BRPI0610115A2

BRPI0610115A2 - métodos para a análise de imagem baseada em separação de cromógenos

Info

Publication number: BRPI0610115A2
Application number: BRPI0610115-1A
Authority: BR
Inventors: Rapha L Marcelpoil; Ryan Williams; Cedrick Orny
Original assignee: TriPath Imaging
Priority date: 2005-05-13
Filing date: 2006-05-12
Publication date: 2011-10-18
Also published as: WO2006124651A2; CA2607609C; EP1975875A3; JP2008539763A; EP1882237A2; CN101176116A; US9547801B2; US8492156B2; ES2617882T3; EP1978485A1; KR20080016847A; AU2006247575B2; US20100067774A1; CA2848233C; MX2007014016A; CA2848233A1; AU2006247575A1; US20100061618A1; JP2014110797A; EP1978486A1

Abstract

MéTODOS PARA A ANáLISE DE IMAGEM BASEADA EM SEPARAçãO DE CROMóGENOS. Métodos para separação de cromógenos com base em análise de imagem são proporcionados, com esses métodos sendo dirigidos para técnicas de videomicroscopia quantitativa em aplicações de patologia e biologia celular.

Description

MÉTODOS PARA A ANÁLISE DE IMAGEM BASEADA EM SEPARAÇÃO DE CROMÓGENOS

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção se refere a uma análise de imagem e, mais particularmente, a métodos para análise de imagem baseada em separação de cromógenos, relativos a técnicas de videomicroscopia quantitativa em aplicações de biologia celular e de patologia.

DESCRIÇÃO DA TÉCNICA RELACIONADA

A determinação e a análise de tecidos são domínio da patologia. Recentemente, os desenvolvimentos metodológicos e tecnológicos transformaram a análise de imagem digital em uma das ferramentas mais eficientes para auxílio a patologistas na interpretação de imagens com uma maior precisão. Ainda que essas técnicas de análises de imagens contribuam substancialmente para proporcionar aos citologistas com análises celulares objetivas e reprodutíveis, as técnicas de interpretação histológica tendem ainda a depender da análise subjetiva de espécimes. Essas técnicas de interpretação histológica também podem ser submetidas a um consenso entre um grupo de observadores ou entre grupos de observadores, que tendem ainda mais a proporcionar resultados menos precisos, menos reprodutiveis e menos objetivos. Por essas razões, a análise de imagem de tecidos foi inicialmente restrita a tecnologias desenvolvidas para a análise de espécimenes citológicos.

Com a evolução e disponibilidade de computadores de alto desempenho, comunicação local e de longa distância, soluções de bases de dados efetivas em custo, tecnologia de armazenamento aperfeiçoada e câmeras digitais e/ou escâners de alta resolução efetivos em custo, a situação está agora mudada. Algoritmos mais sofisticados, anteriormente ineficientes devido à falta de potência de CPU (unidade de processamento central) , não podiam ser antes aplicados a seções de tecidos em um meio físico de rotina. No entanto, esses algoritmos podem ser agora usados para determinar e quantificar aspectos específicos de tecidos relativos à quantificação do marcador e à localização subcelular. Ao mesmo tempo, um suporte mais compreensivo para uma determinação visual reprodutível e mais padronizada de seções de tecidos ficou disponível, com base na etapa inicial em análise de imagem, isto é, a criação e o controle de imagens digitais. Isso é especialmente verdade nos campos de controle de qualidade, garantia de qualidade e padronização. As imagens digitais de casos difíceis podem ser submetidas a patologistas de referência para obtenção de uma segunda opinião. Essas imagens também podem ser usadas efetivamente para teste de proficiência. As imagens digitais são também a sustentação de bases de dados de referência de imagens poderosas, que podem ser acessadas via rede, e desempenham um papel crescentemente importante na documentação de casos e resultados de avaliação, particularmente, em relatórios eletrônicos ou impressos compreensivos.

Uma vez que uma lâmina de tecido seja preparada, um patologista examina visualmente o espécimen de tecido sob um microscópio. Se e análise de imagem for conduzida com uma lâmina, o microscópio deve ser equipado com pelo menos uma câmera ou outro dispositivo de captura de imagem, que é ligado a um sistema computadorizado por meio de uma interface. A câmara amostra a imagem microscópica óptica da amostra de tecido por meio do microscópio. Por conseguinte, uma imagem digital é coletada na memória do computador e pode ser exibida no seu monitor. No entanto, a aquisição dessas imagens digitais deve ser feita de modo que detalhes importantes das imagens ópticas sejam ainda corretamente representados pelos dados armazenados. Geralmente, a etapa seguinte para uma determinação quantitativa das imagens digitalizadas é a segmentação, que inclui algumas vezes uma etapa intermediária adicional de pré-processamento. Durante a segmentação, as células são separadas entre si e do fundo da imagem. Em alguns casos, avanços em algoritmos possibilitaram a segmentação de células abaixo do nivel do componente subcelular (isto é, núcleo, citoplasma e membranas). Embora possa parecer uma tarefa fácil, a segmentação é freqüentemente uma etapa difícil e propensa a erro em análise de imagem. Para lâminas nas quais as células são bem separadas e manchadas, de modo que ocorram bons contrastes na imagem digitalizada, a segmentação pode ser feita muito confiavelmente em muitos casos. Assim que uma das condições mencionadas acima não seja preenchida, no entanto, algoritmos de segmentação intensos em tempo e altamente sofisticados, usando adicionalmente conhecimentos anteriores sobre as células e as suas relações entre si, ou sobre o marcador e a localização subcelular das manchas de contagem, precisam ser aplicados. Esse é o caso, por exemplo, em casos de seções de tecidos de tumores infiltrantes, nos quais a maior parte das células não está mais bem separada na lâmina, mas tende a ficar em contato e sobrepostas. Usando um algoritmo baseado em marcador, é possível circunscrever, automaticamente, a região de interesse, e os patologistas decidem, usando as suas próprias habilidades subjetivas, se a região apresentada é adequada ou necessita ser refinada manualmente. Uma vez que as áreas significativas de uma imagem são determinadas, a extração de aspectos ocorre. Para cada célula (e os seus componentes subcelulares) , um conjunto de aspectos densitométricos, morfométricos, de textura e contextuais podem ser medidos, com o objetivo de caracterizar as células individuais e as suas interações o mais compreensivamente possível.

A última etapa é a apresentação dos dados brutos e a compilação deles em resultados e/ou contagens significativos. A saída resultante de um sistema de análise de imagem devem ser adequados às formas dos sistemas de gradação visuais e/ou semiquantitativos já em uso pelo patologista, de modo a promover consistência, para que seja facilmente aplicáveis, ou que sejam capazes de ser interpretados em uso rotineiro.

A plataforma para a avaliação de amostras de tecido por meio de análise de imagem é o afastamento mais e mais dos analisadores de imagens multipropósito para "estações de trabalho de patologia" configuradas para trabalho rotineiro. Essas estações de trabalho combinam as ferramentas necessárias para proporcionar ao patologista as informações necessárias para derivar os melhores resultados possíveis. Central a tal estação de trabalho está o microscópio, possivelmente equipado com partes robóticas incluindo um estágio motorizado, um dispositivo de focalização automático, um alterador de objetiva, e um dispositivo de ajuste de intensidade de luz. Diferentes dispositivos de entrada, tais como câmeras capazes de rápidas focalização e aquisição automáticas de imagens de alta resolução, são ligados à estação de trabalho. A estação de trabalho pode ser parte de uma Rede de Área Local (LAN). A estação de trabalho pode também suportar diferentes protocolos de comunicação, de modo que canais de comunicação disponíveis podem ser usados para conectar a estação de trabalho com outros locais no mundo (Rede de Longa Distância ou WAN).

Quando integrado dentro de uma LAN e/ou WAN, a estação de trabalho pode ter acesso garantido às bases de dados de referência existentes e aos Sistemas de Informações de Hospitais (HIS) , de modo que quaisquer novos casos a serem examinados podem ser comparados com as imagens e informações relativas de casos de referência, que foram acumulados com o tempo. Além disso, as imagens adquiridas de lâminas sob revisão podem ser complementadas com a história do paciente e do caso.

A estação de trabalho de patologia é preferivelmente adequada para uma avaliação compreensiva do tecido. Partindo-se das informações e das imagens digitais da amostra de tecido inicial, as imagens das lâminas preparadas do tecido podem ser tomadas. As informações do paciente e do caso, as próprias imagens e quaisquer informações quantitativas sobre os componentes da amostra de tecido podem ser todas armazenadas na mesma base de dados.

Todas as informações acumuladas pela estação de trabalho para um caso, tais como imagens, resultados de medida e dados do paciente, podem ser selecionadas como sendo parte de um relatório, que pode ser impresso ou assinado eletronicamente pela rede. 0 relatório proporciona uma imagem compreensiva do caso sob avaliação e facilita a garantia de qualidade e a padronização.

Durante o pré-processamento / segmentação das imagens capturadas, muitas diferentes técnicas / algoritmos podem ser implementados para análise de imagem, particularmente para videomicroscopia quantitativa no campo de aplicações de patologia e biologia celular, por uso de formação de imagem de espectro múltiplo adaptada a câmaras coloridas (isto é, câmeras RGB 3CCD).

A análise efetiva de imagens microscópicas é essencial em biologia e patologia celular, particularmente para a detecção e quantificação em materiais genéticos (genes, RNA mensageiro) ou a expressão dessas informações genéticas na forma de proteínas, por exemplo, amplificação de genes, deleção de genes, mutação de genes, número de moléculas de RNA mensageiro ou análises de expressão de proteínas. A amplificação de genes é a presença de cópias em demasia do mesmo gene em uma célula, em que uma célula contém usualmente duas cópias, conhecidas de outro modo como alelos, do mesmo gene. A deleção de genes indica que menos de duas cópias de um gene podem ser encontradas em uma célula. A mutação de genes indica a presença de genes incompletos ou não funcionais. Os RNAs mensageiros (mRNAs) são moléculas de informações genéticas, sintetizadas de leitura de genes, que servem como modelos para síntese de proteínas. A expressão de proteínas é a produção de uma determinada proteína por uma célula. Se a codificação dos genes para essa proteína é supra-regulada ou cópias em demasia do gene ou mRNA estão presentes, a proteína pode ser superexpressa. Se o gene é regulado descendentemente ou deletado, o nível de expressão de proteína pode estar baixo ou ausente.

Os comportamentos celulares normais são controlados precisamente por mecanismos moleculares envolvendo um grande número de proteínas, mRNAs e genes. A amplificação de genes, a deleção de genes e a mutação de genes são conhecidas como tendo um papel proeminente em comportamentos celulares anormais por meio de expressão de proteínas anormais. A gama de comportamentos celulares preocupantes inclui comportamentos tão diversos como, por exemplo, regulação de proliferação ou diferenciação. Portanto, as detecção e quantificação efetivas em amplificação, deleção e mutação de genes, níveis de mRNAs ou análises de expressão de proteínas são necessárias, para facilitar as ferramentas úteis de pesquisa, diagnóstico e prognóstico.

Há várias técnicas laboratoriais dedicadas às detecção e quantificação em amplificação, deleção e mutação de genes, níveis de mRNAs ou análises de expressão de proteínas. Por exemplo, essas técnicas incluem as das manchas ocidental, do Norte e do Sul, reação em cadeia de polimerase ("PCR"), ensaio de imunosseparação ligado a enzima ("ELISA") e técnicas de hibridização genômica comparativa ("CGH"). No entanto, a microcospia é rotineiramente utilizada porque é uma técnica informativa, propiciando investigações rápidas nos níveis celular e subcelular, que pode ser implementada a um custo relativamente baixo.

Quando a microscopia é a técnica de laboratório selecionada, as amostras biológicas são submetidas, usualmente, primeiro a preparações de detecção e revelação específicas. Uma vez que as amostras são preparadas, um especialista humano analisa as amostras com um microscópio apenas ou com um microscópio acoplado a uma câmara e um computador, propiciando um estudo mais padronizado e quantitativo. O microscópio pode ser configurado para análise inteiramente automática, na qual o microscópio é automatizado com estágio e foco automatizados, trocadores de objetivas motorizados, controles de intensidade de luz automáticos e assemelhados.

A preparação das amostras para detecção pode envolver diferentes tipos de técnicas de preparação, que são adequadas para análise de formação de imagem microscópica, tais como, por exemplo, técnicas de preparação baseadas em imunomarcação e baseadas em hibridização. Essas técnicas de detecção podem ser acopladas com técnicas de revelação adequadas, tais como, por exemplo, técnicas baseadas em reação de cor visível e baseadas em fluorescência.

As Hibridização In Situ ("ISH") e Hibridização In Situ Fluorescente ("FISH") são técnicas de detecção e revelação usadas, por exemplo, para detecção e quantificação de análises de mutação e amplificação de informações genéticas. Ambas as ISH e FISH podem ser aplicadas a amostras histológicas ou citológicas. Essas técnicas usam sondas, complementares específicas para reconhecimento de seqüências precisas correspondentes. Dependendo da técnica usada, a sonda específica pode incluir um marcador químico (ISH) ou um marcador fluorescente (FISH) , em que as amostras são depois analisadas usando um microscópio de transmissão ou um microscópio de fluorescência, respectivamente. 0 uso de um marcador químico ou um marcador fluorescente depende do objetivo do usuário, cada tipo de marcador tendo vantagens correspondentes em relação ao outro em casos particulares.

No caso de análises de expressão de proteínas, por exemplo, outras técnicas de imuno-histoquímica ("IHC") e imunocitoquímica ("ICC") podem ser usadas. A de IHC é a aplicação de imunoquímica a seções de tecido, enquanto que a de ICC é a aplicação de imunoquímica a células cultivadas ou impressões de tecido, após serem submetidas a preparações citológicas, por exemplo, preparações de base liquida. A imunoquimica é uma família de técnicas baseadas no uso de anticorpo específico, em que os anticorpos são usados para alvejar especificamente as moléculas dentro ou na superfície das células. O anticorpo contém, tipicamente, um marcador que vai sofrer uma reação bioquímica e, desse modo, experimentar uma mudança de cor, ao encontrar as moléculas alvo. Em alguns casos, a amplificação de sinal pode ser integrada ao protocolo particular, em que um anticorpo secundário, que inclui a mancha do marcador, segue a aplicação de um anticorpo monoclonal específico primário.

Em ambos os estudos de hibridização e imunomarcação, cromógenos de diferentes cores são usados para distinguir os diferentes marcadores. Como esses marcadores podem ser específicos de compartimentos de células, esse conhecimento a priori pode ser usado para segmentar automaticamente as células (isto é, separa as máscaras dos núcleos das máscaras citoplásmicas e/ou das membranas. No total, algoritmos "colorimétricos" são objetivados para proporcionar informações das amostras, para facilitar a diagnose e/ou prognose do caso particular. Para ilustração, a detecção e a quantificação dos níveis de expressão de proteína ER, PR e HER2 da mama podem ser proporcionadas por uso de um algoritmo de microscopia quantitativa aplicado a técnicas imuno-histoquímicas (IHC).

À luz dessas técnicas de análise de imagens, no entanto, existe uma necessidade para aperfeiçoamentos que facilitam a flexibilidade nessas análises, enquanto proporcionando a um patologista informações precisas e úteis, para permitir que ele forme um diagnóstico e/ou prognóstico adequados.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

As necessidades mencionadas acima e outras são satisfeitas na presente invenção, que, em uma concretização, proporciona um método de manchamento de uma amostra para formação de imagem microscópica, em que a imagem da amostra manchada é configurada para apresentar um contraste ótimo entre os componentes subcelulares para diagnose por um patologista. Esse método compreende o manchamento de uma amostra com um corante; determinação de um valor de transmitância do corante de uma imagem microscópica da amostra; formação de uma imagem artificial da amostra do valor de transmitância determinado do corante; variação do valor de transmitância do corante de modo a formar uma série de imagens artificiais; seleção de uma imagem, da série de imagens, apresentando o contraste ótimo entre os componentes subcelulares para o corante e determinação do valor de transmitância correspondente do corante nessa imagem; e variação do manchamento da amostra com o corante, de modo a proporcionar uma amostra manchada tendo o valor de transmitância do corante correspondente ao contraste ótimo entre os componentes subcelulares.

Outro aspecto da presente invenção compreende um método de manchar artificialmente uma amostra. Esse método inclui o manchamento de uma amostra com um primeiro corante; determinação de um valor de transmitância e de um coeficiente de extinção do primeiro corante de uma imagem microscópica da amostra; formação de uma imagem artificial da amostra do valor de transmitância determinado do primeiro corante; e substituição de um coeficiente de extinção de um segundo corante pelo coeficiente de extinção do primeiro corante, de modo a manchar artificialmente a amostra com o segundo corante.

Ainda um outro aspecto da presente invenção compreende um método de obtenção de medidas de uma amostra de uma imagem dela. Esse método inclui a seleção de uma região de interesse na amostra de uma imagem RGB dela; segmentação da região de interesse na região RGB, para identificar quaisquer objetos de interesse nela; implementação da extração de aspectos, para determinar as medidas para os objetos de interesse identificados; e determinação de contagens de células com relação a pelo menos um de localização de marcador e razão de sinal para ruido.

Um outro aspecto da presente invenção compreende um método de seleção de uma região de interesse em uma lâmina, em que a região é contrastada positivamente das redondezas dela em uma imagem apenas de marcador correspondente a uma imagem RGB da amostra, e a região contrastada positivamente inclui pelo menos uma de um núcleo relativamente maior e uma de densidade celular relativamente mais alta do que as redondezas. Esse método inclui a aplicação de um filtro passa-baixos a uma imagem apenas de marcador de uma amostra, em que a imagem apenas de marcador é obtida por separação de cromógenos da imagem RGB da amostra; determinação de histograma de pixels apenas de marcador na imagem apenas de marcador; e decomposição em duas partes da imagem apenas de marcador de acordo com um limiar no histograma apenas de marcador, de modo a formar uma máscara para discriminar entre regiões negativa e positiva da amostra. Outro aspecto da presente invenção compreende um método de segmentação de uma amostra de uma imagem dela. Esse método inclui a determinação de um componente de fundo de uma imagem RGB da amostra, por meio de um processo de produção de um limiar; segmentação da imagem por criação de uma imagem componente de pelo menos uma de uma membrana, um citoplasma e um núcleo; refino da imagem segmentada; e filtração de quaisquer objetos indesejados da imagem.

Ainda outro aspecto da presente invenção compreende um método de determinação de dados de densidade óptica para pelo menos um manchamento por corante de uma amostra, para uma alta concentração de corante, de uma imagem obtida com um dispositivo de formação de imagem de baixa resolução de bits. Esse método inclui a captura de uma série de imagens da amostra a diferentes tempos de integração; seleção de uma intensidade não saturada mais alta em cada uma de canais vermelho, verde e azul do dispositivo de formação de imagem; e reconstrução de uma imagem otimizada da amostra usando os niveis de intensidade não saturada mais altos nos canais vermelho, verde e azul, de modo que a faixa otimizada seja adequada para a separação de cromógenos.

Outro aspecto da presente invenção compreende um método de separação de cromógenos para uma imagem de uma amostra biológica, manchada com quatro corantes obtidos com um dispositivo de formação de imagem de três canais. Esse método inclui a definição a priori de três combinações de corantes significativas conhecidas dos quatro corantes espacialmente colocados na amostra biológica; obtenção de uma imagem de uma amostra manchada com quatro corantes, com um dispositivo de formação de imagem tendo canais vermelho, verde e azul, de modo que a imagem inclua, desse modo, uma pluralidade de pixels, todos tendo um tripleto RGB correspondente; projeção de cada tripleto RGB em um plano de coeficiente de extinção, em que Ecr + Ecg + Ecb = 1; determinação da combinação de três corantes dos quatro corantes no plano do coeficiente de extinção correspondente a cada tripleto RGB; e separação da imagem da amostra por tabulação de uma quantidade de pixels na imagem correspondente a cada uma das três combinações de corantes no plano do coeficiente de extinção.

As concretizações da presente invenção satisfazem, desse modo, as necessidades identificadas aqui e proporcionam vantagens significativas, como mais detalhado na presente descrição.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A invenção tendo sido assim descrita em termos gerais, vai-se fazer agora referência aos desenhos em anexo, que não são necessariamente feitos em escala, e em que:

a Figura 1 ilustra esquematicamente uma série de imagens manchadas eletronicamente de uma amostra, em que o valor de transmitância de um dos corantes manchando a amostra é variado, de modo a determinar a intensidade do marcador ótima, como mostrado no núcleo, permitindo tanto uma leitura morfológica pelo patologista quanto uma decisão positiva da célula baseada na expressão do marcador;

as Figuras 2A e 2B mostram alguns exemplos de regiões de interesse selecionadas automaticamente, de acordo com um aspecto da presente invenção;

as Figuras 3A1 - 3A2 e 3B1 - 3B2 mostram exemplos de regiões de interesse selecionadas automaticamente e

uma segmentação subcelular subseqüente, de acordo com um aspecto da presente invenção;

a Figura 4 ilustra esquematicamente um método de contagem de células, de acordo com um aspecto da presente invenção; as Figuras 5A e 5B ilustram um método de análise de amostras incluindo altas concentrações de corante, usando uma abordagem de tempo de integração, de acordo com um aspecto da presente invenção;

as Figuras 6A - 6D ilustram dados relativos a cada um dos 4 corantes para manchamento de uma amostra, para um procedimento de separação de cromógenos por 4 corantes, de acordo com um aspecto da presente invenção;

as Figuras IA, 7B1 e 7B2 ilustram esquematicamente os 4 corantes das Figuras 6A - 6D, representados no plano do coeficiente de extinção equivalente de Maxwell, e

as suas 2 combinações de 3 corantes aceitas, respectivamente, de acordo com um aspecto da presente invenção;

a Figura 8A ilustra um campo de visão PAP modificado manchado com 4 corantes da Figura 6;

as Figuras 8B - 8E ilustram o campo de visão PAP modificado da Figura 8A para cada um dos 4 corantes separadamente dos outros corantes, usando separação de cromógenos; e

a Figura 9A ilustra um campo de visão fonte (RGB) de

uma amostra, enquanto que a Figura 9B ilustra uma amostra manchada eletronicamente simulada para dois dos quatro componentes corantes, e a Figura 9C ilustra uma imagem manchada eletronicamente apenas PAP da amostra reconstruída com todos os componentes corantes, exceto DAB.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção vai ser descrita a seguir mais inteiramente, com referência aos desenhos em anexo, nos quais, algumas, mas não todas, as concretizações da invenção são mostradas. De fato, essas invenções podem ser representadas em muitas diferentes formas e não devem ser consideradas como limitadas às concretizações aqui apresentadas; em vez disso, essas concretizações são proporcionadas de modo que essa descrição satisfaça os requisitos legais aplicáveis. Os números similares se referem aos elementos similares do princípio ao fim.

A PLATAFORMA DE FORMAÇÃO DE IMAGEM MICROSCÓPICA Em um dispositivo microscópico típico para aquisição e processamento de imagem, a imagem aumentada da amostra deve ser primeiro capturada e digitalizada com uma câmera. Geralmente, câmeras digitais de dispositivo acoplado a carga (CCD) são usados qualquer um de microscopia quantitativa de luz ou fluorescência. Excluindo os espectrofotômetros, duas diferentes técnicas são geralmente usadas para conduzir esses estudos microscópicos colorimétricos. Em uma técnica, uma câmara CCD em branco e preto (BW) pode ser usada. Nesse caso, uma imagem de nível cinza da amostra é obtida, correspondente a uma luz monocromática tendo um comprimento de onda específico ao manchamento da amostra a ser analisada. 0 comprimento de onda de luz específico é obtido ou por filtração de uma luz de fonte branca, por meio de um filtro de largura de faixa estreita específica, ou por controle direto do comprimento de onda da fonte de luz, usando controles manuais ou eletrônicos. Conseqüentemente, usando essa técnica, o tempo de análise aumenta com o aumento do número de cores, porque uma fonte de luz ou um filtro deve ser selecionado para cada diferente manchamento de amostra diferente ou cada comprimento de onda diferente. Portanto, muitas imagens diferentes da amostra, apresentando a resposta espectral da amostra a diferentes comprimentos de onda, devem ser capturadas individualmente em uma ordem seqüencial, para facilitar a análise. Quando múltiplas cenas ou campos de visão devem ser analisados, o protocolo típico é automatizar a seqüência em um modo em batelada, para manter o tempo de processamento.

De acordo com uma segunda técnica, uma câmera digital CCD colorida é usada, em que três imagens de nível cinza da amostra são capturadas e obtidas simultaneamente. Cada imagem de nível cinza corresponde a uma imagem de nível cinza em cada um dos respectivos canais vermelho, verde e azul (RGB) da câmera CCD. Quando uma câmera digital CCD colorida é usada, em que três imagens de níveis cinza são capturadas e obtidas simultaneamente (cada imagem de nível cinza corresponde a uma imagem de nível cinza em cada um dos três canais vermelho, verde e azul (RGB), técnicas de separação de cromógenos podem ser aplicadas, que podem permitir que a densidade óptica de cada espécie molecular (revelada pelo seu cromógeno ou corante associado) seja avaliada em qualquer local da imagem (pixel). Na amostra biológica, os marcadores e as manchas de contagem indicam, de uma maneira geral, os corantes para detecção e quantificação. De acordo com uma terceira técnica surgida (por exemplo, usando uma câmera multiespectral JUMBOSCAN da Lumiere Technology) , até 13 imagens de nivel cinza da amostra podem ser capturados e obtidos simultaneamente.

Esse tipo de câmera / escâner pode aumentar, no futuro, o potencial das técnicas de separação de cromógenos, por aumento do número de corantes que podem ser resolvidos, simultaneamente, para uma determinada amostra.

Independentemente, a concentração da espécie molecular pode ser determinada de uma imagem colorida da amostra, em que a imagem colorida inclui 3 ou mais canais. Em um sistema de videomicroscopia equipado com uma câmera 3CCD, a imagem deve ser desejavelmente equilibrada e normalizada de acordo com uma referência branca de campo vazio e uma imagem de campo preto, e depois corrigida para sombreamento. Além do mais, a imagem deve ser desejavelmente corrigida espacialmente para . aberrações cromáticas, canal por canal. Uma densidade óptica da amostra pode ser então computada em cada um dos canais vermelho, verde e azul da imagem RGB, a um pixel particular na imagem, da luz transmitida medida. Um vetor de densidade óptica correspondente é depois formado para esse pixel. O vetor de densidade óptica é então multiplicado pelo inverso de uma matriz de coeficiente de absorção relativo dos corantes presentes de modo a formar um vetor resultante para o pixel, representando as contribuições de densidade óptica de cada corante. A matriz de coeficiente de absorção relativa compreende um coeficiente de absorção relativa para cada corante (marcador(es) e mancha(s) de contagem), usado no protocolo de preparação de amostra, em cada um dos três canais vermelho, verde e azul. 0 vetor resultante compreende, desse modo, a concentração da espécie molecular, como indicada pelo marcador(es), e pela(s) mancha(s) de contagem, para aquele pixel.

Essas técnicas de formação de imagem, também conhecidas como técnicas de formação de imagem multiespectrais, quando adaptadas para formação de imagens coloridas (câmera RGB), propiciam um processamento em tempo real (taxa de video) da amostra (tipicamente 40 milissegundos por quadro), que proporciona uma vantagem considerável. Na verdade, para os aspectos de velocidade e processamento em tempo real, ou a exibição de finalidades, no caso de uso da câmera RGB, a aquisição por diferentes canais é feita em paralelo, e tabelas de verificação (LUT) podem ser geradas, que mapeiam os valores de entrada de cor RGB para as concentrações pré-computadas e/ou transmitância de cada um dos corantes participantes. Essas técnicas são discutidas em mais detalhes, por exemplo, nas publicações dos pedidos de patente U.S. 2003/0091221A1 ("Method for quantitative videomicroscopy and associated system and computer software programa product) e 2003/0138140A1 (("Method for quantitative videomicroscopy and associated system and computer software programa product), ambos de Marcelpoil et al. e cedidas à empresa Tripath Imaging, Inc., também o cessionário da presente invenção, cujos conteúdos são aqui incorporados inteiramente por referência.

A LEI DE LAMBERT-BEER

A plataforma de formação de imagem microscópica é configurada para analisar a amostra de acordo com a lei de Lambert-Beer. A lei de Lambert-Beer descreve geralmente uma proporcionalidade, que pode ser observada entre a concentração das moléculas em uma solução (a concentração da "espécie molecular" ou da "amostra") e a intensidade da luz medida pela solução. A lei de Lambert-Beer é tipicamente expressa como:

OD = ε . 1. C (1) OD é a densidade óptica da solução, ε é a constante de proporcionalidade chamada coeficiente de extinção molar ou absorção, 1 é a espessura da amostra, e C é a concentração da espécie molecular. 0 coeficiente de absorção ε é especifico da espécie molecular e é expresso tipicamente em unidades de L . mol"1 . cm-1.

Essa relação de proporcionalidade definida pela lei de Lambert-Beer foi verificada sob várias condições, incluindo, por exemplo, luz monocromática iluminando a amostra, baixa concentração molecular dentro da amostra, geralmente sem qualquer heterogeneidade de resposta de luz ou fluorescência (fluorescência e difusão desprezíveis) da amostra, e falta de fotossensibilidade química da amostra. A lei de Lambert-Beer pode ter, no entanto, requisitos adicionais, tal como, por exemplo, uma iluminação de Koehler correta da amostra sob o microscópio.

A iluminação de Koehler é oferecida em quase todos os microscópios do estado da técnica e proporciona uma iluminação uniforme no plano da imagem, enquanto permite um controle de contraste efetivo. A iluminação de Koehler é tipicamente crítica para análise de densitometria. A iluminação de Koehler correta é proporcionada, por exemplo, por um sistema de iluminação de dois estágios para o microscópio, em que a fonte é transformada em imagem na abertura do condensador de subestágio por um condensador auxiliar. 0 condensador de subestágio forma, por sua vez, uma imagem do condensador auxiliar no objeto. Um diafragma de iris pode ser também colocado em cada condensador, em que a primeira iris controla a área do objeto a ser iluminado, e a segunda iris varia a abertura numérica do feixe de iluminação.

A lei de Lambert-Beer tem uma propriedade aditiva, de modo que se a amostra compreender várias espécies moleculares absorventes de luz, por exemplo, Si e S2, tendo as respectivas concentrações Ci e C2, a OD de uma amostra de espessura 1 (em solução, li - I2 = 1) pode ser expressa como:

OD = ε1 . 11 . Cl + ε2 . 12 . C2 (2)

Essa situação pode ocorrer, por exemplo, em uma análise biológica, em que uma "cena" ou campo de visão ou parte da amostra foi manchado com dois corantes, consistindo de um corante marcador para alvejar a espécie molecular de interesse e uma mancha de contagem para mancharaento do restante da amostra. CORREÇÃO DE ABERRAÇÃO CROMÁTICA

Para medir precisamente a concentração de determinadas espécies formadas em imagem sob um microscópio, as medidas das densidades ópticas conduzidas a diferentes comprimentos de onda devem corresponder à mesma parte da amostra. Isto é, o sistema pode ser fisicamente corrigido para aberração cromática ou, de outro modo, a correção pode ser feita por outra metodologia, tal como software.

O poder de dispersão natural do vidro faz com que uma simples lente focalize luz azul a uma distância mais curta do que a luz vermelha. Isto é, uma simples lente tem diferentes comprimentos focais para luzes de diferentes comprimentos de onda (diferentes cores) . Dois fenômenos ocorrem como uma conseqüência direta:

1) A diferença na posição ao longo do eixo vertical dos pontos focais para luz de diferente comprimento de onda é chamada aberração cromática longitudinal; isto é, quando da focalização da imagem para uma determinada cor (verde, por exemplo), duas imagens correspondendo às outras cores tendem a ficar ligeiramente fora de foco (azul e vermelho, nesse exemplo, vão parecer fora de foco); e 2) A diferença em aumento (comprimento focai) para luzes de diferentes comprimentos de onda é chamado aberração cromática lateral; isto é, a imagem de um comprimento de onda azul (curto) vai parecer maior do que a imagem de um comprimento de onda vermelho (grande).

Em sistemas com objetivas de alta qualidade (objetivas apocromáticas), a aberração cromática é corrigida. Se a aberração cromática for de outro modo estruturalmente não bem corrigida, um método baseado em software, para correção de aberração cromática lateral, pode ser implementado como se segue:

1) Determinar a coordenada do centro da objetiva, comparada com a do centro do circuito integrado da câmara;

2) Avaliar o fator de aumento observado para cada comprimento de onda, comparado com um comprimento de onda selecionado arbitrário (usualmente o comprimento de onda central, isto é, verde, se usando uma câmera RGB); e 3) Reamostrar cada imagem de acordo com o seu aumento relativo e a coordenada do centro da objetiva.

EXECUÇÃO DA SEPARAÇÃO DE CROMÓGENOS

Uma vez que o microscópio tenha sido ajustado no modo de iluminação de Koehler para aquisição de imagem, e quaisquer aberrações cromáticas tenham sido abordadas ou objetivas apocromáticas usadas, a propriedade aditiva da lei de Lambert-Beer pode ser usada para conduzir a separação de cromógenos, usando equações algébricas lineares.

Mais particularmente, a propriedade aditiva da lei de Lambert-Beer pode ser também expandida a uma situação na qual a cena é analisada em um meio físico de imagem colorida, tal como, por exemplo, a gerada por uma câmera RGB tendo canais vermelho, verde e azul separados. Nesse exemplo, o corante marcador (ou "corante") vai apresentar os coeficientes de absorção, €1, €2 e €3, nos canais vermelho, verde e azul, respectivamente. Notar que a análise da imagem em cada um dos canais vermelho, verde e azul compreende essencialmente uma representação vermelha da imagem pelo espectro vermelho, uma representação verde da imagem da imagem pelo espectro verde, e uma representação azul da imagem pelo espectro azul. Conseqüentemente, a mancha de contagem (ou "corante 2") vai apresentar os coeficientes de absorção, ε1, ε2 e ε3, nos canais vermelho, verde e azul, respectivamente. Portanto, de acordo com a propriedade aditiva da lei de Lambert-Beer, a análise da amostra no meio físico RGB vai levar ao sistema de três equações para a densidade óptica dela:

ODr = εir . Ii . Ci + ε2r . l2 · C2 (3)

ODg = εig . Ii . Ci + ε2g . l2 · C2 (4)

ODb = εib . Ii . Ci + S2b . l2 . C2 (5)

em que ODr, ODg e ODb representam as densidades ópticas da amostra, medidas nos canais vermelho, verde e azul, respectivamente. Ainda mais, no caso de uma maior complexidade na preparação da amostra, tal como, por exemplo, o tratamento da amostra com três diferentes corantes, as equações (3), (4) e (5) ficam:

ODr = εir . li . Ci + S2r . I2 . C2 + S3r . l3 · C3 (6)

ODg = εig . εi . Ci + S2g . I2 . C2 + S3g . l3 . C3 (7) ODb — ℇib . I1 . Cl + S2b . I2 · C2 + S3b . I3 . C3 (8)

Nessa situação, os três corantes podem compreender, por exemplo, um corante marcador e duas manchas de contagem, ou dois corantes marcadores e uma mancha de contagem, ou mesmo três corantes marcadores separados. Essa propriedade da lei de Lambert-Beer pode ser expandida para incluir uma pluralidade ainda maior de combinações de corantes. No entanto, o procedimento de separação de cromógenos aqui descrito focaliza o fazer uso de um dispositivo de captura de imagem colorida rápido com 3 canais, tal como, por exemplo, a câmera 3CCD RGB, para formação de imagem multiespectral de marcadores biológicos. Portanto, devido aos três canais de informações distintos (R, G, Β), apenas três equações podem ser usadas em qualquer local.

Na aplicação da lei de Lambert-Beer a um sistema microscópico digital, é difícil e complexo, impreciso, ou algumas vezes impossível de medir a espessura 1 da amostra. Conseqüentemente, a concentração C da espécie molecular pode ser estendida e examinada como o produto de 1 e C (1. C)r, e os resultados tratados conseqüentemente. Por exemplo, quando a concentração de um corante está sendo comparada com a concentração de outro corante em uma amostra particular, o termo espessura da amostra vai ser comum a ambas as concentrações e, desse modo, ficar menos importante determinar a espessura da amostra como um valor preciso e absoluto. Portanto, deve-se entender que uma determinação precisa da espessura não é usualmente necessária, mas considerada constante e, portanto, geralmente desprezível na análise aqui descrita.

A aplicação da lei de Lambert-Beer ao sistema microscópico digital também reconhece que a lei de Lambert- Beer pode ser expressa como:

OD(x,y) = log I0(x,y) - log Ι(x,y) (9)

para uma imagem digital da amostra, em que (x, y) significa um pixel particular na imagem, OD(x,y) é a densidade óptica da amostra nesse pixel, I(x,y) é a intensidade ou

transmitância de luz medida da amostra nesse pixel, e I0(x,y) é a intensidade de luz da fonte de luz, medida sem a amostra absorvente de luz. Conseqüentemente:

IOD = Σν (log I0(x,y) - Iog I(x,y)) (10)

em que IOD é a densidade óptica integrada da imagem digital da amostra, e N é o número de pixels na imagem superficial da amostra. Uma constante de proporcionalidade pode ser considerada adequadamente, quando comparações relativas são tiradas das intensidades de luz. Além disso, em microscopia quantitativa de acordo com a lei de Lambert-Beer, a relação de proporcionalidade entre a densidade óptica OD da amostra e as concentrações do corante é conservada.

Portanto, para uma amostra preparada examinada pelo sistema de microscopia digital, a relação adequada é expressa como:

In I0 - In I = In (I0/I) = OD = ε . 1 . C (11)

Quando, por exemplo, uma câmera RGB de 8 bits é usada no sistema, a intensidade de luz transmitida pela amostra vai ser expressa como 28 = (256) valores entre 0 e 255. Por exemplo, a intensidade inicial Io da fonte de luz, que corresponde a uma transmitância de 100%, vai ser expressa como valores próximos a 255 (representando o valor mais brilhante possível) em cada um dos canais vermelho, verde e azul. De fato, o operador ajusta o dispositivo de manipulação / fonte de luz da câmera, de modo que uma luz "branca" pura na ausência da amostra, correspondendo a uma transmitância de 100%, vá ter um valor de intensidade próximo a 255 em cada um dos canais vermelho, verde e azul, enquanto que na ausência de luz, correspondendo a uma transmitância de 0%, a "imagem negra" vai ter um valor de intensidade próximo a 0 em cada um dos canais vermelho, verde e azul. Em qualquer pixel, uma transmitância de 100%, Io, é portanto expressa como a diferença entre o valor medido pela câmera na presença da fonte de luz, menos o valor medido pela câmera na ausência da fonte de luz, para cada um dos canais vermelho, verde e azul. Em virtude da intensidade da fonte de luz poder variar espacialmente pelo campo de visão medido, e porque o dispositivo óptico pode absorver luz heterogeneamente, uma transmitância de 100% pode corresponder a diferentes faixas dinâmicas pelo campo de visão medido. A OD da amostra é expressa (11) como o logaritmo da razão da transmitância na ausência da amostra (Io) e transmitância na presença de amostra (I) , e é, portanto, bastante independente espacialmente das pequenas variações na faixa dinâmica real a uma transmitância de 100% .

Uma vez que a intensidade da fonte de luz se mantém substancialmente constante com o tempo, ou pode ser facilmente reavaliada, a leitura da intensidade de luz em qualquer pixel pode ser, portanto, traduzida em uma medida da transmitância relativa no local do pixel para cada um dos canais vermelho, verde e azul. Uma vez que I0 e I são conhecidos, a OD correspondente pode ser computada.

Qualquer local no campo de visão no qual um único corante está presente (o único material absorvente) permite que os coeficientes de extinção relativa do corante sejam medidos para os diferentes canais RGB. Porque na equação (1) , 1 . C é igual para cada um dos canais RGB em um determinado local, se ambos IeC são conhecidos nesse local particular, o coeficiente de extinção exato pode ser computado como sendo OD / (1 . C) . O coeficiente de absorção ε em cada um dos canais vermelho, verde e azul pode ser, desse modo, conseqüentemente extraído como sendo:

Er = ODr / (1 . C) = (ln (I0r/Ir)) / (1 . C) (12)

Sg = ODg / (1 . C) = (ln (Iog/Ig)) / (1 . C) (13)

Eb = ODr / (1 . C) = (In (WIb)) / (1 . C) (14)

Infelizmente, (1 . C) é usualmente desconhecido e, portanto, os coeficientes de extinção ε são computados arbitrariamente, como sendo a relação da 0D, medida no determinado pixel no canal considerado, e a OD máxima, medida nesse local para quaisquer dos canais RGB (a determinação do coeficiente de absorção ε em cada um dos canais vermelho, verde e azul, na ausência de um conhecimento a priori relativo a (1 . C) é motivo de manipulação de equação linear, para obter uma solução relativa na qual l e C são arbitrariamente ajustados a 1), em que:

εr = ODr / 1 = ODr = In (I0r/Ir) (13)

εg = ODg / 1 = ODg = In (I0g/Ig) (14)

εb = ODb / 1 = ODb = In (Wlb) (15)

Conseqüentemente, se a concentração absoluta do corante se mantiver desconhecida, é ainda possível computar concentrações do corante arbitrárias (ou relativas) em qualquer pixel, com um fator de erro absoluto conhecido igual a (1 . C).

Em virtude de 1 ser único em um determinado local de pixel e poder ser ajustado arbitrariamente a 1, as equações 6, 7 e 8 podem ser reescritas como apresentadas a seguir, em que C1, C2 e C3 são relativos a 1.

ODr = S1r . C1 + s2r . C2 + s3r . C3 (16) 38/72

ODg — Sig . Cl + &2g · C2 + e3g · C3

(17)

ODb — Sib · Ci + S2b · C 2 + B3b · C3

(18)

Quando todos os coeficientes de extinção tiverem sido avaliados para diferentes corantes, e as densidades ópticas serem conhecidas da leitura dos dados de imagem, a resolução dessas equações para extrair C1, C2 e C3 envolve apenas um conjunto de equações lineares.

SOLUÇÃO DE EQUAÇÕES / MATRIZES ALGÉBRICAS LINEARES

Um conjunto de equações surge, por exemplo, como: (19)

anXi + ai2X2 + ai3x3 + . . . + aiNxN = bi

a2ixi + a22X2 + a23*3 + . . . + a2NxN = b2

a3ixi + a32X2 + a33x3 + . . . + a3NxN = b3

aMiXi + aM2X2 + aM3x3 + ... + 3mnXn — t>M Aqui, as N incógnitas Xj, j = 1, 2, N são

relacionadas a M equações. Os coeficientes ag com 1=1, 2, ..., M e j = 1, 2, ..., N são números conhecidos, como são as quantidades no lado direito bi, i = 1, 2, M.

Se M < N, há efetivamente menos equações que incógnitas. Nesse caso, pode não haver solução, ou então mais de uma vetor solução x.

Se N = M, então pode haver tantas equações quanto incógnitas, e há uma boa chance de resolução para um único conjunto de solução de x/s.

Se M > N, em que há mais equações que incógnitas, e não há, em geral, qualquer vetor de solução χ para a equação (1), o conjunto de equações é dito estar superdeterminado, Nesse caso, a solução mais adequada vai ser considerada em geral como aquela se ajustando melhor a todas as equações (isto é, a solução minimizando a soma dos erros de reconstrução).

A equação (19) pode ser assim escrita em forma de matriz como

A . χ = b Aqui, (.) denota multiplicação da matriz, A é a matriz de coeficientes e b é o lado direito escrito como um vetor de coluna. Por convenção, o primeiro índice em um elemento aij denota sua fileira; o segundo índice a sua coluna, ai ou a[i] denota uma fileira inteira a[i][j], j = 1, ..., N.

A solução da equação da matriz A . x = b para um vetor desconhecido x, em que A é uma matriz quadrada de coeficientes, e b é um vetor do lado direito conhecido, usualmente requer a determinação de A-1, que é o inverso de matriz da matriz A.

χ = A-1 . b (21)

A-1, que é inverso de matriz da matriz A, isto é, A .

A-1 = A-1 .A-1, em que 1 é a matriz de identidade. Em um caso particular, as condições experimentais são ajustadas de modo que há mais (ou um número igual) de equações que incógnitas, M ≥ N. Quando M > N ocorre, não há, em geral, nenhum vetor de solução x para a equação (19), e o conjunto de equações é dito ser superdeterminado. Freqüentemente, no entanto, a melhor solução de "compromisso" é uma que fica mais perto de satisfazer todas as equações simultaneamente. Se a proximidade é definida no sentido dos mínimos quadrados (isto é, a soma dos quadrados das diferenças entre os lados direito e esquerdo da equação (19) são minimizadas) , então o problema linear superdeterminado se reduz a um problema linear resolvivel (usualmente), também referido como o problema dos mínimos quadrados lineares, que pode ser resolvido usando decomposição de valores singulares (SVD). A SVD envolve a modelagem paramétrica de dados, e é um método para resolver a maior parte dos problemas dos mínimos quadrados lineares. (NUMERICAL RECIPES IN C: THE ART OF SCIENTIFIC COMPUTING (ISBN 0-521- 43108-5) Copyright (C) 1988 - 1982 pela Cambridge University Press. Programs Copyright (C) 1988 - 1992 pela Numerical Recipes Software.).

Na aplicação desses conceitos ao presente caso, a determinação da matriz do coeficiente de absorção ε, para os diferentes corantes, pode ser feita independentemente de avaliação simples e armazenada para posterior aplicação às amostras tratadas com pelo menos um dos respectivos corantes. As soluções de computação para todos os valores de pixels possíveis permite substancialmente o processamento em tempo real. Desse modo, no exemplo selecionado de um dispositivo de aquisição de imagem colorido 3CCD de 8 bits, a intensidade de luz medida I de uma amostra varia entre os limites de 0 e 255 em cada um dos canais vermelho, verde e azul, todos os possíveis valores de cinza (com relação à intensidade de luz origina I0) podem ser pré-computados (2563 no caso de um sistema RGB de 8 bits) e armazenados, por exemplo, dentro do computador. Desse modo, para uma amostra manchada com um corante particular, a intensidade de luz transmitida I (ou a densidade óptica OD) pode ser medida em um pixel em cada dos canais vermelho, verde e azul e depois comparada aos valores de cinza previamente armazenados e a matriz dos coeficientes de absorção ε para aquele corante particular, para assim determinar a concentração do corante C (ou uma estimativa dela como o produto I . C) nesse pixel. Nesse aspecto, há [256(vermelhas) χ 256(verdes) χ 256(azuis)] = 256^3 soluções para computar, originando uma tabela de verificação (LUT) de 16 megabytes (dados brutos) para cada um dos corantes. As resoluções dos valores de cinza excedendo 8 bits por canal vão propiciar maiores LUTs (isto é, > 1 gigabyte se 10 bits por canal).

MANCHAMENTO ELETRÔNICO

De acordo com um aspecto da presente invenção, os níveis de cinza ou os valores de transmitância RGB de uma imagem artificial, resultante de qualquer combinação dos corantes examinados previamente, podem ser gerados, desde que não haja mais variáveis desconhecidas. Como tal, para um pixel particular e as suas concentrações de corantes resolvidas, as imagens de corantes únicas vão corresponder às seguintes intensidades de pixels em Branco e Preto (BW) ou RGB:

ODnw = C e Ibw = Exp (In(I0) - ODbw) (22)

ODr = Er . C e Ir = Exp (In(I0) - ODr) (23)

ODg = Sg . C e Ig = Exp (In(I0) - ODg) (24)

ODb = Sb . C e Ib = Exp (In(I0) - ODb) (25)

Quando esse processo é aplicado a cada pixel de uma imagem digital capturada, uma figura do mesmo campo de visão pode ser gerada usando apenas a respectiva contribuição de quaisquer dos corantes constituintes. Como tal, se os coeficientes de extinção de um corante forem trocados com os coeficientes de extinção de outro corante, é então possível simular como a mesma imagem artificial, correspondente a um determinado marcador, seria vista por um microscópio, se o corante usado para revelar esse marcador for trocado por um corante secundário. Além do mais, usando a propriedade aditiva da lei de Lambert-Beer, é também possível, como mostrado na Figura 1, gerar uma imagem artificial na qual as contribuições relativas de cada corante são trocadas, por exemplo, usando coeficientes de ponderação absolutos ou coeficientes de ponderação relativos (ver as equações 26 - 28 para uma imagem manchada eletronicamente ("e-manchada") com 2 corantes, em que a imagem RGB é reconstruída após troca das proporções de Corante 1 e Corante 2 pelos fatores de ponderação Wi e W2.

ODr = W1 . ɛ1r . C1 + W2 . S2r . C2 e Ig = Exp (In(I0) - ODg)

(26)

ODg = W1 . ɛ1g . C1 + W2 . s2g . C2 e Ig = Exp (In(I0) - ODg)

(27)

ODb = W1 . ɛ1b . Ci + W2 . s2b . C2 e Ib = Exp (In(I0) - 0Db)

(28)

Mais particularmente, a Figura 1 ilustra um exemplo de receptor de estrogênio (ER) , no qual uma série de imagens da mesma célula (imagem original a uma transmitância determinada de cerca de 32% é mostrada circundada em vermelho) , na qual a proporção de um marcador (Marrom DAB) é alterada eletronicamente (artificialmente), após separação de cromógenos, de cerca de uma transmitância de 22% a cerca de uma transmitância de 40%, sem alteração do teor de hematoxilina. Dessa maneira, um contraste ótimo entre os componentes subcelulares pode ser determinado das imagens artificiais, bem como da proporção do corante necessário para proporcionar o valor de transmitância correspondente ao contraste ótimo entre os componentes subcelulares alvejados e não alvejados específicos do marcador. ESTRATÉGIA DE MEDIDA

De acordo com outro aspecto da presente invenção, uma estratégia de medida pode ser baseada e fazer uso da(s) técnica(s) de separação de cromógenos descrita (s) acima em muitos aspectos, de permitir que apenas o marcador de interesse seja medido especificamente, para as capacidades de e-manchamento, que permitem que as imagens contrastadas otimizadas por segmentação sejam geradas.

A obtenção de resultados de medida da imagem adquirida inclui várias etapas: 1) seleção da região de interesse (região do tumor); 2) segmentação para identificar os objetos de interesse na imagem; e 3) extração de aspectos para calcular os vários aspectos de medida para os objetos identificados e afetar as contagens de células com base, por exemplo, na localização dos seus marcadores e na razão de sinal para ruido.

1) PRÉ-SELEÇÃO DA REGIÃO DE INTERESSE

Para reduzir a carga de trabalho para o patologista, uma metodologia de pré-seleção foi desenvolvida para delinear automaticamente a região de interesse potencial dentro do campo de visão, que vai ser a região usada para análise, em que qualquer parte excluída é assim excluída da análise. Esse metodologia de pré-seleção geralmente requer dois fatores a priori:

a região de interesse é positivamente contrastada das redondezas, quando olhando-se na imagem apenas de marcador; e

as células epiteliais alvos de câncer, que diferem das células do estroma por, por exemplo, um maior núcleo e uma densidade celular mais alta.

Conseqüentemente, um grande filtro passa-baixos pode ser aplicado à imagem apenas de marcador, resultante da ou das técnicas de separação de cromógenos aplicadas no campo de visão RGB. 0 histograma apenas de marcador é medido (evitando regiões de fundo baseadas na imagem de luminância) , e então a imagem é decomposta em duas partes ao melhor limiar no histograma, que pode discriminar duas classes (regiões negativa e positiva). Quaisquer pequenos furos são enchidos para alisar a máscara final. A máscara é delineada na parte de topo do campo de visão RGB original da imagem de visão, para permitir aceitação / rejeição pelo patologista, como mostrado nas Figuras 2A e 2B. Mais particularmente, a Figura 2A ilustra um exemplo PSMB9, e a Figura 2B ilustra um exemplo HER2 de definição automática da região de interesse, de acordo com uma concretização da metodologia de pré-seleção aqui descrita. A região de interesse é automaticamente computada ou determinada de outro modo, e pode ser apresentada ao patologista para refino final e/ou aprovação. Se o patologista rejeitar a máscara proposta, ferramentas de desenho permitem que o patologista selecione manualmente a região de interesse adequada.

2) ESTRATÉGIA DE SEGMENTAÇÃO

A estratégia de segmentação inclui as seguintes etapas:

determinação de fundo;

criação de imagens dos componentes celulares;

segmentação da membrana*;

segmentação do núcleo;

segmentação do citoplasma; - refino da segmentação; e

- filtração de objetos indesejados.

*no caso de marcadores de membrana, tal como Her2, uma etapa específica adicional de segmentação da membrana é conduzida.

Vários exemplos dessa segmentação são apresentados, por exemplo, nas Figuras 3A1 - 3A2 e 3B1 - 3B2, respectivamente. Mais particularmente, a Figura 3A1 mostra um exemplo PSMB9 (marcador citoplásmico) de definição automática da região de interesse, seguida por segmentação subcelular na Figura 3A2. Dentro da região de interesse, células automaticamente definidas foram segmentadas, de modo que as máscaras do núcleo apareçam em azul e os limites citoplásmicos apareçam em vermelho, enquanto que os pixels de fundo são mostrados em preto. A Figura 3B1 ilustra um exemplo HER2 (marcador de membrana) de definição automática da região de interesse, seguida por segmentação subcelular na Figura 3B2. Dentro da região definida automaticamente, as células foram segmentadas de modo que as máscaras do núcleo apareçam em azul e a membrana apareça em verde, enquanto que os pixels de fundo são mostrados em preto. Uma pessoa versada na técnica vai considerar, no entanto, que etapas de processamento ou refino adicionais podem ser, em alguns casos, necessários para adaptar esses algoritmos genéricos para as especificidades do tecido ou marcador.

2A) DETERMINAÇÃO DE FUNDO

A primeira etapa de segmentação é dividir o conteúdo de imagem em primeiro plano e fundo. Uma vez que a plataforma de formação de imagem é projetada para suportar microscopia de campo brilhante, objetos vão aparecer mais escuros do que o fundo brilhante. Para criar uma máscara de fundo para uma imagem, a imagem é convertida em uma imagem de luminância e um nivel de limiar de fundo é calculado. Cada pixel tendo um valor de luminância acima do limiar de fundo é considerado como pertencente ao fundo. Contrariamente, qualquer pixel com menos luminância do que o limiar pertence ao primeiro plano, que tem que ser processado ainda nas etapas seguintes.

A determinação desse limiar de fundo envolve a uniformização da imagem de luminância e o cálculo do histograma da imagem uniformizada. O histograma é então varrido, começando na extremidade mais alta, para um mínimo local a ser usado para o valor de limiar. A busca é limitada quando uma transmissão a 90% arbitrária é atingida, que se traduz, para o caso de imagens em 8 bits, no valor de 230.

2B) CRIAÇÃO DE IMAGENS DE COMPONENTES CELULARES

Na etapa de segmentação seguinte, as imagens de componentes celulares para o núcleo e o citoplasma são criadas usando técnicas de separação de cromógenos descritos previamente. A separação é iniciada de acordo com a especificação da contribuição da densidade óptica de cada corante para o componente celular especifico. Essas imagens de componentes são depois usadas como entrada para as etapas de segmentação do núcleo e do citoplasma subseqüentes. As imagens de componentes são baseadas nas capacidades de e-manchamento e geram imagens que melhor contrastam com o compartimento celular alvejado de regiões vizinhas.

2C) SEGMENTAÇÃO DA MEMBRANA

A segmentação da membrana é feita usando as seguintes etapas: encontrar o valor médio por toda a imagem que não é fundo;

encher qualquer local na imagem com esse valor médio, se o valor local for mais brilhante;

encontrar a membrana por geração da diferença de imagem entre as partes principais de convolução de uniformização pequenos e grandes;

decompor em duas partes a imagem de contraste resultante com base no contraste local medido;

extrair o esqueleto das máscaras de membranas candidatas;

excluir qualquer pedaço de esqueleto menor do que um comprimento mínimo solicitado; e

- expandir o esqueleto das máscaras de membranas por um pixel em qualquer direção e manter apenas as máscaras de membranas que ficam na parte mais baixa do esqueleto. A segmentação da membrana é feita primeiro para facilitar a segmentação adicional do núcleo, uma vez que as membranas são geralmente esperadas separar os núcleos entre si.

2D) SEGMENTAÇÃO DO NÚCLEO

No inicio do processo de segmentação do núcleo, ambos os valores dos pixels médios da imagem dos componentes do núcleo são calculados considerando a máscara de fundo. 0 maior desses valores é usado para criar uma máscara de núcleo inicial por introdução de limiar na imagem de componentes do núcleo com esse valor. Qualquer pixel tendo um valor mais alto do que esse limiar é ajustado no valor de limiar, de modo que apenas pixels tendo um valor mais baixo permanecem com os seus valores originais na máscara de núcleo inicial. Se as máscaras de membranas são disponíveis, qualquer pixel de máscara de núcleo potencial localizado dentro de uma máscara de membrana é eliminado.

Essa máscara de núcleo preliminar ou inicial é depois submetida a um filtro passa-baixos com uma parte essencial de 1,5 vez o tamanho do núcleo esperado, para preparar a máscara de núcleo inicial para um procedimento de segmentação ou transformação divisora de águas. A saída do procedimento de segmentação divisora de águas é combinada com a máscara do núcleo inicial, de modo que apenas os pixels da máscara são ajustados, em que a imagem divisora de águas tem bacias de captura, e a máscara do núcleo inicial tem um valor de pixel abaixo do valor de limiar. A máscara do núcleo resultante é depois finalizada por uma etapa de limpeza, incluindo o enchimento de furos tendo uma área menor do que cerca de um quinto do tamanho do núcleo esperado, e a remoção de objetos que são menores do que cerca de um quarto do tamanho de núcleo esperado.

2E) SEGMENTAÇÃO DO CITOPLASMA

O processo de segmentação do citoplasma usa uma abordagem de duas vias para criar a máscara do citoplasma. Ambas as vias usam a máscara do núcleo criada na etapa anterior como o ponto de partida. Primeiro, a máscara do núcleo é invertida e transformada à distância. A primeira máscara de citoplasma potencial é criada por decomposição em duas partes da saida da transformação à distância, de modo que todos os pixels dentro do tamanho de célula esperado sejam incluídos na máscara resultante. Para mascarar apenas o primeiro plano, a primeira máscara de citoplasma potencial resultante é então combinada com a máscara de fundo. Para a segunda máscara de citoplasma potencial, a máscara do núcleo é novamente invertida e depois transformada por divisão de águas. Ambas as primeira e segunda máscaras de citoplasma potenciais são então combinadas para criar a máscara de citoplasma final.

2F) REFINO DA SEGMENTAÇÃO

Uma vez que ambas as máscaras de segmentação do núcleo e do citoplasma tenham sido estabelecidas, essas máscaras são mais refinadas usando o conhecimento das máscaras combinadas. Partindo com a máscara de citoplasma, cada objeto segmentado na máscara do citoplasma é identificado e é associado com uma imagem marcada, em que cada objeto é identificado por um valor de pixel único. Devido à transformação de divisão de águas na segmentação do citoplasma, os objetos marcados são separados entre si. Como tal, a imagem marcada é dilatada para reconectar os objetos marcados.

A imagem marcada é depois usada para refinar a máscara do núcleo. Isto é, cada objeto marcado é decomposto em duas partes usando um limiar individual. Para cada objeto marcado, o processo é o seguinte: calcular o histograma para cada pixel pertencente ao objeto marcado e determinar o valor de pixel médio;

- determinar os limites superior e inferior para a busca do limiar; o limite superior é determinado por integração do histograma, partindo do limite superior até 20% da área do objeto ser acumulada; o limite inferior é determinado de uma maneira similar por integração do histograma do limite inferior, até também 20% do tamanho do núcleo expresso ser acumulado;

- se o limite inferior for inferior ao limite superior, o limiar é calculado por aplicação da análise discriminada de Fisher para a gama de valores no histograma entre os limites; de outro modo, o limiar é o valor médio dos limites superior e inferior; e

redesenhar o objeto na máscara do núcleo por decomposição em duas partes da imagem dos componentes do núcleo, usando o valor de limiar recém-determinado. A seguir, os furos na máscara do núcleo tendo uma área menor do que cerca de um quinto do tamanho do núcleo esperado são enchidos. Para impedir subsegmentação, a máscara é primeiro transformada à distância e depois transformada por uma divisão de águas, para dividir os núcleos unidos potencialmente.

Finalmente, a máscara do núcleo é limpa de artefatos por remoção de todos os objetos menores do que cerca de um quinto do tamanho do núcleo esperado. Uma vez que a máscara do núcleo refinada é determinada, o procedimento de segmentação do citoplasma é repetido e resulta em uma máscara de citoplasma refinada.

Para segmentação Her2neu, uma etapa adicional de remoção de membrana é conduzida, que elimina qualquer máscara de membrana localizada dentro de cerca de 3 pixels de uma máscara de núcleo, de modo a facilitar a discriminação de uma membrana celular de uma membrana de núcleo.

2G) FILTRAÇÃO DE CÉLULAS INDESEJADAS

A última etapa de processamento no procedimento de segmentação envolve a filtração de células indesejadas. Para esse procedimento, cada objeto na máscara de citoplasma refinada é marcado. Também, a imagem POV adquirida é submetida a uma separação de cromógenos nas imagens dos corantes para o marcador e a mancha de contagem. Para cada objeto identificado, um retângulo limitante é determinado e, se o objeto for posicionado mais próximo do que uma determinada distância para qualquer limite de objeto, o objeto não é mais considerado e é descartado de modo a impedir o processamento das células estendendo-se além do limite da imagem. Se a célula passar por esse critério, os seus aspectos de medida, tais como densitometria, textura, forma e informações contextuais, são calculados. Outros exemplos (não inclusivos) incluem:

- área;

perímetro;

centro de gravidade (CoG);

OD mínima;

OD média; e

-OD máxima. Cada aspecto é computado para o núcleo, o citoplasma e/ou toda a célula, bem como para cada um de luminância, corante (s) marcador(es) e corante(s) de mancha(s) de contagem.

Usando a transmitância média determinada da OD média, outro critério de passar / falhar é aplicado à célula. Isto é, se a transmitância média da célula for mais alta do que um valor de limiar especificado no ajuste da segmentação, a célula não é mais considerada e é descartada.

3A) CONTAGEM DAS CÉLULAS

Com base nos aspectos avaliados para cada célula, uma contagem pode ser atribuída àquela célula, dependendo da intensidade do marcador e da sua razão sinal para ruído no compartimento alvejado. Uma célula é considerada positiva, quando o teor do marcador dessa célula na densidade (intensidade) óptica de compartimento alvejado específico de marcador é significativamente mais alto do que nos compartimentos vizinhos. Por exemplo, se o marcador for um marcador de núcleo, o contraste, ou a razão de sinal para ruído, é computado da medida de densidade óptica específica de marcador no núcleo versus a densidade óptica residual medida pelo citoplasma. Em virtude do ruído de fundo não ser específico por definição, a densidade óptica média de fundo global é medida por todo o compartimento do citoplasma das células dentro da região de interesse selecionada.

MARCADOR DO NÚCLEO

Célula SNR = NúcleoMOD / CitoplasmaMOD (28)

Para facilitar a correlação ótima com o conhecimento do patologista, o contraste requerido para designar uma célula como sendo positiva pode ser adaptado de forte para fraco, uma vez que alguns patologistas consideram apenas núcleos muito intensos como sendo positivos, enquanto que outros patologistas consideram qualquer manchamento positivo tênue como sendo positivo. Essa determinação positiva subjetiva baseada no nível de contraste pode ser também afetada pela patologia particular sendo considerada.

UMA CÉLULA É POSITIVA PARA UM MARCADOR DE NÚCLEO SE

NúcleoMOD > CitoplasmaMOD + máx[8,k(1 - CitoplasmaMOD)] (29) Para ER (receptores de estrogênio), verificou-se que ε = 0,02 e k = 0,11.

Para PR (receptores de progesterona), verificou-se que ε = 0,02 e k = 0,20.

Conseqüentemente, como mostrado na Figura 4, qualquer célula abaixo da curva é negativa, e, de outro modo, positiva. Isto é, a Figura 4 ilustra as curvas de SNR e OD do núcleo definindo, para ER e PR, os estados negativo e positivo de uma célula. Para esses marcadores de núcleo, a Razão de Sinal para Ruido (SNR) é avaliada como uma razão da OD do Núcleo para a OD do marcador citoplásmico. Se uma célula fica abaixo da curva (canto direito superior), a célula é considerada positiva, e, de outro modo, negativa. Geralmente, quanto mais forte a intensidade do núcleo, menor deve ser a SNR para conferir positividade à célula (e vice-versa).

3B) CONTAGEM GLOBAL

Uma contagem global pode ser atribuída a um caso que reflete, para esse caso, as informações pedidas pelo patologista, para estabelecer seus diagnóstico / prognóstico. Contagem global = 100 * (# células positivas / # células em ROI) (30)

No caso de testes de ER e/ou PR, a contagem global pedida pelo patologista é o percentual de células positivas dentro da região do tumor. Portanto, uma vez que o patologista está confidente nos seus diagnóstico / prognóstico da região de interesse proposta (proposta automaticamente ou desenhada manualmente), o percentual de células contadas positivamente é registrado.

CONCEITO DE INTEGRAÇÃO

Para investigar ainda mais a contribuição da OD dos diferentes corantes, quando as concentrações são muito altas e as limitações relativas aos bits da câmera são atingidas, uma estratégia baseada no tempo de integração (velocidade do obturador) da câmera pode ser implementada. Isto é, o mesmo campo de visão é transformado em imagem com a mesma câmera, mas com diferentes tempos de integração. Como mostrado nas Figuras 5A e 5B, a OD medida é normalizada com o tempo de integração e os valores não saturados medidos, correspondentes ao tempo de integração máximo em cada canal, são mantidos. Mais particularmente, a Figura 5A mostra uma célula particular com alta intensidade do marcador, que é capturada como imagem usando diferentes tempos de integração (4.000 s-1 a 250 s-1), para aperfeiçoar a resolução de bits nas regiões mais escuras. De acordo com essa metodologia, a formação em pixels da imagem de cromógenos separados no núcleo (apenas hematoxilina) desaparece substancialmente, quando a resolução de bits adequada é usada. A Figura 5B mostra as intensidades de luz transmitida RGB, bem como os valores de OD normalizado com o tempo para um pixel representativo capturado usando diferentes tempos de integração (4.000 s"1 a 250 s"1), para aperfeiçoar a resolução de bits nas regiões mais escuras da imagem mostrada na Figura 5A. 0 aperfeiçoamento de resolução de bits é derivado dos valores de intensidade de luz transmitida RGB, que são selecionados em cada um dos canais RGB para o tempo de integração, antes da saturação.

QUEBRA DO LIMITE 3D USANDO ENTRADA RGB: SEPARAÇÃO DE CROMÓGENOS 4D

Um exemplo desse procedimento para a separação de cromógenos 4D é proporcionado por uma combinação de 4 corantes, para um procedimento PAP modificado, como mostrado nas Figuras 6A - 6B, isto é, Hematoxilina (Figura 6A), Eosina (Figura 6B), Verde (Figura 6C) e DAB (Figura 6D) . Nesse caso, 3 canais (R, GeB) compreendem os canais de entrada, com 4 desconhecidos (corantes) . Nesse caso, um conhecimento a priori pode ser usado. Os corantes são representados em um plano equivalente de Maxwell, que inclui o plano do coeficiente de extinção, no qual EcR + EcG + EcB = 1. Nesse plano, um corante é representado por um local XY único. Em cada local XY único do plano, diferentes tripletos RGB mostrando diferentes transmitâncias (diferentes intensidades de um determinado corante) podem ser apresentados, em que, no presente exemplo, um tripleto RGB tendo a transmitância mais próxima a 50% é apresentado na Figura 7A. Mais particularmente, a Figura 7A mostra diferentes tripletos RGB, tal como o tripleto RGB tendo a transmitância mais próxima de 50%. Cada corante é projetado no plano Ec, com base no seu coeficiente de extinção nos canais vermelho, verde de azul do dispositivo de captura de imagem (câmera), com cada corante sendo representado pela sua letra inicial.

Com relação à natureza dos respectivos corantes, há duas configurações de 3 corantes aceitas entre as 4 possíveis configurações dos 3 corantes, como mostrado nas Figuras 7B1 e 7B2, respectivamente, em que essas duas configurações de 3 corantes são todas realçadas por um triângulo circundante. De um conhecimento a priori, sabe-se que é improvável que todos os 4 corantes vão estar significativamente presentes no mesmo local geográfico com relação à amostra. Portanto, a separação de cromógenos considera, nesse caso, apenas configurações de 3 corantes, nas quais os 3 corantes podem ser co-localizados com relação à amostra. Mais particularmente, Eosina e Verde são basicamente corantes citoplásmicos, que mancham células com diferentes atributos citoplásmicos. Conseqüentemente, esses corantes não são prováveis de estar presentes no mesmo local com relação à amostra, ainda que, devido à localização da Hematoxilina entre os corantes Eosina e Verde nesse plano do coeficiente de extinção, uma mistura de Eosina e Verde pode ser enganada com Hematoxilina (mas é muito improvável de ser enganada para DAB).

Desse modo, para solucionar o problema 4D, o procedimento de separação de cromógenos é aplicado por procura para cada tripleto RGB dessa FOV, no seu local XY, a mancha correspondente seria localizada, o local XY sendo o local no plano do coeficiente de extinção no qual EcR + EcG + EcB = 1. Nesse plano, a configuração 3D circundante, ou por ausência a configuração 3D mais próxima, é determinada e usada para solucionar as equações para a densidade óptica para os 3 corantes correspondentes, enquanto que a densidade óptica do corante remanescente é ajustada para ser 0. Uma pessoa versada na técnica vai notar que a maior parte dos locais XY dos tripletos RGB investigados deve ficar dentro de uma das duas configurações de 3 corantes aceitas. A Figura 8A ilustra um campo de visão tendo todos os 4 corantes representados (isto é, um campo de visão PAP modificado típico, no qual todos os 4 corantes são representados, em que a célula central escura é positiva DAB, como mostrado na Figura 8C). As Figuras 8B - 8E ilustram o mesmo campo para cada um dos 4 corantes.

ADAPTAÇÃO ÜLTRA-RÁPIDA DO ESCÂNER PARA BUSCAR CÉLULAS POSITIVAS (DAB) EM UM MEIO FÍSICO PAP MODIFICADO

Os aspectos discutidos da separação de cromógenos 4D e do e-manchamento podem, em alguns casos, combinarem-se para formar outro aspecto da presente invenção. Mais particularmente, em continuação do exemplo acima dirigido para o uso de DAB e Hematoxilina, um escâner pode ser implementado, que é capaz de leitura de lâminas PAP modificadas (uma solução de evento raro positivo DAB), como mostrado na Figura 9A (uma imagem RGB de um campo de visão original). Depois, com base nos procedimentos de separação de cromógenos 4D e e-manchamento, a situação dos 4 corantes pode ser solucionada. Uma vez resolvida, uma imagem simulada pode ser reconstruída usando um processo de "e- manchamento", para incluir apenas as contribuições de DAB e Hematoxilina, como mostrado na Figura 9B. Além disso, canais apenas de Hematoxilina e DAB podem ser usados como uma entrada para o escâner, de modo que o escâner vai ser configurado para capturar uma imagem "apenas de Hematoxilina e DAB", que produziria uma imagem substancialmente igual àquela mostrada na Figura 9B. Além disso, uma imagem apenas de PAP simulada pode ser reconstruída usando apenas as contribuições de Hematoxilina, Eosina e Verde, como mostrado na Figura 9C.

CONSIDERANDO A DISTORÇÃO RGB

Para acomodar e/ou compensar a distorção RGB, devido ao caminho da imagem, aos dispositivos eletrônicos, e/ou às variações de manchamento, uma modificação da separação de cromógenos pode ser considerada. Isto é, a formação de imagem de material biológico manchado com apenas um corante demonstra que o modelo do coeficiente de extinção, que pode ser calculado de cada tripleto RGB dentro da fonte FOV, varia ligeiramente em torno da medida aceita média. Conseqüentemente, quando uma mistura de corantes está presente, múltiplas soluções de misturas de corantes podem ser na verdade aceitas ou aceitáveis. Diferentes fontes de ruído podem ser responsáveis por essa distorção RGB. Por exemplo, a aquisição da imagem com uma câmera CMOS, em vez de uma câmera CCCD, pode ser um fator.

Para compensar essas distorções, a solução de contribuição do respectivo corante, para um determinado tripleto RGB e um determinado modelo de corante, é computada de uma maneira ligeiramente diferente. Mais particularmente, o tripleto RBG sob investigação é considerado como o centro de uma esfera no espaço RGB tendo um determinado raio r. Todos os tripletos dentro dessa esfera são investigados para as suas soluções de contribuição de corantes, e as soluções são submetidas a um trabalho de determinação da média para cada corante, para todos os tripletos RGB que satisfazem o modelo de combinação de corantes. Se nenhum tripleto RGB pertence ao modelo de combinação de corantes, o tripleto RGB mais próximo dentro da esfera ao modelo de combinação de corantes é retido como a melhor solução candidata potencial.

PROCEDIMENTOS DINÂMICOS

Tradicionalmente, todos os algoritmos ou procedimentos computacionais, usados em aplicações microscópicas quantitativas, são implementados ou introduzidos no sistema por engenheiros de software. Como tal, cada versão de software inclui, geralmente, um conjunto limitado de algoritmos, que não podem ser alterados sem as modificações do software ("atualizações de software").

Por exemplo, uma aplicação pode calcular o percentual de células positivas em uma lâmina, por cálculo da razão do número de células tendo uma densidade óptica média (MOD) de uma mancha de marcador no núcleo da célula maior do que um valor de limiar para o número total de células na lâmina. Em uma aplicação tradicional, o valor de limiar pode ser configurável, mas a fórmula usada para calcular a razão se mantém fixa; vai sempre comparar o número de células em relação a um determinado limiar, para o número total de células. Mesmo se um procedimento ou algoritmo permitir que o valor de limiar varie, com base em outros aspectos extraídos, as fórmulas usadas para determinar o limiar são ainda fixas.

Conseqüentemente, outro aspecto da presente invenção compreende uma metodologia na . qual os algoritmos ou procedimentos são configurados para serem dinâmicos (isto é, produzindo resultados baseados em fórmulas introduzidas por um enxofre) . Isto é, em vez dos algoritmos ou procedimentos sendo codificados diretamente no software, o software pode avaliar as fórmulas a serem usadas durante a execução efetiva da análise. Mais particularmente, uma aplicação de microscopia quantitativa, tais como algoritmos dinâmicos, calcula ou de outro modo determina primeiro um conjunto de aspectos gerais em vários níveis, incluindo um nível de lâmina, um nível de núcleo TMA, um nível de campo e um nível celular. Esses aspectos gerais pode ser depois marcados, definindo, desse modo, diferentes "variáveis", que podem ser combinadas em várias formas entre si, usando, por exemplo, operações matemáticas padrões, para formar aspectos de nível ou definir funções. Como tal, durante o tempo de execução da análise, a aplicação vai carregar a lista de aspectos marcados e fórmulas aplicáveis. Quando uma fórmula é necessária na análise, essa fórmula é avaliada dinamicamente e os aspectos marcados usados para alterar a fórmula, quando necessário. Se uma fórmula é freqüentemente recalculada, ou é suficientemente complexa, essa fórmula ou parte dela pode ser pré-compilada para acelerar a execução.

Esse método pode assim permitir que o conjunto de algoritmos ou os procedimentos implementados pela aplicação sejam atualizados, adicionados ao, ou de outro modo modificados no, campo, sem requerer qualquer modificação externa para o software. Como tal, a aplicação proporciona flexibilidade aos usuário, uma vez que uma nova funcionalidade pode ser criada, quando necessário e/ou desejado, sem requerer qualquer desenvolvimento de software externo complexo. Essas funções podem, por exemplo, gerar contagens numéricas para as lâminas, núcleos, campos ou células. Além disso ou alternativamente, essas funções podem proporcionar uma capacidade de filtração. Como um exemplo da aplicação dessas funções, um usuário pode definir uma função que calcula um percentual positivo, como descrito acima, em que as fórmulas dinâmicas podem ser também usadas para definir uma função que permita exibir as células "positivas", campos ou núcleos realçados. Essas fórmulas também podem ser usadas, por exemplo, para definir as faixas para os valores normais esperados, ou as caixas especificadas, tais como "0", "+1", "+2", etc.

Muitas modificações e outras concretizações das invenções aqui apresentadas vão ficar na mente daqueles versados na técnica, a qual essas invenções se referem, tendo o beneficio dos ensinamentos apresentados nas descrições acima e dos desenhos associados. Portanto, deve- se entender que as invenções não são limitadas às concretizações especificas descritas, e que as modificações e outras concretizações são intencionadas para serem incluídas dentro do âmbito das reivindicações em anexo.

Embora termos específicos sejam aqui empregado, são usados apenas em um sentido genérico e descritivo apenas e não para fins limitantes.

Claims

1. Método de manchamento de uma amostra para formação de imagem microscópica, no qual a imagem da amostra manchada é configurada para exibir um contraste ótimo entre os componentes subcelulares para diagnose por um patologista, caracterizado pelo fato de que compreende: manchar uma amostra com um corante; determinar um valor de transmitância do corante de uma imagem microscópica da amostra; formar uma imagem artificial da amostra do valor de transmitância determinado do corante; variação do valor de transmitância do corante, de modo a formar uma série de imagens artificiais; selecionar uma imagem, da série de imagens, apresentando o contraste ótimo entre os componentes subcelulares para o corante, e determinar o valor de transmitância correspondente do corante nessa imagem; e variar o manchamento da amostra com o corante, de modo a proporcionar uma amostra manchada tendo o valor de transmitância do corante correspondente ao contraste ótimo entre os componentes subcelulares.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que variar o valor de transmitância compreende variar o valor de transmitância do corante, por aplicação de um de um coeficiente de ponderação absoluto e um coeficiente de ponderação relativo a uma densidade óptica correspondente a ele.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda determinar uma proporção do corante, necessária para manchar a amostra, de modo a proporcionar uma amostra manchada tendo o valor de transmitância do corante correspondente ao contraste ótimo entre os componentes subcelulares.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que determinar um valor de transmitância do corante compreende ainda determinar um valor de transmitância do corante em cada um de um canal vermelho, um canal verde e um canal azul da imagem microscópica da amostra.

5. Método de manchar artificialmente uma amostra, caracterizado pelo fato de que compreende: manchar uma amostra com um primeiro corante; determinar um valor de transmitância e um coeficiente de extinção do primeiro corante em cada um de um canal vermelho, um canal verde e um canal azul de um espaço de cor RGB a partir de uma imagem de microscopia da amostra; formar uma imagem artificial da amostra do valor de transmitância determinado do primeiro corante em cada um de um canal vermelho, um canal verde e um canal azul; e substituir um coeficiente de extinção de um segundo corante pelo coeficiente de extinção do primeiro corante, em cada um de um canal vermelho, um canal verde e um canal azul, de modo a manchar artificialmente a amostra com o segundo corante, no espaço de cor RGB.

6. Método de obtenção de medidas de uma amostra de uma imagem dela, caracterizado pelo fato de que compreende: selecionar uma região de interesse na amostra de uma imagem RGB dela por: selecionar uma região contrastada positivamente das suas vizinhanças em uma imagem apenas de marcador, correspondente à imagem RGB, a região positivamente contrastada incluindo pelo menos um de núcleos relativamente maiores e densidade celular relativamente mais alta do que a das vizinhanças; segmentar a região de interesse na imagem RGB para identificar quaisquer objetos de interesse nela por: aplicar um filtro passa-baixos à imagem apenas de marcador da amostra, a imagem apenas de marcador sendo obtida por separação de cromógenos da imagem RGB da amostra; determinar um histograma de pixels apenas de marcador na imagem apenas de marcador; e decompor em duas partes a imagem apenas de marcador de acordo com um limiar no histograma apenas de marcador, de modo a formar uma máscara para discriminar entre regiões negativas e positivas da amostra. implementar extração de aspectos para determinar as medidas para os objetos de interesse identificados; e determinar as contagens de células com relação a pelo menos uma de localização de marcador e razão de sinal para ruido.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que determinar um histograma apenas de marcador compreende ainda determinar um histograma apenas de marcador para regiões que não são de fundo da imagem apenas de marcador, as regiões que não são de fundo sendo determinadas de uma imagem de luminância da amostra.

8. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que compreende ainda encher quaisquer furos indeterminados na máscara, seguinte à decomposição em duas partes da imagem apenas de marcador, de modo a formar uma máscara uniforme definindo aberturas correspondentes às regiões positivas da amostra.

9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que compreende ainda superpor a máscara uniforme na imagem RGB da amostra, de modo que as regiões positivas da amostra na imagem RGB apareçam pela máscara uniforme.

10. Método de selecionar uma região de interesse em uma lâmina, caracterizado pelo fato de que a região é contrastada positivamente das vizinhanças dela em uma imagem apenas de marcador, correspondente a uma imagem RGB da amostra, a região contrastada positivamente incluindo pelo menos um de núcleos relativamente maiores e densidade celular relativamente mais alta, compreendendo: aplicar um filtro passa-baixos à imagem apenas de marcador de uma amostra, a imagem apenas de marcador sendo obtida por separação de cromógenos da imagem RGB da amostra; determinar um histograma de pixels apenas de marcador na imagem apenas de marcador; e decompor em duas partes a imagem apenas de marcador de acordo com um limiar no histograma apenas de marcador, de modo a formar uma máscara para discriminar entre regiões negativas e positivas da amostra.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que determinar um histograma apenas de marcador compreende ainda determinar um histograma apenas de marcador para regiões que não são de fundo da imagem apenas de marcador, as regiões que não são de fundo sendo determinadas de uma imagem de luminância da amostra.

12. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que compreende ainda encher quaisquer furos indeterminados na máscara, seguinte à decomposição em duas partes da imagem apenas de marcador, de modo a formar uma máscara uniforme definindo aberturas correspondentes às regiões positivas da amostra.

13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que compreende ainda superpor a máscara uniforme na imagem RGB da amostra, de modo que as regiões positivas da amostra na imagem RGB apareçam pela máscara uniforme.

14. Método de segmentar uma amostra de uma imagem dela, caracterizado pelo fato de que compreende: determinar um componente de fundo de uma imagem RGB da amostra por um processo de determinação de limiar por: converter a imagem RGB em uma imagem de luminância correspondente; e determinar um nivel de luminância de limiar de fundo da imagem de luminância, com os pixels acima do limiar na imagem de luminância correspondendo ao componente de fundo e os pixels abaixo do limiar na imagem de luminância correspondendo a um componente que não é de fundo. segmentar a imagem por criação de uma imagem componente de pelo menos um de uma membrana, um citoplasma e um núcleo, a imagem componente sendo criada pela aplicação de um procedimento de separação de cromógenos à imagem RGB da amostra, para pelo menos um corante indicando um de membrana, citoplasma e núcleo; refinar a imagem segmentada; e filtrar quaisquer objetos indesejados da imagem.

15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que determinar um nivel de luminância de limiar de fundo da imagem de luminância compreende ainda: uniformizar a imagem de luminância; determinar um histograma de pixels para a imagem de luminância uniformizada, o histograma tendo uma parte mais alta e uma parte mais baixa; e varrer o histograma, começando aproximadamente da sua extremidade mais alta, para determinar os mínimos locais correspondentes ao nível de luminância de limiar.

16. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que compreende ainda limitar a varredura do histograma aos pixels tendo uma transmitância inferior a cerca de 90%.

17. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que segmentar a imagem compreende ainda: determinar uma intensidade média de pixels de um componente que não é de fundo de uma imagem de componente de membrana; substituir qualquer pixel tendo uma intensidade maior do que a intensidade média por um de intensidade média, de modo a formar uma máscara de membrana; gerar uma imagem de diferença entre as partes essenciais de convolução de uniformização grandes e pequenas da imagem de componente de membrana, para formar uma imagem de contraste; decompor em duas partes a imagem de contraste usando um limiar de contraste local; formar um esqueleto de máscaras de membrana da imagem de contraste decomposta em duas partes; eliminar qualquer parte do esqueleto inferior a um tamanho mínimo; expandir o esqueleto de máscaras de membrana por pelo menos um pixel em cada direção; e eliminar quaisquer máscaras de membrana que não correspondem ao esqueleto.

18. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que segmentar a imagem compreende ainda: determinar uma intensidade média de pixels de um componente que não é de fundo de uma imagem de componente de núcleo; substituir qualquer pixel, tendo uma intensidade superior a uma intensidade de limiar compreendendo a maior intensidade média, com a intensidade de limiar, de modo a formar uma máscara de núcleo; filtrar em filtro passa-baixos a máscara de núcleo inicial com uma parte essencial de 1,5 vez um tamanho de núcleo esperado; segmentar por transformação em divisão de águas da máscara de núcleo inicial, de modo a produzir uma imagem de saída; e combinar a imagem de saída da segmentação por transformação em divisão de águas com a máscara de núcleo inicial, para formar uma máscara de núcleo resultante, e de modo que os pixels da máscara sejam indicados quando a segmentação por transformação em divisão de águas tenha uma bacia de captação e quando a máscara de núcleo inicial tiver uma intensidade de pixel abaixo da intensidade de limiar.

19. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que compreende ainda, se uma máscara de membrana estiver disponível, eliminar qualquer pixel da máscara de núcleo resultante dentro de uma máscara de membrana.

20. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que compreende ainda limpar a máscara de núcleo resultante por enchimento de partes indeterminadas dela, tendo uma área inferior a cerca de um quinto do tamanho do núcleo esperado, e eliminar os objetos inferiores a cerca de um quarto do tamanho do núcleo esperado.

21. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que segmentar a imagem compreende ainda: inverter e transformar à distância a máscara de núcleo resultante; decompor em duas partes a máscara de núcleo resultante transformada à distância e invertida, de modo que os pixels dentro de um tamanho de célula esperado sejam incluídos em uma primeira máscara de citoplasma potencial; e combinar a primeira máscara de citoplasma potencial com um componente de fundo da imagem de componente de núcleo, de modo a formar uma máscara de um componente que não é de fundo da primeira máscara de citoplasma potencial.

22. Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que compreende ainda: inverter e transformar à distância a máscara de núcleo resultante, para formar uma segunda máscara de citoplasma potencial; e combinar as primeira e segunda máscaras de citoplasma potenciais, para formar uma máscara de citoplasma resultante.

23. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que refinar a imagem segmentada compreende ainda: identificar cada objeto segmentado na máscara de citoplasma resultante; associar cada objeto segmentado identificado com um objeto marcado em uma imagem marcada, cada objeto segmentado identificado sendo identificado por um valor de pixel único, por dilatação da imagem marcada; e decompor em duas partes cada objeto marcado usando um limiar individual associado com ele, de modo a refinar a máscara de núcleo resultante.

24. Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que a decomposição em duas partes de cada objeto marcado, para refinar a máscara de núcleo resultante, compreende: determinar um histograma para pixels do objeto marcado, o histograma tendo um limite superior e um limite inferior, e determinar uma intensidade média dos pixels; determinar um limite superior e um limite inferior para um limiar, o limite superior sendo determinado por integração do histograma, partindo do seu limite superior por cerca de 20% de uma área do objeto marcado, o limite inferior sendo determinado por integração do histograma, partindo do seu limite inferior por cerca de 20% do tamanho do núcleo esperado; se o limite inferior for inferior ao limite superior, aplicar análise de discriminação de Fisher ao histograma, entre os limites superior e inferior, para determinar o limiar; de outro modo, designar uma média dos limites superior e inferior como o limiar; e reinserir o objeto marcado na máscara de núcleo resultante por decomposição em duas partes da imagem componente de núcleo usando o limiar.

25. Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que compreende ainda: transformar à distância a máscara de núcleo resultante; e transformar por divisão de águas a máscara de núcleo resultante, seguinte à sua transformação à distância, de modo a separar quaisquer núcleos unidos e minimizar a subsegmentação.

26. Método de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que encher partes indeterminadas da máscara de núcleo resultante, tendo uma área inferior a cerca de um quinto do tamanho de núcleo esperado.

27. Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que compreende ainda remover quaisquer objetos inferiores a cerca de um terço do tamanho de núcleo esperado da máscara de núcleo resultante, de modo a produzir uma máscara de núcleo refinado.

28. Método de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que compreende ainda: inverter e transformar à distância a máscara de núcleo refinada; decompor em duas partes a máscara de núcleo refinada transformada à distância e invertida, de modo que os pixels dentro de um tamanho de célula esperado sejam incluídos em uma primeira máscara de citoplasma refinada potencial; e combinar a primeira máscara de citoplasma refinada potencial com um componente de fundo da imagem de componente de núcleo, de modo a formar uma máscara de um componente que não é de fundo da primeira máscara de citoplasma refinada potencial.

29. Método de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que compreende ainda: inverter e transformar à distância a máscara de núcleo refinada, para formar uma segunda máscara de citoplasma refinada potencial; e combinar as primeira e segunda máscaras de citoplasma refinadas potenciais, para formar uma máscara de citoplasma refinada.

30. Método de determinação de dados de densidade óptica para o pelo menos um corante manchando uma amostra, para uma alta concentração de corante, de uma imagem obtida com um dispositivo de formação de imagem de baixa resolução de bits, caracterizado pelo fato de que compreende: capturar uma série de imagens da amostra em diferentes tempos de integração; selecionar uma intensidade não saturada mais alta em cada um dos canais vermelho, verde e azul do dispositivo de formação de imagem; e reconstruir uma imagem otimizada da amostra usando os níveis não saturados mais altos nos canais vermelho, verde e azul, de modo que a imagem otimizada seja adequada para separação de cromógenos.

31. Método de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que compreende ainda normalizar as densidades ópticas medidas para cada uma de uma série de imagens em cada um dos canais vermelho, verde e azul, com relação ao tempo de integração correspondente para a respectiva imagem, a intensidade não saturada mais alta sendo selecionada das densidades ópticas medidas normalizadas.

32. Método de separação de cromógenos para a imagem de amostra biológica manchada com quatro corantes obtidos com dispositivo de formação de imagem de três canais, caracterizado pelo fato de que compreende: definir a priori três combinações de corantes significativas conhecidas de quatro corantes espacialmente colocados na amostra biológica; obtenção de uma imagem de uma amostra manchada com quatro corantes, com um dispositivo de formação de imagem tendo canais vermelho, verde e azul, de modo que a imagem inclua, desse modo, uma pluralidade de pixels, todos tendo um tripleto RGB correspondente; projeção de cada tripleto RGB em um plano de coeficiente de extinção, em que Ecr + Ecg + Ecb = 1; determinação da combinação de três corantes dos quatro corantes no plano do coeficiente de extinção correspondente a cada tripleto RGB; e separação da imagem da amostra por tabulação de uma quantidade de pixels na imagem correspondente a cada uma das três combinações de corantes no plano do coeficiente de extinção.