JP5044633B2 - 定量ビデオ顕微鏡法とそれに関連するシステムおよびコンピュータソフトウェアプログラム製品 - Google Patents
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Description
この点において、本発明の実施の形態によると、サンプルを構成する少なくとも1つの分子種であって、それぞれ色素によって示される分子種の量を決定する方法が提供される。第一に、サンプルの画像が、カラー画像取込デバイスにより、画像データとして取り込まれる。サンプルの光学密度を、画像の特定のピクセルにおいて赤色、緑色、青色の各チャネル毎に決定する。その後、当該ピクセルに対して、対応する光学密度行列が形成される。光学密度行列に相対的吸収係数行列を掛けて、当該ピクセルに対しての終結行列を形成する。相対的吸収係数行列は、サンプルとは独立に、赤色、緑色、青色の各チャネル毎に、各色素に対しての相対的吸収係数を有する。終結行列は、当該ピクセルにおける、それぞれの色素によって示される各分子種の量を有する。
さらに、本発明の他の有利な側面によると、サンプルを構成する少なくとも1つの分子種であって、それぞれ色素によって示される分子種の量を、サンプルの画像から決定するためビデオ顕微鏡システムが提供される。当該システムは、サンプルの画像を画像データとして取り込むことが出来るように構成されたカラー画像取込デバイスと、当該画像取込デバイスに動作可能に連動したコンピュータデバイスとを有する。当該コンピュータデバイスは、当該画像のピクセルにおける赤色、緑色、青色の各チャネル毎のサンプルの光学密度を、サンプルの画像データから決定して、該ピクセルに対して、対応する光学密度行列を形成するように構成された処理部を有する。コンピュータデバイスの他の処理部は、光学密度行列に、相対的吸収係数行列の逆行列を掛けて、当該画像の当該ピクセルに対しての終結行列を形成するように構成されている。相対的吸収係数行列は、サンプルとは独立に、各色素に対しての赤色、緑色、青色の各チャネル毎の相対的吸収係数を有する。終結行列は、当該ピクセルにおける、それぞれの色素によって示される各分子種の量を含む。
さらに、本発明の他の有利な側面によると、画像取込デバイスの画像取込用構成部品に動作可能に連動した拡大対物レンズによって検出可能な光を放出するための光源を含み、画像を作り出すように構成されたビデオ顕微鏡システムにおいて色収差を補正するための方法が提供される。第一に、拡大対物レンズの中心座標が、画像取込用構成部品の中心座標を基準にして決定される。光源によって放出された光から選ばれた複数の光波長について、当該複数の波長から選ばれた平均波長の倍率を基準にして、当該複数の波長の各々について、倍率が決定される。当該画像は、拡大対物レンズの中心座標が画像取込用構成部品の中心座標に対応し、各波長の倍率が中間波長の倍率に対応するように調整される。
OD=ε・l・C (1)
で表される。ODは溶液の光学密度(optical density)、εはモル減衰係数(molar extinction)または吸収係数(absorption coefficient)と呼ばれる比例定数、lはサンプルの厚み、Cは分子種の濃度である。吸収係数εは分子種に特有なもので一般にL・mol-1・cm-1の単位で表される。
OD=ε1・l1・C1+ε2・l2・C2 (2)
と表すことが出来る。この状況は例えば、興味のある分子種を標的とするマーカ色素(marker dye)とサンプルの他の部分を染色するための対比染色試薬(counterstain)とから成る2つの色素を使って、「シーン(scene)」、視野(field of view)、あるいはサンプルの一部が染色されている場合の生体解析において生じることがある。
ODr=ε1r・l1・C1+ε2r・l2・C2 (3)
ODg=ε1g・l1・C1+ε2g・l2・C2 (4)
ODb=ε1b・l1・C1+ε2b・l2・C2 (5)
ODr、ODg、ODbは赤色、緑色、および青色チャネルでそれぞれ測定されたサンプルの光学密度を表す。なおさらに、例えばサンプルを3つの色素で処理するといったように調製の煩雑さが増す場合には、式(3)、(4)、(5)はそれぞれ以下のようになる。
ODr=ε1r・l1・C1+ε2r・l2・C2+ε3r・l3・C3 (6)
ODg=ε1g・l1・C1+ε2g・l2・C2+ε3g・l3・C3 (7)
ODb=ε1b・l1・C1+ε2b・l2・C2+ε3b・l3・C3 (8)
こうした状況では、3つの色素は例えば1つのマーカ色素と2つの対比染色試薬、あるいは2つのマーカ色素と1つの対比染色試薬、あるいは3つとも別々のマーカ色素、といったものから成る場合がある。しかし当業者であれば、本発明の範囲を逸脱することなく、ここに実例として示したランバート・ベールの法則の加法性はさらに多くの色素の組み合わせを含む場合まで拡張させることができることは理解されるでろう。本発明の特に有利な態様では、3つの別個のチャネル(赤色、緑色、青色チャネル)にわたりマルチスペクトル・イメージングするための例えば3CCD・RGBカメラといった高速取込型カラーイメージングデバイスが利用されることにも注意したい。ここでは例示的に3つの方程式が解析で用いられたが、当業者であれば、実例としてここに示したコンセプトは或る特定のイメージングデバイスで利用できるだけの多くのチャネルに適用することができることは理解されるであろう。
OD(x,y)=logI0(x,y)−logI(x,y) (9)
サンプル500のデジタル画像450は例えば直交座標系において配列した複数のピクセルから成る。(x,y)は画像450内の或る特定のピクセルの位置を指定し、OD(x,y)はそのピクセルにおけるサンプル500の光学密度であり、I(x,y)はそのピクセルにおけるサンプル500の測定光度または透過率であり、I0(x,y)はサンプルといった光を吸収するオブジェクトが中間に存在しない場合の光源200の測定光度である。このとき次式が成立する。
IOD=ΣN(logI0(x,y)−logI(x,y)) (10)
IODはサンプル500のデジタル画像450の集積光学密度(integrated optical density)である。Nはサンプルの表面画像450にあるピクセル数を表す。さらに、当業者であれば、式(9)と式(10)で表される対数関係は本発明の技術的思想的範囲を逸脱することなく様々な底で表すことができることは理解されよう。例えば、その関係は、底2,底10、あるいは自然対数で表されることがある。ただ、様々な底はそれぞれの比例定数によって関係付けられる(例えば、ln(x)またはloge(x)=2.3026log10(x))。こうして、相対比較が光度について行われるところでは比例定数が適切に考慮される必要がある。さらに、ランバート・ベールの法則に基づく定量顕微鏡においては、サンプルの光学密度ODと色素濃度の間の比例関係が議論される。
lnI0−lnI=lnI0/I=OD=ε・l・C (11)
εr=ODr/(l・C)=(ln(I0r/Ir))/(l・C) (12)
εg=ODg/(l・C)=(ln(I0g/Ig))/(l・C) (13)
εb=ODb/(l・C)=(ln(I0b/Ib))/(l・C) (14)
εr=ODr/1=ODr=ln(I0r/Ir) (15)
εg=ODg/1=ODg=ln(I0g/Ig) (16)
εb=ODb/1=ODb=ln(I0b/Ib) (17)
結果として、特定の色素の絶対濃度が未知のままの場合、赤色チャネル550、緑色チャネル600、青色チャネル650の各チャネル毎の任意の所定のピクセルに対する相対的吸収係数εは、l・Cに等しい誤差因子を使って計算されてよい。
ODr=ε1r・C1+ε2r・C2+ε3r・C3 (18)
ODg=ε1g・C1+ε2g・C2+ε3g・C3 (19)
ODb=ε1b・C1+ε2b・C2+ε3b・C3 (20)
注意として、異なる色素に対する吸収係数ε行列の決定は、サンプル評価と関係なく実行されてよく、そしてそれぞれの色素の少なくとも1つを用いて処理されるサンプルに適用するために更に記憶保存されてよい。さらには、特定の色素に対する様々な吸収係数ε行列は光源200の初期光度I0データと共に例えばコンピュータデバイス350、イントラネットもしくはインタネット上に置かれたサーバ、あるいは当業者に周知の他のデータ記憶媒体に記憶保存されてよい。こうして、吸収係数εが異なる色素について評価されており、また光学密度ODが画像データから決定されていると、それぞれの色素濃度C1、C2、C3を導き出すために適切な方程式が連立線形方程式として解かれる場合がある。
a11x1+a12x2+a13x3+...+a1NxN=b1
a21x1+a22x2+a23x3+...+a2NxN=b2
a31x1+a32x2+a33x3+...+a3NxN=b3
..........................................
aM1x1+aM2x2+aM3x3+...+aMNxN=bM (21)
N個の未知数xj(j=1,2,...,N)はM個の方程式によって関係付けられる。係数aij(i=1,2,...,M、j=1,2,...,N)はbi(i=1,2,...,M)と共に一般的に既知である。M<Nの場合、未知数の数よりも方程式数が少ない。このような場合、解無しかまたは唯一より多くの解行列xが存在し得る。さらにN=Mの場合、方程式と未知数の数は同数で、唯一の解が決定される場合がある。さらにM>Nの場合、方程式数が未知数より多く存在し、一般的に、特定の解行列xは存在しない。このような連立方程式系は条件過剰(overdetermined)と言われる。この場合、一般的に最も適切な解は方程式にベストフィットする解であると考えられている。このベストフィットする解というのは一般に、再現誤差(reconstruction error)の和が最小の解に対応する。
A・x=b (22)
記法”・”は行列の積を意味する。Aは係数行列でbは連立方程式の等号の右側に現れたbiから成る列ベクトルである。一般的に線形代数の慣習に従って、行列要素aijの最初の添字は行番号を表し、二番目の添字は列番号を表す。さらに、aiまたはa[i]は行列Aのi番目の行a[i][j](j=1,...,N)を表す。未知ベクトルxに対する行列方程式A・x=bを解くには通常、左からAの逆行列A-1を掛ければよい。
x=A-1・b (23)
A-1はAの逆行列で、IDを単位行列(identity matrix)とすれば、そればA-1・A=A・A-1=IDを満足する。解を決定し易くするために、方程式数が未知数の数以上になるようにパラメータが構成されることがある。既に議論したように、M>Nになっている場合、一般的には数21式に対する特定の解行列xは存在せず、方程式系は条件過剰になる。しかしこうした状況では、ベストな「妥協的(compromise)」な解、あるいはベストフィットな解というのがしばしば、全ての方程式を最も近似的なしかも同時に満足する解になる。こうした近似的な解というのは例えば、数21式の両辺の差の二乗和を最小にする最小二乗法で決まる場合がある。結果として、条件過剰な線形方程式系は、当業者にはなじみのある特異値分解(SVD:singular value decomposition)法で解かれる場合がある線形最小二乗法としばしば称される可解問題に帰着することがある。SVD法はデータのパラメータモデリングに向けられたもので、線形最小二乗問題を解くために通常選ばれる方法である。この手法についての詳細は例えば、NUMERICAL RECIPES IN C :THE ART OF SCIENTIFIC COMPUTING (ISBN 0-521-43108-5) Copyright (C) 1988 1992 by Cambridge University Press. Programs Copyright (C)1988-1992 by Numerical Recipes Softwareを参照されたい。
ln(IBW)=ln(I0)−ODBW、ここでODBW=C (24)
ln(Ir)=ln(I0)−ODr、ここでODr=εr・C (25)
ln(Ig)=ln(I0)−ODg、ここでODg=εg・C (26)
ln(Ib)=ln(I0)−ODb、ここでODb=εb・C (27)
こうして次の表が得られる。
Claims (3)
- 画像取込デバイスの画像取込用構成部品に動作可能に連動した拡大対物レンズによって検出可能な光を放出するための光源を含み、画像を作り出すように構成されたビデオ顕微鏡システムにおいて色収差を補正するための方法であって、
画像取込用構成部品の中心座標を基準にして拡大対物レンズの中心座標を決定するステップと、
光源によって放出された光から選ばれた複数の光波長について、該複数の波長から選ばれた平均波長の倍率を基準にして該複数の波長の各々の倍率を決定するステップと、
拡大対物レンズの中心座標が画像取込用構成部品の中心座標に対応し、各波長の倍率が前記平均波長の倍率に対応するように画像を調整するステップと
を含むビデオ顕微鏡システムにおける色収差補正方法。 - 光源と拡大対物レンズとの間に、開口部から成る較正グリッドを有するスライドを更に配置するステップと、
前記複数の波長の各々に対して、x軸とy軸とを有する直交座標系に関して前記グリッドの画像を形成するステップと、
前記複数の波長の各々の画像から、前記グリッドの各開口部毎に直交座標系に関して中心座標を決定するステップと、
平均波長の画像を基準画像として指定するステップと、
基準画像を基に各画像についてグリッドの各開口部毎に、直交座標系に関してそれぞれの画像における開口部の中心座標と基準画像における対応する開口部の中心座標との間の差を、x軸に沿った差δxとy軸に沿った差δyとして表して決定するステップと、
xの関数としてx軸に沿った微分とyの関数としてy軸に沿った微分のそれぞれについて、再現誤差を最小化する線形方程式を決定するステップと、
線形方程式を、xの関数としてx軸に沿った微分とyの関数としてy軸に沿った微分のそれぞれについて、x軸に沿った微分とy軸に沿った微分をそれぞれの線形方程式の中でゼロに設定した上で解くことにより、拡大対物レンズの中心座標を決定するステップと、
拡大対物レンズの中心までの距離の関数としてx軸に沿った微分とy軸に沿った微分の二乗和の平方根から成る再現誤差を最小化するための線形方程式を決定するステップと
を更に含む請求項1に記載の方法。 - 基準画像の倍率を基準にして、複数の波長のそれぞれについて画像の倍率を供するために、拡大対物レンズの中心までの距離の関数として線形方程式の傾きを決定するステップを更に含む請求項2に記載の方法。
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