ES2617882T3 - Método de análisis de imagen basado en la separación de cromógenos - Google Patents

Abstract

Método de separación de cromógenos para una imagen de una muestra biológica teñida con cuatro colorantes obtenidos con un dispositivo de toma de imágenes de tres canales, donde el método comprende: definir, a partir de un conocimiento a priori, tres combinaciones de colorantes de tres de cuatro colorantes que están situados espacialmente en la muestra biológica; obtener una imagen de una muestra teñida con cuatro colorantes con un dispositivo de toma de imágenes con un canal rojo, verde y azul, donde la imagen por lo tanto incluye una pluralidad de píxeles, cada uno de ellos con un triplete RGB correspondiente; proyectar los coeficientes de extinción de cada colorante, en cada uno de los canales rojo, verde y azul del dispositivo de toma de imágenes, en un plano de coeficiente de extinción incluido en un plano equivalente de Maxwell, donde el plano del coeficiente de extinción está definido por los componentes del coeficiente de extinción EcR, EcG y EcB, donde EcR+EcG+EcB>=1, de tal manera que las combinaciones de los tres colorantes conocidos a priori están representados por un triángulo cuyos vértices corresponden a localizaciones en el plano del coeficiente de extinción de los respectivos tres de cuatro colorantes; proyectar cada triplete RGB en el plano del coeficiente de extinción para determinar una localización correspondiente en el plano del coeficiente de extinción y la correspondiente combinación de tres colorantes de los tres de cuatro colorantes asociados con la misma, determinando qué triángulo asociado con una combinación de colorantes rodea la localización del triplete RGB o qué triángulo asociado con una combinación de colorante está más cercano a la localización del triplete RGB; y separar la imagen de la muestra determinando los pixeles en la imagen correspondientes a cada combinación de tres colorantes previamente definida en el plano del coeficiente de extinción, y realizando la correspondiente separación de cromógenos de tres colorantes para esos pixeles.

Description

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

DESCRIPCION

Metodo de analisis de imagen basado en la separacion de cromogenos Antecedentes de la invencion Area de la invencion

La presente invencion hace referencia al analisis de imagenes y, mas concretamente, a metodos para el analisis de imagenes basado en la separacion de cromogenos relacionada con tecnicas de video-microscopfa cuantitativas en aplicaciones de biologfa y patologfa celular.

Descripcion del arte relacionado

La evaluacion y el analisis de los tejidos es dominio de la patologfa. Durante el pasado reciente, los desarrollos metodologicos y tecnologicos han convertido el analisis de imagen digital en una de las herramientas mas eficaces para ayudar a los patologos a la hora de interpretar las imagenes con creciente precision. Aunque dichas tecnicas de analisis de imagenes contribuyen sustancialmente a proporcionar a los citologos un analisis celular preciso, reproducible y objetivo, las tecnicas de interpretacion histologica tienden aun a depender del analisis subjetivo de las muestras. Tales tecnicas de interpretacion histologica pueden tambien estar sujetas a la variabilidad respecto a intra- e interobservador, que ademas tienden a proporcionar resultados menos precisos, menos reproducibles y menos objetivos. Por tales razones, el analisis de imagenes de tejidos estaba inicialmente limitado a tecnologfas desarrolladas para el analisis de muestras citologicas.

La situacion ha cambiado en la actualidad con la evolucion y disponibilidad de ordenadores de alto rendimiento, comunicacion de area local y de area amplia, soluciones de bases de datos rentable, tecnologfa de almacenamiento mejorada, y camaras y/o aparatos de escaner digitales de alta resolucion rentables. No pudieron aplicarse a secciones de tejido en un entorno de rutina con anterioridad algoritmos mas sofisticados, no efectivos anteriormente debido a la carencia de potencia de las CPU. Sin embargo, tales algoritmos pueden ser utilizados en la actualidad para evaluar y cuantificar las caracterfsticas especfficas de los tejidos relacionadas con la cuantificacion de marcadores y la localizacion sub-celular. Al mismo tiempo, se encuentran disponibles soportes mas completos para una evaluacion visual mas estandarizada y reproducible de las secciones de tejido, en base a la etapa inicial en el analisis de imagenes, concretamente la creacion y gestion de imagenes digitales. Esto se aplica especialmente a las areas de control de calidad, garantfa de calidad y estandarizacion. Las imagenes digitales de casos diffciles pueden intercambiarse con patologos de referencia mediante telepatologfa para obtener una segunda opinion. Tales imagenes pueden tambien utilizarse de forma efectiva para pruebas de aptitud. Las imagenes digitales tambien son la base de potentes bases de datos de imagenes de referencia, a las cuales se puede acceder a traves de una red, y que juegan un papel cada vez mas importante en la documentacion de casos y de resultados de evaluacion, en particular en informes electronicos o impresos completos.

Una vez que se prepara un portaobjetos con una muestra, un patologo examina visualmente la muestra de tejido al microscopio. Si hubiera de aplicarse un analisis de imagen con respecto al portaobjetos, el microscopio debe estar equipado al menos con una camara o con otro dispositivo de captura de imagenes, que este conectado a un sistema informatico a traves de una interfaz. La camara muestrea la imagen optica microscopica de la muestra del tejido mediante el microscopio. Como resultado, se recoge una imagen digital en la memoria del ordenador y puede mostrarse en el monitor del mismo. Sin embargo, la adquisicion de estas imagenes digitales debe realizarse de tal manera que los detalles importantes de las imagenes opticas se encuentran aun representados correctamente por los datos almacenados.

Generalmente, la siguiente etapa para una evaluacion cuantitativa de las imagenes digitalizadas es la segmentacion, que en ocasiones incluye una etapa adicional intermedia de pre-procesamiento. Durante la segmentacion, las celulas se separan unas de otras y del fondo de la imagen. En algunos ejemplos, los avances algorftmicos han hecho imposible segmentar las celulas hasta el nivel de un componente sub-celular (es decir, nucleo, citoplasma o membranas). Aunque puede parecer una tarea sencilla, la segmentacion es a menudo una etapa diffcil y propensa a errores en el analisis de imagenes. Para portaobjetos en los que las celulas se separan bien y se tinen de forma que tiene lugar un buen contraste en la imagen digitalizada, la segmentacion puede realizarse de forma muy fiable en muchos casos. Tan pronto como una de las condiciones anteriores no se cumpla, sin embargo, han de aplicarse algoritmos de segmentacion sumamente sofisticados y que consumen mucho tiempo, utilizando conocimiento a priori adicional sobre las celulas y su relacion una con otra, o sobre marcadores y localizacion sub-celular con coloracion de contraste. Este es el caso, por ejemplo, en casos de secciones de tejido de tumores infiltrantes, en los que la mayorfa de las celulas ya no se separan bien en el portaobjetos, sino que tienden a tocarse y solaparse entre si.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Utilizando un algoritmo basado en marcadores, es posible circunscribir la region de interes automaticamente, y dejar que el patologo decida, utilizando su propia experiencia subjetiva, si la region presentada es adecuada o necesita ser refinada manualmente. Una vez que se determinan las areas significativas de una imagen, tiene lugar la extraccion de caracterfsticas. Para cada celula (y sus componentes sub-celulares), pueden medirse un conjunto de caracterfsticas densitometricas, morfometricas, de textura, y contextuales, con el objetivo de caracterizar las celulas individuales y sus interacciones de forma tan exhaustiva como sea posible.

La ultima etapa es la presentacion de los datos en bruto y la compilacion de los mismos en forma de resultados y/o puntuaciones significativas. Los datos de salida resultantes de un sistema de analisis de imagenes deberfan coincidir, de forma deseable, con la forma de los sistemas de clasificacion visual y/o semi-cuantitativos que ya estan siendo utilizados por el patologo para fomentar la consistencia, para que sean facilmente aplicables, o para poder ser interpretados en el uso rutinario.

La plataforma para la evaluacion de muestras de tejido mediante el analisis de imagenes se esta desplazando, cada vez mas, desde un analizador de imagenes de uso general hacia “estaciones de trabajo de patologfa” especializadas y dedicadas, configuradas para el trabajo de rutina. Tales estaciones de trabajo combinan herramientas con la necesaria informacion para obtener los mejores resultados posibles. En una posicion central con respecto a dicha estacion de trabajo se encuentra el microscopio, posiblemente equipado con partes roboticas que incluyen una etapa motorizada, un dispositivo de enfoque automatico, un cambiador de objetivos, y un dispositivo de ajuste de intensidad de la luz. Diferentes dispositivos de entrada se encuentran enlazados con la estacion de trabajo, tales como camaras capaces de un enfoque automatico rapido y de la adquisicion de imagenes de alta resolucion. La estacion de trabajo puede ser parte de una red de area local (LAN). La estacion de trabajo puede ademas soportar diferentes protocolos de comunicaciones, de manera que puedan utilizarse canales de comunicaciones disponibles para conectar la estacion de trabajo con otros lugares en el mundo (red de area amplia o WAN).

Cuando esta integrada dentro de una LAN y/o WAN, se puede garantizar el acceso de la estacion de trabajo a bases de datos de referencia existentes y a sistemas de informacion hospitalarios (HIS, por sus siglas en ingles), de tal manera que cualquier caso nuevo a ser examinado pueda ser comparado con las imagenes y la informacion anexa de los casos de referencia que se han acumulado a lo largo del tiempo. Ademas, las imagenes adquiridas de los portaobjetos bajo examen pueden complementarse con la historia del paciente y del caso.

La estacion de trabajo de patologfa esta adaptada, preferiblemente, para una evaluacion exhaustiva del tejido. Comenzando con la informacion y las imagenes digitales de la muestra de tejido inicial, pueden tomarse las imagenes de los portaobjetos preparados a partir del tejido. La informacion del paciente y del caso, las propias imagenes, y cualquier informacion cuantitativa acerca de los componentes celulares de la muestra de tejido pueden todos almacenarse en la misma base de datos.

Toda la informacion acumulada por la estacion de trabajo para un caso, tal como imagenes, resultados de mediciones, datos del paciente, datos de preparacion, puede seleccionarse para que forme parte de un informe que puede o bien imprimirse o firmarse electronicamente a traves de la red. El informe proporciona una imagen completa del caso bajo evaluacion, y facilita la garantfa de calidad y estandarizacion.

Durante el pre-procesamiento / segmentacion de las imagenes capturadas, pueden implementarse muchas tecnicas / algoritmos diferentes para el analisis de imagenes, en particular para video-microscopfa cuantitativa en el area de aplicaciones de biologfa celular y patologfa, utilizando imagen multiespectral adaptada a camaras en color (es decir, camaras 3CCD - RGB).

Un analisis efectivo de las imagenes microscopicas es esencial en biologfa celular y patologfa, en particular para la deteccion y cuantificacion en el material genetico (genes, ARN mensajero) o la expresion de esta informacion genetica en forma de protefnas, por ejemplo, amplificacion genica, delecion genica, mutacion genica, numero de moleculas de ARN mensajero o analisis de la expresion de protefnas. La amplificacion genica es la presencia de demasiadas copias del mismo gen en una celula, en donde una celula contiene habitualmente dos copias, conocidas de otro modo como alelos, del mismo gen. La delecion genica indica que pueden encontrarse menos de dos copias de un gen en una celula. La mutacion genica indica la presencia de genes incompletos o no funcionales. Los ARN mensajeros (ARNm) son moleculas de informacion genetica, sintetizadas a partir de la lectura genica, que se utilizan como plantillas para la sfntesis de protefnas. La expresion de protefnas es la produccion de una protefna determinada por parte de una celula. Si el gen que codifica esta protefna se regula por incremento o se encuentran presentes demasiadas copias del gen o ARNm, la protefna puede ser sobre-expresada. Si el gen se regula por disminucion o se elimina, el nivel de expresion de protefnas puede ser bajo o estar ausente.

Los comportamientos celulares normales son controlados de forma precisa por mecanismos moleculares que implican un gran numero de protefnas, ARNm y genes. Se sabe que la amplificacion genica, la delecion genica y la mutacion genica tienen un papel destacado en los comportamientos celulares anomalos mediante la expresion de protefnas anomala. El rango de comportamientos celulares de interes incluye comportamientos tan diversos como, por ejemplo, la regulacion de la proliferacion o la diferenciacion. Por lo tanto, es necesaria una deteccion y

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

cuantificacion efectiva en la amplificacion, delecion y mutacion genica, niveles de ARNm o analisis de la expresion de protemas, para facilitar unas herramientas de investigacion, de diagnostico y de prognosis de utilidad.

Existen numerosas tecnicas de laboratorio dedicadas a la deteccion y cuantificacion en la ampliacion, delecion y mutacion genica, niveles de ARNm o analisis de expresion de protemas. Por ejemplo, tales tecnicas incluyen tecnicas de inmunotransferencia Western, Northern y Southern blots, reaccion en cadena de la polimerasa ("PCR", por sus siglas en ingles), ensayo de inmunoabsorcion enzimatica ("ELISA", por sus siglas en ingles), y tecnicas de hibridacion genomica comparada ("CGH", por sus siglas en ingles). Sin embargo, la microscopfa se utiliza de forma rutinaria porque es una tecnica informativa, que permite rapidas investigaciones a nivel celular y sub-celular, que puede ser implementada a un coste relativamente bajo.

Cuando la tecnica de laboratorio elegida es la microscopfa, las muestras biologicas, habitualmente, se someten en primer lugar a preparaciones espedficas para la deteccion y el revelado. Una vez que las muestras se preparan, un usuario experto analiza las muestras solo con un microscopio o con un microscopio acoplado a una camara y a un ordenador, lo que permite un estudio tanto mas estandarizado como mas cuantitativo. El microscopio puede estar configurado para un analisis completamente automatico, en donde el microscopio es automatizado con platina y enfoque motorizados, cambiadores de objetivos motorizados, controles de intensidad de la luz automaticos y similares.

La preparacion de las muestras para deteccion puede implicar diferentes tipos de tecnicas de preparacion que son adecuadas para el analisis de imagenes microscopicas, tales como, por ejemplo, tecnicas de preparacion basadas en la hibridacion y basadas en el inmunomarcaje. Tales tecnicas de deteccion pueden ir acompanadas de tecnicas de revelado apropiadas, tales como, por ejemplo, tecnicas basadas en fluorescencia y tecnicas basadas en reaccion por cambio de color visible.

La hibridacion in situ (“ISH”, por sus siglas en ingles) y la hibridacion in situ fluorescente (“FISH”, por sus siglas en ingles) son tecnicas de deteccion y revelado que se utilizan, por ejemplo, para la deteccion y cuantificacion de la amplificacion de la informacion genetica y del analisis de la mutacion. Tanto la ISH como la FIS pueden ser aplicadas a muestras histologicas o citologicas. Estas tecnicas utilizan sondas complementarias espedficas para reconocer secuencias precisas correspondientes. Dependiendo de la tecnica utilizada, la sonda espedfica puede incluir un marcador (ISH) o un marcador fluorescente (FISH), en donde las muestras se analizan entonces utilizando un microscopio de transmision o un microscopio de fluorescencia, respectivamente. El uso de un marcador qmmico o un marcador fluorescente depende del objetivo del usuario, presentando cada tipo de marcador ventajas correspondientes sobre los otros en casos en particular.

En caso de analisis de la expresion de protemas, pueden emplearse, por ejemplo, tecnicas adicionales de inmunohistoqmmica (“IHC”, por sus siglas en ingles) y de inmunocitoqmmica (“ICC”, por sus siglas en ingles). La IHC es la aplicacion de la inmunoqmmica a secciones del tejido, mientras que la ICC es la aplicacion de la inmunoqmmica a celulas cultivadas o huellas de tejido despues de que se hayan sometido a preparaciones citologicas espedficas, por ejemplo, preparaciones a base de lfquidos. La inmunoqmmica es una familia de tecnicas basadas en el uso de anticuerpos espedficos, en donde se utilizan anticuerpos para establecer como diana espedficamente unas moleculas en el interior o en la superficie de las celulas. El anticuerpo habitualmente, contiene un marcador que se sometera a una reaccion bioqmmica, y por lo tanto experimental un cambio de color, al encontrarse con las moleculas diana. En algunos casos, puede integrarse una amplificacion de senal en el protocolo en particular, en donde un anticuerpo secundario que incluye el colorante marcador sigue a la aplicacion de un anticuerpo monoclonal espedfico primario.

Tanto en los estudios de hibridacion como en los de inmunomarcaje, se utilizan cromogenos de diferentes colores para distinguir los diferentes marcadores. Como los marcadores pueden ser espedficos del compartimento celular, este conocimiento a priori puede ser utilizado para segmentar automaticamente las celulas (es decir, separar las mascaras correspondientes al nucleo de las mascaras citoplasmaticas o las correspondientes a la membrana). En general, los algoritmos “colorimetricos” estan dirigidos a proporcionar informacion sobre las muestras para facilitar el diagnostico y/o pronostico del caso en particular. A modo de ilustracion, puede proporcionarse la deteccion y cuantificacion de los niveles de expresion de protema ER, PR y HER2 en la mama utilizando un algoritmo de microscopfa cuantitativa aplicada a tecnicas de inmunohistoqmmica (IHC).

En vista de tales tecnicas de analisis de imagenes, sin embargo, existe la necesidad de mejoras que faciliten la flexibilidad en dichos analisis, proporcionando, al mismo tiempo, informacion util y precisa a un patologo que permita a dicho patologo formar un diagnostico y/o pronostico apropiado.

La patente US 2003/0191221 divulga un metodo para la separacion de cromogenos.

Resumen de la invencion

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Acorde con la presente invencion, se proporciona un metodo para la separacion de cromogenos para una imagen de una muestra biologica tenida con cuatro colorantes, obtenida con un dispositivo de toma de imagenes de tres canales, donde el metodo comprende:

definir, a partir de un conocimiento a priori, tres combinaciones de colorantes de tres de cuatro colorantes que estan situados espacialmente en la muestra biologica;

obtener una imagen de una muestra tenida con cuatro colorantes con un dispositivo de toma de imagenes con un canal rojo, verde y azul, donde la imagen por lo tanto incluye una pluralidad de pixeles, cada uno de ellos con un triplete RGB correspondiente;

proyectar los coeficientes de extincion de cada colorante, en cada uno de los canales rojo, verde y azul del dispositivo de toma de imagenes, en un plano de coeficiente de extincion incluido en un plano equivalente de Maxwell, donde el plano del coeficiente de extincion esta definido por los componentes del coeficiente de extincion Ecr, Ecg y Ecb, donde Ecr+Ecg+Ecb=1, de tal manera que las combinaciones de los tres colorantes conocidos a priori estan representados por un triangulo cuyos vertices corresponden a localizaciones en el plano del coeficiente de extincion de los respectivos tres de cuatro colorantes;

proyectar cada triplete RGB en el plano del coeficiente de extincion para determinar una localizacion correspondiente en el plano del coeficiente de extincion y la correspondiente combinacion de tres colorantes de los tres de cuatro colorantes asociados con la misma, determinando que triangulo asociado con una combinacion de colorantes rodea la localizacion del triplete RGB o que triangulo asociado con una combinacion de colorante esta mas cerca de la localizacion del triplete RGB; y

separar la imagen de la muestra determinando los pixeles en la imagen correspondientes a cada combinacion de tres colorantes previamente definida en el plano del coeficiente de extincion, y realizando la correspondiente separacion de cromogenos de tres colorantes para esos pixeles.

Las realizaciones de la presente invencion por tanto cumplen con las necesidades identificadas en la presente patente y proporcionan ventajas significativas tal como se detalla adicionalmente en la presente patente.

Breve descripcion de las diversas vistas del dibujo o dibujos

Habiendo descrito de este modo la invencion en terminos generales, se hara a continuacion referencia a los dibujos anexos que no estan necesariamente dibujados a escala, y en donde:

La FIG. 1 ilustra esquematicamente una serie de imagenes de una muestra tenidas electronicamente, en donde el valor de transmitancia de uno de los colorantes que tine la muestra se varfa para determinar la intensidad optima del marcador, tal como se muestra en el nucleo, permitiendo tanto una lectura morfologica por parte del patologo como una decision positiva de la celula en base a la expresion del marcador;

Las FIGS. 2A y 2B muestran algunos ejemplos de regiones de interes seleccionadas automaticamente de acuerdo con un aspecto de la presente invencion;

Las FIGS. 3A1-3A2 y 3B1-3B2 muestran ejemplos de regiones de interes seleccionadas automaticamente y la posterior segmentacion subcelular de acuerdo con un aspecto de la presente invencion;

La FIG. 4 ilustra de forma esquematica un metodo de puntuacion de las celulas de acuerdo con un aspecto de la presente invencion;

Las FIGS. 5A y 5B ilustran un metodo para el analisis de muestras que incluye altas concentraciones de colorante utilizando un enfoque de integracion de tiempo de acuerdo con un aspecto de la presente invencion;

Las FIGS. 6A-6D ilustran datos en referencia a cada uno de los 4 colorantes para el tenido de una muestra para un procedimiento de separacion de cromogenos de 4 colorantes de acuerdo con un aspecto de la presente invencion;

Las FIGS. 7A, 7B1, y 7B2 ilustran de forma esquematica los 4 colorantes de las FIGS. 6A-6D representados en el plano del coeficiente de extincion equivalente de Maxwell, y las 2 combinaciones aceptadas de 3 colorantes de los mismos, respectivamente, de acuerdo con un aspecto de la presente invencion;

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

La FIG. 8A ilustra un campo de vision de un PAP modificado, tenido con los 4 colorantes de la FIG. 6;

Las FIGS. 8B-8E ilustran el campo de vision de un PAP modificado de la FIG. 8A para cada uno de los 4 colorantes independientemente de los otros colorantes utilizando separacion de cromogenos extendida; y

La FIG. 9A ilustra un campo de vision origen (RGB) de una muestra, mientras que la FIG. 9B ilustra una muestra tenida electronicamente simulada de la misma para dos de los cuatro componentes colorantes, y la FIG. 9C ilustra una imagen simulada tenida electronicamente de un PAP unicamente, de la muestra reconstruida con todos los componentes colorantes excepto DAB.

Descripcion detallada de la invencion

La presente invencion sera descrita a continuacion de forma mas completa de aquf en adelante en referencia a los dibujos anexos, en los que se muestran algunas, pero no todas las realizaciones de la invencion. De hecho, esta invencion puede ser realizada de muchas formas diferentes y no debe considerarse limitada a las realizaciones expuestas en la presente patente; en su lugar, estas realizaciones se proporcionan de manera que esta divulgacion satisfaga los requerimientos legales aplicables. Numeros similares hacen referencia a elementos completamente similares.

La plataforma de toma de imagenes de microscopfa

En un dispositivo de microscopfa habitual para la adquisicion y procesamiento de imagenes, la imagen aumentada de la muestra debe ser capturada y digitalizada, en primer lugar, con una camara. Generalmente, se utilizan camaras digitales con dispositivo de carga acoplada (CCD, por sus siglas en ingles) tanto en microscopfa optica o en microscopfa de fluorescencia cuantitativa. Excluyendo los espectrofotometros, se utilizan generalmente dos tecnicas diferentes para realizar dichos estudios microscopicos colorimetricos. En una tecnica, puede utilizarse una camara CCD en blanco y negro (BW). En dicho ejemplo, se obtiene una imagen de la muestra en escalas de grises, correspondiente a luz monocromatica con una longitud de onda especffica al tenido de la muestra a ser analizada. La longitud de onda especffica de la luz se obtiene ya sea mediante filtrado de una fuente de luz blanca a traves de un filtro de un ancho de banda reducido, o controlando directamente la longitud de onda de la fuente de luz, utilizando controles manuales o electronicos. Por consiguiente, utilizando esta tecnica, el tiempo de analisis aumenta a medida que el numero de colores aumenta, ya que debe seleccionarse una fuente de luz o un filtro para cada diferente coloracion de la muestra o cada diferente longitud de onda. Por lo tanto, deben capturarse individualmente diversas imagenes diferentes de la muestra, que ofrecen la respuesta espectral de la muestra en diferentes longitudes de onda, en un orden secuencial para facilitar el analisis. Cuando deben analizarse multiples escenas o campos de vision, el protocolo habitual es automatizar la secuencia en un modo por lotes para conservar el tiempo de procesamiento.

Segun una segunda tecnica, se utiliza una camara digital CCD en color, en donde se capturan y se obtienen simultaneamente tres imagenes de la muestra en escala de grises. Cada imagen en escala de grises corresponde a una imagen en escala de grises en cada uno de los canales rojo, verde y azul (canales RGB) de la camara CCD en color. Cuando se utiliza una camara digital CCD en color, en donde tres imagenes en escala de grises de la muestra se capturan y se obtienen simultaneamente (cada imagen en escala de grises corresponde a una imagen en escala de grises en cada uno de los respectivos canales rojo, verde y azul (RGB)), pueden aplicarse las tecnicas de separacion de cromogenos, las cuales permiten que la densidad optica de cada especie molecular (revelada por su cromogeno o colorante asociado), sea evaluada en cualquier localizacion de la imagen (pixel). En la muestra biologica, los marcadores y las tinciones de contraste generalmente indican los colorantes a ser detectados y cuantificados.

Segun una tercera tecnica derivada (por ejemplo, utilizando una camara multiespectral JUMBOSCAN de Lumiere Technology), pueden capturarse y obtenerse simultaneamente hasta 13 imagenes en escala de grises de la muestra. Este tipo de camara/escaner podrfa aumentar el potencial de las tecnicas de separacion de cromogenos en el futuro aumentando el numero de colorantes que pueden ser disueltos simultaneamente para una muestra determinada.

A pesar de todo, la concentracion de la especie molecular puede determinarse a partir de una imagen en color de la muestra, donde la imagen de color incluye 3 o mas canales. En un sistema de video-microscopfa equipado con una camara 3CCD, la imagen debe ser balanceada y normalizada de acuerdo a una imagen de un campo vacfo de referencia en blanco y una imagen en negro, y a continuacion corregida en cuanto al sombreado. Ademas, la imagen debe, de forma deseable, corregirse espacialmente para evitar las aberraciones cromaticas, canal por canal. Entonces puede calcularse una densidad optica de la muestra en cada uno de los canales rojo, verde y azul de la imagen en RGB, en un pixel en particular en la imagen, a partir de la luz transmitida medida. Se forma a partir de entonces un vector de densidad optica correspondiente para ese pixel. El vector de densidad optica se multiplica a continuacion por la inversa de una matriz del coeficiente de absorcion relativa de los colorantes presentes en la

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

muestra para formar un vector resultante para el pixel, representando las contribuciones de densidad optica de cada colorante. La matriz del coeficiente de absorcion relativa comprende un coeficiente de absorcion relativa para cada uno de los colorantes (marcador o marcadores) y coloracion o coloraciones de contraste utilizadas en el protocolo de preparacion de la muestra, en cada uno de los canales rojo, verde y azul. El vector resultante comprende de ese modo la concentracion de la especie molecular, segun se indica por el marcador o marcadores, y por la coloracion o coloraciones de contraste, para ese pixel.

Dichas tecnicas de toma de imagenes, tambien conocidas como tecnicas de toma de imagenes multiespectrales, cuando se adaptan a las imagenes en color (camaras RGB), permiten un procesamiento en tiempo real (velocidad de video) de la muestra (habitualmente 40 milisegundos por fotograma), lo que proporciona una considerable ventaja. En efecto, por razones de velocidad y procesamiento en tiempo real, o con propositos de visualizacion en caso de la utilizacion de una camara RGB, la adquisicion a traves de diferentes canales se lleva a en paralelo y pueden generarse tablas de busqueda (LUT, por sus siglas en ingles) que asignan los valores de entrada de color RGB a concentraciones y/o factor de transmision pre-calculados de cada uno de los colorantes participates.

Dichas tecnicas se tratan en mas detalle, por ejemplo, en los Nos. de publicacion de Solicitud de Patente de EE.UU. 2003/0091221A1 (Metodo para video-microscopia cuantitativa y sistema y producto de programa de software asociados) y US 2003/0138140A1 (Metodo para video-microscopia cuantitativa y sistema y producto de programa de software asociados), ambas de Marcelpoil et al. y cedidas a Tripath Imaging, Inc, tambien el cesionario de la presente invencion, el contenido de las cuales se incorporan en la presente memoria en su totalidad a modo de referencia.

La ley de Lambert-Beer

La plataforma de toma de imagenes microscopicas esta configurada para analizar la muestra de acuerdo con la ley de Lambert-Beer. La ley de Lambert-Beer describe generalmente una proporcionalidad que se puede observar entre la concentracion de moleculas en una solucion (la concentracion de la “especie molecular” o la “muestra”) y la intensidad de la luz medida a traves de la solucion. La ley de Lambert-Beer se expresa habitualmente como:

OD = elC (I)

OD (por sus siglas en ingles) es la densidad optica de la solucion, £ es la constante de proporcionalidad denominada extincion molar o coeficiente de absorcion, I es el espesor de la muestra, y C es la concentracion de la especie molecular. El coeficiente de absorcion £ es especffico a la especie molecular y se expresa habitualmente en unidades de Lmol'1cm'1.

Esta relacion de proporcionalidad definida por la ley de Lambert-Beer ha sido verificada bajo diversas condiciones que incluyen, por ejemplo, luz monocromatica que ilumina la muestra, una baja concentracion molecular dentro de la muestra, en general nula fluorescencia o heterogeneidad en la respuesta a la luz (fluorescencia y difusion no significativas) de la muestra, y carencia de fotosensibilidad qufmica de la muestra. La ley de Lambert-Beer puede presentar requerimientos adicionales, sin embargo, tales como, por ejemplo, una correcta iluminacion de Koehler de la muestra bajo el microscopio.

La iluminacion de Koehler se ofrece en practicamente todos los microscopios del estado del arte, y proporciona una iluminacion uniforme en el plano de la imagen, a la vez que permite un control efectivo del contraste. La iluminacion de Koehler es habitualmente de vital importancia para un analisis de la densitometrfa. Una correcta iluminacion de Koehler se consigue, por ejemplo, mediante un sistema de iluminacion de dos diafragmas para el microscopio en el que la fuente se proyecta en la abertura del condensador subplatina por parte de un condensador auxiliar. El condensador subplatina, a su vez, forma una imagen del condensador auxiliar sobre el objeto. Tambien puede colocarse un diafragma iris en cada condensador, en donde el primer iris controla el area del objeto a ser iluminado, y el segundo iris varfa la apertura numerica del haz de iluminacion.

La ley de Lambert-Beer presenta una propiedad aditiva de tal manera que, si la muestra comprende diversas especies moleculares absorbentes de luz, por ejemplo, s1, y s2, con una respectiva concentracion C1 y C2, la OD de una muestra de espesor I (en solucion, 1 = I2 = l) puede expresarse como:

OD = el • 11 - Cl + e2 ■ 12 • C2 (2)

Esta situacion puede ocurrir, por ejemplo, en analisis biologicos donde una “escena” o campo de vision de la muestra se ha tenido con dos colorantes que consisten en un colorante marcador para establecer como diana la especie molecular de interes y un colorante de contraste para tenir el resto de la muestra.

5

10

15

20

25

30

35

40

Correccion de la aberracion cromatica

Para medir de forma precisa la concentracion de especies determinadas en imagen bajo un microscopio, las mediciones de las densidades opticas realizadas a diferentes longitudes de onda deben corresponder a la misma porcion de la muestra. Es decir, el sistema puede corregirse ffsicamente para corregir la aberracion cromatica o, de otro modo, la correccion puede realizarse mediante otra metodologfa, tal como mediante un software.

El poder de dispersion natural del cristal causa que una lente simple enfoque la luz azul a menor distancia que la luz roja. Es decir, una lente simple presenta diferentes longitudes focales para luz de diferente longitud de onda (diferentes colores). Dos fenomenos tienen lugar como consecuencia directa de ello:

1) la diferencia en la posicion a lo largo del eje vertical de los puntos focales para luz de diferente longitud de onda se denomina aberracion cromatica longitudinal. Es decir, cuando se enfoca la imagen para un determinado color (verde, por ejemplo), las imagenes que corresponden a los otros colores tienden a estar ligeramente desenfocadas (el azul y el rojo, en este ejemplo, apareceran desenfocados).

2) La diferencia en el aumento (longitud focal) para la luz de diferentes longitudes de onda se denomina aberracion cromatica lateral. Es decir, la imagen de una longitud de onda azul (pequena) aparecera mayor que la imagen de una longitud de onda roja (grande).

En sistemas con objetivos de alta calidad (objetivos apocromaticos), la aberracion cromatica esta corregida. Si la aberracion cromatica no esta bien corregida de otro modo estructuralmente, puede implementarse un metodo basado en un software para corregir la aberracion cromatica lateral de la siguiente forma:

1) Determinar la coordenada del centro del objetivo en comparacion con el centro del chip de la camara;

2) Evaluar el factor de aumento observado para cada longitud de onda en comparacion con una longitud de onda elegida arbitraria (habitualmente la longitud de onda central, es decir, la verde si se utiliza una camara RGB); y

3) Volver a muestrear cada imagen de acuerdo con su aumento relativo y la coordenada del centro del objetivo.

Realizar la separacion de cromogenos

Una vez que el microscopio se ha configurado en el modo de iluminacion Koehler para la adquisicion de imagenes, y de que se haya abordado cualquier aberracion cromatica o utilizado objetivos apocromaticos, puede utilizarse la propiedad aditiva de la ley de Lambert-Beer para realizar la separacion de cromogenos utilizando ecuaciones algebraicas lineales.

Mas concretamente, la propiedad aditiva de la ley de Lambert-Beer puede tambien extenderse a una situacion en la cual la escena se analiza en un entorno de imagen en color, tal como, por ejemplo, una escena generada por una camara RGB con canales rojo, verde y azul separados. En dicho ejemplo, el colorante marcador (o “colorante 1”) mostrana coeficientes de absorcion £ir, £ig, y £ib, respectivamente. Ha de senalarse que el analisis de la imagen de cada uno de los canales, rojo, verde, y azul comprende esencialmente analizar una representacion en rojo de la imagen a traves del espectro rojo, una representacion verde de la imagen a traves del espectro verde, y una representacion azul de la imagen a traves del espectro azul. Por consiguiente, el colorante de contraste (o “colorante 2”) mostrana los coeficientes de absorcion £2r, £2g, y £2b, en el canal rojo, verde y azul respectivamente. Por lo tanto, de acuerdo con la propiedad aditiva de la ley de Lambert-Beer, el analisis de la muestra en el entorno RGB conducirfa al sistema de tres ecuaciones para determinar la densidad optica de la misma:

ODr — 6 Jr • li • Cl + €jr h ' Cj

(3)

ODg ~ t/g ' 1/ • Cj + t-2% • lj • Cj

(4)

ODff ~ £/& • // ■ Cj + t2b ■ h ■ C2

(5)

donde ODr, Odg, y ODb representan las densidades opticas de la muestra medida en el canal rojo, verde y azul respectivamente. Aun mas, en el caso de un aumento en la complejidad de la preparacion de la muestra tal como, por ejemplo, el tratamiento de la muestra con tres colorantes diferentes, las ecuaciones (3), (4), y (5) pasan a ser:

5

10

15

20

25

30

35

ODr - £jr • h • Cj + ■ h • C? + • /j ■ Cj

GDf “ ■ 1/ ■ Cj + 62g ’lj‘ C] + • /j • Cj (7j

■ 11 ■ Cj + ' 6 ‘ Cj + Cji • /j ' Cj fSS^

En dicha situacion, los tres colorantes pueden comprender, por ejemplo, un colorante marcador y dos colorantes de contraste, o dos colorantes marcadores y un colorante de contraste, o incluso tres colorantes marcadores diferentes. Esta propiedad de la ley de Lambert-Beer puede extenderse para incluir una pluralidad incluso mayor de combinaciones de colorantes. Sin embargo, el procedimiento de separacion de cromogenos descrito en la presente patente se centra en hacer uso de un dispositivo de captura rapida de imagenes en color con 3 canales, tal como por ejemplo una camara 3CCD - RGB, para toma de imagenes multiespectrales de marcadores biologicos. Por lo tanto, debido a los 3 canales de informacion distintos (R, G, B) solamente pueden utilizarse tres ecuaciones en una localizacion.

A la hora de aplicar la ley de Lambert-Beer a un sistema de microscopfa digital, resulta diffcil y complejo, impreciso, o algunas veces imposible medir el espesor I de la muestra. Consecuentemente, la concentracion C de la especie molecular puede extenderse y examinarse como el producto de I y C (l ■ C), y los resultados tratarse en consecuencia. Por ejemplo, cuando la concentracion de un colorante se compara con la concentracion de otro colorante en una muestra en particular, el termino del espesor de la muestra sera comun a ambas concentraciones y por tanto se vuelve menos importante determinar el espesor de la muestra como un valor absoluto y preciso. Por lo tanto, ha de entenderse que habitualmente no se requiere una determinacion precisa del espesor, sino que se supone constante y por lo tanto poco significativo en el analisis divulgado en la presente memoria.

La aplicacion de la ley de Lambert-Beer a un sistema de microscopfa digital tambien reconoce que la ley de Lambert-Beer puede expresarse como:

ODfcy) - log Io(x,y) - log I fay)

(9)

para una imagen digital de la muestra, donde (x, y) representa un pixel en particular de la imagen, OD(x,y) es la densidad optica de la muestra en ese pixel, I(x,y) es la intensidad de la luz o la transmitancia medida de la muestra en ese pixel, y Io(x,y) es la intensidad de la luz de la fuente de luz segun se mide sin la muestra absorbente de luz. Por consiguiente:

imagen1

donde IOD es la densidad optica integrada de la imagen digital de la muestra, y N es el numero de pfxeles en la superficie de la imagen de la muestra. Puede considerarse de forma apropiada una constante de proporcionalidad cuando se realizan comparaciones relativas en intensidades de luz. Ademas, en microscopfa cuantitativa, segun la ley de Lambert-Beer, se conserva la relacion de proporcionalidad entre la densidad optica OD de la muestra y las concentraciones de colorante.

[0046] Por lo tanto, para una muestra preparada examinada mediante el sistema de microscopfa digital, la relacion apropiada se expresa como:

In lo-In I = In Iq/I = OD = € - / • C (11)

Donde, por ejemplo, se utiliza una camara RGB de 8 bits en el sistema, la intensidad de luz transmitida a traves de la muestra sera expresada como 28 (=256) valores entre 0 y 255. Por ejemplo, la intensidad inicial Io de la fuente de luz, que corresponde al 100% de transmitancia, sera expresada como valores cercanos a 255 (que representa el valor mas brillante posible) en cada canal rojo, verde y azul. De hecho, el operador ajusta el capturador de fotogramas de la camara / la fuente de luz de manera que una luz “blanca” pura en ausencia de la muestra, correspondiente al 100% de transmitancia, presente un valor de intensidad cercano a 255 en cada uno de los canales, rojo, verde y azul, mientras que en ausencia de luz, correspondiente a un 0% de transmitancia, la “imagen

5

10

15

20

25

30

en negro” tendra un valor de intensidad cercano a 0 en cada uno de los canales, rojo, verde y azul. En cualquier pixel, el 100% de transmitancia, I0, se expresa por lo tanto como la diferencia entre el valor medido por la camara en presencia de la fuente de luz, menos el valor medido por la camara en ausencia de la fuente de luz, para cada uno de los canales, rojo, verde y azul. Debido a que la intensidad de la fuente de luz puede variar espacialmente a lo largo del campo de vision medido, y debido a que la optica puede absorber luz de forma heterogenea, el 100% de transmitancia puede corresponder a diferentes rangos dinamicos a lo largo del campo de vision medido. La OD de la muestra se expresa (11) como el logaritmo de la relacion de la transmitancia en ausencia de la muestra (I0), y la transmitancia en presencia de la muestra (I), y es por lo tanto en gran medida espacialmente independiente de las pequenas variaciones en el rango dinamico real medido al 100% de transmitancia.

Debido a que la intensidad de la fuente de luz permanece sustancialmente constante en el tiempo, o puede ser facilmente re-evaluada, la lectura de la intensidad de la luz en cualquier pixel puede, por lo tanto, traducirse a una medida de la transmitancia relativa en la localizacion del pixel para cada uno de los canales, rojo, verde y azul. Una vez que se conoce la Io y la I, puede calcularse la correspondiente OD.

Cualquier localizacion en el campo de vision donde este presente un unico colorante (el unico material absorbente) permite que los coeficientes de extincion relativos del colorante sean medidos para los diferentes canales RGB. Debido a que en la ecuacion (1), lC es igual para cada uno de los canales RGB en una localizacion determinada, si se conocen tanto I como C en esta localizacion en particular, el coeficiente de extincion exacto puede calcularse como OD/ (lC). El coeficiente de absorcion £ en cada uno de los canales, rojo, verde y azul puede por tanto extraerse consecuentemente como:

(t= ODr / (l'C) = (lnflo/l,)) / (l'C) (12)

eg = ODg / 0'C) = (ln(Iog/Ig)) / (l'C) (13)

eb = ODb/(lC) = (In(Wlb))/(lC) (14)

Desafortunadamente, (lC) no se conoce habitualmente y por lo tanto, los coeficientes de extincion £ se calculan de forma arbitraria, como la relacion de la OD medida en el pixel determinado en el canal considerado y la OD maxima medida en esta localizacion para cualquiera de los canales RGB (la determinacion del coeficiente de absorcion £ en cada uno de los canales, rojo, verde y azul en ausencia de un conocimiento a priori con referencia a (lC) es una cuestion de manipulacion de la ecuacion lineal para lograr una solucion relativa cuando I y C se ajustan de forma arbitraria a 1), en donde:

er = ODr /1 =ODr = ln(I„A)

f g = ODg / 1 = ODg = ln(log/Ig)

fb = ODb/l = ODb = ln(Iob/Ib)

(13)

(14)

(15)

Consecuentemente, si la concentracion absoluta del colorante sigue siendo desconocida, es aun posible calcular de forma arbitraria (o relativa) las concentraciones de colorante en cualquier pixel, con un factor de error absoluto conocido igual a (lC).

Debido a que el valor I es unico en una determinada localizacion del pixel y puede ser ajustado de forma arbitraria a 1, las ecuaciones 6, 7, y 8 pueden re-escribirse como sigue a continuacion, donde C1, C2 y C3 se relacionan con l.

ODr = £/r ■ Cj + (2r ■ Cj + £jr ■ Cj (16)

ODg - £Jg ■ Cl + €2g ■ C2 + £sg ‘ C3 (17)

ODb — *Ib ■ Cl + (2b ■ C2 + (Jb • Cj (18)

5

10

15

20

25

30

35

40

Cuando todos los coeficientes de extincion han sido evaluados para los diferentes colorantes, y las densidades opticas se conocen a partir de la lectura de los datos de imagenes, resolver estas ecuaciones para extraer Ci, C2 y C3 solo implica resolver un conjunto de ecuaciones lineales.

Solucion de ecuaciones algebraicas lineales / Matrices

Un conjunto de ecuaciones algebraicas lineales se presenta, por ejemplo, como:

aii*i + a,2X2 + 013*3 + ... + Q\nXn = b\ 021*1 "*■ 022*2 + 023*3 + . • • + 02 N*N = bj 03|Xi + 032*2 + 033*3 + ... + 03A*tf = bz

0AfI*l +0Af2*2 +0Af3*3 + • • • + dMI^N ~ bf4

Aquf las N incognitas xj, j = 1, 2, ..., N estan relacionadas por M ecuaciones. Los coeficientes aj con i = 1, 2, ..., My j = 1, 2, ..., N son numeros conocidos, al igual que las cantidades de la derecha b, i =1, 2, ..., M.

Si M < N, hay efectivamente menos ecuaciones que incognitas. En este caso puede no haber solucion, o bien mas de un vector x de solucion.

Si N = M entonces hay tantas ecuaciones como incognitas, y existe una buena oportunidad de resolver un conjunto de Xj’s de una solucion unica.

Si M >N de tal manera que hay mas ecuaciones que incognitas, y no hay, en general, un vector x de solucion a la ecuacion (1), se dice que el conjunto de ecuaciones esta sobredeterminado. En tal caso, se considerara la solucion mas apropiada, en general, la que mejor se ajuste a todas las ecuaciones (es decir, la solucion que minimice la suma de los errores de construccion).

La ecuacion (19) puede por tanto expresarse de forma matricial como

A x = b (20)

Aquf (') indica multiplicacion de la matriz, A es la matriz de coeficientes y b es el lado derecho expresado como un vector de columna. Por convencion, el primer fndice en un elemento a-j indica su fila; el segundo fndice su columna. a. o a[i] indica una fila completa a[i][j], j=1, ..., N.

La solucion de la ecuacion matricial Ax = b para un vector x desconocido, donde A es una matriz cuadrada de coeficientes, y b es un vector del lado derecho conocido, requiere habitualmente la determinacion de A-1 que es la inversa de la matriz, de la matriz A.

x = A'1 ‘ b (21)

A-1 que es la inversa de la matriz, de la matriz A, es decir, AA"1 = A-1A = 1, donde 1 es la matriz de identidad. En un caso en particular, se establecen las condiciones experimentales de manera que haya mas ecuaciones (o un numero igual) que incognitas, M>N. Cuando ocurre M>N, no hay, en general, un vector x de solucion a la ecuacion (19), y se dice que el conjunto de ecuaciones esta sobredeterminado. De forma frecuente, sin embargo, la mejor solucion “de compromiso” es una que se acerque al maximo a satisfacer todas las ecuaciones de forma simultanea. Si la cercanfa se define en el sentido de los mfnimos cuadrados (es decir, que la suma de los cuadrados de las diferencias entre el lado izquierdo y el derecho de la ecuacion (19) se minimiza), entonces el problema lineal sobredeterminado se reduce a un problema lineal (habitualmente) que puede resolverse, tambien denominado como problema lineal de los mfnimos cuadrados, que pueden resolverse utilizando descomposicion de valor singular (SVD, por sus siglas en ingles). La SVD implica la modelizacion parametrica de datos, y es un metodo para resolver la mayorfa de los problemas de los mfnimos cuadrados lineales. (NUMERICAL RECIPES IN C: THE ART OF SCIENTIFIC COMPUTING (ISBN 0-521-43108-5) Copyright (C) 1988-1992 de Cambridge University Press. Copyright de los Programas (C) 1988-1992 de Numerical Recipes Software.).

A la hora de aplicar estos conceptos al presente caso, la determinacion de la matriz del coeficiente de absorcion £ para diferentes colorantes puede realizarse independientemente de la evaluacion de la muestra y almacenarse para

5

10

15

20

25

30

35

su aplicacion adicional a las muestras tratadas con al menos uno de los respectivos colorantes. Calcular soluciones para todos los valores de pfxeles posibles permite un procesamiento sustancialmente en tiempo real. Debido a que en el ejemplo elegido de un dispositivo de adquisicion de imagenes en color 3CCD de 8 bits, la intensidad de la luz I medida de una muestra se situa en un rango entre los lfmites de 0 y 255 en cada uno de los canales, rojo, verde y azul, todos los valores posibles de gris (con respecto a la intensidad de luz original Io) pueden ser pre-calculadas (2563 en caso de un sistema RGB de 8 bits) y almacenados, por ejemplo, en el ordenador. Por tanto, para una muestra tenida con un colorante en particular, la intensidad de luz transmitida I(o la densidad optica OD) puede ser medida en un pixel en cada uno de los canales, rojo, verde o azul y a continuacion comparada con los valores de gris previamente almacenados y la matriz del coeficiente de absorcion £ para ese colorante en particular para asf determinar la concentracion de colorante C (o un estimado de la misma como el producto IC) en ese pixel. A este respecto, existen [256(rojo) x 256(verde) x 256(azul)] = 2563 soluciones para calcular, dando lugar a una tabla de busqueda (LUT) de 16 megabytes (datos en bruto) para cada uno de los colorantes. Las resoluciones del valor de gris que exceden los 8 bits por canal conduciran a mayores LUT (por ejemplo, >1 gigabyte si 10 bits por canal).

Tenido electronico

De acuerdo con un aspecto de la presente invencion, pueden generarse los valores de transmitancia de las escalas de grises o RGB de una imagen artificial que se obtienen como resultado de cualquier combinacion de los colorantes examinados anteriormente, ya que no hay mas variables desconocidas. Como tales, para un pixel en particular y sus concentraciones de colorantes disueltos, las imagenes de un unico colorante corresponderfan a las siguientes intensidades de pfxeles en blanco y negro (BW) o RGB:

ODbw-C y ODr = tT'C ODg — (g ’ C ODb — f b ■ C

Ibw- Exp( ln(I„) - ODbw)

(22)

lr=Exp(ln(10)-ODr)

(23)

lg= Exp( ln(Io) - ODs)

(24)

It = Exp( ln(I„) - ODb)

(25)

Cuando este proceso se aplica a cada pixel de una imagen capturada, puede generarse una imagen artificial del mismo campo de vision utilizando unicamente la respectiva contribucion de cualquiera de los colorantes constituyentes. Como tal, si los coeficientes de extincion de un colorante se intercambian con los coeficientes de extincion de otro colorante, es posible simular como se verfa la misma imagen artificial correspondiente a un marcador determinado unicamente, a traves de un microscopio si el colorante utilizado para revelar este marcador se cambiara a un colorante secundario.

Ademas, utilizando la propiedad aditiva de la ley de Lambert-Beer law, tambien es posible, tal como se muestra en la FIG. 1, generar una imagen artificial donde las contribuciones relativas de cada colorante se cambian, por ejemplo, utilizando coeficientes de peso absoluto o coeficientes de peso relativo (ver la ecuacion 26-28 para una imagen tenida electronicamente (abreviado en ingles “e-stained”) con dos colorantes, donde la imagen RGB se reconstruye despues de cambiar las proporciones del Colorante 1 y del Colorante 2 por los factores de ponderacion W1 y W2.

ODr = >V1 . 6/r * Cj + W2 . 'Cl y I,= Exp( ln(Io) - ODr) ODg ~ Wi. f/g * Cl + Wj . €ig • Cl y If= Exp( Ln(l0>- ODg) ODb = Wi. £;b * Cj + Yfz. 6ib ' c3 y Ift = Exp( lnflc)- ODb)

(26)

(27)

(28)

Mas en particular, la FIG. 1 ilustra un ejemplo de receptor estrogenos (ER) en el que una serie de imagenes de la misma celula (la imagen original a una determinada transmitancia de aproximadamente un 32%, se muestra rodeada en rojo), en el que la cantidad de un marcador (DAB marron) se cambia electronicamente (artificialmente), despues de la separacion de cromogenos, desde aproximadamente un 22% de transmitancia a aproximadamente un 40% de transmitancia, sin cambiar el contenido de hematoxilina. De esta manera, puede determinarse un contraste optimo entre componentes sub-celulares a partir de imagenes artificiales, ademas de la cantidad necesaria de colorante

5

10

15

20

25

30

35

40

para proporcionar el valor de transmitancia correspondiente al contraste optimo entre componentes sub-celulares no diana y diana especfficos del marcador.

Estrategia de medicion

De acuerdo con otro aspecto de la presente invencion, una estrategia de medicion puede estar basada en y puede hacer uso de la o las tecnicas de separacion de cromogenos descritas anteriormente en muchos aspectos, desde permitir que se mida especfficamente unicamente el marcador de interes, hasta las habilidades de tenido electronico que permiten que se generen imagenes contrastadas optimizadas por la segmentacion.

Obtener resultados de medicion de la imagen adquirida incluye diversas etapas: 1) seleccionar la region de interes (region tumoral); 2) segmentacion para identificar los objetos de interes en la imagen; y 3) extraccion de caracterfsticas para calcular las diversas caracterfsticas de medicion para los objetos identificados y efectuar puntuaciones celulares en base a, por ejemplo, la localizacion de su marcador y la relacion senal - ruido.

1) Pre-seleccion de la region de interes

Para reducir la carga de trabajo para el patologo, se desarrollo una metodologfa de pre-seleccion para delinear automaticamente la region de interes potencial dentro del campo de vision que sera la region utilizada para el analisis, en donde cualquier parte excluida queda, por tanto, excluida del analisis. Dicha metodologfa de pre- seleccion generalmente requiere dos factores a priori:

• la region de interes esta contrastada positivamente con respecto al area circundante cuando se mira a la imagen de solo el marcador.

• el cancer establece como diana las celulas epiteliales las cuales difieren de las celulas de estroma en, por ejemplo, un nucleo mayor y una mayor densidad celular.

Consecuentemente, puede aplicarse un filtro paso bajo de gran magnitud a la imagen de solo marcador que se obtiene como resultado de la o las tecnicas de separacion de cromogenos aplicadas al campo de vision RGB. Se mide el histograma de solo marcador (evitando las regiones de fondo que se basan en la imagen de luminancia), y a continuacion la imagen es binarizada de acuerdo al mejor umbral en el histograma que podrfa distinguir dos clases (regiones negativas y positivas). Cualquier hueco pequeno se rellena para suavizar la mascara final. La mascara se representa en la parte superior de la imagen del campo de vision RGB original para permitir la aceptacion/rechazo del patologo, tal como se muestra en las FIGS. 2A y 2B. Mas particularmente, la FIG. 2A ilustra un ejemplo de PSMB9 y la FIG. 2B ilustra un ejemplo de HER2 de definicion automatica de la region de interes de acuerdo con una realizacion de la metodologfa de pre-seleccion divulgada en la presente patente. La region de interes se calcula automaticamente o se determina de otro modo, y puede presentarse al patologo para su refinamiento y/o aprobacion final. Si el patologo rechaza la mascara propuesta, las herramientas de dibujo permiten al patologo seleccionar manualmente la region de interes apropiada.

2) Estrategia de segmentacion

La estrategia de segmentacion incluye los siguientes pasos:

• Determinacion del fondo

• Creacion de la imagen del componente celular

• Segmentacion de la membrana*

• Segmentacion del nucleo

• Segmentacion del citoplasma

• Refinamiento de la segmentacion

• Filtrado de objetos no deseados

* En el caso de los marcadores de la membrana, tales como Her2, se realiza un paso especlfico adicional de segmentacion de la membrana.

Se muestran diversos ejemplos de dicha segmentacion, por ejemplo, en las FIGS. 3A1-3A2 y 3B1-3B2, respectivamente. Mas particularmente, la FIG. 3A1 muestra un ejemplo de PSMB9 (marcador citoplasmatico) de definicion automatica de la region de interes, seguido de segmentacion sub-celular en la FIG. 3A2. Dentro de la region de interes, se han segmentado celulas definidas automaticamente, de tal manera que las mascaras del 5 nucleo aparecen en azul y los lfmites del citoplasma aparecen en rojo, mientras que los pfxeles del fondo se muestran en negro. La FIG. 3B1 ilustra un ejemplo de HER2 (marcador de membrana) de definicion automatica de la region de interes, seguido de segmentacion sub-celular en la FIG. 3B2. Se han segmentado celulas dentro de la region definida automaticamente, de tal manera que las mascaras del nucleo aparecen en azul y la membrana aparece en verde, mientras que los pfxeles del fondo se muestran en negro. Un experto en el arte apreciara, sin 10 embargo, que etapas o refinamientos adicionales del procesamiento de imagenes pueden, en algunos casos, ser necesarios para adaptar dichos algoritmos genericos a las especificidades del tejido o marcador.

2a) Determinacion del fondo

La primera etapa de segmentacion es dividir el contenido de la imagen en primer plano y fondo. Ya que la plataforma esta disenada para soportar microscopfa de campo claro, los objetos apareceran mas oscuros que el fondo claro. 15 Para crear una mascara de fondo para una imagen, la imagen se convierte en una imagen de luminancia y se calcula un nivel umbral del fondo. Se considera que cada pixel con un valor de luminancia por encima del nivel umbral del fondo, pertenece al fondo. De forma inversa, cualquier pixel con una luminancia menor que el umbral pertenece al primer plano, que ha de ser procesado adicionalmente en las siguientes etapas.

Determinar el valor umbral del fondo implica suavizar la imagen de luminancia y calcular el histograma de la imagen 20 igualada. El histograma se escanea a continuacion, comenzando en el extremo mas elevado, para determinar un mfnimo local a ser utilizado para el valor umbral. La busqueda se limita cuando se alcanza un 90% de transmision arbitraria, que se traduce, para el caso de imagenes de 8 bits, en el valor de 230.

2b) Creacion de imagenes de componentes celulares

En la siguiente etapa de segmentacion, las imagenes del componente celular para el nucleo y el citoplasma se crean 25 utilizando tecnicas de separacion de cromogenos descritas anteriormente. La separacion se inicia de acuerdo a la especificacion de la contribucion de la densidad optica de cada colorante al componente celular especffico. Aquellas imagenes de componentes se utilizan entonces como datos de entrada para las etapas posteriores de segmentacion del nucleo y citoplasma. Las imagenes del componente estan basadas en las habilidades de tenido electronico y generan imagenes que mejor contrastan con el compartimento celular diana de las regiones vecinas.

30 2c) Segmentacion de la membrana

La segmentacion de membrana se realiza utilizando las siguientes etapas:

• Encontrar el valor medio sobre la imagen total que no es fondo.

• Rellenar cualquier localizacion en la imagen con este valor medio, si el valor local es mas brillante.

• Encontrar la membrana generando la diferencia de imagen entre nucleos de convolucion de suavizado

35 grandes y pequenos.

• Binarizar la imagen de contraste resultante en base al contraste local medido.

• Extraer el esqueleto de las mascaras de la membrana candidata.

• Eliminar cualquier pieza del esqueleto menor que una longitud minima solicitada.

• Expandir el esqueleto de las mascaras de la membrana en un pixel en cualquier direccion y mantener

40 unicamente las mascaras de la membrana que caen bajo el esqueleto.

La segmentacion de la membrana se realiza en primer lugar para facilitar una segmentacion adicional del nucleo, ya que generalmente se espera que las membranas separen los nucleos entre si.

2d) Segmentacion del nucleo

Al principio del proceso de segmentacion del nucleo, tanto los valores de la media como de la mediana de la imagen 45 del componente del nucleo se calculan en consideracion con la mascara del fondo. El mayor de esos valores se utiliza para crear una mascara del nucleo inicial formando umbrales de la imagen del componente del nucleo con

5

10

15

20

25

30

35

40

45

este valor. Cualquier pixel con un valor mayor que este umbral se ajusta al valor umbral de manera que unicamente los pfxeles con un valor inferior permanezcan con su valor original en esta mascara del nucleo inicial. Si estan disponibles las mascaras de la membrana, se borra cualquier pixel potencial de la mascara del nucleo que caiga dentro de una mascara de la membrana.

Esta mascara del nucleo preliminar o inicial se somete a un filtro de paso bajo con un nucleo de 1,5 veces el tamano de nucleo previsto para preparar la mascara del nucleo inicial para un procedimiento de transformacion divisoria o de segmentacion. Los datos de salida del procedimiento de segmentacion divisoria se combinan con la mascara inicial del nucleo de manera que solamente los pfxeles de la mascara se ajustan donde la imagen divisoria presenta cuencas y la mascara del nucleo inicial presenta un valor de pixel por debajo del valor umbral. La mascara del nucleo resultante se finaliza a continuacion mediante una etapa de depuracion que incluye el relleno de huecos con un area menor de aproximadamente un quinto del tamano del nucleo previsto, y eliminar objetos que son mas pequenos de aproximadamente un cuarto del tamano previsto del nucleo.

2e) Segmentacion del citoplasma

El proceso de segmentacion del citoplasma utiliza un enfoque de dos vfas para crear la mascara del citoplasma. Ambas vfas utilizan la mascara del nucleo creada en la etapa previa como el punto de partida. Primero, la mascara del nucleo se invierte y se transforma en cuanto a la distancia. La primera mascara del citoplasma potencial se crea mediante binarizacion de los datos de salida de la transformada de la distancia de tal manera que todos los pfxeles dentro del tamano de celula previsto esten incluidos en la mascara resultante. Para formar la mascara solamente del primer plano, la primera mascara potencial del citoplasma resultante se combina entonces con la mascara del fondo. Para la segunda mascara potencial del citoplasma, la mascara del nucleo se invierte nuevamente y a continuacion se somete a transformacion divisoria. Tanto la primera como la segunda mascara potencial se combinan entonces para crear la mascara del citoplasma final.

2f) Refinamiento de la segmentacion

Una vez que las mascaras de segmentacion tanto del citoplasma como del nucleo han sido establecidas, esas mascaras se refinan adicionalmente utilizando el conocimiento de las mascaras combinadas. Comenzando con la mascara del citoplasma, cada objeto segmentado en la mascara del citoplasma se identifica y se asocia con una imagen etiquetada, en donde cada objeto es identificado por un unico valor de pixel. Debido a la transformacion divisoria en la segmentacion del citoplasma, los objetos etiquetados se separan entre sL Como tal, la imagen etiquetada es dilatada una vez para reconectar los objetos etiquetados.

La imagen etiquetada se utiliza a continuacion para refinar la mascara del nucleo. Es decir, cada objeto es binarizado utilizando un umbral individual. Para cada objeto etiquetado el proceso es como sigue a continuacion:

• Calcular el histograma para cada pixel que pertenece al objeto etiquetado y determinar el valor de pixel medio.

• Determinar un lfmite superior e inferior para la busqueda del umbral. El lfmite superior se determina integrando el histograma comenzando desde el lfmite superior hasta que se acumula un 20% del area del objeto. El lfmite inferior se determina de forma similar integrando el histograma desde el lfmite inferior hasta que tambien se acumula un 20% del tamano previsto del nucleo.

• Si el lfmite inferior es menor que el lfmite superior, el umbral se calcula aplicando el analisis discriminante de Fisher al rango de valores en el histograma entre los lfmites; de otro modo, el umbral es el valor medio de los lfmites superior e inferior.

• Redibujar el objeto en la mascara del nucleo binarizando la imagen del componente del nucleo utilizando el valor umbral que se acaba de determinar.

A continuacion, se rellenan los huecos en la mascara del nucleo con un area menor de aproximadamente un quinto del tamano previsto del nucleo. Para evitar una infra-segmentacion, se aplica a la mascara una transformada de distancia en primer lugar para dividir los nucleos potencialmente unidos.

Finalmente, la mascara del nucleo se limpia de artefactos eliminando todos los objetos menores de aproximadamente un tercio del tamano previsto del nucleo. Una vez que la mascara del nucleo refinada se determina, el procedimiento de segmentacion del citoplasma se repite y se obtiene como resultado una mascara del citoplasma refinada.

10

15

20

25

30

35

Para la segmentacion de Her2neu, se realiza la etapa adicional de la eliminacion de la membrana, que elimina cualquier mascara de la membrana situada dentro de aproximadamente 3 pfxeles de una mascara del nucleo, para facilitar la discriminacion de una membrana celular de una membrana del nucleo.

2g) Filtrado de las celulas no deseadas

La ultima etapa de procesamiento en el procedimiento de segmentacion implica el filtrado de celulas no deseadas. Para este procedimiento, se etiqueta cada objeto en la mascara del citoplasma refinada. Ademas, la imagen del FOV adquirida se separa por cromogenos en imagenes del colorante para el marcador y el colorante de contraste. Para cada objeto identificado, se determina un rectangulo de limitacion y, si el objeto se situa mas cerca que una determinada distancia a cualquier lfmite de la imagen, el objeto ya no se toma en cuenta y se descarta para evitar un procesamiento de las celulas que se extienden mas alla del lfmite de la imagen. Si la celula pasa este criterio, se calculan sus caracterfsticas de medicion clave, tales como densitometrfa, textura, forma, informacion contextual.

Los ejemplos adicionales (incompletos) incluyen:

• Area

• Perfmetro

• Centro de Gravedad (CoG)

• OD minima

• OD media

• OD maxima

Se calcula cada caracterfstica para el nucleo, el citoplasma, y/o la celula entera, ademas de para cada uno de entre la luminancia, colorante o colorantes marcadores y colorante o colorantes de contraste.

Utilizando la transmitancia media determinada a partir de la OD media, se aplica otro criterio de exito/fracaso a la celula. Es decir, si la transmitancia media de la celula es mayor que un valor umbral especificado en el ajuste de la segmentacion, la celula no se considera mas y se descarta.

3a) Puntuacion de las celulas

En base a las caracterfsticas evaluadas para cada celula, se puede atribuir una puntuacion a esa celula dependiendo de la intensidad del marcador y de la relacion senal - ruido de la misma en el compartimento diana. Una celula se considera positiva cuando el contenido del marcador de dicha celula en la densidad optica (intensidad) del compartimento diana especffico al marcador es significativamente mayor en los compartimentos vecinos. Por ejemplo, si el marcador es un marcador del nucleo, se calcula el contraste, o la relacion senal - ruido, para la medida de la densidad optica especffica del marcador en el nucleo contra la densidad optica residual medido en el citoplasma. Debido a que el ruido de fondo no es especffico por definicion, la densidad optica media general del fondo se mide por todo el compartimento del citoplasma de las celulas dentro de la region de interes seleccionada.

Marcador del nucleo:

SNR Celula = NucleoMOD / CitoplasmaMOD (28)

Para facilitar una correlacion optima con el “know-how” (experiencia) del patologo, el contraste requerido para designar una celula como positiva, puede adaptarse de fuerte a debil, ya que algunos patologos consideran unicamente los nucleos muy intensos como positivos, mientras que otros patologos consideran cualquier ligera coloracion positiva, como un positivo. Una determinacion positiva tan subjetiva basada en el nivel de contraste puede ademas verse afectada por la patologfa en particular que va a ser considerada.

Una celula es positiva para un marcador de nucleo si

NucleoMOD > CitoplasmaMOD + max [s, k(l- CitoplasmaMOD)] (29)

• Para los ER (receptores de estrogenos) se observo que £ =0,02 y k=0,11

• Para los PR (receptores de progesterona) se observo que £=0,02 y k=0,20

Por consiguiente, tal como se muestra en la FIG. 4, cualquier celula bajo la curva es negativa, y de lo contrario 5 positiva. Es decir, la FIG. 4 ilustra curvas de SNR y OD del nucleo que definen, para los ER y PR, el estatus negativo y positivo de una celula. Para tales marcadores del nucleo, se evalua la relacion senal - ruido (SNR) como una relacion de la OD del nucleo con respecto a la OD del marcador citoplasmatico. Si una celula cae por encima de la curva (esquina superior derecha), la celula se considera positiva, y de lo contrario negativa. Generalmente, cuanto mas fuerte es la intensidad del nucleo, menor debe ser la SNR para denominar la celula positiva (y vice-versa).

10 3b) Puntuacion global

Una puntuacion global puede ser atribuida a un caso que refleje, para ese caso, la informacion solicitada por el patologo para establecer si diagnostico / pronostico.

Puntuacion total = 100* # celulas positivas / # celulas en ROI (30)

En el caso de las pruebas de ER y/o PR, la puntuacion total solicitada por el patologo es el porcentaje de celulas 15 positivas dentro de la region tumoral. Por lo tanto, una vez que el patologo esta seguro de su diagnostico / pronostico de la region de interes propuesta (propuesta automaticamente o dibujada manualmente), se informa sobre el porcentaje de celulas puntuadas positivamente.

Concepto de integracion

Para investigar adicionalmente la contribucion de la OD de los diferentes colorantes cuando las concentraciones son 20 muy altas y se alcanzan limitaciones en cuanto a bits de la camara, puede implementarse una estrategia basada en la integracion del tiempo (velocidad de obturacion) de la camara. Es decir, el mismo campo de vision se visualiza con la misma camara, pero con diferentes tiempos de integracion. Tal como se muestra en las FIGS. 5A y 5B, la OD medida se normaliza con el tiempo de integracion y se mantienen los valores no saturados medidos correspondientes al tiempo de integracion maximo en cada canal. Mas particularmente, la FIG. 5A muestra una 25 celula en particular con una intensidad del marcador elevada que se captura como imagen utilizando diferentes tiempos de integracion (4000s-1 a 250s-1) para mejorar la resolucion de bits en las regiones mas oscuras. De acuerdo con una metodologfa de ese tipo, el pixelado de la imagen con separacion de cromogenos en el nucleo (solo hematoxilina), desaparece sustancialmente cuando se utiliza la resolucion de bits apropiada. La FIG. 5B muestra intensidades de luz transmitida RGB, ademas de valores de OD normalizados en el tiempo para un pixel 30 representativo capturado utilizando diferentes tiempos de integracion (4000s-1 to 250s-1) para mejorar la resolucion de bits en las regiones mas oscuras de la imagen que se muestra en la FIG. 5A. La mejora de la resolucion de bits se obtiene a partir de los valores de intensidad de luz transmitida RGB que se seleccionan en cada uno de los canales RGB para el tiempo de integracion, antes de la saturacion.

Romper el lfmite de 3D utilizando una entrada RGB: Separacion de cromogenos de 4D

35 Se proporciona un ejemplo de un procedimiento de este tipo para la separacion de cromogenos de 4D mediante una combinacion de 4 colorantes para un procedimiento de un PAP modificado, segun se muestra en las FIGS. 6A-6B, concretamente Hematoxilina (FIG. 6A), Eosina (FIG. 6B), Verde (FIG. 6C), y DAB (FIG. 6D). En este ejemplo, 3 canales (R, G, y B) comprenden los canales de entrada, con 4 incognitas (colorantes). En dicho ejemplo, puede utilizarse conocimiento a priori. Los colorantes se representan en un plano equivalente de Maxwell que incluye el 40 plano del coeficiente de extincion donde EcR+EcG+EcB=1. En este plano, un colorante es representado por una unica localizacion XY. En cada localizacion XY del plano, pueden presentarse diferentes tripletes RGB que muestran diferentes transmitancias (diferentes intensidades de un colorante determinado), en donde, en el presente ejemplo, se muestra un triplete RGB con la transmitancia mas cercana al 50% en la FIG. 7A. Mas particularmente, la FIG. 7A muestra diferentes tripletes RGB, tal como el triplete RGB mas cercano al 50% de transmitancia. Cada colorante se 45 proyecta en el plano Ec en base a sus coeficientes de extincion en los canales rojo, verde y azul del dispositivo de captura de la imagen (camara), donde cada colorante esta representado por su letra inicial.

Con respecto a la naturaleza de los respectivos colorantes, existen dos configuraciones aceptadas de 3 colorantes entre las 4 posibles configuraciones de los 3 colorantes, tal como se muestra en las FIGS. 7B1 y 7B2, respectivamente, en donde cada una de estas dos configuraciones de 3 colorantes se destacan mediante un

triangulo circundante. A partir de un conocimiento a priori, se sabe que es improbable que todos los 4 colorantes esten significativamente presentes en la misma localizacion geografica con respecto a la muestra. Por lo tanto, la separacion de cromogenos en este ejemplo considera unicamente configuraciones de 3 colorantes en las que los 3 colorantes podrfan situarse conjuntamente con respecto a la muestra. Mas particularmente, la Eosina y el Verde son 5 colorantes principalmente citoplasmaticos que tinen celulas con diferentes atributos citoplasmaticos. Consecuentemente, no es probable que estos colorantes esten presentes en la misma localizacion con respecto a la muestra incluso aunque, debido a la localizacion de la hematoxilina entre los colorantes Eosina y Verde en este plano de extincion, una mezcla de Eosina y Verde podrfa confundirse con Hematoxilina (pero es muy improbable que se confunda con DAB).

10 Por tanto, para resolver el problema de la configuracion de 4D, el procedimiento de separacion de cromogenos se aplica buscando cada triplete RGB de este FOV donde estarfa localizado, en la localizacion XY del mismo, el correspondiente colorante, en donde la localizacion XY es la localizacion en el plano del coeficiente de extincion donde EcR+EcG+EcB=1. En este plano, se determina y se utiliza la configuracion de 3D circundante, o la configuracion mas cercana a 3D por defecto, para resolver las ecuaciones para determinar la densidad optica de los 15 3 colorantes correspondientes, mientras que la densidad optica del colorante restante se ajusta a 0. Un experto en el

arte apreciara que la mayorfa de las localizaciones XY de los tripletes RGB investigados deberfan encontrarse dentro de una de las 2 configuraciones aceptadas de 3 colorantes. La FIG. 8A ilustra un campo de vision con todos los 4 colorantes representados (es decir, un campo de vision de un PAP usual modificado donde todos los 4 colorantes estan representados, en donde la celula central oscura es positiva en DAB, tal como se muestra en la 20 FIG. 8C). Las FIGS. 8B-8E ilustran el mismo campo para cada uno de los 4 colorantes.

Adaptacion ultra-rapida del escaner para buscar celulas positivas en (DAB) en un entorno de un PAP modificado

Los aspectos discutidos de la separacion de cromogenos de 4D y tenido electronico pueden, en algunos casos, combinarse para formar otro aspecto de la presente invencion. Mas particularmente, en continuacion con el ejemplo anterior dirigido al uso de DAB y Hematoxilina, puede implementarse un escaner que pueda leer portaobjetos de 25 PAP modificados (una solucion poco frecuente positiva en DAB), tal como se muestra en la FIG. 9A (una imagen RGB de un campo de vision original). A continuacion, en base a los procedimientos de separacion de cromogenos de 4D y tenido electronico, puede resolverse la situacion de 4 colorantes. Una vez resuelta, puede reconstruirse una imagen simulada utilizando un proceso de “tenido electronico” para incluir unicamente las contribuciones de DAB y Hematoxilina, tal como se muestra en la FIG. 9B. Ademas, los unicos canales de Hematoxilina y DAB podrfan ser 30 utilizados como datos de entrada para el escaner, de tal manera que el escaner estarfa configurado para capturar una imagen de “solamente Hematoxilina y DAB”, que producirfa una imagen sustancialmente igual a la que se muestra en la FIG. 9B. Ademas, una unica imagen de un PAP simulada podrfa reconstruirse utilizando solamente las contribuciones de Hematoxilina, Eosina y Verde, tal como se muestra en la FIG. 9C.

Consideracion de la distorsion RGB

35 Para adaptar y/o compensar la distorsion RGB debido a las variaciones de la trayectoria, electronica y/o coloracion

de la imagen, puede considerarse una modificacion de la separacion de cromogenos. Es decir, el material biologico visualizado tenido unicamente con un colorante demuestra que el modelo del coeficiente de extincion, que puede calcularse a partir de cada triplete RGB dentro de la fuente del FOV, varfa ligeramente alrededor de la medida media aceptada. Consecuentemente, cuando una mezcla de colorantes esta presente, podrfan aceptarse o resultar 40 aceptables de facto multiples soluciones de mezclas de colorantes. Diferentes fuentes de ruido podrfan ser responsables de dicha distorsion del RGB. Por ejemplo, adquirir la imagen con una camara CMOS en lugar de una camara 3CCD podrfa ser un factor.

Para compensar estas distorsiones, la solucion de contribucion respectiva del colorante para un triplete RGB determinado y un modelo de multiples colorantes determinado se calcula de una forma ligeramente diferente. Mas 45 particularmente, el triplete RGB bajo investigacion se considera el centro de una esfera en el espacio RGB con un

radio dado r. Todos los tripletes dentro de esta esfera se investigan para determinar sus soluciones de contribucion de colorante, y se calcula la media de las soluciones para cada colorante para todos los tripletes RGB que satisfacen el modelo de combinacion de colorantes. Si ningun triplete RGB pertenece al modelo de combinacion de colorantes, el triplete RGB dentro de la esfera mas cercano al modelo de combinacion de colorantes como el mejor candidato de 50 solucion potencial.

Procedimientos dinamicos

Tradicionalmente, todos los algoritmos o procedimientos computacionales utilizados en aplicaciones de microscopfa cuantitativa son implementados o construidos en el sistema por ingenieros de software. Como tal, cada version de software incluye generalmente un conjunto limitado de algoritmos, que no pueden cambiarse sin modificacion del 55 software ("actualizaciones del software ").

5

10

15

20

25

30

35

40

Por ejemplo, una aplicacion puede calcular el porcentaje de celulas positivas en un portaobjetos calculando la relacion del numero de celulas con una densidad optica media (MOD) de un colorante marcador en el nucleo mayor que un valor umbral con respecto al numero de celulas totales en el portaobjetos. En una aplicacion tradicional, el valor umbral puede ser configurable, pero la formula utilizada para calcular la relacion permanece fija; siempre comparara el numero de celulas sobre un umbral determinado con el numero de celulas totales. Incluso si un procedimiento o algoritmo permite que el valor umbral total varfe en base a otras caracterfsticas extrafdas, las formulas utilizadas para determinar el umbral siguen siendo fijas.

Por consiguiente, otro aspecto de la presente invencion comprende una metodologfa por la que los algoritmos o procedimientos estan configurados para ser dinamicos (es decir, producir resultados basados en formulas introducidas por un usuario). Es decir, en lugar de que los algoritmos o procedimientos esten codificados directamente en el software, el software puede evaluar las formulas a ser utilizadas en el periodo de ejecucion real del analisis. Mas particularmente, una aplicacion de microscopfa cuantitativa que implementa dichos algoritmos dinamicos, calcula en primer lugar o determina de otro modo un conjunto de caracterfsticas generales a diversos niveles, incluyendo a nivel del portaobjetos, a nivel de nucleo de una matriz tisular o TMA (por sus siglas en ingles), a nivel de campo, y a nivel celular. Dichas caracterfsticas generales pueden ser referenciadas, definiendo de ese modo diferentes “variables” que pueden combinarse de diversas formas unas con otras utilizando, por ejemplo, operaciones matematicas estandar, para formar caracterfsticas de un nivel mas elevado, o para definir funciones. Como tal, en el periodo de ejecucion del analisis, la aplicacion cargarfa la lista de caracterfsticas referenciadas y las formulas aplicables. Cuando se necesita una formula en el analisis, esa formula se evalua dinamicamente y las caracterfsticas referenciadas se utilizan para modificar la formula como sea necesario. Si una formula es recalculada con frecuencia, o es suficientemente compleja, dicha formula o parte de la misma puede ser pre-compilada para acelerar la ejecucion.

Dicho metodo permite de ese modo que el conjunto de algoritmos o procedimientos implementados por la aplicacion a ser actualizada, anadida o modificada de otro modo, en el campo, sin requerir ninguna modificacion externa al software. Como tal, la aplicacion proporciona flexibilidad a los usuarios, ya que puede crearse una nueva funcionalidad, segun sea necesario y/o se desee, sin requerir ningun desarrollo de software externo complejo. Tales funciones pueden, por ejemplo, generar puntuaciones numericas para los portaobjetos, nucleos, campos o celulas. Ademas, o de forma alternativa, tales funciones pueden proporcionar capacidad de filtrado. Como un ejemplo de aplicacion de tales funciones, un usuario puede definir una funcion que puede calcular un porcentaje positivo, segun se describe anteriormente, en donde las formulas dinamicas pueden tambien utilizarse para definir una funcion que permite una visualizacion para resaltar celulas, campos o nucleos “positivos”. Dichas formulas dinamicas pueden tambien utilizarse, por ejemplo, para definir rangos para valores normales previstos, o celdas designadas como '0', '1+', '2+', etc.

Diversas modificaciones y otras realizaciones de las invenciones expuestas en la presente memoria vendran a la mente del experto en el arte al que estas invenciones pertenecen, con el beneficio de los contenidos presentados en las descripciones anteriores y en los dibujos asociados. Por lo tanto, ha de entenderse que se preve que las invenciones y otras realizaciones esten incluidas en el alcance de las reivindicaciones adjuntas. Aunque se utilizan terminos especfficos en la presente memoria, estos se utilizan en sentido generico y descriptivo unicamente y no con propositos de limitacion.

Claims (1)

1. 10

   15

   20

   REIVINDICACIONES

   1. Metodo de separacion de cromogenos para una imagen de una muestra biologica tenida con cuatro colorantes obtenidos con un dispositivo de toma de imagenes de tres canales, donde el metodo comprende:

   definir, a partir de un conocimiento a priori, tres combinaciones de colorantes de tres de cuatro colorantes que estan situados espacialmente en la muestra biologica;

   obtener una imagen de una muestra tenida con cuatro colorantes con un dispositivo de toma de imagenes con un canal rojo, verde y azul, donde la imagen por lo tanto incluye una pluralidad de pixeles, cada uno de ellos con un triplete RGB correspondiente;

   proyectar los coeficientes de extincion de cada colorante, en cada uno de los canales rojo, verde y azul del dispositivo de toma de imagenes, en un plano de coeficiente de extincion incluido en un plano equivalente de Maxwell, donde el plano del coeficiente de extincion esta definido por los componentes del coeficiente de extincion Ecr, Ecg y Ecb, donde Ecr+Ecg+Ecb=1, de tal manera que las combinaciones de los tres colorantes conocidos a priori estan representados por un triangulo cuyos vertices corresponden a localizaciones en el plano del coeficiente de extincion de los respectivos tres de cuatro colorantes;

   proyectar cada triplete RGB en el plano del coeficiente de extincion para determinar una localizacion correspondiente en el plano del coeficiente de extincion y la correspondiente combinacion de tres colorantes de los tres de cuatro colorantes asociados con la misma, determinando que triangulo asociado con una combinacion de colorantes rodea la localizacion del triplete RGB o que triangulo asociado con una combinacion de colorante esta mas cercano a la localizacion del triplete RGB; y

   separar la imagen de la muestra determinando los pixeles en la imagen correspondientes a cada combinacion de tres colorantes previamente definida en el plano del coeficiente de extincion, y realizando la correspondiente separacion de cromogenos de tres colorantes para esos pixeles.