISCUSSÃO:

[000373] A progressão da doença renal é acompanhada por intensa remodelação, inflamação e formação de tecidos das lesões fibróticas levando por fim à ruptura da arquitetura do tecido do rim e à perda da função renal. A fibrose é central para esse processo e envolve a ativação e expressão de fibroblastos, neovascualrização do tecido doente, e deposição massiva da matriz extracelular. Os mecanismos moleculares implicados como principais acionadores desses eventos incluem a regulação errônea do eixo do TGF-β por expressão alterada das proteínas ECM e seus receptores nas células que populam as lesões fibrótica25-27, e a importância funcional do TGF-β na promoção da fibrose tecidual tem sido documentada in vitro e em modelos de animal de doença. A superexpressão de TGF-β é suficiente para induzir a ativação de fibroblastos e angiogênese in vivo e para ativar a produção excessiva de ECM em culturas organotípicas e de celulares34,37,38. Inversamente, ruptura genética ou famracalógica de sinalização de TGF-β proporciona proteção eficaz contra fibrose em modelos de fibrose pulmonar, dérmica e renal30,32,33,39-41.

[000374] Vários estudos direcionados à inibição sistêmica da função de TGF-β (mAbs de bloqueio, rsTGF-βRII-Ig, inibidores de receptor de TGF-β quinase) têm mostrado que atenuam a fibrose em modelos animais de doença. Contudo, todas essas abordagens tiveram como objetivo bloquear a forma ativada de TGF-β , enquanto o potencial terapêutico dos agentes que bloqueiam a ativação de TGF-β permanece menos explorado. TGF-β é expresso como um precursor latente e pode ser convertido em uma citocina biologicamente ativa por vários mecanismos que incluem espécies de oxigênio reativo, pH, trombospondina-1, proteinases extracelulares, e integrinas21,42-44. De particular interesse dentre os últimos está αvβ6, uma integrina induzível por TGF-β expressa nos sítios de remodelação epitelial e que mostra que funciona como receptor e ativador do TGF-β latente11,17,45. A subunidade β6 é supra-regulada em várias formas da doença renal10, e sua ablação genética mostrou que proporciona acentuada proteção contra fibrose renal induzida por lesão no modelo de camundongo de obstrução ureteral unilateral (UUO)46. Proteção similar de camundongos deficientes de β6 tem sido observada no modelo de fibrose pulmonar por bleomicina sugerindo que αvβ6 pode mediar fibrose em tecidos diversos17,47. Interessantemente, fosforilação induzida por UUO de SMAD2, um mediador central de sinalizador de TGF-β , foi acentuada- mente reduzida nos rins deficientes de β6, indicando que αvβ6 pode certamente operar in vivo como parte do circuito regulador de TGF-β .

[000375] Estudos prévios com camundongos de nocaute β6 têm proporcionado evidência que αvβ6 pode desempenhar um papel na iniciação da fibrose, sugerindo essa integrina como um novo alvo terapêutico. Procurou-se determinar se inibição farmacológica da função de αvβ6 com mAbs de bloqueio poderia atenuar a fibrose renal em camundongos Col4A3-/-, um modelo de animal da síndrome de Alport, recessiva autossômica28,29. A síndrome de Alport é uma doença hereditária causada por mutações nos genes Col4A3, Col4A4, ou Col4A548. Defeitos nesses genes resultam na montagem aberrante de redes de colágeno IV e formação anormal das membranas glomerulares e basais tubulares. Pacientes com Alport desenvolvem glomerulonefrite progressiva que leva à doença renal de estágio final. Observou-se supra- regulação acentuada de αvβ6 em Alport humana, bem como em tecidos de rim de camundongos Col4A3-/-. No rim de camundongo Col4A3-/-, a expressão aumentada de αvβ6 era particularmente proeminente no epitélio tubular, onde precedeu e acompanhou a expansão ampla de células positivas para SMA e deposição de colágeno. Com base nesse padrão de expressão, formulou-se a hipótese que αvβ6 se torna supra- regulado cedo no ciclo de resposta epitelial à lesão e pode ser um importante mediador tanto na iniciação como na manutenção da fibrose em uma situação de dano epitelial persistente. Os resultados de nossos estudos mostram bloqueio mediado por anticorpo de αvβ6 pode tanto inibir a iniciação, bem como a progressão precoce da fibrose renal e suprimir sua manutenção. Consistente com os achados anteriores do modelo de camundongo deficiente de β6 de UUO46, os efeitos de mAbs de bloqueio de αvβ6 observados nos experimentos se correlacionaram com a atividade e expressão reduzidas de TGF-β. Interessantemente, o aparente decréscimo de TGF-β e de expressão de SMA seguintes ao tratamento com αvβ6 mAbs ocorreu somente na vizinhança imediata das células positivas para αvβ6, mas foi também detectável em regiões teciduais relativamente distais. Embora essa constatação possa sugerir que αvβ6 pode contribuir com a ativação do eixo do TGF-β, tanto de um modo direto como de um modo indireto, por exemplo, por meio de auto- ativação parácrina da expressão de TGF-β, não se exclui a possibilidade de que o bloqueio de αvβ6 possa proporcionar proteção através de efeitos extra-renais, inclusive alteração da função imune sistêmica. Avaliou-se níveis no soro de várias quimiocinas e citocinas e populações no sangue periférico em camundongos depois de quatro semanas de tratamento com αvβ6 mAbs e nenhuma alteração significante foi encontrada. Adicionalmente, somente alterações mínimas em monócitos nos rins de rins Col4A3-/- foram detectadas por imunoistoquímica com tratamento com αvβ6 mAbs ou nocaute genético do gene de β6. Estudos posteriores avaliando o estado funcional do sistema imune com tratamento com αvβ6 mAbs ou com estudos de transplante poderiam focar isto mais completamente.

[000376] A regulação errônea e a hiperatividade da por meio de de TGF-β têm sido implicadas como um proeminente mecanismo envolvido na progressão da doença renal nos camundongos Col4A36. Uma característica interessante do circuito de TGF-β que poderia explicar o papel aparentemente dominante desta citocina na doença fibrótica é a capacidade do TGF-β de induzir sua própria expressão. Isso faz surgir a possibilidade que o efeitos antifibróticos de bloqueio de αvβ6 podem ser mediados, pelo menos em parte, por mecanismos indiretos. Isso poderia incluir efeitos a jusante na expressão de TGF-β por alteração da inflamação e fibrose localmente e interferindo com a subseqüente atividade do TGF-β. Já que αvβ6 pode ser induzida por TGF-β e promover a ativação de TGF-β latente, explorou-se a relação funcional entre TGF-β e αvβ6 mediando a patologia de rim Col4A3-/-. Comparou- se os impactos de αvβ6 mAbs e rsTGF-βRII-Ig na expressão de transcritos associados à doença nos rins de camundongos Col4A3-/-. Essa comparação revelou uma associação funcional distinta dos genes dependentes de αvβ6 com TGF-β bem como uma similaridade bem- próxima dos padrões de modulação de genes por αvβ6 mAbs e por rsTGF-βRII-Ig. Além disso, o tratamento de camundongos Col4A3-/- com mAbs de bloqueio de avβ6 inibiu a expressão no rim de TGF-β. Essas constatações mostram que os efeitos modificadores da doença de αvβ6 mAbs poderiam resultar da inibição da função de TGF-β, possivelmente por meio de supressão da ativação mediada por αvβ6 do TGF-β latente no tecido doente. Um aspecto intrigante dos dados acima é a inibição da expressão de gene pró-inflamatório através do bloqueio de avβ6 ou TGF-β. TGF-β tem funções antiinflmatórias e imunossupressivas bem estabelecidas, contudo, os padrões de modulação de gene por rsTGF-βRII-Ig e por mAbs anti-αvβ6 nesses experimentos foram indicativos de uma função pró-inflamatória de TGF- β no modelo de doença Alport. Embora o mecanismo real desse efeito pró-inflamatório necessite de posterior investigação, ele poderia ser baseado na capacidade conhecida do TGF-β de induzir arresto de crescimento e morte de células epiteliais31,49-51. Já que o dano epitelial proporciona um importante mecanismo para ativação de imunorres- postas à lesão tecidual, a aparente função pró-inflamatória de TGF-β sugerida por esses dados poderia ser indireta e mediada por lesão promovida por TGF-β ao epitélio do rim. De acordo com esse modelo, avβ6 pode funcionar como um importante componente do mecanismo dependente de TGF-β da remodelação epitelial, e a regulação errônea de sua função na doença poderia ainda promover lesão e inflamação no tecido associado à doença.

[000377] Os resultados desse estudo demonstram que αvβ6 é altamente supra-regulada em doença de rim humano e ao direcionar avβ6 com anticorpos de bloqueio de função pode fornecer uma nova e eficaz abordagem para modulação terapêutica da fibrose renal. Já que a expressão de αvβ6 é altamente restrita às células epiteliais no tecido doente, essa abordagem permite a supressão local de função de TGF- β. Como TGF-β é expresso em uma variedade de células e tipos de tecido, e desempenha um importante papel na regulação de vários processos homoestáticos diferentes, o bloqueio da função de αvβ6 oferece uma alternativa mais segura para a inibição sistêmica de TGF- β naquelas doenças onde a integrina αvβ6 é supra-regulada. CONCLUSÕES

[000378] αvβ6 é superexpressa em doença renal humana associada à patologia inflamatória e fibrótica.

[000379] mAbs de bloqueio de αvβ6 inibem a fibrose em modelo Col4A3-/- (Alport) de fibrose renal.

[000380] Estudos de tratamento retardado indicam que o bloqueio terapêutico de αvβ6 não somente inibe a progressão da fibrose renal, mas também permite a resolução de lesões fibróticas existentes.

[000381] Nocaute genético de β6 leva à proteção nos camundongos Col4A3-/-.

[000382] A caracterização de transcritos mostrou que mAbs de bloqueio de αvβ6 inibiram significantemente alterações associadas a doenças na expressão de mediadores fibróticos e inflamatórios.

[000383] Padrões similares de modulação de transcritos foram produzidos com tratamento com TGF-β RII solúvel sugerindo funções reguladoras compartilhadas de αvβ6 e TGF-β. REFERÊNCIAS: 1. Okada H, Kalluri R: Cellular and molecular pathways that lead to progression and regression of renal fibrogenesis. Curr MoI Med 2005, 5:467-474 2. Sheppard D: Functions of pulmonary epithelial integrins: from development to disease. Physiol Rev 2003, 83:673-686 3. Norman JT, Fine LG: Progressive renal disease: fibroblasts, extracellular matrix, and integrins. Exp Nephrol 1999, 7:167-177 4. Border WA, Noble NA: Interactions of transforming growth factor-beta and angiotensin II in renal fibrosis. Hypertension 1998, 31:181-188 5. Wang W, Koka V, Lan HY: Transforming growth factor-beta and Smad signalling in kidney diseases. Nephrology 2005, 10:48-56 6. 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[000385] Obstrução Ureteral Unilateral (UUO) é um bem estabelecido modelo de animal de lesão renal levando à fibrose tubulointersticial renal acelerada. Obstrução do trato urinário produz pressão intraluminal aumentada no uréter e túbulos renais que causa lesão parenquimatosa renal. UUO é caracterizada por hidronefrose, dilatação tubular, apoptose tubular renal, atrofia renal progressiva, infiltração celular intersticial, um aumento do TGF-β renal e fibrose intersticial renal1. A função da integrina αvβe pode participar tanto da ativação de TGF-β como do processo de transformação epitelial para mesenquimal. Já que estes processos contribuem para a progressão da doença, o modelo de UUO foi usado para avaliar a eficácia do anticorpo monoclonal anti-αvβ6 mu3G9 e proteína de fusão de Ig tipo II de receptor de TGF-β murino, solúvel, recombinante (rsTGF-βrii-Ig) contra fibrose renal rapidamente progressiva. A inibição percentual média da coloração de actina na musculatura lisa com mu3G9 em 4 mg/kg, dosada i.p. três vezes por semana durante os dez dias do curso do experimento, foi de 32%. INTRODUÇÃO

[000386] Fibrose progressiva é um processo comum que leva ao desenvolvimento de doença renal de estágio final e promovida por remodelação epitelial, ativação de fibroblastos, inflamação, e reorganização das interações celulares com a matriz extracelular (ECM). Mecanismos moleculares que contribuem com esses eventos são complexos e incluem a regulação errônea do eixo de TGF-β, remodelação de ECM aberrante, e expressão alterada e função de receptores de adesão celular da superfamília de integrinas2-9. Estudos recentes têm revelado funções reguladoras importantes de várias integrinas e moléculas associadas em células epiteliais renais e mesenquimais8,10-13.

[000387] Dentre as integrinas cuja expressão é fortemente aumentada na doença renal está a integrina αvβθ induzida por TGF-β3,14,15. A expressão de αvβθ é geralmente restrita às células epiteliais onde ela é expressa em baixos níveis em tecidos adultos normais e elevados durante o desenvolvimento, lesão, e neoplasia14,1θ-18. Embora αvβθ seja expressa relativamente em níveis baixos em rim adulto saudável, sua expressão é proeminente no desenvolvimento de rim de camundongos, particularmente nos túbulos proximais, alça de Henle, e dutos coletores1θ,17,19. Recentemente, expressão elevada de αvβθ foi reportada para várias formas de patologia renal humana.

[000388] Consistente com a expressão aumentada de αvβθ in vivo durante a remodelação de tecido, expressão da integrina αvβθ em células epiteliais cultivadas pode ser induzida por citocinas que regulam a remodelação epitelial, incluindo EGF e TGF-β3,14. Além disso, superexpressão de β6 na pele de camundongos transgênicos tem mostrado provocar a formação de ferimentos crônicos espontâneos20 sugerindo que αvβ6 pode desempenhar um importante papel na regulação de remodelação de tecido epitelial.

[000389] Ligantes conhecidos para αvβe incluem fibronectina, tenascina, e os peptídeos 1 e 3 associados à latência (LAP1 e LAP3), os fragmentos N-terminal das formas precursoras latentes de TGF-β 1 e -β321-25. Como resultado da ligação a esses ligantes, αvβe pode mediar adesão celular, disseminação, migração, e ativação de TGF-β latente. TGF-β é sintetizado como uma proteína latente que é clivada e secretada com o LAP N-terminal não-covalentemente associado à citocina de TGF-β C-terminal, ativa, madura. O complexo de TGF-β latente não pode se ligar a seu receptor cognato e assim permanece biologicamente inativo até ser convertido na forma nativa por um de vários mecanismos alternativos que incluem clivagem por proteases, exposição a pH baixo ou radiação ionizante, e alterações conformacionais no complexo latente permitindo que ele se ligue aos seus receptores cognatos26-29. Uma alteração conformacional ativadora pode ser induzida por αvβe envolvendo a ligação direta da integrina a um motivo de RGD contido dentro do LAP1 e LAP3. Essa ligação converte o precursor de TGF-β em um estado competente por ligação de receptor22,25. Essas constatações sugerem que a supra-regulação da expressão de αvβ6 na superfície das células epiteliais pode levar à ativação local de TGF-β, seguida por ativação parácrina de eventos dependentes de TGF-β em células "bystander".

[000390] Já que TGF-β foi implicado como um regulador central de fibrose renal, foi formujada a hipótese que sua ativação local por αvβ6 pode ser um processo importante no início e progressão de doença renal e bloqueio da função de αvβ6 poderia suprimir o desenvolvimento de fibrose renal. Nos estudos descritos aqui foi mostrado que αvβe é significantemente supra-regulada no modelo de obstrução ureteral unilateral de camundongo de fibrose renal. Foi mostrado que mAbs bloqueando a ligação de ligante e as funções de ativação de TGF-β de αvββ30 inibem a fibrose no modelo. Materiais e Métodos

[000391] 1. Animais. Camundongos C57BL (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) isentos de antígeno viral, de 8-12 semanas de idades, machos, pesando 25,5 ± 0,2g foram usados nos estudos. Os animais foram alojados na instalação para animais do laboratório isento de vírus, Biogen Idec, em prateleiras com gaiolas isoladoras, ventiladas, e deixados se acomodarem por sete dias antes do início do estudo. Os camundongos tiveram acesso a vontade à ração de camundongo, padrão, irradiada (LabDiet Prolab® 5P75 Isopro® RMH 3000) e água estéril durante toda a acomodação, e período experimental. Peso corporal foi medido em intervalos como parte do monitoramente da saúde dos animais.

[000392] 2. Anticorpos e reagentes. αvββ mAbs foram gerados conforme descrição aqui e como previamente descrito30. cDNAs de 2A1 e de 3G9 quiméricos humanos/camundongo foram gerados dos RNAs totais de hibridomas parentes respectivos com iniciadores de região constante CDL-739 para a cadeia pesada e CDL-738 para a cadeia leve usando o kit de síntese de cDNA do Primeiro filamento (Amersham/Pharmacia, Piscataway, NJ). Os genes de região variável de cadeias pesada e leve foram amplificados pela reação em cadeia de polimerase usando os mesmos iniciadores 3’ para a síntese de cDNA e grupos de iniciadores degenerados específicos para a maioria das seqüências de sinais de genes de anticorpos murinos (seqüências disponíveis mediante solicitação) e Pfu DNA polimerase (Stratagene, La Jolla CA). Regiões variáveis de cadeias pesada e leve clonadas foram ligadas a vetores de expressão de mamífero com regiões constantes de IgG1 humano. Proteína de fusão de Ig tipo II de receptor de TGF-β, murino, estável (sTGFbRII-Ig) foi gerada conforme descrição prévia11 e adquirida da R&D Systems (532-R2, Minneapolis, MN).

[000393] 3. Imunoistoquímica. Seções de tecido foram desparafinizadas em xileno e etanol, re-hidratadas em água destilada, e, então, imersas em metanol contendo 0,45% de H2O. Os tecidos foram incubados com pepsina (00-3009, Zymed, San Francisco, CA) e bloqueados com avidina e biotina (SP-2001; Vector Laboratories, Burlingame, CA). O anticorpo primário foi diluído em PBS contendo 0,1% de BSA e os tecidos foram incubados durante a noite, a 4°C. Para imunocoloração de β6 no tecido de camundongo, as seções foram incubadas com uma forma quimérica humana/camundongo do mAb anti-αvβ6, 2A130, e um anticorpo secundário biotinilado antihumano (PK-6103, Vector Laboratories, Burlingame, CA). Para imunocoloração de β6 em tecido murino 2A130, e um anticorpo secundário biotinilado anticamundongo (PK-6102, Vector Laboratories). Complexo de avidina-biotina-raiz forte peroxiadase (Vector Kit, PK-6102) foi aplicado às seções, incubadas por 30 minutos à temperatura ambiente, e substrato de 3,3'- diaminobenzindina (DAB) foi preparado conforme instruções (SK- 4100, Vector Laboratories) e aplicado às seções por 5 minutos à temperatura ambiente. As seções de tecido foram coloridas com Hematoxilina de Mayer, por 1 minuto, e rinsadas em água e PBS.

[000394] 4. Indução de obstrução ureteral unilateral de fibrose renal. Cirurgia para os estudos foi realizada durante o período de dois dias e esquemas de dosagem para os camundongos foram sincronizados com relação ao dia da ligação do uréter. O uréter esquerdo foi assepticamente isolado por meio de uma laparotomia a esquerda da linha média sob anestesia de cetamina:xilazina (1.000:10 mg/kg, s.c.). Duas ligaduras de seda, apertadas, 6-0, oclusivas, foram colocadas sobre o uréter no nível do pólo inferior do rim, e o coorte do uréter entre as ligaduras. A parede abdominal foi fechada com uma sutura de Vicryl 4-0 e a pele fechada com náilon 4-0. Os animais foram deixados para recuperação em um chumaço com aquecimento e administrados com 0,05 mg/kg s.c. de buprenorfina, duas vezes ao dia, nos Dias 0 e 1. O animais foram dosados três vezes, semanalmente, com mu3G9 ou duas vezes, semanalmente, com rsTGF-βRII-Ig, começando no dia antes da cirurgia. O procedimento foi adaptado do relatório previamente descrito31.

[000395] 5. Coleta de amostras de tecido e análise histológica para indicadores de doença. Os animais foram eutanizados com dióxido de carbono no Dia 10 depois da ligação. Ambos os rins (esquerdo ligado, direito não ligado) foram removidos e repartidos igualmente de forma transversal através do centro da pelve renal. Uma metade de cada rim foi passada em formalina tamponada neutra a 10% para coloração de tecido fixado. A outra metade de cada rim foi colocada em sacarose a 15%, seguida por sacarose a 30% para coloração imunoistoquímica da actina da musculatura lisa.

[000396] As seções de rim fixadas em formalina foram coloridas para teor de colágeno com corante de tricromo de Masson, e para anatomia estrutural com H&E. As seções coloridas com tricromo foram morfometricamente quantificadas em imagens capturadas por microscópio de campo claro usando um sistema de análise de imagens Leica Qwin. As imagens foram capturadas usando condições de iluminação padronizadas e ajustes de exposição de câmera digital, corrigidos para fundo, e calibrados para padrões de distância.

[000397] Os limites foram estabelecidos para detectar azul escuro para coloração de colágeno em lâminas coloridas com tricromo de Masson. A área de colágeno foi analisada em imagens tomadas em 200X. Imagens de campos contíguos cobrindo a seção de rim esquerdo inteiro foram tiradas de cada animal para quantificação.

[000398] 6. Análise estatística. O teor de colágeno em cada campo medido foi expresso com o percentual da área de tecido total dentro do campo de 200 X (excluindo qualquer espaço branco), isto é % de área azul. Dezesseis a trinta e cinco campos individuais foram medidos de cada rim. Esses incluíram todo o tecido cortical e medular da seção e excluiu a papila renal. A área média azul em porcentagem de todos os campos no rim ligado esquerdo foi calculada de cada animal e servida como a classificação de fibrose dos animais para teste estatístico. A significância estatística de diferenças relacionadas a tratamento na % de área azul, dentro os vários grupos de tratamento, foi determinada por análise de variância de uma por meio de, seguida do procedimento de Student- Newman-Keuls para comparação de pares múltiplos. As diferenças foram consideradas como sendo estatisticamente significantes quando p<0,05. Resultados

[000399] 1. Expressão de αvββ em rins depois de UUO. A expressão de integrina αvβ6 em rins depois de UUO examinada por análise imunistoquímica. A expressão mínima de αvβ6 foi detectada em rins não- lesionados (normais), enquanto a expressão supra-regulada significante foi demonstrada em 7, 10, e 14 dias depois de UUO (figura 41). Expressão detectável foi medicada logo 3 dias após UUO.

[000400] 2. Inibição de imunocoloração de actina na musculatura lisa de rins de UUO com tratamento com mu3G9. A extensão da fibrose no modelo murino de UUO foi medida por análise histomorfométrica de coloração de actina da musculatura lisa-a, imunoistoquímica (corante marrom) ou coloração da matriz de colágeno com tricromo de Masson (corante azul). Em cada estudo, a proporção de área de tecido ocupada por fibrose foi determinada em camundongos de UUO recebendo veículo ou mAb de controle de isótipo (grupos de controle negativo), em grupos recebendo tratamento terapêutico de teste, e em camundongos normais não ligados. Os efeitos terapêuticos são expressos em porcentagem de inibição de coloração de matriz de colágeno (azul) com tricromo de Masson ou coloração da actina (marrom) da musculatura lisa por cálculo da razão da diferença em área colorida entre o controle negativo e o teste terapêutico sobre a diferença entre o controle negativo e camundongos normais não ligados.

[000401] Com a finalidade de relacionar os resultados em estudos múltiplos, os efeitos terapêuticos são expressos como percentagem de inibição de coloração da actina na musculatura lisa-α. A inibição percentual média da coloração da actina da musculatura lisa em 4 mg/kg de mu3G9, dosada i.p. três vezes por semana, para os dez dias do curso do experimento, foi de 32,8%; enquanto a rsTGF-βRII-Ig mostrou uma inibição percentual média de 13,2 mg/kg (Tabela 14.1). Tabela 14.1. Inibição percentual média da coloração da actina da musculatura lisa-a para mu3G9 e sTGFbRII-Ig contendo dados de múltiplos estudos.

[000402] Dosagem intraperitoneal, 3x/semana, por 10 dias. Vide Tabela 14.8 para camundongos individuais em cada dose Tabela 14.2. Inibição percentual média em UUO-4 da coloração de actina da musculatura lisa.

Tabela 14.3. Inibição percentual média em UUO-6 de coloração de actina da musculatura lisa.

Tabela 14.4A. Inibição percentual média em UUO-7 da coloração de actina da musculatura lisa.

Tabela 14.4B. Inibição percentual média em UUO-7 da coloração com tricromo de Masson

Tabela 14.5. Inibição percentual média em UUO-8 da coloração de actina da musculatura lisa.

Tabela 14.6. Inibição percentual média em UUO-9 da coloração de actina da musculatura lisa.

Tabela 14.7. Inibição percentual média em UUO-14 da coloração de actina da musculatura lisa.

Tabela 14.8. Porcentagem de inibição da imunocoloração de actina da musculatura lisa em animais individuais com tratamento com mu3G9 ou com rsTGFbRII-Ig.

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EXEMPLO 15: Uso de Anti-αvβ6 em um Modelo Murino de Fibrose Pulmonar Induzida por Radiação INTRODUÇÃO

[000403] Fibrose pulmonar ocorre quando remodelação desordenada da matriz segue a lesão pulmonar (Chapman 2004). Dentre muitos fatores de sinalização que estão desregulados na fibrose pulmonar, a citocina TGFβ desempenha um papel particularmente importante. Em modelos animais, a inibição de sinalização de TGFβ previne fibrose no pulmão, rim, fígado e pele.

[000404] Depois do processamento intracelular, TGFβ e seu pró- domínio são secretados como um complexo associado covalentemente (Annes, Munger et al., 2003). TGFβ ligado a seu pró-domínio é latente, isto é, não pode se ligar aos receptores de TGFβ; logo, o pró-domínio é referido como peptídeo associado à latência (LAP). Além de agir como um inibidor de TGFβ, LAP interage por meio de ligação de dissulfeto com proteínas da família de Proteínas de Ligação de TGFβ Latente (LTBP). LTBPs são proteínas matriz e ancoram TGFβ latente na ECM. Liberação de TGFβ a partir de LAP, um processo chamado de ativação de TGFβ latente, é uma etapa necessária na por meio de de sinalização de TGFβ. A etapa de ativação é um alvo potencial para estratégias de redução de sinalização de TGFβ.

[000405] As integrinas αvβ6 e αvβs ativam TGFβ1 e TGFβ3 latentes por interação com uma seqüência de aminoácidos de RGD localizada próxima aos C-terminais dos respectivos LAPs (Munger, Huang et al., 1999; Annes, Rifkin et al. 2002; Mu, Cambier et al., 2002). (TGFβ2, a isoforma final de TGFβ, não tem uma seqüência de RGD e não pode ser ativada por essas integrinas). Dentro do pulmão, a ativação de TGFβ pela integrina αvβ6 desempenha um papel não-redundante na homeostasia e resposta a lesão. αvβ6 é expressa em pequenas quantidades no epitélio de pulmão normal, mas é rapidamente supra- regulada seguinte à lesão. Camundongos carecendo do gene de β6 (Itgb6-/-) desenvolvem inflamação pulmonar e enfisema como resultado da reduzida sinalização de TGFβ . Exposição de pulmões de camundongo à bleomicina causa lesão aguda acompanhada por um grande aumento da expressão de αvβ6, seguida por fibrose dependente de TGFβ; camundongos Itgb6-/- não desenvolvem fibrose pulmonar depois de tratamento com bleomicina.

[000406] Radiação ionizante causa fibrose pulmonar (Franko e Sharplin 1994; Movsas, Raffin et al., 1997; Martin, Lefaix et al., 2000; Abratt, Morgan et al., 2004). Em contraste com o modelo de fibrose pulmonar por bleomicina, onde a fibrose começa dentro de dias depois da lesão pulmonar, a fibrose pulmonar induzida por radiação (RILF) começa meses depois da lesão. RILF murina é dependente da cepa. A cepa C57BL/6 usada nesses experimentos é suscetível. No modelo murino de RILF, há também uma substancial morte tardia ocorrendo em torno do tempo do desenvolvimento da fibrose; essa mortalidade é provável devido à perda de perfusão no pulmão (Franko, Nguyen et al., 1996; Haston, Zhou et al., 2002). Um mAb anti-αvβ6 inibidor (3G9) foi desenvolvido (Weinreb, Simon et al., 2004). As metas desses estudos foram: (1) estabelecer a dependência de αvβ6 de RILF em uma cepa de camundongo suscetível por comparação das respostas de Itgb6+/+ e Itgb6-/- à radiação torácica, (2) confirmar a dependência de TGFβ do modelo murino de RILF por tratamento de camundongos irradiados com um antagonista de TGFβ (receptor de TGFβ solúvel) e (3) confirmar os efeitos de várias doses de 3G9 dadas aos camundongos irradiados.

MATERIAIS E MÉTODOS

[000407] 1. Animais. Todos os camundongos usados eram camundongos fêmeas Itgb6-/- e foram um presente de Dean Sheppard, UCSF, e foram criados nessa instalação em um background C57BL/6. Camundongos do tipo selvagem foram C57VL/6 adquiridos de Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME), de 7 a 9 semanas de idade na chegada e deixados uma semana para aclimatização nessa instalação de animais antes da radiação. Todos os procedimentos de manuseio de animais e experimentos foram aprovados pelo comitê de assistência a animais da New York University School of Medicine e conformados às diretrizes de NIH para o cuidado e uso de animais de laboratório. As gaiolas foram restringidas a um máximo de 5 camundongos por gaiola de acordo com o protocolo de instalação para animais. Os camundongos foram monitorados diariamente quanto à morbidade e à mortalidade. Camundongos moribundos foram sacrificados.

[000408] 2. Anticorpos. Dois anticorpos foram obtidos da Biogen Idec (Cambridge, MA), e foram preparados conforme descrito em algum lugar aqui. O anticorpo primário testado, 3G9, é um mAb anti-αvβ6 que bloqueia a ativação de TGFβ mediada por αvβ6. Esse é um subtipo de IgG1 e se liga a αvβ6 em um modo independente de cátion. O Ab de controle (1E6) era um Ab monoclonal de IgG1 de LFA-3 antihumano de camundongo que não interage com LFA-3 de camundongo. Doses desse Ab de controle até 200 mg/kg/semana por 4 semanas em camundongos normais não mostraram toxicidade (dados da Biogen Idec). Alíquotas de anticorpo foram preparadas como diluições em PBS estéril para obter doses de 0,3, 1, 3, 6, e 10 mg/kg em um volume total de 200 microlitros. Injeções subcutâneas no flanco direito ou injeções intraperitoneais, dependendo do experimento, começaram na semana 15 pós-irradiação.

[000409] 3. Protocolo de Radiação. Os camundongos foram irradiados quando estavam com 8 a 10 semanas de idade. Antes da irradiação, anestesia foi conseguida usando Avertin (2,2,2-tribromoetanol; Acros Organics, NJ) com 15 μL/g de uma solução a 2,5% distribuída intraperitonealmente. Os camundongos foram então posicionados em supino com filamento adesiva em uma superfície de Plexiglass. Posicionamento adequado com blindagem de chumbo restringiu a radiação ao tórax. O campo do nível do ápice para o processo xifóide foi de 1,8 cm. Uma fonte de 60Co foi usada para prover irradiação de 14 Gy. A distância da fonte para a pele era de 65 cm. O tempo de exposição com essa fonte foi de ~11 minutos. Depois da exposição à radiação, os camundongos foram levados de volta para suas gaiolas e posicionados com a face para cima e monitorados durante a recuperação.

[000410] 4. Coletas de amostras dos camundongos sacrificados. Os camundongos que sobreviveram em pontos de tempos predeterminados pós-radiação (26, 28 ou 32 semanas para os estudos de anticorpo) foram sacrificados e processados da seguinte maneira. Depois de anestesia profunda ter sido obtida com Avertin, etanol a 70% foi aspergido sobre a pele torácica e abdominal. A cavidade torácica foi aberta através do diafragma. 400-500 μL de sangue foram aspirados diretamente dos ventrículos. A traquéia foi exposta e canulada com um angiocateter de calibre 22. Os pulmões foram lavagens duas vezes com alíquotas de 700 μL. O brônquio do canal principal direito foi ligado ao hilo, e cada lobo foi removido e colocado em um tubo separado, congelado rapidamente em nitrogênio líquido, e armazenado a -80°C. O pulmão esquerdo foi inflado com 400 μL de formalina a 10%, colocado em formalina a 10% durante a noite e embutido em parafina. O fluido de lavagem broncoalveolar (BAL) obtido na ocasião do sacrifício foi dividido em duas alíquotas: 200 μL e o restante. Ambos os tubos foram centrifugados em 2.000 rpm, por 3 minutos. Os sobrenadantes de ambos os tubos foram combinados, congelados em nitrogênio líquido e armazenados a -80°C. O pélete de células do tubo mais largo foi congelado instantaneamente e armazenado do mesmo modo. A alíquota de 200 μL do precipitado de células foi ressuspensa com 200 μL de tampão de lise RBC e misturada inteiramente. 50 μL foram usados para contagem de células em um hematocitômetro. Os 150 μL restantes foram usados para preparações de citospina. O sangue obtido por punção cardíaca foi usado para fazer soro ou plasma como a seguir. Depois de misturamento inicial em tubos Capiject ou tubos de microcentrífuga de 1,5 cm3 heparinizados, as amostras foram centrifugadas a 14.000 rpm por 20 minutos. Os sobrenadantes foram removidos e imediatamente congelados a -80°C.

[000411] 5. Coletas de amostras de camundongos encontrados mortos ou moribundos. Os camundongos que foram encontrados mortos ou moribundos antes de alcançarem a data de sacrifício foram dissecados para obter espécimes de pulmão. Os camundongos moribundos foram eutanizados com Avertin antes da dissecação. A cavidade torácica foi aberta através do diafragma. Foi realizada dissecação até a traquéia com exposição completa. A traquéia foi canulada com um angiocateter de calibre 22. Os pulmões foram inflados com 800-1.000 μL de formalina a 10%. O conteúdo da cavidade torácica foi removido em bloco e colocado em formalina a 10% por pelo menos 24 horas antes da separação do pulmão e embutido em parafina.

[000412] 6. Diferenciação celular. Preparações de citopsina foram coloridas pelo método DiffQuik (imersões de 15 segundos seqüencialmente em Fixador, 1% de Eosina-Y, 1% de Azure A, e água deionizada). As lâminas foram então desidratadas e montadas. Os números de neutrófilos, linfócitos, e macrófagos foram manualmente contados em dois campos de alta energia, separados (400x).

[000413] 7. Imunoistoquímica. Algumas das amostras fixadas em formalina foram usadas para detecção imunoistoquímica de β6. A atividade de peroxidase endógena foi extinta com peróxido de hidrogênio a 3% em metanol por 15 minutos, e recuperação de antígeno foi obtida por aplicação de Digest-All 3 Pepsina (Zymed, South San Francisco) por 5-7 minutos. A solução de bloqueio de Avidina/Biotina (Vector Laboratories, Burlingame, CA) foi usada de acordo com as instruções do fabricante. O bloqueio foi com solução de caseína a 0,5% por 15 minutos. O anticorpo monoclonal anti-β6 ch2A1 (Biogen Idec), que consiste na região variável de um mAb anti-β6 de camundongo clonado em um IgG humano, foi usado em uma diluição de 1:500 em BSA a 0,1%, por 1 hora, à temperatura ambiente. A detecção foi alcançada usando um kit Vectastain ABC (Vector Laboratories) com um anticorpo secundário antihumano de acordo com as instruções do fabricante. A geração de cromógeno foi feita com um kit DAB (Sigma, St. Louis, MO), seguida por contra-coloração com hematoxilina. A especificidade do procedimento foi confirmada pela omissão do anticorpo em seções tratadas em paralelo, o que foi feito rotineiramente, e por testes preliminares em seções do pulmão de camundongos Itgb6- /-, que deram resultados negativos.

[000414] 8. Seções de pulmão, coloração de tricromo, e determinação percentual de fibrose. Os pulmões fixados em formalina, embutidos em parafina, foram seccionados transversalmente para 5 micra de espessura. As seções de pulmão foram obtidas em ou próximo ao hilo por estimativa visual. As lâminas foram desparafinizadas com água deionizada (banho de Xileno x 2 por 3 minutos cada, etanol a 100% x 2 por 3 minutos cada, etanol a 95% x 2 por 3 minutos cada, 70% etanol x 3 minutos, deionizadas com água x 3 minutos). As seções foram coloridas com corante de tricromo de Masson (a solução de Bouin durante a noite para mordente, ferro hematoxilina de Weigert por 5 minutos, Fucsina ácida Escarlate de Biebrich por 5 minutos. Solução de Ácido fosfotúngstico/fosfomolíbdico por 5 minutos, Solução de Azul de anilina por 5 minutos, enxágües com água deionizada, no intervalo, e Ácido acético a 1% por 2 minutos). As lâminas então desidratadas (etanol a 70%, etanol a 95%, etanol a 100%, e xileno), e montadas usando Permount.

[000415] A técnica de percentual de fibrose descrita por Haston et al. (Cancer Res 2002, 62:372-8) foi usada. Imagens de baixo poder (2-3X) de seções de pulmão coloridas com tricromo foram obtidas e salvadas em formato digital. Inspeção manual de alto poder (100-200X) das seções de pulmão foi realizada por microscopia de luz para identificar as regiões de fibrose (definidas por aumentada deposição de colágeno e perda da arquitetura). Áreas de seção transversal de fibrose juntamente com a área de seção transversal total da seção de pulmão foram mostradas na imagem digital suando o software NIH Image 1.62. A soma das áreas da fibrose foi dividida pela área total do pulmão para estabelecer o percentual de fibrose. Uma seção transversal aleatória do pulmão mostrou que reflete o percentual de fibrose no pulmão inteiro quando em comparação com as 10 seções aleatórias (Haston, Amos et al., 1996).

[000416] 9. Ensaio de Hidroxiprolina. A medição do teor de hidroxi- prolina foi adaptada do método de Reddy e Enwememka. O pulmão direito foi removido e pesado. O tecido pulmonar (cerda de 20 mg de peso úmido) foi incubado em 400 μL de solução 2N de NaOH por 12 horas (temperatura ambiente), e então homogeneizado. Os homogeneizados e soluções padrão de hidroxiprolina foram hidrolisados por aquecimento para 120°C, por 30 minutos. Solução de Cloramina-T (0,056M, 450 μL) foi adicionada a 50 μL de hidrolisado e foi deixada que a oxidação prosseguisse por 25 minutos. Reagente de Ehrlich (1M, 500 μL) foi adicionado e foi deixado que a cor fosse revelada, por 20 minutos, a 65°C. Absorbância em 550 nm foi então medida. As concentrações finais são expressas como μg de hidroxiprolina/mg de tecido de pulmão úmido.

[000417] 10. Medições de Razão Mássica RV/LV. Os camundongos usados para este experimento foram em um coorte que foi sacrificada em 32 semanas pós-irradiação; mais sete camundongos C57BL/6 não irradiados foram usados como controles. Os corações dos camundongos irradiados que morreram entre 28 e 32 semanas ou de camundongos que sobreviveram para serem sacrificados com 32 semanas. Os corações foram fixados em formalina. Sob o microscópio de dissecação, os átrios foram removidos, e a parede livre ventricular direita (RV) foi dissecada sendo separada do ventrículo esquerdo e do septo (LV). Cada pedaço do tecido ventricular foi pesado, e a razão foi calculada. Sete camundongos C57BL/6 não irradiados foram usados como controles.

[000418] 11. Estatística. A significância estatística das diferenças percentuais de fibrose entre grupos foi realizada usando o teste de Mann-Whitney para dados não paramétricos. As datas de morte foram registradas e usadas para criar curvas de Kaplan-Meier. Comparações por grupo individual bem como comparações totais das curvas de Kaplan-Meier foram feitas com teste de Log-Rank (Mantel-Cox). Valores médios são reportados com o erro padrão correspondente do desvio médio ou padrão. Para comparação das médias das medições da razão mássica de RV/LV, foi usado o teste t de Student (não-pareado, 2 caudas). O teste exato de Fisher foi usado para comparar a presença ou ausência de fibrose entre os camundongos Itgb6-/- e Itgb6+/+. A significância estatística foi definida como p<0,05. RESULTADOS

[000419] 1. RILF murina requer expressão de αvβ6: comparação de camundongos Itgb6+/+ e Itgb6-/- depois da radiação torácica. Esse experimento foi projetado para comparar a expressão de αvβ6 na linha de base e pós-radiação e para determinar se a ausência de αvβθ preveniu fibrose. Os camundongos Itgb6-/- e Itgb6+/+ foram irradiados e sacrificados em vários pontos de tempo antes e nas 28 semanas. (a) β6 é supra-regulado na 18-20 semanas pós-irradiação. Os camundongos sacrificados, antes das 18 semanas pós-irradiação, tiveram expressão de αvβe, baixa, normal, conforme medida por imunoistoquímica. Contudo, nas 18 semanas, é vista a expressão aumentada difusamente de αvβe em todo o epitélio alveolar (figura 42). (b) Alta expressão de αvβe persiste nas regiões fibróticas. Foram observados consistentemente altos níveis de expressão de αvβe nas células epiteliais dentro das lesões fibróticas, independentemente do tempo desde a irradiação (figura 43). Contudo, a expressão aumentada difusa de αvβe observada nas 18 semanas é freqüentemente menos evidente em pontos de tempo mais tarde (figura 43, compare 24 semanas e 27 semanas). (c) Camundongos carecendo de αvβe não desenvolvem RILF. Nos camundongos de controle, o ponto de tempo mais cedo, no qual as áreas de fibrose poderiam ser discernidas foi de 20-22 semanas pós-irradiação (não mostradas). As áreas fibróticas são tipicamente bem demarcadas e subpleurais. Não foi encontrada nenhuma área de fibrose nas seções de pulmão de camundongos Itgb6-/- sacrificados 27 semanas pós-irradiação (N=17). Em contraste, foram encontradas áreas fibróticas em seções de 21/23 camundongos Itgb6+/+, uma diferença que é estatisticamente significante (p<0,001, teste exato de Fisher, 2 caudas) (figura 44). A % média de área de fibrose das seções de camundongos Itgb6+/+ (27 semanas depois da irradiação) foi de 17% +/- 3%. Confirmamos os achados histológicos por medição do teor de hidroxiprolina dos pulmões de camundongos Itgb6+/+ e Itgb6-/-, 27 semanas pós-radiação (figura 45). (d) Ausência de αvβe não afeta a sobrevivência depois da irradiação do pulmão. Depois da radiação torácica com 14 Gy, a mortalidade foi desprezível até 18 semanas pós-irradiação, e alcançou 50% em aproximadamente 25 semanas pós-irradiação. Não houve diferença significante entre as curvas de sobrevivência dos camundongos Itgb6+/+ e Itgb6-/- (figura 46).

[000420] 2. Efeito do 3G9 (0,3, 1 e 1 mg/kg/semana de dosagem IP) e TGF βR solúvel em modelo de RILF murina. Os resultados anteriores indicam que RILF é dependente da expressão de integrina αvβ6, e que a falta de αvβ6 não piora a mortalidade pós-radiação. A exigência por αvβ6 é consistente com sua função conhecida como ativador de TGFβ1 latente. Esses resultados também sugerem a exeqüibilidade da inibição de αvβ6 como uma estratégia antifibrose. Para testar essa idéia e para confirmar que o modelo murino de RILF é dependente de TGFβ, os camundongos irradiados foram tratados com um Ab de controle, receptor de TGFβ, ou uma de três doses de 3G9 (N=27 por grupo). Um número menor de camundongos (N=15) foi tratado com injeções de PBS (200 μL), somente. 3G9 foi usado em doses de 0,3, 1 e 10 mg/kg, o Ab de controle foi usado em 10 mg/kg, e o receptor de TGFβ solúvel foi usado em 5 mg/kg. Os tratamentos foram iniciados nas 15 semanas pós-irradiação (aproximadamente três semanas antes da super- regulação de αvβ6) e continuou semanalmente até o sacrifício nas 26 semanas pós-irradiação (vide métodos para detalhes). (a) 3G9 e receptor de TGFβ solúvel decrescem a fibrose. Todos os camundongos sobreviventes foram sacrificados nas 26 semanas pós-irradiação. Enquanto o grupo de 0,3 mg/kg não mostrou redução no percentual de fibrose em comparação com os controles, o grupo de 1 mg/kg mostrou uma significante redução de fibrose.Embora o receptor de TGFβ solúvel e os grupos de 10 mf/kg tenham mostrado menos fibrose que os controles, o resultado não atingiu significância estatística na análise de somente camundongos sacrificados (figura 47), É possível que os camundongos que morreram antes do ponto de tempo do sacrifício planejado diferiram biologicamente dos camundongos sobreviventes. Portanto, foi realizada uma análise similar em todos os camundongos que morreram ou que foram sacrificados no período do estudo. Quando todos os camundongos foram considerados (camundongos sacrificados e morrendo antes de serem sacrificados), estava presente fibrose significantemente menor nos grupos de 1 mg/kg, 10 mg/kg, e de receptores de TGFβ solúveis em comparação com os controles. De novo, os grupos de 0,3 mg/kg não tiveram uma diferença significante em comparação com os controles (figura 48). (b) 3G9 na dose de 10 mg/kg causa uma alveolite neutrofílica e linfocítica. A realização de BAL em todos os camundongos sacrificados revelou percentagens aumentadas de neutrófilos e linfócitos no grupo que 10 mg/kg em comparação com os controles (figura 49). Os outros grupos não mostraram aumentos similares. (c) bloqueio de αvβ6 por meio de anticorpos em doses mais baixas não afeta a sobrevivência após a irradiação do pulmão. Não houve diferença significante na sobrevivência quando todos os grupos foram comparados (p = 0,088; comparação de todos os grupos pelo teste de log-rank Mantel-Cox). Contudo, uma tendência para mortalidade aumentada no grupo de 10 mg/kg estava aparente (figura 50). Se somente os grupos de 10 mg/kg/semana e grupos de controle são comparados (isto é sem correção para comparações múltiplas), a diferença entre as curvas de sobrevivência é estatisticamente significante.

[000421] 3. Efeito de 3G9 (1, 3, 6 e 10 mg/kg/semana em dosagem SC) em modelo murino de RILF. Os resultados prévios indicam que a RILF no modelo murino é mediada por TGFβ, e é significantemente reduzida por 3G9 nas doses de 1 mg/kg e 10 mg/kg. Contudo, inflamação alveolar aumentada e uma tendência à mortalidade aumentada estão presentes na dose de 10 mg/kg. Nesse experimento, fibrose em pontos de tempo mais tardios foi avaliada (até 32 semanas pós-irradiação) para testar a possibilidade de o tratamento com 3G9 ter simplesmente retardado o início da RILF por várias semanas em vez de preveni-la. Também, para melhor definir as diferenças na inflamação alveolar e possivelmente na sobrevivência entre as doses de 1 e 10 mg/kg, foram testadas doses adicionais entre 1 e 10 mg/kg. Duzentos e setenta camundongos foram irradiados e divididos em grupos iguais para receber uma das quatros doses de 3G9 (1, 3, 6 e 10 mg/kg) ou o Ab de controle (10 mg/kg). Os tratamentos foram iniciados em 15 semanas pós-irradiação e continuaram, semanalmente, até uma data posterior do sacrifício. O experimento foi feito com 2 grupos de camundongos irradiados cerca de um mês um do outro. Em um grupo, os camundongos que começaram o tratamento seriam sacrificados se eles tivessem sobrevivido às 28 semanas pós-irradiação (Grupo 1), e no outro grupo se eles houvessem sobrevivido às 32 semanas (Grupo 2). Os anticorpos foram dados subcutaneamente (não IP como no experimento anterior). (a) 3G9, em doses de 1, 3, 6 e 10 mg/kg, diminui a fibrose. Níveis de fibrose significantemente diminuídos foram observados em todos os grupos que estavam recebendo 3G9 em comparação com os controles (p< 0,01). Essas diferenças foram significantes em camundongos encontrados mortos ou moribundos, camundongos sacrificados nos pontos de tempo final, e todos os camundongos combinados (figura 51). (b) 3G9 em doses mais altas causa alveolite neutrofílica e linfocítica. Realização de BALs em todos os camundongos sacrificados (N=101) revelou percentagens mais altas de neutrófilos e linfócitos (figura 52) nos grupos de 3 mg/kg, 6 mg/kg, e 10 mg/kg em comparação como os controles (p<0,02). Também, percentagens significantemente mais altas estavam presentes no grupo de 10 mg/kg em comparação com o grupo de 1 mg/kg (p<0,001). Qualitativamente, números aumentados de macrófagos "espumosos" (idênticos àqueles vistos nos camundongos Itgb6-/-) e fragmentos celulares são vistos em doses mais altas (figura 53). (c) 3G9 em uma de 6 mg/kg está associada à sobrevivência reduzida. Não houve diferença de mortalidade entre o grupo de controle em comparação com os grupos de 1 mg/kg e 3 mg/kg (figuras 54 e 55). Contudo, houve uma mortalidade significativamente maior no grupo de 6 mg/kg em comparação com os controles (p< 0,05). O grupo de 10 mg/kg não teve uma redução de sobrevivência em comparação com os camundongos de controle. O grupo de 3G9 de 6 mg/kg/semana apresentou fraca sobrevivência em ambas as coortes de sacrifício nas 28 semanas (Grupo 1) e nas 32 semanas de sacrifício (Grupo 2), embora a diferença seja mais proeminente no grupo de 28 semanas (figuras 54 e 55). (d) Efeito da irradiação no pulmão na razão mássica de RV/LV e perfusão pulmonar. Estudos anteriores sugeriram que mortes durante a fase de fibrose depois da irradiação do pulmão são devido à angústia respiratória resultante de uma combinação da obstrução do espaço aéreo (principalmente devido à fibrose) e perda de perfusão alveolar (Sharplin e Franko, 1989). A perda de perfusão deveria levar à hipertensão arterial pulmonar e hipertrofia ventricular direita, e massa de RV aumentada tem sido reportada nesse modelo. A razão mássica de RV/LV dos camundongos que sobreviveram às 32 semanas e dos camundongos da mesma coorte, que sobreviveram entre 28 e 32 semanas foi medida. Os camundongos que morreram tinham uma razão de RV/LV significantemente aumentada em comparação com os camundongos que sobreviveram e em comparação com os camundongos não-irradiados (figura 56). Além disso, em alguns camundongos que morreram, foram observadas áreas distintas com ausência completa de eritrócitos nas paredes alveolares, uma constatação que é indicativa da perda completa de perfusão alveolar (figura 57). DISCUSSÃO

[000422] TGFβ é conhecida como sendo um mediador pró-fibrótico. Trabalho anterior mostrou que a integrina αvβ6 ativa TGFβl e TGFβ3 latentes e que camundongos Itgb6-/- estão também protegidos da fibrose pulmonar induzida por bleomicina. Os resultados apresentados aqui indicam que os camundongos Itgb6-/- estão também protegidos da fibrose pulmonar induzida por radiação. Esses resultados proporcionam uma explanação para a terapia anti-fibrose alvejando a integrina αvβθ.

[000423] Nesses estudos, foi verificado que 3G9 administrado nas doses de 1 mg/kg/semana reduziu a RILF de modo consistente e eficaz. Doses mais altas, particularmente doses de 6-10 mg/kg/semana, foram associadas às percentagens aumentadas de neutrófilos e linfócitos no fluido do BAL. Essas alterações estão consistentes com o fenótipo dos camundongos Itgb6-/- e sugerem que essas doses de 3G9 são inibidoras da ativação de TGFβ mediada por αvβ6 em tal extensão que os animais fazem fenocopiam os nocautes.

[000424] Além disso, doses mais altas de 3G9 estão associadas, variavelmente, à sobrevivência diminuída do modelo murino de RILF. Na primeira experiência houve uma forte tendência à mortalidade aumentada com a dose de 10 mg/kg/semana, mas não nos camundongos tratados com 1 ou 0,3 mg/kg/semana. Na segunda experiência houve mortalidade aumentada no grupo de 6 mg/kg/semana, mas não nos outros grupos (incluindo 10 mg/kg/semana). Embora as razões para as discrepâncias em dose/resposta não estejam claras, o resultado geral é uma tendência à sobrevivência nas doses mais altas testadas.

[000425] As mortes que ocorrem no modelo de RILF parecem ser devido à angústia respiratória. A mortalidade é dependente da cepa e dependente do sexo (Haston, Zhou et al., 2002). As causas da disfunção pulmonar e da mortalidade no modelo murino de RILF têm sido extensivamente estudadas (Sharplin e Franko, 1989). Os autores desse estudo concluíram que a perfusão pulmonar é reduzida depois da radiação, e esse déficit provavelmente contribui para a mortalidade. Os camundongos que são resistentes à fibrose induzida por radiação também têm sobrevivência diminuída no modelo de fibrose pulmonar induzida por radiação. Tem se constatado que a perfusão pulmonar diminuída nesses camundongos é um fator contributivo principal para a morte nesse modelo. O padrão de déficit de perfusão depende da cepa. Em camundongos propensos à fibrose, a perda completa de perfusão (como julgado pela presença ou ausência de carbono coloidal injetado intravenosamente 30 segundos antes do sacrifício) é restrita às áreas de fibrose e pequenas áreas ocasionais adjacentes às lesões fibrosas. Além disso, houve uma maior variabilidade de região para região na quantidade de carbono em áreas perfundidas nos camundongos irradiados que nos controles não-irradiados, sugerindo que houve áreas substanciais com perfusão reduzida, mas não ausente. Outra evidência para a perda de perfusão pulmonar, vista nas múltiplas cepas de camundongos, foi um número reduzido de vasos sangüíneos pequenos no pulmão isento de lesão, e hipertrofia de RV conforme avaliação da razão de espessura. Os números de eritrócitos nas paredes alveolares (um método diferente de avaliar a perfusão) estavam também reduzidos nos camundongos irradiados (cepa A/J). A maioria dos camundongos C57BL/6 não teve efusões pleurais. Exceto pela cepa C57BL/10J, o dano no miocárdio não ocorreu como uma conseqüência da irradiação.

[000426] Essas observações sobre mortalidade são consistentes com as observações mais extensivas de Sharplin e Franko. Nos camundongos de controle, a quantidade de fibrose é maior nos camundongos que morreram que naqueles que sobreviveram para serem sacrificados (figura 51), sugerindo que maior disfunção pulmonar está associada à morte. Os camundongos que morrem têm hipertrofia ventricular direita (definida como um aumento do índice mássico de RV/LV), ao passo que os camundongos que sobreviveram para serem sacrificados não tinham (figura 56), uma observação que sugere que a perda de perfusão pulmonar está associada à morte. Em alguns camundongos que foram encontrados mortos, as áreas do pulmão carecendo de eritrócitos nas paredes alveolares estavam evidentes nas seções histológicas (figura 57), consistente com a perda completa de perfusão naquelas áreas e consistente com as descrições anteriores (Sharplin e Franko, 1989). Nem evidência de disfunção esofágica (formação de cicatriz, perfuração) que seria responsável pelas mortes, nem necrose no miocárdio, foi observada. Assim, a evidência, interpretada à luz do trabalho anterior, sugere que a perda de perfusão pulmonar ocorre em camundongos C57BL/6 mesmo quando a fibrose é prevenida e que a perda de perfusão pulmonar, não a fibrose, é responsável pela morte. Também foi notado que os camundongos estavam mais propensos a morrerem durante os dois dias após as injeções (tanto com Ab de controle como 3G9), sugerindo que o estresse no manuseio, e talvez o volume extra de fluido da injeção, tenha acelerado a morte dos camundongos marginais.

[000427] Embora a perda de αvβ6 por ablação de gene não afete a mortalidade nesse modelo, altas doses de 3G9 (6 a 10 mg/kg/semana) estavam associadas à morte mais precoce em comparação com os camundongos tratados com dose mais baixa de 3G9 ou Ab de controle. A interpretação mais óbvia é que dose maior de 3G9 piora a mortalidade. Contudo, não se pode excluir a possibilidade de que o Ab de controle e as doses menores de 3G9 aumentem a sobrevivência. Comparação do tempo para 50% de sobrevivência para os três experimentos parece revelar dois grupos. Camundongos do tipo selvagem e Itgb6-/- (figura 46), os camundongos tratados com PBS e os tratados com 10 mg/kg/semana de 3G9 no experimento IP (figura 50), e os camundongos tratados com 6 mg/kg/semana de 3G9 no experimento SC (figura 54) têm tempos médios de sobrevivência de ~22,5-25 semanas, ao passo que todos os outros grupos de tratamento têm tempos de sobrevivência média de ~24,5-30 semanas (figuras 50 e 54). Conclusões definitivas nesse ponto não são possíveis porque as condições experimentais variaram e outras condições podem ter sido alteradas entre os experimentos, causando mudanças na mortalidade de linha de base. Nos camundongos tratados com 3G9 em 6 a 10 mg/kg/semana, não foram observadas novas anormalidades (diferentes de inflamação do pulmão) que poderiam ser responsáveis pelas alterações na sobrevivência em uma inspeção geral dos camundongos na dissecação e na histologia do pulmão. As razões para diferenças na sobrevivência entre doses mais baixas e mais altas de 3G9 no modelo de RILF não são conhecidas.

[000428] Esses estudos fundamentam a conclusão que doses mais baixas de 3G9, que presumivelmente não reduzem ao máximo a ativação de TGFβ mediada por αvβ6, previnem seguramente a fibrose pulmonar no modelo murino de RILF. REFERÊNCIAS Abratt, R. P., G. W. Morgan, et al. (2004). "Pulmonary complications of radiation therapy." Clin Chest Med 25(1): 167-77. Annes, J. P., J. S. Munger, et al. (2003). "Making sense of latent TGFβ activation." J Cell Sci 116(Pt 2): 217-24. Annes, J. P., D. B. Rifkin, et al. (2002). "The integrin αvβ6 binds and activates latent TGFβ3." FEBS Lett 511(1-3): 65-8. Chapman, H. A. (2004). "Disorders of lung matrix remodeling." J Clin Invest 113(2): 148-57. Franlco, A. J., G- K. Nguyen, et al. (1996). "A comparison of the ultrastructure of perfusion-deficient and functional lung parenchyma in CBA mice during the late phase after irradiation." Radiat Res 146(5): 586-9. Franko, A. J. and J. Sharplin (1994). "Development of fibrosis after lung irradiation in relation to inflammation and lung function in a mouse strain prone to fibrosis." Radiat Res 140(3): 347-55. Hasten, C. K., C.I. Amos, et al. (1996) "Inheritance of susceptibility to bleomycin-induced pulmonary fibrosis in the lung." Cancer Res 56(11): 2596-601. Haston, C. K., X. Zhou, et al. (2002). "Universal and radiation-specific loci influence murino susceptibility to radiation-induced pulmonary fibrosis." Cancer Res 62(13): 3782-8. Martin, M., J. Lefaix, et al. (2000). "TGF-βl and radiation fibrosis: a master switch and a specific therapeutic target?" Int J Radiat Oncol Biol Phys 47(2): 277-90. Movsas, B., T. A. Raffm, et al. (1997). "Pulmonary radiation injury." Chest 111(4): 1061-76. Mu, D., S. Cambier, et al. (2002). "The integrin αvβ8 mediates epithelial homeostasis through MTl-MMP-dependent activation of TGF-betal." J Cell Biol 157(3): 493-507. Munger, J. S., X. Huang, et al. (1999). "The integrin αvβ6 binds and activates latent TGFβl: a mechanism for regulating pulmonary inflammation and fibrosis." Cell 96(3): 319-28. Sharplin, J. and A. J. Franko (1989). "A quantitative histological study of strain-dependent differences in the effects of irradiation on mouse lung during the intermediate and late phases." Radiat Res 119(1): 15-31. Weinreb, P. H., K. J. Simon, et al. (2004). "Function- blocking integrin αvβ6 monoclonal antibodies: distinct ligand-mimetic and nonligand-mimetic classes." J Biol Chem 279(17): 17875-87.

EXEMPLO 16: Eficácia de um Anticorpo Monoclonal Anti-integrina αvβ6 na Fibrose Pulmonar Induzida por Bleomicina. SUMÁRIO

[000429] Tratamentos correntes para fibrose pulmonar são altamente ineficazes e existe uma grande necessidade de se desenvolver novas substâncias terapêuticas. Agentes que bloqueiam a por meio de de TGFβ são de particular interesse devido ao papel central do TGF-β no acionamento de muitos dos processos patológicos que caracterizam a fibrose pulmonar, inclusive ativação e proliferação de fibroblastos, e expressão de moléculas da matriz extracelular. Além de suas atividades pró-fibróticas, TGF-β é uma importante citocina antiinflamatória, e assim a inibição terapêutica de TGF-β bloquearia idealmente a fibrose sem promover excesso de inflamação. Trabalho prévio tem demonstrado que a integrina αvβ6 é um mediador chave da ativação TGF-β in vivo, particularmente no pulmão. αvβ6 se liga diretamente aos complexos de TGF-β latente no espaço extracelular e esta ligação é, em muitos casos, requerida para liberação da forma ativa. Camundongos deficientes de αvβ6 têm inflamação pulmonar devido à sinalização de TGF-β comprometida no pulmão e são resistentes à fibrose pulmonar induzida por bleomicina. Foram desenvolvido anticorpos monoclonais que bloqueiam a ligação de αvβ6 ao TGF-β latente e inibem a ativação de TGF-β e subseqüente sinalização. Aqui foi demonstrado que esses anticorpos são eficazes na atenuação de fibrose induzida por bleomicina em camundongos. Foi mostrado ainda que eficácia próxima da máxima na atenuação da expressão de colágeno no pulmão pode ser obtida em doses que não produzem inflamação adicional, conforme medida por números de células inflamatórias no lavagem broncoalveolar. Embora doses mais altas do anticorpo, que também atenuam fibrose, possam induzir inflamação consistente com o que é visto nos camundongos deficientes de αvβ6. Essas constatações demonstram que os efeitos pró- inflamatórios e antifibróticos de bloqueio de TGF-β mediado por αvβ6 são separáveis nesse modelo, e que a inibição da fibrose ocorre em doses inferiores aos efeitos pró-inflmatórios. INTRODUÇÃO

[000430] A citocina TGF-β1 é central para ambas as iniciação e manutenção de fibrose, um processo patológico marcado por reposição do tecido doente com matriz extracelular em excesso (ECM) e levando ultimamente à formação de cicatriz no órgão e insuficiência. TGF-β1 promove proliferação de fibroblastos e a ativação de miofibroblastos, que são responsáveis pela secreção de ECM e por manter a progressão do processo fibrótico [1-6]. TGF-β1 desempenha um papel bem regulado nos eventos de remodelação de tecido que ocorrem durante a cura de ferimento; contudo, em várias doenças deste processo a remodelação de tecido se torna aberrante e é caracterizada por sinalização de TGF-β supra-regulada prolongada, excesso de acúmulo de fibroblastos, deposição de ECM, e formação de cicatriz. A importância de TGF-β1 na progressão da fibrose in vivo tem sido mostrada tanto por estudos de ganho de função bem como através de bloqueio [1, 7-12]. Superexpressão adenoviral e transgênica de várias citocinas no pulmão têm mostrado que TGF-β1 é único em sua capacidade de promover fibrose na ausência de inflamação significante. Outras citocinas que promovem fibrose frequentemente o fazem por supra-regulação de expressão de TGF-β1 no tecido. Além disso, estudos têm mostrado que camundongos deficientes nocaute- adas de SMAD3, um mediador de sinalização de TGF-β, são resistentes ao desenvolvimento de fibrose pulmonar [13]. Numerosos estudos com agentes anti-αvβ6 mostram proteção profunda da fibrose em modelos de doença [8, 9, 11,14-17]. Conseqüentemente, TGF-β1 tem sido identificado como um alvo terapêutico potencial para o tratamento de doenças associadas à patologia de fibrose.

[000431] A integrina αvβ6 tem sido identificada como um regulador crítico da ativação de TGF-β 1. TGF-β1 é sintetizado como proteína latente que é clivada e secretada com o LAP N-terminal não covalentemente associado à citocina TGF-β C-terminal. O complexo de TGF-β 1 latente não pode se ligar ao seu receptor cognato e assim permanece biologicamente inativo, até convertido na forma ativa por um dos vários mecanismos alternativos que incluem clivagem por proteases, exposição a pH baixo ou radiação ionizante, e alterações conformacionais no complexo latente permitindo que ele se ligue a seus receptores cognatos [18-21]. A integrina αvβ6 se liga a um motivo de RGD no complexo de TGF-β 1 latente e a converte em uma forma ativa. [18,22-25]. Embora vários outros mecanismos para ativação de TGF-β tenham sido identificados, estudos em camundongos deficientes de integrina β6 (camundongos nulos de β6) sugerem que a ativação mediada por αvβ6 de TGF-β é necessária para o desenvolvimento de fibrose no pulmão e rim [18,26]. αvβ6 é expressa em níveis baixos ou não detectáveis nos tecidos adultos normais, mas é fortemente supra- regulada na doença inflamatória/fibrótica e é geralmente restrita às células epiteliais [27-30]. Assim, a expressão supra-regulada de αvβ6 em células epiteliais durante a lesão tecidual proporciona um mecanismo aumentado para ativação local aumentada de TGF-β e subseqüentes eventos dependentes de TGF-β em células bystander. O bloqueio da ligação do ligante αvβ6 [31] proporciona um método para inibição localizada da ativação de TGF-β especificamente nos tecidos, onde há expressão supra-regulada de αvβ6. Essa abordagem oferece o potencial para reduzir os riscos na segurança clínica associados à inibição global da por meio de de TGF-β.

[000432] Nos estudos descritos aqui, foi mostrado que αvβ6 é significantemente supra-regulada nas doenças pulmonares humanas associadas à patologia inflamatória e fibrótica, incluindo fibrose pulmonar idiopática (IPF). Estudos prévios têm demonstrado que camundongos nulos de β6, que carecem da função de αvβ6 são protegidos da fibrose pulmonar induzida por bleomicina [18]. Foi mostrado aqui que anticorpos monoclonais que bloqueiam a ligação de ligante e funções de ativação de TGF-β inibem potencialmente a fibrose induzida por bleomicina, em uma variedade de cepas de camundongo e por um número de medidas diferentes da fibrose. Foi demonstrado ainda que as populações de células alveolares não são alteradas em doses eficazes baixas no pulmão lesionado por bleomicina e assim o mecanismo de ação anti-fibrótica é, como esperado, não mediado por inibição de inflamação. Somente com dosagem freqüente alta tem a inflamação adicional sido vista neste modelo, consistente com o achado de inflamação adicional em camundongos nulos de β6. MATERIAIS E MÉTODOS

[000433] 1. Reagentes. «vβe mAbs foram gerados conforme descrição em algum lugar aqui e como previamente descrito [31]. cDNAs de 2A1 e 3G9 quiméricos humanos/camundongo foram gerados do RNAs totais de hibrodoma parentes com iniciadores de região constante CDL-739 para a cadeia pesada e CDL-738 para a cadeia leve usando o kit de síntese de cDNA do Primeiro Filamento (Amersham/Pharmacia, Piscataway, NJ. Os genes de regiões variáveis das cadeias leve e pesada foram amplificados pela reação em cadeia de polimerase usando os mesmos iniciadores 3’ empregados para a síntese de cDNA e pool de iniciadores degenerados específicos para a maioria das seqüências de sinais de gene de anticorpo murino (seqüências disponíveis mediante solicitação) e Pfu DNA polimerase (Stratagene, La Jolla, CA). Regiões variáveis de cadeias pesada e leve clonadas foram ligadas em vetores de expressão de mamífero com regiões constantes de IgG1 humano. Proteína de fusão de receptor de TGF-β tipo II murino-Ig (rsTGF-βrII-Ig) foi gerada como previamente descrito [32]. mu3G9 grau de pesquisa, 1E6 e rsTGF-βrII-Ig (proteína purificada em solução salina tamponada com fosfato) foram usadas em todos os experimentos. 2. Animais

[000434] Camundongos. Camundongos SV129 foram usados para experimentos com hidroxiprolina do pulmão como ponto final (Sheppard Laboratory, UCSF). Os camundongos C57B16 foram usados para experimentos com histomorfometria ou coleta e análise do BAL como pontos finais, camundongos de repórter transgênicos foram usados (Biogen Idec). Para análise quantitativa de expressão de gene de colágeno como um ponto final, os camundongos repórter transgênicos foram usados (Biogen Idec). Os camundongos transgênicos transportando um gene repórter de luciferase sob o controle de uma região 17 kB do promotor do gene collIa foram previamente descritos [33]. Esses camundongos são mantidos por criação de machos transgênicos para fêmeas híbridas C57B1/6 XDBA/2 F1 (Jackson Laboratories). Progênie positiva para o transgene (avaliado por expressão de luciferase na cauda) foi selecionada para os experimentos de desafio com bleomicina descritos abaixo.

[000435] Hamsters (Giri Laboratory). Hamsters Dourado da Síria, machos, pesando de 90 a 110 g foram adquiridos da Simonsens, Inc. (Gilroy, CA). Os hamsters foram alojados em grupos de 4, em instalações com ar filtrado e temperatura e umidade constantes. Todo o cuidado estava de acordo com o National Institutes of Health Guide for Animal Welfare Act. Os hamsters foram aclimatizados nas instalações por 1 semana, antes de quaisquer tratamentos. Um ciclo de 12 horas de calor/escuro foi mantido.

[000436] 3. Imunoistoquímica. Pulmões de camundongos foram coletados em formalina tamponada a 10% e processado para histologia em parafina de acordo com práticas comuns. Seções de tecidos em parafina de pulmões de pacientes com doença pulmonar com patologia fibrótica foram obtidas de G. Davis (U Vermont), R. Lafyatis (Boston University), Ardais Corp. (Lexington, MA) e Asterand Inc. (Detroit, MI). Seções de tecidos foram desparafinizadas em xileno e etanol, reidratadas em água destilada, e então imersas em metanol contendo 0,45% de H2O. Os tecidos foram incubados com pepsina (SP-2001; Vector Laboratories, Burlingame, CA) e bloqueados com avidina e biotina (SP-2001; Vector Laboratories, Burlingame, CA). Anticorpo primário foi diluído em PBS contendo 0,1% de BSA e os tecidos foram incubados durante a noite a 4°C. As seções foram incubadas com uma forma quimérica/camundongo do mAb anti-αvβ6, 2A1 [31], e um anticorpo secundário biotinilado antihumano (PK-6103, Vector Laboratories, Burlingame, CA) para tecidos de camundongo.

[000437] As seções foram incubadas com 2A1 murino [31], e um anticorpo secundário biotinilado anticamundongo (PK-6102, Vector Laboratories) para tecidos humanos. Complexo de avidina-biotina-raiz forte peroxidase (Vetor Kit, PK-6102) foi aplicada às seções, incubadas por 30 minutos à temperatura ambiente, e substrato de 3,3’- diaminobenzidina (DAB) foi preparada conforme instruções (SK-4100, Vector Laboratories) e aplicado às seções por 5 minutos, à temperatura ambiente. Seções dos tecidos foram coloridas com Hematoxilina de Mayer por 1 minuto e enxaguadas em água e PBS. Todas as amostras de tecidos humanos foram obtidas sob aprovação da revisão institucional local e aprovação do paciente.

[000438] 3.1 Instilação de Bleomicina em Camundongos.

[000439] Cepa SV129 (D. Sheppard, UCSF). Os camundongos foram instilados com bleomicina ou solução salina na traquéia, conforme descrição prévia [18]. Resumindo, camundongos de 8 a 12 semanas emparelhados com sexo e idade da linhagem 129/terSVEMS foram mantidos em um ambiente isento de patógeno específico. Bleomicina (Mead Jonhson, Princenton, NJ) foi dissolvida em solução salina estéril (0,03 ou 0,05 unidades em 60 ml). Bleomicina ou solução salina foi administrada transtraquealmente sob anestesia com metoxiflurano por direta redução.

[000440] Camundongos da cepa C57B1/6 e Repórter de Colágeno (Biogen IDEC). OS camundongos foram anestesiados por injeção IP com 100 mg/kg de cetamina e 100 mg/kg de xilazina. Uma incisão de 0,5 - 1,0 cm foi feita no pescoço usando um bisturi no 15 para expor a traquéia à visualização. Bleomicina foi instilada com um dispositivo de microaspersão Penn Century expondo a traquéia e colocando a ponta do microaspersor na traquéia através da cavidade oral. A solução salina foi instilada em animais de controle. Depois da instilação, o sítio cirúrgico foi fechado com grampos estéreis para ferimentos. Buprenorfina, 0,05 mg/kg, foi administrada subcutaneamente para dor pós-operatória.

[000441] Protocolos de tratamentos múltiplos foram utilizados para avaliar o artigo de teste nesses estudos com bleomicina em camundongos e serão, portanto, descritos na seção de resultados.

[000442] 3.2. Instilação de Bleomicina em Hamster. Sob anestesia pentobarbital, os hamsters foram instilados IT com solução salina (AS; 4 mL/kg) ou bleomicina (BL: 6,5 U/4 mL/kg) nos dias 0, 7 e 14. Os animais foram aleatoriamente divididos em seis grupos experimentais: instilados com SA, tratados com PBS (SA + PBS); instilados com BL, tratados com PBS (BL + PBS);; instilados com BL, tratados com mu3G9 começando no dia 0 (BL + Ab1); instilados com BL, tratados com mu3G9 começando no dia 7 (BL + Ab2); instilados com BL, tratados com mu3G9 começando no dia 14 (BL + Ab3); e instilados com BL, tratados com 1E6 começando no dia 0 (BL + 1E6). Os animais foram sacrificados no dia 28 e seus pulmões foram removidos e processados para ensaios de hidroxiprolina e peroxidação lipídica.

[000443] 4. Ensaio de Hidroxiprolina para Teor de Colágeno. Os pulmões foram homogeneizados em 1 mL de dH2O em tubos de vidro (Fisher No 14961). 125 μL de ácido tricloroacético (TCA) a 50% foram adicionados ao homogeneizado e incubados em gelo por 20 minutos. As amostras foram centrifugadas a 1.000 rpm, 5 minutos, e a 4°C. O sobrenadante foi descartado e HCl 12N foi adicionado ao precipitado no tubo de vidro. As amostras foram cozidas a 110°C, por 24 horas (em um béquer de vidro). O precipitado seco foi reconstituído com 2 ml de dH2O. Seis padrões de hidroxiprolina (Sigma -H6002) foram feitos começando de 0,25 mg/mL. Em um tubo Eppendorf, 1,5 mL, contendo 500 μl de cloramina T (cloramina T a 1,4% em Acetato de sódio 0,5M e isopropanol a 10%), 200 μL da amostra foram adicionados e incubados 20 minutos à temperatura ambiente. Então, 500 μL de Ehrlich/pDMBA (p-DMBA 1M (p-dimetilaminobenzaldeído) em isopropanol a 70% e ácido perclórico) foram adicionados e incubados a 65°C por 15 minutos. 100 μL da solução de reação final foram transferidos para uma placa de 96 cavidades, medição em triplicata foi realizada para cada amostra, e as amostras foram lidas em 550 nm, 2 horas mais tarde.

[000444] 5. Índice de Histologia. Para experimentos com histomorfo- metria como um ponto final, na ocasião do sacrifício o pulmão inteiro de cada camundongo foi avaliado histologicamente. As seções transversais foram cortadas e coloridas com Tricromo de Masson por rotina padrão. Seções transversais foram escolhidas de modo a incluir múltiplos lobos dos pulmões de cada camundongo. Campos de alto poder (100X) foram fotografados para cobrir toda a seção colorida com tricromo (uma média de cerca de trinta por camundongo). Cada foto foi avaliada quanto ao teor de colágeno (que aparece azul nas seções histológicas coloridas com tricromo) pelo software Metamorph 6.0.5. As áreas azuis foram selecionadas por limite de cor, e expressas como percentagem da área tecidual total.

[000445] 6. Ensaio com Luciferase. Os pulmões foram coletados e homogeneizados em 1 mL de tampão de lise (KH2PO4 0,1M, pH 7,8 e DL-ditiotreitol 1 ml). As amostras foram então colocadas no gelo por 10 minutos, centrifugadas a 12.000 rpm por 10 minutos, a 4°C, e então 100 μL de cada amostra foi transferida para um Wallac Isoplatter. As amostras foram novamente colocadas em gelo por 15 minutos antes de adicionar 100 μL de Substrato Luclite (PerkinElmer No 601911). A atividade da luciferase foi então lida em um luminômetro.

[000446] 7. Coleta Broncoalveolar (BAL) e Coloração das Células de BAL. Os camundongos foram eutanizados com uma overdose de injeção peritoneal (IP) de Inactina (Sigma). A traquéia foi exposta usando principalmente dissecação de cego. A traquéia foi então aberta com tesouras entre dois anéis de cartilagem e uma agulha de ponta cega de calibre 23 foi inserida na traquéia. A agulha foi mantida no lugar por grampeamento leve com um grampo temporário de Schwartz (Roboz). BAL foi realizado por injeção de 0,8 mL de solução salina tamponada com fosfato sem Ca2+ ou Mg2 (PBS) nos pulmões. O fluido foi então retraído na seringa, sem aplicar muita pressão, e transferido para um tubo Falcon, de polipropileno, 15 mL, no gelo. O procedimento foi repetido, o fluido de BAL foi sugado de volta para a seringa sem exercer excesso de pressão negativa. As amostras foram armazenadas em gelo e processadas para contagens de células, diferenciais e tanto o precipitado como o fluido do BAL foram coletados e armazenados a - 80°C.

[000447] 1. O Bal foi então girado a 180g, 1.000 rpm (Beckman GPR) por 10 minutos em uma centrífuga de mesa a 4°C. O sobrenadante (fluido de BAL) foi então removido e congelado a -80°C. 1,0 mL de solução de lise RBC (Sigma) foi adicionado ao precipitado e turbilhonado por 20 segundos. As contagens de células e cistospinas foram então efetuadas.

[000448] 2. As amostras foram armazenadas em gelo e contadas usando um hemocitômetro, deixando as células sedimentarem por um minuto depois das células serem aplicadas ao hemocitômetro e antes da leitura.

[000449] 3. 100 μL de suspensões celulares foram citogiradas (ThermoShandon) a 500 rpm, por 5 minutos, à temperatura ambiente. Preparações de citospina foram preparadas colocando-se a solução celular no aparelho citogiratório e girando a 500 rpm por 5 minutos. As concentrações de células foram verificadas para se certificar que as concentrações não eram muito altas na lâmina. As lâminas foram deixadas secar durante a noite e então coloridas com DiffQuik (Fisher). A coloração foi efetuada de acordo com o protocolo do fabricante (DiffQuik). Uma vez que as lâminas foram secadas e a tampa introduzida por deslizamento com Permount (Fisher), as células foram categorizadas por tipo, contando 100 células selecionadas aleatóriamente usando um contador de células de laboratório (Fisher).

[000450] 8. Análise Estatística. Comparações estatísticas foram feitas entre o controle e/ou controle de isótipo, e o artigo de teste usando análise de variância (ANOVA). Quando diferenças estatisticamente significantes foram estabelecidas em uma probabilidade de p<0,05, usando ANOVA, diferenças significantes entre os grupos foram avaliadas por teste de comparações múltiplas de Dunnet. RESULTADOS

[000451 ] 1. Expressão de αvβ6 humana em doença pulmonar humana e no modelo de bleomicina. Expressão supra-regulada e sinalização de TGF-β e foram descritas em várias doenças pulmonares humana, envolvendo patologia fibrótica ou inflamatória [20, 34]. Contudo, a expressão de anti-αvβθ foi somente descrita em uma pequena amostra de doença pulmonar fibro-inflamatória [28]. A expressão de αvβθ fi avaliada em quarenta e uma amostras de tecidos pulmonares de pacientes com doença pulmonar caracterizada como tendo alterações fibróticas e/ou inflamatórias (Tabela 16-1). Além disso, foi colorida uma série de tecidos pulmonares de regiões ostensivamente normais de biópsias de pulmão de pacientes com câncer (Imgenex). A expressão de αvβ6 em pulmão normal era quase não-detectável por imunoistoguímica. Algumas seções de tecido na série de tecidos de pulmão "normal" mostraram coloração positiva para αvβ6. Em todas as 41 amostras de pulmões doentes, regiões de pulmão com fibrose e/ou alterações inflamatórias mostraram forte supra-regulação de expressão de αvβ6 (figura 58). αvβ6 foi localizada nas células epiteliais subjacentes a regiões de fibrose manifesta e em regiões adjacentes aos infiltrados inflamatórios. A presença de αvβ6 supra- regulada foi vista através de um espectro de doença fibroinflamatória, incluindo fibrose pulmonar idiopática, doença pulmonar na esclerodermia, e doença pulmonar obstrutiva crônica.

[000452] Para mais bem correlacionar a expressão com as alterações patológicas específicas, foram enviadas as amostras de tecidos coloridos para um patologista pulmonar, treinado, externo. Embora ele fosse incapaz de verificar o diagnóstico patológico de muitas das amostras comercialmente obtidas (Ardais e Asterand), ele notou consistentemente que "intensidade muito alta de coloração de αvβ6 foi vista com pneumonite intersticial usual", uma patologia associada à fibrose e à doença progressiva, em comparação com pneumonite intersticial não-específica (NSIP), uma patologia associada à fibrose menor e um prognóstico melhor. Em todas as biópsias dos pacientes com UIP, intensa coloração é vista dentro dos pneumócitos que revestem os ductos alveolares e alvéolos, tanto do Tipo II como do Tipo I, embora vias áreas grandes sejam altamente negativas e os macrófagos intra-alveolares sejam negativos. Em resumo, "alto nível de coloração foi associado às áreas fibróticas e UIP", e padrões similares de menor intensidade de coloração foram vistas nos outros casos de fibrose, incluindo NSIP. Já que UIP é a patologia dominante em pacientes com fibrose pulmonar idiopática (IPF), a intensa superexpressão de αvβ6, um ativador da citocina TGF-β pró-fibrótica, em pacientes com esta patologia sugere que possa ter um papel funcional em acionar a progressão de fibrose.

[000453] 2. Expressão de αvβ6 no modelo de camundongo de bleomicina. Para verificar que αvβ6 foi também supra-regulada no modelo de camundongo de bleomicina de fibrose pulmonar, colorimos para verificar a presença de proteína αvβ6 nas seções de tecido tiradas 1, 5 e 15 dias depois de instilação de bleomicina. No dia 5, a expressão de αvβ6 é supra-regulada no epitélio alveolar por todas as regiões do pulmão lesionado por desafio por bleomicina (figura 59). No dia 15, quando as regiões de fibrose proeminente são evidentes, αvβ6 é mais fortemente supra-regulada no epitélio alveolar nestas áreas fibróticas.

[000454] 3. Avaliação de fibrose por hidroxiprolina em camundongos SV129. Camundongos geneticamente deficientes de αvβ6 (nulo de β6) demonstraram previamente proteção contra fibrose pulmonar induzida por bleomicina na linhagem SV129 [18]. Procurou-se avaliar a eficácia do anticorpo monoclonal anti-αvβ6, mu3G9, em atenuar a fibrose induzida por bleomicina na mesma cepa. Uma série de quatro experimentos foi conduzida nos laboratórios desses colaboradores, Dean Sheppard em UCSF (Tabela 16-2). Os camundongos SV129 foram instilados com bleomicina na traquéia no dia 0, e mu3G9 foi injetado IP em 4 mg/kg, três vezes por semana, começando em 0, 15 ou 30 dias depois da instilação de bleomicina. Camundongos de controle foram injetados com PBS, ou com um anticorpo de controle negativo 1E6. O 1E6 é um anticorpo IgG1 murino contra LFA-3 humano, e não se liga a nenhum antígeno de camundongo. Os camundongos foram sacrificados no dia 30 ou 60, e a fibrose foi avaliada pelo teor de hidroxiprolina de colágeno tecidual total. Em três dos quatro experimentos houve um decréscimo estatisticamente significante de hidroxiprolina nos camundongos tratados com mu3G9, indicativo da eficácia em atenuar a fibrose induzida por bleomicina (figura 60). Somente quando o tratamento foi retardado até 30 dias depois da instilação com bleomicina (figura 60C) é que o teor de hidroxiprolina nos pulmões de camundongos tratados com mu3G9 não decresceu significativamente em comparação com os camundongos tratados com PBS ou tratados de controle de isótipo.

[000455] 4. Avaliação da sobrevivência em camundongos tratados 46 dias e desafiados com bleomicina. A eficácia anti-fibrótica no modelo de bleomicina não se correlaciona diretamente com sobrevivência aperfeiçoada, e, portanto, não se espera que a sobrevivência fosse aperfeiçoada nos camundongos tratados com mu3G9. Contudo, já que esses camundongos tratados com mu3G9 em 4 mg/kg, 3 vezes na semana a partir do dia 15 até o dia 60 (figura 60D) representaram o período mais longo de tratamento (46 dias) que havia sido testado até esse ponto, analisamos para ver se havia qualquer diferença na sobrevivência dos grupos testados naquele experimento. Não houve diferença significante na sobrevivência global quando foram comparados os camundongos tratados com mu3G9 com aqueles tratados com PBS e com anticorpo de controle de não bloqueio 4B4 (Tabela 16-2).

[000456] 5. Análise histomorfométrica de fibrose em camundongos C57B16. Para validar a eficácia antifibrótica de mu3G9 em uma diferente linhagem de camundongo e em um laboratório diferente, mu3G9 foi avaliado em uma série de experimentos na Biogen Idec usando a linhagem de camundongo C57B16. Essa linhagem é freqüentemente usada no modelo de bleomicina e dá uma rápida fibrose que pode ser medida 14 dias depois da instilação. No primeiro três experimentos, os camundongos foram instilados com bleomicina na traquéia no dia 0, tratados com mu3G9 três dias por semana, começando um dia antes do desafio com bleomicina (dia-1), e eutanizados no dia 14 para coleta de pulmões. No quarto experimento, o tratamento foi retardado até o dia 14, e os pulmões foram coletados no dia 28. Em cada um desses experimentos (figura 61), mu3G9 decresceu consistentemente a percentagem de tecido pulmonar fibrótico com relação aos controles tratados com PBS, medida histomorfometricamente como regiões de coloração azul nas seções de tecidos coloridas com tricromo de Masson. Em um de dois experimentos, no qual o mAb 1E6 foi usado como controle negativo de IG, o mAb 1E6 também reduziu significantemente a percentagem de tecido fibrótico (figura 61A). Esse efeito do mAb 1E6 não foi visto nos experimentos anteriores usando hidroxiprolina como o ponto final (figura 60), nem no experimento de tratamento retardado (dias 14 a 28) (figura 61D). Em resumo, experimentos múltiplos demonstrando a eficácia do mAb mu3G9 na redução da percentagem de tecido fibrótico induzido por bleomicina em camundongos C57B16. Contudo, devido à natureza de intensivo trabalho do ponto final de histomorfometria, procuramos um método mais rápido e quantitativo para medir fibrose.

[000457] 6. Uso de transgene repórter de colágeno-luciferase como um ponto final. Camundongos transgênicos transportando um transgene no qual o gene repórter da luciferase é expresso sob controle do promotor de colágeno Iα2 têm sido usados anteriormente para proporcionar uma leitura quantitativa da expressão de colágeno nos modelos de fibrose [33]; [35]. Nos 14 dias, o aumento dos níveis de luciferase no pulmão nos camundongos desafiados por bleomicina com relação aos controles de solução salina foi de aproximadamente 10 vezes, fazendo com que este fosse um ponto final muito mais sensível que a medição de hidroxiprolina. Usando esse sistema, foi realizada uma titulação da dose do anticorpo 3G9 usando dosagem de uma vez por semana, mas incluindo um grupo de camundongos que foi tratado com os 4 mg/kg - o regime de dosagem de três vezes por semana usado nos experimentos com hidroxiprolina e histomorfometria de tricromo como o ponto final. A titulação da dose foi avaliada em três experimentos, nos quais cada experimento tinha um grupo de controle tratado com PBS (n=6, 5 e 6, para um total de n=17). Para corrigir a variação de experimento para experimento em medições de luciferase, os valores de luciferase para todos os grupos em cada experimento foram normalizados para a média dos controles de PBS. O tratamento com mu3G9 dos camundongos repórter desafiados com bleomicina produziu uma redução dependente de dose no repórter de colágeno luciferase (figura 62), com eficácia significante vista em uma dose semanal de 0,3 mg/kg e eficácia máxima vista em 1 a 3 mg/kg.

[000458] 7. Análise da composição de células do lavagem broncoalveolar. Analisamos as populações de células no lavagem broncoalveolar (BAL) nos dias 2, 5, 8 e 11 do modelo de bleomicina para determinar se a inibição de fibrose era devido à inflamação reduzida ou alterações nas principais subpopulações das células inflamatórias no pulmão. Como esperado, ocorreram elevações das contagens de células no BAL devido à administração intratraqueal de bleomicina em comparação com camundongos instilados com solução salina. Contudo, durante todo o período de tempo, não houve diferença significante no número total de células do BAL, nem nos números ou percentagens dos macrófagos, neutrófilos ou linfócitos vistos nos camundongos tratados com as doses eficazes de 0,3 1,0, e 3 mg/kg de 3G9 em comparação com camundongos tratados com um anticorpo de controle de isótipo 1E6. Testamos, então, doses muito mais altas, usando o tratamento de três vezes por semana que havia sido usado inicialmente para demonstrar a eficácia com os pontos finais de hidroxiprolina e histomorfometria. Aos camundongos foram dadas três doses de 4, 20 e 40 mg/kg de m3G9 nos dias -1, +1 e +3 com relação ao desafio com bleomicina. Os camundongos foram eutanizados no dia 5 e o teor de células do BAL foi analisado. Em uma dose de 4 mg/kg (12 mg/kg de dose total), de novo não ocorreu nenhuma alteração significante no números de células do BAL, nem nos números ou percentagens dos macrófagos, neutrófilos ou linfócitos. Em 20 e 40 mg/kg de dose (60 e 120 mg/kg no total), houve um aumento significante no número de macrófagos em relação aos controles de PBS, mas não em relação ao controle de IgG1 (figura 62). Na dose de 40 mg/kg, houve um aumento significante da percentagem de neutrófilos no BAL, quando em comparação com ambos os controles de PBS e IgG, embora as alterações no número total de neutrófilos não tenham atingido significância. Esse aumento de neutrófilos que ocorre em dose muito alta (120 mg/kg no total) é similar àquele visto com o tratamento de dose alta e prazo mais longo (6 e 10 mg/kg de tratamento, 3-4 meses) em modelo de fibrose por radiação (vide Exemplo 15). Em resumo, anticorpos anti- αvβ6 são capazes de atenuar expressão de colágeno induzida por bleomicina em dose semanais tão baixas quanto 0,3 mg/kg, enquanto doses até 12 mg/kg no total não produzem alterações significantes nas populações de células do BAL neste modelo. Doses mais altas podem produzir aumentos no número total de macrófagos e na percentagem de neutrófilos.

[000459] 8. Avaliação em uma modelo de hamster com doses múltiplas de bleomicina. Foi examinada a eficácia do mu3G9 em modelo de hamster de fibrose pulmonar, onde três doses consecutivas de bleomicina são dadas intratraquealmente nos dias 0, 7 e 14. Três grupos de hamsters foram tratados com mu3G9 em 5 mg/kg por três vezes na semana (15 mg/kg no total por semana), começando nos dias 0, 7 ou 14. Os animais foram sacrificados e avaliados quanto à fibrose no dia 28 por hidroxiprolina (figura 65A) e ensaios de peroxidação lipídica (figura 65B) (realizados na U. Califórnia-Davis, Davis, CA). Inesperadamente, a eficácia não foi vista na atenuação de fibrose neste modelo. Em um dos grupos, os hamsters tratados com mu3G9 começando no dia 7 e no dia 14, os camundongos mostraram uma aumento estatisticamente significante da hidroxiprolina no pulmão com relação a ambos os grupos de controle de PBS e IgG. Os valores de peroxidação lipídica não foram significativamente elevados. As curvas de sobrevivência dos vários grupos de tratamento foram analisadas para ver se esta exacerbação aparente estava tendo um efeito na sobrevivência dos hamsters. Os camundongos tratados com mu3G9 começando no dia 0 (grupo BL + AB1 na figura 65C) começaram a morrer ligeiramente mais cedo que os de controles de PBS e IgG; contudo, quando em comparação com a curva de sobrevivência de B1 + Ab1 individualmente contra os controles de PBS e IgG, a diferença não foi significante (teste de log-rank: p=0,5 versus PBS e p=0,25 versus mAb de controle de IgG). Não é sabido se o anticorpo monoclonal mu3G9 reage em ligação cruzada com o hamster, e é possível que os hamsters possam ter gerado uma resposta a anticorpo contra os anticorpos murinos usados neste modelo. Devido às dificuldades em interpretar os resultados neste modelo, a avaliação de doses diferentes para eficácia não perseguidas, já que eficácia consistente foi observada em dois diferentes modelos murinos de fibrose pulmonar (induzida por bleomicina e por radiação). Tabelas Tabela 16-1: Amostras de Doenças Pulmonares Humanas Imunocoloridas para Expressão de «vβe

Tabela 16-2: Sobrevivência dos camundongos desafiados com Bleomicina tratados 46 dias com mu3G9

Conclusões

[000460] mu3G9 é um potente inibidor da gravidade da doença no modelo de fibrose por bleomicina. Essa série de experimentos demonstrou: (a) expressão de αvβe é supra-regulada nas células epiteliais em um amplo espectro de doenças pulmonares humanas com patologia fibrótica e/ou inflamatória. É similarmente supra-regulada no modelo de camundongo de fibrose por bleomicina. (b) mu3G9 reduziu significantemente a fibrose induzida por bleomicina em múltiplos experimentos, usando múltiplos pontos finais para análise. A eficácia foi observada em todas as cepas de camundongos testadas, SV129, C57B16, e híbridos C57B16 X DBA. A eficácia em suprimir a expressão de colágeno foi vista em doses tão baixas quanto 0,3 mg/kg, semanalmente. (c) o mecanismo de ação de mu3G9 é por meio de inibição de TGF-β, uma citocina pró-fibrótica com propriedades antiinflamatórias. Como esperado, a inibição de fibrose ocorre sem atenuação da inflamação. Doses altas freqüentes de mu3G9 (20 e 40 mg/kg dados dia sim dia não) podem induzir modestos aumentos relativos a PBS, mas não controles de IgG em células totais do BAL, macrófagos e neutrófilos do lavagem broncoalveolar dos camundongos desafiados no dia 5. (d) mu3G9 não foi eficaz em um modelo de bleomicina de doses múltiplas em hamster. Não é claro se a exacerbação aparente da fibrose em um grupo tratado com 3G9 era relacionada ao artigo de teste. (e) tratamento com mu3G9 em uma dose de 4 mg/kg, 3 vezes por semana, por 46 dias, não afetou a sobrevivência no modelo de bleomicina. REFERÊNCIAS 1. Roberts, A.B., et al., Transforming growth factor type B: Rapid induction of fibrosis and angiogenesis in vivo and stimulation of collagen formation in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 1986. 83: p. 4167- 4171. 2. Roberts, A.B. and M.B. Sporn, Regulation of endothelial cell growth, architecture, and matrix synthesis by TGF-beta. Am. Rev. Respir. Dis., 1989. 140: p. 1126-1128. 3. Varga, J., J. Rosenbloom, and S.A. Jimenez, Transforming growth factor beta (TGF beta) causes a persistent increase in steady-state amounts of type I and type III collagen and fibronectin mRNAs in normal human dermal fibroblasts. Biochem. J., 1987. 247(3): p. 597-604. 4. Grande, J.P., D.C. Melder, and A.R. Zinsmeister, Modulation of collagen gene expression by cytokines: stimulatory effect of transforming growth factor-betal , with divergent effects of epidermal growth factor and tumor necrosis factoralpha on collagen type I and collagen type IV. J. Lab Clin. Med., 1997. 130(5): p. 476-486. 5. Walker, G.A., et al., Valvular myofibroblasts activation by transforming growth factor-beta: implications for pathological extracellular matrix remodeling in heart valve disease. Circ. Res., 2004. 95(3): p. 253-260. 6. Eickelberg, O., et al., Extracellular matrix deposition by primary human lung fibroblasts in response to TGF-betal and TGF- beta3. Am. J. Physiol., 1999. 276(5): p. L814-L824. 7. 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Thorax, 1999. 54: p. 805-812. 13. Bonniaud, P., et al., Smad3 null mice develop airspace enlargement and are resistant to TGF-beta-mediated pulmonary fibrosis. J. Immunol, 2004. 173(3): p. 2099-2108. 14. George, J., et al., In vivo inhibition of rat stellate cell activation by soluble transforming growth factor type II receptor: A potential new therapy for hepatic fibrosis. Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 1999. 96(22): p. 12719-12724. 15. Zheng, H., et al., Recombinant soluble transforming growth factor β type II receptor ameliorates radiation enterophay in mice. Gastroenterology, 2000. 119: p. 1286-1296. 16. Kasuga, H., et al., Effects of anti-TGF-β type II receptor antibody on experimental glomerulonephritis. Kid. hit., 2001.60: p. 17451755. 17. Ziyadeh, F.N., et al., Long-term prevention of renal insufficiency, excess matrix gene expression, and glomerular mesangial matrix expansion by treatment with monoclonal antitransforming growth factor-β antibody in db/db diabetic mice. Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 2000. 97(14): p. 8015-8020. 18. Munger, J.S., et al., The integrin αvβ6 binds and activates latent TGFβl : a mechanism for regulating pulmonary inflammation and fibrosis. Cell, 1999. 96: p. 319-328. 19. Gleizes, P.E., et al., TGF-beta latency: biological significance and mechanisms of activation. Stem Cells, 1997. 15(3): p. 190-197. 20. Khalil, N., TGF-heta: from latent to active. Microbes Infect, 1999. 1(15): p. 1255-1263. 21. Barcellos-Hoff, M.H., Latency and activation in the control of TGF-β. J. Mamm. Gland Biol., 1996. 1(4): p. 353-363. 22. Huang, X.Z., et al., The integrin αvB6 is critical for keratinocyte migration on both its known ligand, fibronectin, and on vitronectin. J. Cell Sci., 1998. Ill: p. 2189-2195. 23. Busk, M., R. Pytella, and D. Sheppard, Characterization of the integrin alpha v beta 6 as a fibronectin-binding protein. J. Biol. Chem., 1992. 267(9): p. 5790-5796. 24. Yokosaki, Y., et al., Differential effects of the integrins alpha9betal, alphavbeta3, and alphavbeta6 on cell proliferative responses to tenascin. Roles of the beta subunit extracellular and cytoplasmic domains. J. Biol. Chem., 1996. 271(39): p. 24144-24150. 25. Annes, J.P., D.B. Rifkin, and J.S. Munger, The integrin αvβ6 binds and activates latent TGFβ3. FEBS lett, 2002. 511: p. 65- 68. 26. Ma, LJ., et al., Transforming growth factor-β- dependent and independent pathways of induction of tubulointerstitial fibrosis in β6- /- mice. Am. J. Pathol., 2003. 163: p. 1261-1273. 27. Breuss, J.M., et al., Restricted distribution of integrin β6 mRNA in primate epithelial tissues. J. Histochem. and Cytochem., 1993. 41(10): p. 1521-1527. 28. Breuss, J.M., et al., Expression of the R6 subunit in development, neoplasia and tissue repair suggests a role in epithelial remodeling. J. Cell Sci., 1995. 108: p. 2241-2251. 29. Zambruno, G., et al., Transforming growth factor-βl modulates βl and β5 integrin receptors and induces the de novo expression of the αvB6 heterodimer in normal human keratinocytes: implications for wound healing. J. Cell Biol, 1995. 129(3): p. 853-865. 30. Hakkinen, L., et al., Increased expression of β6- integrin in skin leads to spontaneous development of chronic wounds. Am. J. Pathol., 2004. 164: p. 229-242. 31. Weinreb, P.H., et al., Function-blocking integrin alphavbeta6 monoclonal antibodies. J. Biol. Chem., 2004. 279(17): p. 17875-17887. 32. Cosgrove, D., et al., Integrin αlβl and transforming growth factor-βl play distinct roles in alport glomerular pathogenesis and serve as dual targets for metabolic therapy. Amer. J. of Pathol, 2000. 157(5): p. 1649-1659. 33. Inagaki, Y., et al., Activation of Proalpha2(I) collagen promoter during hepatic fibrogenesis in transgenic mice. Biochem Biophys Res Commun, 1998. 250(3): p. 606-11. 34. Broekelmann, T.J., et al., Transforming growth factor βl is present at sites of extracellular matrix gene expression in human pulmonary fibrosis. Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 1991.88: p. 6642-6646. 35. Denton, C.P., et al., Activation of a fibroblast- specific enhancer of the proalpha2(I) collagen gene in tight-skin mice. Arthritis Rheum, 2001. 44(3): p. 712-22. GLOSSÁRIO

APÊNDICE A: Variação da dosagem de mu3G9 (hidroxiprolina)

APÊNDICE B: Variação da Dosagem de mu3G9 (histomorfometria)

APÊNDICE C: Variação da Dosagem de mu3G9 (camundongos repórter de colágeno)

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APÊNDICE E: Composição Celular no BAL: Dosagem de Três Vezes por Semana

EXEMPLO 17: Análise Molecular dos Efeitos de um Anticorpo Monoclonal Antiintegrina αvβ6 em Pulmão de Camundongo Normal e Doente SUMÁRIO

[000461] Modelos de animal para fibrose pulmonar são eficazes na modelação de alguns aspectos da patologia fibrótica de fibrose pulmonar idiopática (IPF) humana; contudo, nenhum modelo animal mimetiza com acuidade a patologia precisa de IPF. Além disso, já que os mecanismos da iniciação e progressão de IPF não são completamente entendidos, é importante testar potenciais agentes terapêuticos em múltiplos modelos da doença e avaliar a sua eficácia não somente em termos de atenuar a patologia fibrótica, mas também em termos de intervir nas vias moleculares que são tidas como relevantes na doença humana. A por meio de de TGF-β tem sido implicada como uma por meio de chave em IPF. A caracterização global de transcritos de pulmão com IPF humano tem mostrado que a assinatura dominante nesta doença é uma de uma por meio de de TGF- β ativada, que é consistente com os papéis conhecidos do TGF-β no acionamento de muitos dos processos patológicos que caracterizam a fibrose pulmonar, incluindo a ativação e proliferação de fibroblastos e a expressão de moléculas da matriz extracelular. Além de suas atividades pró-fibróticas, TGF-β é uma importante citocina antiinflamatória, e assim a inibição terapêutica de TGF-β deve idealmente bloquear a fibrose em promover excessiva inflamação. A integrina αvβ6 se liga diretamente aos complexos de TGF-β latente e é requerida para conversão de TGF-β em um sítio ativo. Contudo, já que a ativação de TGF-β mediada por αvβ6 é crítica em somente alguns tecidos, os camundongos completamente deficientes da função de αvβ6 mostram patologia somente no pulmão, enquanto os camundongos deficientes de TGF-β mostram inflamação em sistemas de órgãos múltiplos. Assim, a estratégia terapêutica descrita aqui é bloquear a função de αvβ6 para evitar a inibição global da por meio de de TGF-β, e demonstrar que a eficácia no bloqueio da patologia fibrótica associada à sinalização aumentada de TGF-β pode ser obtida em doses que não induzem a inflamação associadas à perda completa de TGF-β . Aqui, foram caracterizadas alterações moleculares no mRNA e nível de proteína associado à patologia fibrótica e inflamatória. Foi demonstrado que altas doses do anticorpo monoclonal anti-αvβ6, mu3G9, o parente murino do candidato clínico BG00011, produzem alterações no mRNA e na proteína em rótulos inflamatórios no pulmão, que são consistentes com os camundongos deficientes de αvβ6. Foi demonstrado ainda que baixas doses de mu3G9 que são eficazes em atenuar fibrose não produzem essas alterações inflamatórias nos camundongos. INTRODUÇÃO

[000462] A citocina TGF-β 1 é uma citocina pró-fibrótica conhecida por estimular fibroblastos para produzir excesso de matriz extracelular (ECM), levando finalmente à formação de cicatriz e insuficiência do órgão (Roberts, 1986). Superexpressão adenoviral e transgênica de várias citocinas no pulmão mostraram que o TGF-β 1 é único em sua capacidade de promover fibrose na ausência de inflamação. Modelos de camundongos de nocaute de genes na por meio de de TGF-β (Bonniaud 2004, Munger 1999) e numerosos estudos com agentes anti- TGF-β têm demonstrado que a eficácia de inibição de TGF-β como meio para atenuar fibrose (George, J. 1999; Sharma, K. 1996; Bonnidaud, P. 2004; Zheng, H. 2000; Kasuga, H. 2001; Ziyadeh F. N., 2000; Laping, N.J., 2003). A integrina αvβ6, composta de duas subunidades: as interinas αv e β6, é um regulador crítico da ativação de TGF-β1, particularmente no pulmão. Ela é supra-regulada nas células epiteliais durante lesão, inflamação e fibrose, e se liga ao complexo de TGF-β 1, convertendo-o em uma forma ativa. [Huang 1998; Munger 1999;Busk 1992; Yokoaski, 1996; Annes 2002]. Bloqueio de ligação de αvβ6 ao TGF-β 1 latente proporciona um método para inibição localizada da ativação de TGF-β nos sítios de expressão supra-regulada de αvβ6, evitando potenciais de riscos de segurança clínica potencial da por meio de TGF-β em todos os tecidos.

[000463] Nos Exemplos acima, caracterizamos a eficácia do anticorpo monoclonal anti-αvβ6, mu3G9, em dois modelos murinos pulmonares de fibrose foi caracterizada: fibrose induzida por bleomicina (Exemplo 16), fibrose induzida por radiação (Exemplo 15). Além disso, os efeitos do tratamento de mu3G9 em camundongos normais são descritos em detalhes nos relatórios de toxicologia. Nesse Exemplo, foram caracterizados os efeitos do tratamento de mu3G9 em camundongos normais e em modelos de doença de fibrose pulmonar nos níveis de mRNA e proteína no pulmão.

[000464] A caracterização de transcritos de tecido pulmão demonstra que o bloqueio de αvβθ atenua ou altera os genes alvo de TGF-β que são associados à fibrose pulmonar induzida por bleomicina. Esses dados sugerem que αvβ6 está envolvida na regulação da fibrose pulmonar e poderia proporcionar um novo alvo molecular para sua modulação terapêutica. MATERIAIS E MÉTODOS

[000465] 1. Reagentes. αvβ6 mAbs foram gerados como descrito em algum lugar aqui, e como previamente descrito (29). cDNAs de 2A1 e 3G9 quiméricos, humanos/camundongo foram gerados a partir dos RNAs totais de hibridomas parentes, respectivos, com iniciadores de região constante CDL-739 para a cadeia pesada e CDL-738 para a cadeia leve usando o kit de síntese de cDNA do Primeiro Filamento (Amersham/Pharmacia, Piscataway, NJ). Os genes de regiões variáveis de cadeias pesada e leve foram amplificados pela reação em cadeia de polimerase usando os mesmos iniciadores 3’ empregados para a síntese de cDNA e pools de iniciadores degenerados específicos para a maioria das seqüências de sinais de genes de anticorpo murino (seqüências disponíveis mediante solicitação) e Pfu DNA polimerase (Stratagene, La Jolla, CA). Regiões variáveis das cadeias pesada e leve clonadas foram ligadas a vetores de expressão de mamífero com regiões constantes de IgG1. Proteína de fusão de receptor tipo II-Ig de TGF-β murino, recombinante, solúvel, (sTG-βRII-Ig) foi gerada conforme descrição prévia (10). mu3G9 de grau de pesquisa, 1E6 e Stgf-bRII-Ig (proteína purificada em solução salina tamponada com fosfato) foram usados em todos os experimentos.

[000466] 2. Animais. (a) Tratamento com mu3G9 em Camundongos Normais para Análise de RNA: os camundongos normais C57B16 foram tratados uma vez por semana, durante quatro semanas (nos dias 1, 8, 15 e 22) com 5 mg/kg de TGFbRII-Ig solúvel, PBS, ou as seguintes doses de mu3G9: 0,3, 1, 3, 10 e 30 mg/kg. Uma coorte de camundongos tratados foi coletada no dia 29 (uma semana depois da última dose = sem recuperação), enquanto a outra coorte foi coletada no dia 78 (8 semanas depois da última dose = recuperação de 7 semanas). Esses experi-mentos foram realizados independentemente do trabalho descrito nos relatórios de toxicologia para camundongo mu3G9, onde a linhagem de camundongo CD-1 foi testada e foi usada uma recuperação de 8 semanas. (b) Tratamento com mu3G9 em Camundongos Normais para Caracterização de Analisados Múltiplos de Proteínas do BAL: camun-dongos C57B16 normais foram tratados por 4 semanas (nos dias 1, 8, 15 e 22) com PBS ou as seguintes doses de mu3G9: 0,1, 0,3, 1, 3, e 10 mg/kg. Os camundongos foram coletados no dia 29 (uma vez por semana depois da última dose) para coleta do lavagem broncoalveolar (BAL). Esses experimentos foram novamente realizados independente-mente do trabalho descrito nos relatórios de toxicologia para camundongos tratados com mu3G9, onde a linhagem de camundongos CD-1 foi testada. (c) Tratamento com mu3G9 no modelo de fibrose por radiação: Detalhes dos grupos de tratamento e os pontos finais usados na avaliação da eficácia de atenuação da fibrose induzida por radiação estão contidos no BIIB Report No Rsch-2006-007. Em resumo, três estudos foram realizados no laboratório de John Munger no New School of Medicine onde os camundongos receberam irradiação torácica e foram tratados com doses diferentes de mu3G9 entre 0,3 e 1,0 mg/kg por semana, começando 15 semanas depois da irradiação. Os pulmões dos camundongos foram coletados para histologia/medição de fibrose, se encontrados mortos durante o estudo. Os camundongos sobreviventes foram coletados nas semanas 26, 28 e 32 pós-irradiação. Fluido do BAL foi coletado de um lobo de pulmão e enviado para Biogen IDEC, enquanto os outros lobos foram processados para histologia/medição de fibrose. A análise das proteínas do fluido do BAL é inserida neste relatório para permitir que sejam feitas comparações com a análise do fluido do BAL de camundongos normais tratados com mu3G9 no Biogen IDEC.

[000467] 3. Coleta do Lavagem Broncoalveolar. Os camundongos foram eutanizados com uma overdose de injeção intraperitoneal (IP) de Inactina (Sigma). A traquéia foi exposta usando, na maioria das vezes, dissecação cega. A traquéia foi então aberta com tesouras entre os dois anéis de cartilagem e uma agulha de ponta cega de calibre 23 foi inserida na traquéia. A agulha foi mantida no lugar por grampeamento leve com um grampo temporário Schwarts (Roboz). BAL foi realizado por injeção de 0,8 mL de solução salina tamponada com fosfato sem Ca2+ ou Mg2+ (PBS) nos pulmões. O fluido foi então retraído na seringa, sem aplicação de muita pressão, e transferido para um tubo Falcon de polipropileno, 15 mL, no gelo. O procedimento é então repetido, o fluido do BAL é sugado de volta na seringa sem exercer excessiva pressão negativa. As amostras são armazenadas no gelo e são processadas para contagens de células, diferenciais, e tanto o precipitado de BAL como o fluido são coletados e armazenados a -80°C.

[000468] 1. O BAL é então girado a 180 g (1.000 rpm) (Beckman GPR), por 10 minutos, em uma centrífuga de mesa, a 4°C. O sobrenadante (fluido do BAL) é então removido e congelado a -80°C. Um mililitro de solução de lise RBC (Sigma) foi adicionado e realizado turbilhonamento por 20 segundos. Foram então efetuadas as contagens de células e de citospinas.

[000469] 2. As amostras são armazenadas em gelo e contadas usando um hemacitômetro. Foi permitido um minuto depois da aplicação das células ao hemacitômetro e antes da leitura das células para que as células se sedimentassem.

[000470] 3. 100 μL de suspensões celulares são citogiradas (ThermoShandon ) a 500 rpm por 5 minutos, à temperatura ambiente. Preparações de citospina são preparadas colocando-se a solução de células no aparelho de citospina e girando a 500 rpm, por 5 minutos. Deve ser verificado que as concentrações celulares não fiquem muito altas na lâmina; se isso acontecer, gire novamente as amostras. Deixe que as lâminas sequem durante a noite, e efetue a coloração com DiffQuik (Fisher). A coloração é feita de acordo com o protocolo do fabricante (DiffQuik). Uma vez que as lâminas estejam secas e as tampas deslizadas com Permount (Fisher), as células são categorizadas por tipo, contando 100 células aleatoriamente selecionadas usando um contador de células de laboratório (Fisher).

[000471] 4. Coleta de pulmão para RNA. Os camundongos foram eutanizados com uma overdose de injeção intraperitoneal (IP) de Inactina (Sigma). O animal é borrifado com EtOH a 70%, e a pele é cortada com um par de tesouras estéreis, a partir do esterno e trabalhando até a cabeça. Uma vez que a pele esteja solta, o esterno e as costelas são cortados para expor o coração e os pulmões. Os pulmões são removidos e colocados em pedaço de gaze estéril para remover quaisquer produtos de sangue e rapidamente colocados em um tubo de fundo redondo, de polipropileno, 14 mL, de 17 x 100 mm (Fisher). Nitrogênio líquido é adicionado ao tubo de polipropileno contendo os pulmões e colocado sobre gelo. Os pulmões são então armazenados a -80°C.

[000472] 5. Preparação de RNA. RNA total foi purificado das amostras de tecido de pulmão, congeladas instantaneamente, usando o reagente Qiazol (Qiagen) de acordo com o protocolo do fabricante. A qualidade do RNA foi verificada por eletroforese capilar em Bioanalyzer 2000 (Agilent).

[000473] 6. Rotular, hibridizar e escanear sondas para caracterização de transcritos. A marcação, hibridização, e coloração das amostras foram efetuadas de acordo com o protocolo de Preparação de Alvo Eucariótico do Affymetrix Technical Manual (701021 rev 1) para Análise de Expressão GeneChip® (Affymetrix, Santa Clara, CA). Em resumo, 5 μg de RNA total purificado foram usados em um 20 μl de reação do Primeiro Filamento com 200 U de SuperScript II (cat No, 18064-022, Invitrogen) e 0,5 μg de iniciador (dT)-T7 {5’- GGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGAGGCGG(T)24], a 42°C, por 1 hora. A síntese da segundo filamento foi efetuado pela adição de 40 U de DNA Polimerase de E. coli (cat No 18010-025, Invitrogen), 2 U de E.coli RNase H (cat No 18021-071, Invitrogen) e 10 U de DNA ligase de E. coli (cat No 18052-019, Invitrogen) seguido por incubação a 16°C, por 2 horas. A reação de síntese do segundo filamento foi purificado usando o Módulo de Limpeza de Amostra GeneChip®, de acordo com o protocolo do fabricante (cat No 900371, Affymetrix, Santa Clara, CA). cDNA purificado foi amplificado usando o kit de rótulo de transcrição de RNA de alto rendimento BioArray (cat No 42655-40, Enzo Life Sciences, Inc., Parmingdale, NY) de acordo com o protocolo de fabricante para produzir 70-120 μg de cRNA rotulado com biotina (RNA complementar). Séries de sondas GeneChip® de MgU74Av2, MgU 74Bv2, e MgU74Cv2 de camundongo foram pré-hibridizadas em um Forno de Hibridização 640 GeneChip® (Affymetrix, Santa Clara, CA), de acordo com o protocolo do fabricante. cRNA, marcado, fragmentado, foi ressuspenso em 300 μL de tampão de hibridização 1X contendo ácido 2- morfolinoetanossulfônico 100 mM, [Na+] 1M, EDTA 20mM, Tween 20 a 0,01%, 0,5 mg/mL de BSA acetilado, 0,1 mg/mL de DNA de esperma de arenque, oligo B2 de controle e transcritos de controle bioB 1,5pM, bioC 5pM, bioD 25pM, e cre 100pM, e hibridizados para séries de sonda GeneChip®, de acordo com o protocolo do fabricante (Affymetrix, Santa Clara, CA). As séries de sondas GeneChip® hibridizadas foram lavadas e coloridas usando Estreptavidina-Ficoeritrinina (cat No S866, Molecular Probes, Eugen, OR) e amplificadas com antiestreptavidina biotinilada (BA-0500, Vector Laboratories, Burlingame, CA) usando Fluidics Station 400 GeneChip® (Affymetrix, Santa Clara, CA). As séries de sondas GeneChip® foram escaneadas usando o Escâner GeneArray (Hewlett Packard, Corvallis, OR).

[000474] 7. Análises de Dados da Caracterização dos Transcritos. Os escaneados das séries foram convertidos em arquivos CEL Affymetrix e o conjunto de dados resultantes (grupo de arquivos CEL representando o experimento completo) foram normalizados usando o método Robusto de Média de Microarray (RMA). Análise estatística e clustering usando as Ferramentas de Array BRP v. 3.4.0 - Beta 2 (NCI), ferramentas de exploração GeneSpring (Agilent) e Spotfire (Spotfire). Análise de Significância de Microarrays (SAM) foi usada para identificar conjuntos de sonda, cujas intensidades de sinal foram alteradas por qualquer dos tratamentos experimentais em comparação com o grupo tratado com PBS com o limite de Taxas de Falsas Descobertas (FDR) ajustado para não exceder 0,01 no limite de confidência (CL). Posterior filtração foi efetuada quando necessária por seleção dos conjuntos de sonda significantemente afetados (FDR<0,01, CL 0,95) mostrando uma alteração de 2 vezes na intensidade do sinal. Os perfis do grupo resultante de genes e o conjunto de condições experimentais foram analisados e visualizados por clustering hierárquico. Análise de trajeto virtual foi realizado usando a base de dados Ingenuity Pathway Analysis (Ingenuity Systems).

[000475] 8. Análise Multiplex dos Níveis de Proteína no fluido do BAL. As alíquotas medindo 200 μL foram tomadas diretamente do fluido do BAL coletado como descrito acima. Essas alíquotas foram enviadas para a Rules Based Medicine, Inc. (Austin, TX), onde elas foram analisadas por um painel padrão de proteínas de camundongo usando sua tecnologia com base em Luminex.

[000476] 9. Análise Estatística. A análise estatística para análise de caracterização de transcritos está descrita acima. As comparações estatísticas na análise dos níveis de proteína no fluido do BAL foram feitas entre o controle de veículo e/ou controle de isótipo, e várias doses do artigo de teste usando análise de variância de uma por meio de (ANOVA). Quando diferenças estatisticamente diferentes foram estabelecidas em uma probabilidade de p<0,5 usando ANOVA, as diferenças significantes foram avaliadas entre os grupos pelo teste de comparação múltiplo de Dunnet. RESULTADOS

[000477] 1. Efeitos do tratamento de camundongos com mu3G9: análises de transcritos do pulmão. Os resultados dos estudos de toxicologia em camundongos CD-1 identificados como um órgão alvo para u3G9. Como descrito em detalhes naqueles estudos, inflamação pulmonar consistente com essas constatações nos camundongos nulos de integrina β6 (que são deficientes de integrina β6) é vista em camundongos tratados com mu3G9. Essa inflamação, como avaliada por histopatologia, não é vista freqüentemente em doses de 1 mg/kg, mas consistentemente em doses de 10 mg/kg, semanalmente. Para avaliar essa inflamação na linhagem C57B16 (a linhagem usada nos estudos de eficácia descritos acima nos Exemplos 15 e 16), os camundongos foram tratados com mu3G entre 0,3 e 30 mg/kg, semanalmente, e os pulmões foram processados para RNA em análise de microarrays.

[000478] 2. Análise de Significância de Microarrays (SAM) com o limite FDR de 0,01 e CL 0,95 foi usada para pesquisar genes diferencialmente expressos em uma série de comparações em pares entre o grupo de controle tratado com PBS e cada um dos grupos de tratamentos experimentais, incluindo os grupos tratados com 3G9 e o grupo sTGFbRII-Ig. Tais análises SAM de pares foram realizadas separada-mente para os grupos de tratamento e de recuperação usando seus respectivos controles de PBS. As listas de genes resultantes foram submetidas a uma etapa de filtração adicional para identificar aquelas dos conjuntos de sonda ("probesets") afetados, cujas intensidades de sinal variaram entre os grupos de controle de PBS e quaisquer dos grupos de tratamento mais que 2 vezes. Os resultados estão sumarizados nas Tabelas 17-1 a 17-6. Alterações significantes na expressão gênica satisfazendo os critérios de seleção acima foram observadas nos subgrupos de 10 mg/kg e 30 mg/kg do grupo de tratamento (Tabelas 17-1 e 17-2). Os perfis da expressão gênica para os conjuntos de sonda selecionados mostram fortes deslocamentos bidirecionais nos níveis de expressão dos genes correspondentes nos grupos de tratamento de 3G9 com 10 mg/kg e 30 mg/kg (figura 66).

[000479] Nenhuma alteração estatisticamente significativa de expressão gênica foi detectada em qualquer outro subgrupo de tratamento ou no grupo de recuperação (Tabelas 17-1 e 17-2). Contudo, gene MMP12 e outros 25 genes selecionados para mais que 0,95 correlação de Pearson de seus perfis de expressão com aquele do MMP12, mostraram uma tendência detectável ascendente no grupo de tratamento com 3 mg/kg de 3G9 (figura 67; Tabela 17-7).

[000480] Anotação funcional do gene significantemente afetado por 3G9 foi realizada usando a base de dados Ingenuity Pathway Analysis (IPA) e tem mostrado forte associação desses genes com imunorre- sposta e sinalização de citocinas imunorreguladoras (figura 68). De forma similar, a análise de trajeto regulador virtual sugeriu a associação das alterações induzidas por 3G9 na expressão gênica com alterações na sinalização de quimiocina, TGF-β, e interferon. Essas associações seguem das configurações das duas redes de mais alta classificação (figura 69A, 69B).

[000481] 2. Análise PCR Quantitativa de Transcritos de MMP-12. MMP-12 mostra o maior número de vezes de supra-regulação de qualquer transcrito nos pulmões de camundongos tratados com mu3G9 (Tabela 17-3). MMP-12 foi previamente reportada como o mais altamente supra-regulado transcrito nos pulmões de camundongos nulos de β6. Para ainda elucidar a relação entre a expressão de MMP- 12 e o tratamento com mu3G9, os níveis de transcrito de MMP-12 por PCR quantitativa foram analisados, incluindo RNA preparado dos pulmões de camundongos nulos de β6. O tratamento com mu3G9 produziu um aumento dependente de dose no transcrito de MMP-12 que foi significante em 10 e 30 mg/kg. A alteração de expressão na expressão de MMP-12 foi comparável naquelas doses com aquela vista nos camundongos nulos de β6. Similar aos resultados descritos acima para a análise de microarrays, os níveis de MMP-12 por PCR quantitativa tenderam ascendentemente na dose de 3 mg/kg, mas ficaram inalterados nas doses de 0,3 e 1 mg/kg.

[000482] 3. Análise de Proteína do BAL dos Pulmões de Camundongos Normais tratados com mu3G9. Para ainda caracterizar as alterações moleculares no pulmão atribuíveis ao tratamento com mu3G9, foram analisados os níveis de 60 proteínas (Tabela 17-8) em fluido do BAL de uma outra coorte de camundongos tratados por 4 semanas com doses de mu3G9 entre 0,1 e 10 mg/kg. A análise das proteínas foi efetuada por ensaio Luminex (análise de proteína Multiplex). Consistentes com essas constatações no nível de transcritos, as proteínas múltiplas com inflama-ção pulmonar foram elevadas no fluido do BAL de camundongos tratados com 10 mg/kg de dose (Tabela 17-9). Além disso, algumas dessas alterações foram também significantes por ANOVA na dose de 3 mg/kg; contudo, nenhuma proteína no painel foi elevada pela dose de 1 mg/kg.

[000483] 4. Análise das Proteínas do fluido do BAL do Modelo de Fibrose induzida por Radiação. A eficácia do mu3G9 em atenuar a fibrose pulmonar induzida por radiação está descrita acima no Exemplo 15. Amostras de fluido do BAL (BALF) coletadas naqueles estudos foram analisadas por caracterização das proteínas de multianalisados, usando o mesmo painel de camundongo que foi usado no BALF de camundongos tratados com mu3G9. A análise de BALF dos pontos de tempo da semana 28 (tratamento de 13 semanas) e semana 32 (tratamento de 17 semanas) é efetuada aqui. As proteínas que foram significantemente alteradas conforme determinado por ANOVA estão resumidas na Tabela 17-11. Como com a caracterização de transcritos e resultados de proteínas nos camundongos normais, a maioria das proteínas que é alterada no modelo de fibrose por radiação atinge significância somente na dose de 10 mg/kg, embora algumas sejam significantes e todas mostrem tendência em 3 mg/kg. A maioria dessas proteínas são citocinas ou quimiocinas conhecidas por estarem associadas à fibrose pulmonar. Quatorze das 20 proteínas supra- reguladas por 2 vezes ou mais em camundongos normais tratados com 10 mg/kg de mu3G9 (Tabela 17-10) são também consideradas consistentemente supra-reguladas no modelo de radiação. Apesar das diferenças no período de tratamento de mu3G9 e no estado de lesão/inflamação, a concordância entre as constatações nos camundongos normais e irradiados é marcante. Muitas das proteínas mostram supra-regulação muitas vezes mais alta consistente com o período de tratamento mais longo no modelo de radiação (Tabela 1712), mas no global as constatações são consistentes nessas duas situações bem diferentes. Além disso, apesar dos diferentes níveis de linha de base nos camundongos normais e irradiados (a lesão por radiação supra-regula a maioria dessas proteínas), a faixa de doses que estes rótulos inflamatórios são supra-regulados é a mesma que nos camundongos normais e irradiados. Especificamente, eles são supra- regulados nas doses de 3 e 10 mg/kg, mas não na dose de 1 mg/kg tanto nos camundongos normais como nos doentes (ilustrados com as quatro proteínas mais altamente supra-reguladas na semana 28 na figura 70). Assim, apesar da expressão muito maior do alvo do fármaco na modelo de radiação (vide Exemplo 15 acima), as doses que produzes alterações das proteínas no BAL específicas para o tratamento com mu3G9 são as mesmas em ambas as situações. É importante notar que nem todas as proteínas induzidas por mu3G9 sejam tidas como tendo efeitos pró-inflamatórios e/ou pró-fibróticos. Por exemplo, a quimiocina de CXCL IP-10/CXCK10 demonstrou eficácia anti-fibrótica potente nos modelos de camundongos, e camundongos deficientes de IP-10 ou de seu receptor CXCR3 mostram uma exagerada resposta fibrótica à bleomicina. Contudo, alterações consistentes não são vistas nesta ou em outras citocinas na dose eficaz próxima da máxima de 1 mg/kg de dose, de modo que é improvável que qualquer uma dessas alterações no meio de citocina do pulmão seja requerida para eficácia do tratamento com mu3G9.

[000484] Dentre as proteínas que foram supra-reguladas nos camundongos normais, mas não no modelo de radiação, foram ApoA1, Fibrinogênio, e TIMP-1. Os níveis dessas proteínas e uma quarta proteína, haptoglobina, são aumentados no fluido do BAL dos camundongos irradiados em comparação com os camundongos normais, mas são reduzidos pelo tratamento com mu3G9 (figura 71). Assim, a normalização dos níveis para essas proteínas em doses eficazes sugere que eles podem estar agindo com rótulos substitutos da eficácia no ponto de tempo de 28 semanas (figura 72). As únicas proteínas no painel que alteraram significantemente nas doses inferiores foram aquelas que foram reduzidas por tratamento: TIMP-1 e haptoglobina. TIMP-1 é um alvo de TGF-β conhecido e é freqüentemente elevado na doença fibrótica. Sua infra-modulação é consistente com o mecanismo de ação do mu3G9, isto é, inibe a ativação de TGF-β mediada por αvβ. Tabelas Tabela 17-1: Análise das alterações dos transcritos no pulmão para mu3G9, in vivo, em escalação de dose. Número de conjuntos de sonda significantemente (FDR < 0,01, CL 0,95) afetados por tratamentos experimentais

Tabela 17-2: Análise dos transcritos no pulmão com alteração de 2 vezes. Número de conjuntos de sonda mostrando alterações significantems maiores que duas vezes na intensidade de sinal em resposta aos tratamentos experimentais.

CONCLUSÕES

[000485] Os efeitos do tratamento com mu3G9 têm sido caracterizados em camundongos normais por caracterização dos transcritos e por caracterização das proteínas dos analisados múltiplos: (A) Análise de caracterização de transcritos dos pulmões de camundongos tratados com altas doses de mu3G9 induz significantes alterações em vários transcritos associados à inflamação pulmonar. Essas alterações são consistentes com os resultados da caracterização dos transcritos de camundongos nulos de β6 (deficientes de αvββ). Os alvos específicos que são erroneamente regulados são consistentes com a reduzida sinalização de TGF-β6 no pulmão devido ao mecanismo de ação do mu3G9. (b) Os resultados da caracterização das proteínas demons-tram igualmente aumentos consistentes em algumas citocinas e quimiocinas associadas ao mecanismo de ação do mu3G9. (c) Alterações nos transcritos alcançam significância somente na dose de 10 mg/kg, embora vários transcritos apresentem uma tendência ascendente na dose de 3 mg/kg. Algumas das alterações de proteínas são significantes na dose de 3 mg/kg, mas a maioria alcança significância na dose de 10 mg/kg. Nenhuma alteração na proteína ou no transcrito é significante na dose de 1 mg/kg.

[000486] Os efeitos do tratamento com mu3G9 têm sido caracterizados no modelo de fibrose por radiação por caracterização das proteínas dos analisados múltiplos: (a) Muitas das mesmas citocinas e quimiocinas induzidas por alta dose de mu3G9 em camundongos normais também aumentaram na dose alta de mu3G9 no modelo de fibrose por radiação. (b) Apesar a expressão muito mais alta do alvo do mu3G9, integrina αvββ, as elevações nestes rótulos inflamatórios são vistos nas mesmas doses no modelo de radiação e nos camundongos normais, isto é elevação nas 3 e 10 mg/kg, mas não na 1 mg/kg, que é uma dose eficaz próxima da máxima neste modelo (vide Exemplo 15).

[000487] Algumas proteínas associadas à fibrose, especialmente TIMP-1 e haptoglobina, foram normalizadas pelo tratamento com mu3G9 nas doses eficazes no ponto de tempo de 28 semanas. REFERÊNCIAS Annes JP, Rifkin DB, Munger JS. The integrin αvB6 binds and activates latent TGFB3. FEBS lett 2002; 511:65-68. Bonniaud P, KoIb M, Gait T, Robertson J, Robbins C, Stampfii M, Lavery C, Margetts PJ, Roberts AB, Gauldie J. Smad3 null mice develop airspace enlargement and are resistant to TGF-beta- mediated pulmonary fibrosis. J Immunol. 2004; 173(3):2099-108. Bonniaud P, Margetts PJ, Schroeder JA, Kapoun AM, Damm D, Murphy A, Chakravarty S, Dugar S, Higgins L, Protter AA and others. Progressive TGF-(beta)l-induced lung fibrosis is blocked by an orally active ALK5 kinase inhibitor. Am J Respir Crit Care Med. 2004. Breuss JM, Gallo J, DeLisser HM, Klimanskaya IV, Folkesson HG, Pittet JF, Nishimura S, Aldape K, Landers DV, Carpenter W et al. 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[000488] Foi agora descrito inteiramente a presente invenção em alguns detalhes a título de ilustração e exemplo para clareza de entendimento, será óbvio para aquele com versado na técnica que a mesma pode ser realizada por modificação ou alteração da invenção dentro de uma ampla e equivalente faixa de condições, formulações e outros parâmetros sem afetar o escopo da invenção ou qualquer modalidade específica desta, e que tais modificações ou alterações são tidas como englobadas pelo escopo das reivindicações apensas.

[000489] Todas as publicações, patentes e pedidos de patentes mencionados neste relatório descritivos são indicadores do nível de conhecimento daqueles versados na técnica à qual a invenção pertence, e são aqui incorporados a título de referência na mesma extensão como se cada publicação, patente, ou pedido de patente individual, fosse, específica e individualmente, indicado para ser incorporado a título de referência.

Claims (25)

1. Anticorpo humanizado que se liga especificamente a αvβ6, caracterizado pelo fato de que compreende um domínio variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 74 e um domínio variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 71.

2. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é conjugado a um agente citotóxico.

3. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo como definido na reivindicação 1 ou 2, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

4. Composição, de acordo com a reivindicação 3, caracteri-zada pelo fato de que o anticorpo é conjugado a um agente citotóxico.

5. Método de preparação de um anticorpo humanizado, caracterizado pelo fato de que compreende a cultura de uma célula hospedeira compreendendo um vetor recombinante ou vetores recombinantes compreendendo as sequências de ácido nucleico estabelecidas nas SEQ ID NOs: 5 e 6, sob condições apropriadas para a expressão de um anticorpo humanizado, em que cadeias de anticorpo humanizado são expressas e um anticorpo humanizado é produzido.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que compreende ainda isolar o anticorpo humanizado.

7. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira é uma célula CHO.

8. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que é para uso como medicamento.

9. Método in vitro de diagnóstico de um carcinoma que tem maior probabilidade de progredir para um carcinoma invasivo, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) contato de uma amostra de tecido epitelial canceroso compreendendo um tumor ou porção do mesmo obtida de um paciente e uma amostra de tecido epitelial não canceroso obtida de um paciente com um anticorpo, como definido na reivindicação 1 ou 2, que se liga a uma ou mais subunidades de integrina αvβ6; e (b) determinar o nível de expressão de integrina αvβ6 nas amostras de tecido, em que um aumento no nível de expressão de integrina αvβ6 na amostra de tecido canceroso em relação ao nível de expressão de integrina αvβ6 na amostra de tecido não canceroso indica a presença no paciente de um carcinoma com maior probabilidade de progredir para um carcinoma invasivo.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é conjugado com pelo menos um marcador detectável.

11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o marcador detectável é selecionado do grupo que consiste em um marcador cromogênico, um marcador enzimático, um marcador radioisotópico, um marcador isotópico não radioativo, um marcador fluorescente, um marcador tóxico, um marcador quimiolumi- nescente, um marcador radiográfico X, um marcador de spin e um marcador de agente de contraste de ressonância magnética nuclear.

12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o marcador cromogênico é diaminobenzidina ou ácido 4-hidroxiazo-benzeno-2-carboxílico.

13. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o marcador de enzima é selecionado do grupo que consiste em malato desidrogenase, nuclease estafilocócica, delta-5- esteroide isomerase, levedura-álcool desidrogenase, alfa-glicerol fosfato desidrogenase, triose fosfato isomerase, peroxidase, fosfatase alcalina, asparaginase, glicose oxidase, β-galactosidase, ribonuclease, urease, catalase, glicose-6-fosfato desidrogenase, glicoamilase e acetilcolinesterase.

14. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o marcador radioisotópico é selecionado do grupo que consiste em 3H, 111In, 125I, 131I, 32P, 35S, 14C, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 75Se, 152Eu, 90Y, 67Cu, 217Ci, 211At, 212Pb, 47Sc e 109Pd.

15. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o marcador isotópico não radioativo é selecionado do grupo que consiste em 157Gd, 55Mn, 162Dy, 52Tr, 56Fe, 99mTc e 112In.

16. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o marcador fluorescente é selecionado a partir do grupo que consiste em um marcador 152Eu, um marcador de fluoresceína, um marcador de isotiocianato, um marcador de rodamina, um marcador de ficoeritrina, um marcador de ficocianina, um marcador de aloficocianina, um marcador de proteína fluorescente verde (GFP), um marcador de o- ftaldeído e um marcador de fluorescamina.

17. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o marcador tóxico é selecionado a partir do grupo que consiste em um marcador de toxina da difteria, um marcador de ricina e um marcador de toxina da cólera.

18. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o marcador quimioluminescente é selecionado do grupo que consiste em um marcador de luminol, um marcador de isoluminol, um marcador de éster de acridínio aromático, um marcador de imidazol, um marcador de sal de acridmio, um marcador de éster de oxalato, um marcador de luciferina, um marcador de luciferase e um marcador de aequorina.

19. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o marcador radiográfico X é bário ou césio.

20. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o marcador de spin é deutério.

21. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o marcador de agente de contraste de ressonância magnética nuclear é selecionado a partir do grupo que consiste em Gd, Mn e Fe.

22. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o tumor é um carcinoma.

23. Método, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que o carcinoma é selecionado do grupo que consiste em um carcinoma de mama, e carcinoma endometrial, um carcinoma pancreático, um carcinoma colorretal, um carcinoma de pulmão, um carcinoma de ovário, um carcinoma cervical, um carcinoma prostático, um carcinoma de fígado, um carcinoma de esôfago, um carcinoma de cabeça e pescoço, um carcinoma de estômago, um carcinoma esplênico e um adenocarcinoma.

24. Método, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o carcinoma é carcinoma da mama in situ.

25. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que o carcinoma da mama in situ é um carcinoma ductal in situ (DCIS) ou um carcinoma lobular in situ (LCIS).

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