MX2007014016A

MX2007014016A - Metodos de analisis de imagenes basados en la separacion del cromogen.

Info

Publication number: MX2007014016A
Application number: MX2007014016A
Authority: MX
Inventors: Raphael Marcelpoil; Ryan Williams; Cedrick Orny
Original assignee: Tripath Imaging Inc
Priority date: 2005-05-13
Filing date: 2006-05-12
Publication date: 2008-02-11
Also published as: ES2617882T3; BRPI0610115B8; EP1975875A2; US20100067774A1; EP1975876A2; US7989209B2; WO2006124651A3; US20130301899A1; CA2848233C; EP1978486B1; CA2607609C; JP2016001179A; EP1975874A2; EP1975875A3; US20070026525A1; CN101176116B; US8492156B2; EP1978485A1; CA2607609A1; JP2014110797A

Abstract

Se proporcionan metodos para el analisis de imagenes basado en la separacion del cromogen, dichos metodos siendo dirigidos a las tecnicas de video microscopia cuantitativa en la biologia celular y las aplicaciones patologicas.

Description

MÉTODOS DE ANÁLISIS DE IMÁGENES BASADOS EN LA SEPARACIÓN DEL CROMQGEN CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere al análisis de imágenes y más particularmente a los métodos para el análisis de imágenes basados en la separación del cromogen relacionados a técnicas de video-microscopía cuantitativa en las aplicaciones patológicas y biológicas celulares ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El análisis y evaluación de los tejidos es el dominio de la patología Durante el reciente pasado, los desarrollos tecnológicos y metodológicos han encausado al análisis de las imágenes digitales en unn de las herramientas más eficientes para ayudar a los patólogos en la interpretación de imágenes con exactitud incrementada Aunque dichas técnicas de análisis de imágenes contribuyen su stancialmente para proporcionar un análisis celular objetivo, reproducible y exacto a los otólogos, las técnicas de interpretación histológica aún tienden a depender del análisis subjetivo de los especímenes Dichas técnicas de interpretación histológica también pueden someterse a variados acuerdos de intra- así como ínter-observadores, que además tienden a proporcionar resultados menos exactos, menos reproducibles y menos objetivos Para dichas razones, el e nálisis de imágenes de los tejidos se restringió inicialmente a tecnologías desarrolladas para el análisis de los especímenes citológicos Con la' evolución y disponibilidad de computadoras de alto rendimiento, la comunicación local y de amplia área, las soluciones de bases de datos de costo efectivo, la tecnología de almacenamiento mejorada y las cámaras digitales de alta resolución de costo efectivo y/o escáneres, la situación ahora ha cambiado Más algoritmos sofisticados, formalmente inefectivos debido a la céirencia del poder del CPU, no podrían aplicarse anteriormente a las secciones de tejido en un ambiente de rutina Sin embargo, dichos algoritmos ahora pueden usarse para evaluar y cuantificar ÍE S características específicas del tejido para realizar la cuantificacion y localizacion subcelular Al nismo tiempo, soporte mas completo para una evaluación visual más estandarizada y reproducible de las secciones del tejido ha llegado a estar disponible con base en la etapa inicial en el análisis de imágenes, a saber la creación y manejo de las imágenes digitales Esto es especialmente verdadero en los campos del control de calidad, el aseguramiento de la calidad y la estandanzaciorp Las imágenes digitales de casos difíciles pueden intercambiarse con referencia a los patólogos Vía la telepatología para lograr una segunda opinión Dichas imágenes también pueden ser efectivamente usadas para la valoración eficiente Las imágenes digitales también son la base de bases de datos de referencia de imagen poderosa, que pueden accesarse vía una red y juegan un rol ncrementadamente importante en la documentación de casos y los resultados de evaluación particularmente en reportes impresos o electrónicos completos Una vez que la porción del tejido es preparada, un patólogo examina visualmente el espécimen de .ejido bajo un microscopio Si el análisis de la imagen debe aplicarse con respecto a la porción, el microscopio deberá al menos equiparse con una cámara u otro dispositivo de captación de imágenes que se conecta a un sistema de computadora vía una interfase La cámara muestrea la inpagen microscópica óptica de la muestra del tejido vía el microscopio Como un resultado, una imagen digital se colecta en la memoria de la computadora y puede desplegarse en el monitor de la misma Sin embargo, la adquisición de estas imágenes digitales debe realizarse de manera que los detalles importantes de las imágenes ópticas aún se representan correctamente por los datos a macenados Generalmente, la siguiente etapa para una evaluación cuantitativa de las imágenes digitales es la segmentación, que algunas veces incluye una etapa intermedia adicional de pre-procesamientol Durante la segmentación, las células se separan una de la otra y del fondo de la imagen En alg unos ejemplos, los avances algorítmicos hacen posible segmentar las células abajo del nivel de componente sub-celular (es decir, núcleo, citoplasma y membranas) Aunque puede parecer una tarea fácil, la segmentación comúnmente es una etapa difícil propensa al error en el análisis de imágenes Para las porciones en donde las células se separan y marcan delicadamente en una forma que un buen contraste ocurre en la imagen digitalizada, la segmentación puede realizarse muy confiadamente en muchos casos. Tan pronto como una de las condiciones anteriores no se cumple, sin embargo, tienen que aplicarse algoritmos de segmentación que consumen tierr po y altamente sofisticados, que usan conocimiento a priori adicional acerca de las células y su i elación uno con otra o acerca del marcador y conteo de la marcación de la localización su -celular. Este es el caso, por ejemplo en los ejemplos de las secciones de tejido de tumores de infiltración, en donde la mayoría de las células no son más separadas delicadamente en la porción pero tienden a estar en contacto y traslapándose una a otra.

Usando un algoritmo basado en el marcador, es posible circunscribir la región de interés automáticamer te y dejar al patólogo decidir usar su propia experiencia objetiva, si la región presentada eí adecuada o necesita ser refinada manualmente. Una vez que las áreas significativas d una imagen se determinan, se lleva a cabo la extracción de la característica. Para cada célula (y sus componentes sub-celulares), un juego de características densitométricas, morfométricas, de textura y contextúales pueden medirse con un objetivo de caracterizar las células individuales y sus interacciones tan completamente como sea posible.

La últinha etapa es la presentación de datos sin procesar y la compilación de los mismos en los resultados y/o calificaciones significativos. La salida resultante de un sistema de análisis de imágenes deberá igualar deseablemente la forma de los sistemas de graduación semi-cuantitativa y/o visual ya én uso por le patólogo de manera que promueva la consistencia para ser más fácilmente apli cable o para ser capaz de ser interpretada en el uso de rutina.

La plataforma para la evaluación de las muestras de tejido vía el análisis de imágenes está cambiando más y más del analizador de imágenes de propósito general a "estaciones de trabajo de patología" dedicadas y especializadas configuradas para el trabajo de rutina. Dichas estaciones de trabajo combinan herramientas necesarias para proporcionar al patólogo con la información necesaria para derivar los mejores resultados posibles. Central a dicha estación de trabajo está el microscopio, posiblemente equipado con partes robóticas incluyendo una plataforma motorizada, un dispositivo de enfoque automático, un cambiador objetivo y un dispositivo de ajuste de intensidad de la luz. Los diferentes dispositivos de entrada, tales como las cámaras capaces de un enfoque automático rápido y la adquisición de imágenes de alta resolución están unidos a la estación de trabajo. La estación de trabajo puede ser parte de una Red de Área Local (LAN). La estación de trabajo también puede soportar diferentes protocolos de comunicación de manera que los canales de comunicación disponibles pueden usarse para conectar la estación de trabajo con otros lugares en el mundo (Red de Área Amplia o WAN).

Cuando se integra dentro de una LAN y/o WAN, la estación de trabajo puede otorgar el acceso a las bases de datos de referencia existentes y los Sistemas de Información del Hospital (HIS) de mane -a que cualquier nuevo caso a examinarse puede compararse con las imágenes y la información que acompaña a los casos de referencia que se han acumulado con el transcurso del tiempo. Ademeis, las imágenes adquiridas de las porciones bajo revisión pueden complementarse con la historia ael caso y del paciente. i La estación de trabajo del patólogo de preferencia se adecúa para una evaluación del tejido completo. Iniciando con la información y las imágenes digitales de la muestra de tejido inicial, pueden tomarse las imágenes de las porciones preparadas del tejido. La información del caso y del paciente, las imágenes por sí mismas y cualquier información cuantitativa acerca de los componentes felulares de la muestra del tejido pueden todas almacenarse en la misma base de datos.

Toda la información acumulada por la estación de trabajo para un caso, tal como las imágenes, los •esultados de la medición, los datos del paciente, los datos de preparación, pueden seleccionarse para ser parte de un reporte que puede imprimirse o firmarse electrónicamente vía la red. El reporte proporciona una imagen completa del caso bajo evaluación y facilita la exactitud y estandarización de la calidad.

Durante la segmentación/pre-procesamiento de las imágenes capturadas, muchas técnicas diferentes/algoritmos pueden implementarse para el análisis de imágenes, particularmente para video microscoDía cuantitativa en el campo de las aplicaciones de patología y biología celular, mediante usar as imágenes de espectro múltiple adaptadas para las cámaras de color (es decir, cámaras RGB 3CCD).

El anal sis efectivo de las imágenes microscópicas es esencial en la biología y patología celular, particularmente para la detección y cuantificación en el material genético (genes, ARN mensajero) o la expresión de esta información genética en la forma de proteínas, por ejemplo, amplificación de genes, omisión de genes, mutación de genes, número de moléculas de ARN mensajero o análisis de expresión de proteínas. La amplificación de genes es la presencia de demasiadas copias del mismo gen en una célula, en donde una célula usualmente contiene dos copias, de otra manera conocidas como alelos del mismo gen. La omisión de genes indica que menos de dos copias de un gen puede encontrarse en una célula. La mutación de genes indica la presencia de genes no funcionales o incompletos. Los ARNs mensajeros (mARN) son moléculas de información genética, sintetizados de la lectura de genes, que sirven como plantillas de la síntesis de proteínas. La expresión de las proteínas es la producción de una proteína dada por una célula. Si la codificación de genes para esta proteína es más regulada o demasiadas copias del gen o mARN están presentes, la proteína puede sobre-expresarse. Si el gen es menos regulado u omitido, el nivel de expresión de la proteína puede ser bajo o estar ausente.

Los conportamientos normales celulares se controlan precisamente por los mecanismos moleculares que involucran un gran número de proteínas, mARNs y genes. La amplificación de genes, la omisión de genes y la mutación de genes se conocen por tener un rol prominente en comportamientos celulares anormales a través de la expresión de proteínas anormales. El rango de los comporamientos celulares de inquietud incluyen los comportamientos tan diversos como, por ejemplo, proliferación o regulación de diferenciación. Por lo tanto, la detección efectiva y cuantificación en la amplificación de los genes, la omisión y mutación, los niveles de mARNs o los análisis de expresión de proteínas son necesapos para facilitar la búsqueda útil, el diagnóstico y las herramientas de pronóstico Existen numerosas técnicas de laboratorio dedicadas a la detección y cuantificación en la amplificación do genes, la omisión y mutación, los niveles de mARN o los análisis de expresión de la proteína Por ejemplo, dichas técnicas incluyen las hibridaciones Western, Northern y Southern, la reacción er cadena de pohmerasa ("PCR"), la prueba de inmuno-separación de enzima reticulada ("ELISA") y las técnicas de hibridación genómica comparativa ("CGH") Sin embargo, la microscopía se usa rutinariamente porque es una técnica informativa, permitiendo las investigaciones rápidas en los niveles celulares y sub-celulares, que pueden implementarse en un costo relativamente bajo Cuando la microscopía es la técnica de laboratorio seleccionada, las muestras biológicas usualmente primero padecen la detección específica y las preparaciones de relevación Una vez que las muestras se prepararon, un experto humano analiza las muestras con solo un microscopio o con un microscopio acoplado a una cámara y una computadora, permitiendo ambos un estudio mas estandarizado y cuantitativo El microscopio puede configurarse para el análisis completamente! automático, en donde el microscopio se automatiza con un foco y plataforma motorizados, cambiadores de objetivo motorizados, controles de intensidad de luz automática y los similares La preparación de las muestras para la detección puede involucrar diferentes tipos de técnicas de preparación que se adaptan al análisis de formación de imágenes microscópicas, tales como por ejemplo, técnicas de preparación basadas en inmuno-marcación y basadas en hibridación D chas técnicas de detección pueden acoplarse con las técnicas de revelación apropiadas, tales como por ejemplo, técnicas basadas en la reacción de color visible y basadas en fluorescencia La hibridación ¡n situ ("ISJ") y la Hibridación In Situ de Fluorescencia ("FISH") son técnicas de detección y evelación usadas, por ejemplo para la detección y cuantificación de la amplificación de información genética y los análisis de mutación. Ambos ISH y FISH pueden aplicarse a muestras histológicas y citológicas. Estas técnicas usan sondas complementarias específicas para reconocer las Secuencias precisas correspondientes. Dependiendo de la técnica usada, la sonda específica pu jede incluir un marcador químico (ISH) o un marcador fluorescente (FISH), en donde las muestras posteriormente se analizan usando un microscopio de transmisión o un microscopio de fluorescenc a , respectivamente. El uso de un marcador químico o un marcador fluorescente depende del objetivo del usuario, cada tipo de marcador que tiene ventajas correspondiente sobre los otros ejempl os particulares.

En el caso de los análisis de expresión de proteínas, las técnicas adicionales de inmunohistoquimica (IHC") e inmunocitoquímica ("ICC"), por ejemplo pueden usarse. La IHC es la aplicación de leí inmunoquimica a las secciones de tejido, en vista de que ICC es la aplicación de la inmunoquímica para las células cultivadas o las impresiones de tejido después de que han pasado por preparacic nes citológicas específicas, es decir, preparaciones basadas en líquidos. La inmunoquímice es una familia de técnicas basadas en el uso de anticuerpos específicos, en donde los anticuerpos se usan para marcar específicamente las moléculas dentro o en la superficie de las células. El anticuerpo, típicamente contiene un marcador que pasa por una reacción bioquímica y por medio de l<- cual experimenta un cambio de color, al encontrarse con las moléculas blanco. En algunos ejemp os, la amplificación de señales puede integrarse en el protocolo particular, en donde un anticuerpo secundario que incluye la marcación del marcador sigue la aplicación de un anticuerpo mopoclonal específico primario.

En ar?bos estudios de inmunomarcación e hibridación, los cromogenes de diferentes colores se usa . para distinguir los marcadores diferentes. Como estos marcadores pueden ser de compartimientcj) celular específico, este conocimiento a priori puede usarse para segmentar automáticamertite las células (es decir, separar las máscaras del núcleo de las máscaras de la membrana y/ citoplásmicas). En forma total, los algoritmos "colorimétricos" se dirigen a proporcionar la información de muestra para facilitar el diagnóstico y/o pronóstico del caso particular. Pare ilustración, la detección y cuantificación de los niveles de expresión de la proteína ER, PR y HER del pecho pueden proporcionarse usando un algoritmo de microscopio cuantitativo aplicado a las técnicas de inmunohistoquímica (IHC).

A la lu de dichas técnicas de análisis de imágenes, sin embargo, existe una necesidad para las mejoras que facilitan la flexibilidad en dicho análisis mientras se proporciona a un patólogo una información útil y exacta para permitir al patólogo formar un diagnóstico y/o pronóstico apropiado.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN Las necesidades anteriores y otras necesidades se cubren mediante la presente invención que, en una rmdalidad, proporciona un método de marcado de una muestra para la formación de ?l microscopio por medio de la cual, la imagen de la muestra marcada se configura para exhibir ur contraste óptimo ente los componentes sub-celulares para el diagnóstico por un patólogo. Dicho método comprende marcar una muestra con un tiente, determinando un valor de transmisión del tinte de una imagen microscópica de la muestra, formando una imagen artificial de la muestra del valor de transmisión determinado del tinte, variando el valor de transmisión del tiente de manera que forme una serie de imágenes artificiales, seleccionando una imagen, de la serie de imágenes, exhibiendo el contraste óptimo entre los componentes sub-celulares para el tinte y determinando el valor de transmisión correspondiente del tinte en una imagen y variando la marcación de la muestra con el tinte de manera que proporciones una muestra de marcado que tiene el valor qe transmisión del tinte correspondiente al contraste óptimo entre los componentes sub-celulares.

Otro as pecto de la presente invención comprende un método para marcar artificialmente una muestra. Dicho método incluye marcar una muestra con un primer tinte, determinando un valor de transmisión y un coeficiente de extinción del primer tinte desde una imagen microscópica de la muestra, forme ndo una imagen artificial de la muestra desde el valor de transmisión determinado del primer tinte y substituyendo un coeficiente de extinción de un segundo tinte para el coeficiente de extinción del primer tinte de manera que marque artificialmente la muestra con el segundo tinte.

Aún otro aspecto de la presente invención comprende un método para obtener las mediciones de una muestra desde una imagen del mismo. Dicho método incluye seleccionar una región de interé ?sS en la muestra desde una imagen RGB del mismo, la segmentación de la región de interés en la imagen RGB para identificar cualquier objeto de interés en el mismo, implementandc la extracción de la característica para determinar las mediciones para los objetos identificados do interés y determinar los resultados celulares con respecto a una ubicación del marcador y la señal para la proporción del ruido.

Un aspecto adicional de la presente invención comprende un método para seleccionar una región de interés en una porción, en donde la región está contrastada positivamente desde un borde del misrr o en una imagen solamente del marcador correspondiente a una imagen RGB de la muestra y la r gión positivamente contrastada incluye al menos uno de un núcleo relativamente más grande y una densidad celular relativamente mayor que el borde. Dicho método incluye aplicar un filtro de paso bajo a una imagen del marcador solamente de una muestra, en donde la imagen del marcador solamente se obtiene a través de la separación del cromogen de la imagen RGB de la muestra, determinando un histograma del marcador solamente de píxeles en la imagen del marcador solamente y binarizando la imagen del marcador solamente de conformidad con un umbral en el histograma del marcador solamente para así formar una máscara para discriminar entre las regiones negativa y positiva de la muestra.

Otro aspecto de la presente invención comprende un método de segmentar una muestra desde una i? magen de la misma. Dicho método incluye determinar un componente de fondo de una imagen RGB de la muestra vía un proceso de segmentación de imágenes, la segmentación de imágenes med ante crear una imagen componente de al menos una membrana, un citoplasma y un núcleo, depurando la imagen segmentada y filtrando cualquier objeto indeseado de la imagen Aún otro aspecto de la presente invención comprende un método para determinar los datos de densidad opt ica para al menos un tinte marcando una muestra, para una alta concentración del tinte desde una imagen obtenido con un dispositivo de formación de imágenes de bajos bits de resolución Dicho método incluye capturar una sene de imágenes de la muestra en diferentes tiempos de m te¡grac?ón, seleccionando una intensidad mucho más alta no saturada en cada uno de los canales roí o, verde y azul del dispositivo de formación de imágenes y reconstruyendo una imagen optim i2¡ada de la muestra usando los niveles de intensidad no saturados mucho más altos en los canales rojo, verde y azul de manera que la imagen optimizada es apropiada para la separación del cromogen Otro aspecto de la presente invención comprende un método de separación del cromogen para una imagen de una muestra biológica marcada con cuatro tintes obtenidos con un dispositivo de formación de imágenes de tres canales Dicho método incluye definir combinaciones de tres tintes significantes conocidas a priop de los cuatro tintes especialmente colocados en la muestra biológica, obteniendo una imagen de una muestra marcada con cuatro tintes con un dispositivo de formación de imágenes teniendo un canal rojo, verde y azul, tal como la imagen por ello incluye una pluralidad de píxeles cada uno teniendo un tpplete RGB correspondiente, proyectando cada RGB en un plano de coeficiente de extinción en donde Ecr+Ecg+Ecb=1 , determinando la combinación ele tres tintes de los cuatro tintes en el plano del coeficiente de extinción correspondientes a cada tpplete RGB y separando la imagen de la muestra mediante tabular una cantidad de pixeles en la imagen correspondiente a cada combinación de tres tintes en el plano de coeficiente de extinción Las modalidades de la presente invención ademas cubren las necesidades identificadas en este documento y proporcionan ventajas como se detallan posteriormente en este documento 1 /tiempo de integración IV = tiempo de integración.

Las Figuras 6-6C ilustran los datos con respecto a cada uno de los 4 tintes para marcar una muestra peira un procedimiento de separación de cromogenes de 4 tintes de conformidad con un aspecto de la presente invención.

Las Fi muras 7, 7A y 7B ilustran esquemáticamente los 4 tintes de las Figuras 6-6C representados sor el plano de coeficiente de extinción equivalente Maxwell y las 2 combinaciones de tres tintes ace ptadas de los mismos de conformidad con un aspecto de la presente invención.

La Figura 8 ilustra un campo PAP modificado de vista marcada con los 4 tintes de la Figura Las Figuras 8A-8D ilustran el campo PAP modificado de vista de la Figura 8 para cada uno de los 4 tinte separadamente desde los otros tintes usando la separación de cromogenes extendida y La Figí ra 9 ilustra un campo fuente (RGB) de la vista de una muestra, mientras la Figura 9A ilustra una muestra e-marcada simulada de la misma para dos de los cuatro componentes del tinte y la Figura 9B ilustra un PAP simulado solamente de la imagen e-marcada de la muestra reconstruida con todos los componentes del tinte excepto DAB.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención ahora se describirá más ampliamente en este documento con referencia a lo¡¡ dibujos que la acompañan, en los cuales, algunas pero no todas las modalidades de las invenciones se muestran. En efecto, estas invenciones pueden incorporarse en muchas diferentes formas y no deberán construirse como limitantes de las modalidades establecidas en este documento, mas bien que estas modalidades se proporcionan de manera que esta descripción cumplirá los requerimientos legales aplicables Los números parecidos se refieren a los elementos similares de principio a fin La Plataforma de Formación de Imágenes Microscópicas En un dispositivo de microscopio típico para la adquisición y procesamiento de imágenes, la imagen aumentada de la muestra debe primero capturarse y digitalizarse con una cámara Generalmente, as cámaras digitales de dispositivo de carga acoplada (CCD) se usan en microscopios eje luz o cuantitativos de fluorescencia Excluyendo los espectrofotómetros, dos diferentes tecucas generalmente se usan para realizar dichos estudios microscópicos colopmetpcos En una técnica, una cámara de blanco y negro (BW) CCD puede usarse En dicha ejemplo, una imagen de nivel gris de la muestra se obtiene, correspondiente a una luz monocromático que tiene una longitud de onda específica para el marcado de la muestra para ser analizada La longitud de onda especifica de la luz se obtiene mediante la filtración de una luz de fuente blanca vía un filtro de ancho de banda angosto específico o mediante controlar directamente la longitud d onda de la fuente de luz, usando controles electrónicos o manuales Por consiguiente, i sando esta técnica, el tiempo de análisis incrementa a medida que incrementan los colores porque una fuente de luz o un filtro debe seleccionarse para cada marcado de muestra diferente o cada longitud de onda diferente Por lo tanto, muchas imágenes diferentes de la muestra, most-ando la respuesta espectral de la muestra en diferentes longitudes de onda, debe capturarse individualmente en un orden secuencial para facilitar el análisis Cuando las escenas múltiples o campos de vista deben analizarse, el protocolo típico es automatizar la secuencia en un modo de lote para conservar el tiempo de procesamiento De conformidad con una segunda técnica, una cámara digital CCD de color se usa, en donde tres im ágenes de nivel gris de la muestra se capturan y obtienen simultáneamente Cada imagen de nivel gris corresponde a una imagen de nivel gris en cada uno de los canales Rojo, Verde y Azul respectivos (RGB) de la cámara de color CCD Cuando una cámara digital CCD de color se usa, en donde tres imágenes de nivel gris de la muestra se capturan y obtienen simultáneamente (cada imagen de nivel gris corresponde a una imagen de nivel gris en cada uno de los canales Rojo, Verde y Azul respectivos (RGB), las técnicas de separación de cromogenes pueden aplicarse, las cuales permiten la densidad óptica de cada especie molecular (reveladas por su cromogen asociado o tinte) para evaluarse en cualquier ubicación de la imagen (píxel). En la muestra biológica, los marcadores y marcas del contador generalmente indican los tintes para detectar y cua?tificar De conformidad con una tercera técnica surgiendo (es decir, usando una cámara de múltiples espectros JUMBOSCAN de Lumiere Technology) más de 13 imágenes de nivel gris de la muestra puedsn capturarse y obtenerse simultáneamente Este tipo de cámara/escaner incrementaría el potencial de las técnicas de separación del cromogen en la característica mediante incrementar el número de tintes que pueden resolverse simultáneamente para una muestra dada Sin tomar en cuenta, la concentración de la especie molecular puede determinarse de una imagen de color de la muestra, en donde la imagen de color incluye 3 o más canales En un sistema de viduo-microscopio equipado con una cámara 3CCD, la imagen deberá deseablemente balancearse y normalizarse de conformidad con una referencia blanca de campo vacío y una imagen de campo negro y posteriormente corregirse para oscurecimiento Por lo tanto, la imagen deberá corregirse espaciadamente en forma deseable para las aberraciones cromáticas, canal por canal Una densidad óptica de la muestra posteriormente puede computarse en cada uno de los canales de la imagen RGB en un pixel particular en la imagen, de la luz transmitida medida Un vector de densidad óptica correspondiente se forma posteriormente para ese píxel El vector de densidad óptica posteriormente se multiplica por la inversa de una matriz de coeficiente de absorción relat va de los tintes presentes en la muestra de manera que forman un vector resultante para el píxel, -epresentando las contribuciones de densidad óptica de cada tinte La matriz de coeficiente de absorción relativa comprende un coeficiente de absorción relativo para cada uno de los marcadores de tinte y marcadores del contador usados en el protocolo de preparación de la muestra, en cada uno de los canales rojo, verde y azul. El vector resultante además comprende la concentración (jle las especies moleculares, como se identifican por el marcador y por el marcado del contador para ese píxel.

Dichas técnicas de formación de imágenes, también conocidas como técnicas de formación de ¡fágenes de espectros múltiples, cuando se adaptan a la formación de imágenes de color (cámara RGB) permiten un procesamiento en tiempo real (rango de video) de la muestra (típicamente 40 milisegundos por cuadro), que proporciona una ventaja considerable. En efecto, para objetivos ae velocidad y procesamiento en tiempo real o propósitos de despliegue en el caso del uso de una cámara RGB, la adquisición a través de diferentes canales se realiza en tablas paralelas y de búsqueda (LUT) puede generarse, la cual mapea los valores de entrada del color RGB a concentraciones pre-computadas y/o la transmisión de cada uno de los tintes participantes.

Dichas técnicas se describen en mayor detalle, por ejemplo en las Publicaciones de Solicitud de Patente Norteamericanas Nos. US 2003/0091224A1 (Método para la video-microscopía cuantitativa y sistema asociado y producto de programa de software de computadora) y la US 2003/0138140A1 (Método para el sistema asociado y video-microscopía cuantitativa y producto de programa de software por computadora), ambos de Marcelpoil eí al. y asignados a Tripath Imagina Inc. también el cesionario de la presente invención, los contenidos de los cuales se incorporan en este documento en su totalidad como referencia.

La Ley Lambert -Beer La plataforma de formación de imágenes microscópicas se configura para analizar la muestra de conformidad con la ley Lambert-Beer. La ley Lambert-Beer generalmente describe una proporcionalidad que puede observarse entre la concentración de moléculas en una solución (la concentración ¿ie la "especie molecular" o la "muestra") y la intensidad de la luz medida a través de la solución. La ey Lambert-Beer típicamente se expresa como: OD = e • /• C (1) OD es la densidad óptica de la solución, e es la constante de proporcionalidad llamada extinción molar o coeficiente de absorción, í es el espesor de la muestra y C es la concentración de la especie mol cular. El coeficiente de absorción e es específico para la especie molecular y se expresa típicarnente en unidades de L mol'1 cm" Esta re ación de proporcionalidad definida por la ley Lambert-Beer se ha verificado bajo las varias condiciohes incluyendo, por ejemplo iluminación de luz monocromática de la muestra, baja concentración rtnolecular dentro de la muestra, generalmente no fluorescencia o heterogeneidad de respuesta a la luz (fluorescencia insignificante y difusión) de la muestra y la falta de fotosensibilidad química de la muestra. La ley Lambert-Beer puede tener requerimientos adicionales, sin embargo, tal como, por ejemplo la iluminación Koehler correcta de la muestra bajo el microscopio.

La iluminación Koehler se ofrece en casi todo el estado de los microscopios de la técnica y proporciona inóluso iluminación en el plano de la imagen, mientras permite el control de contraste efectivo. La iluminación Koehler es típicamente crítica para el análisis de densitometría. La iluminación Koehler correcta se proporciona, por ejemplo por un sistema de iluminación de dos etapas para el microscopio en el cual la fuente se forma en imágenes en la abertura del condensador de sub-etapas por un condensador auxiliar. El condensador de sub-etapa, a su vez, forma una imagen del condensador auxiliar en el objeto. Un diagrama del iris también puede colocarse en cada condensador, en donde el primer iris controla el área del objeto para ser iluminado y el segundo iris varía la apertura numérica del haz de iluminación.

La ley Lambert-Beer tiene una propiedad aditiva de manera, que si la muestra comprende varias especies moleculares de absorción de la luz, por ejemplo Si y s2, teniendo concentración respectiva C, C2, el OD de una muestra de espesor \ (en solución, íi = í2 = í) puede expresarse como: OD = e1 -/l C1+e2/2-C2 (2) Esta situación puede ocurrir, por ejemplo en un análisis biológico en donde una "escena" o campo de vista o porción de la muestra se ha marcado con dos tintes que consisten de un tinte marcador para señalar la especie molecular de interés y un marcado del contador para marcar el resto de la muefetra Corrección de la Aberración Cromática Para medir exactamente la concentración de especies dadas formadas en imágenes bajo un microscopio las mediciones de las densidades ópticas realizadas en diferentes longitudes de onda deberán corresponder a la misma porción de la muestra. Esto es, el sistema puede corregirse físicamente pana la aberración cromática o de otra manera, la corrección puede hacerse a través de otra método ogía tal como el programa.

La energía de dispersión natural del vidrio causa que un simple lente enfoque la luz azul en una distancia más corta que la luz roja. Esto es, un lente simple tiene diferentes longitudes focales para la luz de deferentes longitudes de onda (diferentes colores). Dos fenómenos ocurren como una consecuencia directa: 1 ) La diferencié en posición a lo largo del eje vertical de los puntos focales para la luz de la longitud de onda diferente se llama aberración cromática longitudinal. Esto es, cuando se enfoca la imagen para un color dado (verde, por ejemplo), las imágenes correspondientes a los otros colore tienten a estar ligeramer te fuera de foco (azul y rojo, en este ejemplo parecerán fuera de foco). 2) La diferencié en el aumento (longitud focal) para la luz de longitudes de onda diferentes se llama aberración cromática lateral. Esto es, la imagen de una longitud de onda azul (corta) parecerá más larga que la im agen de una longitud de onda roja (larga).

En sistemas con objetivos de alta calidad (objetivos apocromáticos), la aberración cromática se corrige. Si la aberración cromática de otra manera no es bien corregida estructuralmente, un método basado en el programa para corregir la aberración cromática lateral puede implementarse como sigue: 1 ) Determinar el coordinado del centro objetivo como se compara con el centro del chip de la cámare ; 2) Evaluar el factor de aumento observado para cada longitud de onda como se compara a una lor gitud de onda arbitrariamente seleccionada (usualmente la longitud de onda central, es decir, verde si se usa una cámara RGB) y 3) Volver á muestrear cada imagen de conformidad con su aumento relativo y el coordinado del centro objetivo.

Realización de la Separación del Cromogen Una vez que los microscopios se han establecido en el modo de iluminación Koehler para la adquisición de imágenes y cualquier aberración cromática se ha dirigido o se han usado los objetivos apocromáticos, la propiedad aditiva de la ley Lambert-Berr puede usarse para realizar la separación del cromogen usando ecuaciones algebraicas lineales.

Más particularmente, la propiedad del aditivo de la ley Lambert-Beer también puede expandirse a L na situación en la cual la escena se analiza en un ambiente de imágenes de color, tal como, por ejemplo, generadas por una cámara RGB que tiene canales separados rojo, verde y azul. En tal ejemplo, el tinte marcador (o "tinte 1") exhibiría coeficientes de absorción e1r, e1g y e1b, en los canales rojo, verde y azul, respectivamente. Notar que el análisis de la imagen en cada uno de los canales rojo, verde y azul esencialmente comprende analizar una representación roja de la imagen a través del espectro rojo, una representación verde de la imagen a través de espectro verde y una representación verde de la imagen a través del espectro verde y una representación azul de la imagen a través del espectro azul. Por consiguiente, el marcado del contador (o "tinte 2") exhibiría los coeficientes de absorción, e2r, e2g, y e2b, en los canales rojo, verde y azul respectivamente. Por lo tanto, de conformidad con la propiedad aditiva de la ley Lambert-Beer de la muestra en el ambiente RGB dirigiría al sistema de tres ecuaciones para la densidad óptica del mismo: ODr = e?X Cy e2X2'C2 (3) ODg = e1g /1 Cy e2g /2 C2 (4) ODb = e1b-frCy e2b f2-C2 (5) en donde ODr, ODg y Odb representan las densidades ópticas de la muestra medida en los canales rojo, verde y a2:ul respectivamente. Aún además, en el caso de la complejidad de preparación de muestra increrr entada tal como, por ejemplo, el tratamiento de las muestras con tres diferentes tintes, las ecuaciones (3), (4) y (5) llegan a ser: ODr = e,X. C, + e2X2 C2 - e3X3-C3 (6) ODg = e1g-/, C, + e2g /2-C2+ e3g /3-C3 (7) OD- = e1b -/, C. + e2b -f2 C2+ e3bX3 C3 (8) En dicha situación, los tres tintes pueden comprender, por ejemplo, un tinte marcador y dos marcados del contador o dos tintes del marcador y un marcado del contador, o incluso tres tintes del marcador separados. Esta propiedad de la ley Lambert-Beer puede expandirse para incluir una pluralidad incluso mayor de combinaciones de tinte. Sin embargo, el procedimiento de separación del cromogen descrito en este documento se enfoca en hacer uso de un dispositivo de captura de la imagen a color rápido con tres canales, tal como por ejemplo una cámara 3CCD RGB, para la formación de imágenes de múltiples espectros de los marcadores biológicos. Por lo tanto, debido a los 3 canales de información distintos (R, G, B) solamente tres ecuaciones pueden usarse en cualquier ubicación.

Al aplicar la ley Lambert-Beer a un sistema de microscopio digital, si es difícil y complejo, inexacto o algunas veces no es posible medir el espesor í de la muestra. Consecuentemente, la concentración C de la especie molecular puede extenderse y examinarse como el producto de í y C (J-C) y los resu tados se tratan por consiguiente. Por ejemplo, en donde la concentración de un tinte se está comparando a la concentración de otro tinte en una muestra particular, el término del espesor de la muestra será común para ambas concentraciones y además llega a ser menos importante para determinar el espesor de la muestra como un valor exacto y absoluto. Por lo tanto, se entenderá que una determinación exacta del espesor usualmente no se requiere, pero se asume la constante y por lo tanto generalmente es insignificante en el análisis descrito en este documento.

La aplicación de la ley Lambert-Beer al sistema de microscopio digital también reconoce que la ley Lampert-Beer puede expresarse como: OD(x.y) = log lo(x,y) - log l(x,y) (9) para una imagen digital de la muestra, en donde (x,y) significa un píxel particular en la imagen, OD(X?y) es la dfnsidad óptica de la muestra en ese píxel, l(x,y) es la intensidad de la luz medida o transmisión de la muestra en ese píxel y l0(X?y) es la intensidad de la luz de la fuente de luz como se mide sin la muestra que absorbe la luz. Por consiguiente: lOD = ?(log lo y) - log l(x,y) (10) N en donde lOD os la densidad óptica integrada de la imagen digital de la muestra, y N es el número de píxeles en la imagen de la superficie de la muestra. Una constante de proporcionalidad puede considerarse apropiadamente en donde las comparaciones relativas se trazan en las intensidades de luz. Además, en el microscopio cuantitativo de conformidad con la ley de Lambert-Beer, se conserva la rolación de proporcionalidad entre la densidad óptica OD de la muestra y las concentraciones del tinte.

Por lo lanto, para una muestra preparada examinada por el sistema de microscopio digital, la relación apropiada se expresa como: Inlo-lnl = InlJI = OD = e l-C (11) En donde, por ejemplo una cámara de RGB de 8 bits se usa en el sistema, la intensidad de la luz transmitida a través de la muestra se expresará como valores 28 (=256) entre 0 y 255. Por ejemplo, la inte¡nsidad inicial l0 de la fuente de luz, que corresponde a 100% de la transmisión, se expresará como valores cercanos a 255 (representando el valor más brillante posible) en cada uno de los canales rojo, verde y azul. En efecto, el operador ajustas el botón del recuadro de la cámara/fuente de luz de manera que la luz "blanca" pura en la ausencia de la muestra, correspondiente a la transmisión al 100%, tenga un valor de intensidad cercano a 225 en cada canal rojo, verde y azul, en vista de que en la ausencia de la luz, correspondiente al 0% de la transmisión, la "imagen en blanco" tendrá un valor de intensidad cercano a 0 en cada uno de los canales rojo, verde y azul. En cualquier píxel, la transmisión al 100%, l0, es por lo tanto expresada como la diferer cia entre el valor medido por la cámara en la presencia de la fuente de luz, menos el valor medido por la cámara en la ausencia de la fuente de luz, para cada uno de los canales rojo, verde y azul. Debido a que la intensidad de la fuente de luz puede variar parcialmente sobre el campo medido de la vista y porque los ópticos pueden absorber heterogéneamente la luz, la transmisión al 100% puede corresponder a rango dinámicos diferentes sobre el campo medido de la vista. La OD de la muestra se expresa (11) como el logaritmo del radio de la transmisión en la ausencia de la muestra (l0) y la transmisión en la presencia de la muestra (I) y por lo tanto es espacialmente grandemente independiente de las pequeñas variaciones den el rango dinámico real medido en el 100% de la transmisión.

Dado que la intensidad de la fuente de luz continúa sustancialmente constante en el tiempo o puede re-evdl uarse fácilmente, la lectura de la intensidad de luz en cualquier píxel puede por lo tanto traducirse! en una medición de la transmisión relativa en la ubicación del píxel para cada uno de los canales rojo, verde y azul. Una vez que l0 y I se conocen, la OD correspondiente puede computarse.

Cualquier ubicación en el campo de vista en donde un tinte único está presente (el matepal solamente de absorbencia) permite que los coeficientes de extinción relativos del tinte se midan para los diferentes canales RGB. Porque en la ecuación (1 ), /C es igual para cada uno de los canales RGB en una ubicación dada, si ambos /y C se conocen en esta ubicación particular el coeficiente de extinción exacto puede computarse como siendo ODI(f.C). El coeficiente de absorción e en cada uno de los canales rojo, verde y azul puede además extraerse consecuentemente como siendo: Cuando todos los coeficientes de extinción se han evaluado por diferentes tintes y las densidades ópticas se conocen a partir de la lectura de los datos de la imagen, resolviendo estas ecuaciones para extraer C,, C2 y C3 justo se involucra el resolver un juego de ecuaciones lineales.

Solución de Ec uaciones Algebraicas Lineales / Matrices Un j juego de ecuaciones algebraicas lineales aparece, por ejemplo como: (19) 3íí j+af2 2+aj3x3+...+3fw m=b? &2. ?+a2 x2+a23X3+ - - -+3?N N=b2 a31X?+a32x2+a 3x3+ .. +a3 N= 3 3MlXl+dM2x2+dM3 3+ - Aquí el N desconoce x,, j = 1 , 2 N se relaciona por las ecuaciones M. Los coeficientes con a,, con / = 1 , 2, ..., M y j = 1 , 2, ..., ?/ son números conocidos, como son las cantidades a mano derecha £),, / = 1, 2 , M.

S'\ M < (V, existen efectivamente menos ecuaciones que desconocidas. En este caso puede no haber solución o incluso más de un vector de solución x.

Si N = M entonces existen tantas ecuaciones como desconocidas y existe un buen cambio de solución para un juego de solución única de x/s.

Si M > N existen más ecuaciones que desconocidas, y existe en general, un vector de no solución x par la ecuación (1 ), el juego de ecuaciones se dice que está sobre determinado. En dicho caso, la polución más apropiada se considerará en general como el mejor ajuste de todas las ecuaciones (es decir, la solución minimiza la suma de errores de reconstrucción).

Ecuación (19) puede además escribirse en la forma de matriz como A x = b (20) Aquí (•) denota la multiplicación de la matriz, A es la matriz de coeficientes y b es el lado a mano derecha escrito como un vector de columna. Por convención, el primer índice en un elemento a¡¡ denota su fila, el segundo índice su columna. a„ o a[i] denota una fila completa a[i](j], = 1 , ..., /V.

La solución de la ecuación de matriz A x=b para un vector x desconocido, en donde A es la matriz cuadrada de los coeficientes y b es un vector a mano derecha conocido, usualmente requiere la determinación de A"1 que es la matriz inversa de la matriz A. x = A.rb (21) A'1 que es la matriz inversa de la matriz A, es decir, A A"1= A"1 • A = 1 , en donde 1 es la matriz de identidad. En un caso particular, las condiciones experimentales se establecen de manera que ex stan más ecuaciones (o números iguales) que desconocidos, M >N. Cuando M > N ocurre, existe, en general un vector x de no solución para la ecuación (19) y el juego de ecuaciones se dice que esta sobre determinado. Frecuentemente, sin embargo, la solución mejor "comprometida ' es una que llega a estar más cercana para satisfacer todas las ecuaciones simultáneamente. Si la cercanía se define en el sentido de los últimos cuadrados (es decir, que la suma de los c uadrados de las diferencias entre los lados a mano derecha e izquierda de la ecuación (19) se minimizan), entonces el problema lineal sobre determinado se reduce a un problema lineé I que se resuelve (usualmente), también referido como el problema de menos cuadros lineal, que puede resolverse usando la descomposición del valor singular (SVD). El SVD involucra el modelo paramétrico de los datos y es un método para resolver los problemas menos cuadrados más lineales. (RECETAS NUMÉRICAS EN C: EL ARTE DE LA COMPUTACIÓN CIENTÍFICA ( SBN 0-521-43108-5) Copyright (C) 1988-1992 por Cambridge University Press. Programs Copyright (C) 1988-1992 por Numerical Recipes Software).

En la aplicación de estos conceptos al presente caso, la determinación de la matriz e del coeficiente de absorción para diferentes tintes puede realizarse independientemente de la muestra de evaluación ¡y almacenarse para la aplicación adicional a las muestras tratadas con al menos uno de los tintes respectivos. Las soluciones de cómputo para todos los valores de píxeles posibles permite el procesamiento sustancialmente en tiempo real. Dado que en el ejemplo seleccionado de un dispositivo do adquisición de imágenes a color 3 CCD de 8 bits, la intensidad de luz medida 1 de una muestra oscila entre los límites de 0 y 255 en cada uno de los canales rojo, verde y azul, todos loa valores grises posibles (con respecto a la intensidad de luz original l0) puede pre-computarse (2563 en el caso de un sistema RGB de 8 bits) y almacenarse, por ejemplo, dentro de la computadora. Además, para una muestra marcada con un tinte particular, la intensidad de la luz transmitida I (o la densidad óptica OD) puede medirse en un píxel en cada uno de los canales rojo, verde y azul y entonces se comparan con los valores grises previamente almacenados y la matriz e de coeficiente c e absorción para el tinte particular para por lo tanto determinar la concentración de tinte C (o un estimado del mismo como el producto 1-C) en ese píxel. A este respecto, existen [256(rojo) x 2í¡6(verde) x 2556 (azul)] = 2563 soluciones para computar, proporcionando la elevación a un¡5 tabla de observación (LUT) de 16 megabites (datos sin procesar) para cada uno de los tintes. L s resoluciones de valores grises excediendo de 8 bits por canal conducirán a LUTs mayores (es decir, >1 gigabite si 10 bits por canal).

Marcado Electrónico De conformidad con un aspecto de la presente invención, los niveles de gris o los valores de transmisión RGB de una imagen artificial resultante de cualquier combinación de los tintes previamente e aminados pueden generarse dado que no existen más variables desconocidas. Como tal, para un píxel particular y sus concentraciones de tinte resueltas, las imágenes de tinte simple corresponderían a las intensidades de píxel RGB o de Blanco y Negro (BW): ODBW= C y lBW = Exp(ln(l0) - ODBW) (22) ODr= er C y lr = Exp(ln(l0) - ODr) (23) ODg= eg C y lg = Exp(ln(l0) - ODg) (24) ODb= eb C y lb = Exp(ln(l0) - ODb) (25) Cuando este proceso se aplica a cada píxel de una imagen digital capturada, una imagen artificial del m smo campo de vista puede generarse usando solamente la contribución respectiva de cualquiera de los tintes constituyentes Como tal, si los coeficientes de extinción de un tinte se intercambian cc n los coeficientes de extinción de otro tinte, entonces es posible estimular como la misma imagen artificial correspondiente a un marcador dado solamente se observaría a través de un microscopio, si el tinte usado para revelar este marcador se cambia a un tinte secundario Por lo tanto, usando la propiedad del aditivo de la ley Lambert-Beer, también es posible como se muest a en la Figura 1 , generar una imagen artificial en donde las contribuciones relativas de cada tinte se cambian, por ejemplo, usando coeficientes de peso absoluto o coeficientes de peso relativo (ver la ecuación 26-28 para una imagen de tinte electrónicamente marcada Ce-marcada") en donde la imagen RGB se reconstruye después de cambiar las proporciones del Tinte 1 y el Tinte 2 mediante el factor de peso W-, y w2 ODr= w, - er-C, + w2 e2r-C2 y lr = Exp(ln(l0) - ODr) (26) ODg= w-i - eg C, + w2-e2g-C2 y lg = Exp(ln(l0) - ODg) (27) ODb= w, - eb C, + w2 -e2b C2 ylb = Exp(ln(l0) - ODb) (28) Más particularmente, la Figura 1 ilustra un ejemplo del receptor de estrógenos (ER) en el cual una sene de imágenes de la misma célula (imagen original en una transmisión determinada de aproximadamente 32% se muestra circulada en rojo) en la cual la cantidad de un marcador (Café DAB) se cambia electrónicamente (artificialmente), después de la separación del cromogen, desde aproximadameite una transmisión del 22% a aproximadamente una transmisión del 40%, sin cambiar el conlenido de hematoxilina De esta manera, un contraste óptimo entre los componentes sub-celulares puede determinarse de las imágenes artificiales, así como la cantidad de tinte necesario para proporcionar el valor de transmisión correspondiente al contraste óptimo entre los componentes sub-celulares no señalados y los señalados de marcador específico Estrategia de Medición De conformidad con otro aspecto de la presente invención, una estrategia de medición puede basarse en y puede hacer uso de la técnica de separación de cromogen anteriormente descrita en rrluchos aspectos, permitiendo solamente el marcador de interés para ser específicamente medido, para las capacidades de e-marcado que permite que la segmentación de imágenes de centraste optimizado se genere.

La obtención de los resultados de medición de la imagen adquirida incluye varias etapas: 1) seleccionar la región de interés (región de tumor), 2) segmentación para identificar los objetos de interés en IÍI imagen y 3) caracterizar la extracción para calcular las varias características de medición para los objetos identificados y afectar los resultados celulares con base en, por ejemplo su localización del marcador y la proporción de señal a ruido. 1) Región de Pre-Selección de Interés Para reducir la carga de trabajo para el patólogo, una metodología de pre-selección se desarrolló para delinear automáticamente la región potencial de interés dentro del campo de vista que será la región usada para el análisis, en donde cualquier parte excluida además se excluye del análisis. Dicha metodología de pre-selección generalmente requiere dos factores a priori: • La "egión de interés se contrasta positivamente desde los bordes cuando se observa en la imagen solamente del marcador. ß Las células epiteliales blancos de cáncer que difieren de las células estroma por, por ejemplo, un gran núcleo e intensidad celular mayor.

Consecuentemente, un gran filtro de bajo paso puede aplicarse a la imagen de solamente el marcador res ultante de la técnica de separación del cromogen aplicada al campo RGB de vista. El histograma e solamente el marcador se mide (evitando las regiones de fondo con base en la imagen de luminiscencia) y posteriormente la imagen se binariza de conformidad con el mejor umbral en el histograma que podría discriminar dos clases (regiones negativa y positiva). Cualquier orificio pequeño se llena para la máscara final y suave. La máscara se delinea en la parte superior del campo RGB original de la imagen de vista para permitir el rechazo/aceptación por el patólogo, como se muestra en las Figuras 2 y 2A. Más particularmente, la Figura 2 ilustra un ejemplo PSMB9 y la Fig ura 2A ilustra un ejemplo HER2 de definición automática de la región de interés de conformidad coh una modalidad de la metodología de pre-selección descrita en este documento. La región de i iteres se computa o de otra manera se determina automáticamente y puede presentarse al patólogo para la aprobación y/o refinamiento final. Si el patólogo rechaza la máscara propuesta, las lerramientas de dibujo permitirán al patólogo seleccionar manualmente la región apropiada de interés 2) Estrategia de Segmentación La estrategia de segmentación incluye las siguientes etapas: » Determinación del fondo © Creación de la imagen del componente celular ® Segmentación de la membrana* © Segmentación del núcleo ß Segmentación del citoplasma o Refinamiento de la segmentación o Filt -ación de los objetos indeseados *En el caso de los marcadores de membrana, tal como Her2, una etapa específica adicional de la segmentación de membrana se realiza Varios ejemplos de dicha segmentación se muestran, por ejemplo en las Figuras 3-3A y 3B-3B, respectivamente. Más particularmente, la Figura 3 muestra un ejemplo PSMB9 (marcador citoplásmico) de la definición automática de la región de interés seguida por la segmentación subcelular en la Figura 3A. Dentro de la región de interés, las células automáticamente definidas se han segmentado, de manera que las máscaras del núcleo aparezcan en azul y los límites del citoplasma apóirezcan en rojo, mientras los píxeles del fondo se muestran en negro. La Figura 3B ilustra un ejemplo HER2 (marcador de membrana) de definición automática de la región de interés seguida por la segmentación sub-celular en la Figura 3C. Dentro de la región automáticamente definida, las células se han segmentado, de manera que las máscaras del núcleo aparecen en azul y la membrana aparece en verde, mientras los píxeles del fondo se muestran en negro. Un experto en la técnica apreciará, sin embargo, esas etapas de procesamiento de imágenes adicionales o refinamientos cjue pueden, en algunos casos, ser necesarios para adaptar dichos algoritmos genéricos al teji _lo o especificidades del marcador. 2a) Determinación del Fondo La primera etapa de la segmentación es dividir el contenido de la imagen en el frente y fondo. Dicha plataforma de imagen se designa para soportar el microscopio de campo brillante, los objetos aparecerán más oscuros que el fondo brillante. Para crear una máscara del fondo para una imagen, la imagen se convierte en una imagen de luminiscencia y un nivel del umbral del fondo se calcula. Cada píxel que tiene un valor de luminiscencia arriba del nivel de umbral del fondo se considera para pertenecer al fondo. Inversamente, cualquier píxel con menos luminiscencia que el umbral pertenece al fondo que se ha procesado además en las etapas siguientes.

Determ inar este valor de umbral de fondo involucra suavizar la imagen de luminiscencia y calcular el histegra ma de la imagen suavizada. Entonces el histograma se escanea, iniciando en el extremo mayor , para un mínimo local para usarse para el valor de umbral. La búsqueda se limita cuando una tránsm ¡sión arbitraria del 90% se alcanza, lo cual se traduce para el caso de las imágenes de 8 bits, en el valor de 230. 2b) Creación de la Imagen del Componente Celular En la Siguiente etapa de la segmentación, las imágenes del componente celular para el núcleo y el ci topló asma se crearon usando las técnicas de separación del cromogen previamente descritas. La Reparación se inició de conformidad con la especificación de la contribución de la densidad óptioa de cada tiente para el componente celular específico. Aquellas imágenes del componente entonces se usan como entrada para las etapas de segmentación del citoplasma y núcleo subsecuentes Las imágenes del componente se basan en las capacidades de e-marcado y generan las imágenes que mejor contrastan con el compartimiento celular marcado de las regiones cercanas. 2c) Segmentación de la membrana La segmentación de la membrana se realiza usando las siguientes etapas: - Ene ontrar el valor promedio sobre la imagen completa que no es el fondo. • Llenar cualquier ubicación en la imagen con su valor medio, si el valor local es más brillante. - Encontrar la membrana mediante generar la diferencia de imagen entre los núcleos de circunvolución de suavizado menor. <¡> Binarizar la imagen de contraste resultante con base en el contraste local medido. - Extraer el esqueleto de las máscaras de membrana candidatas. ® Orr itir cualquier pieza del esqueleto más pequeña que una longitud mínima solicitada, o Expandir el esqueleto de las máscaras de membrana por un píxel en cualquier dirección y conservar solamente las máscaras de membrana que caen debajo del esqueleto.

La s egmentación de la membrana se realiza primero para facilitar la segmentación adicional del nificleo , dado que las membranas generalmente se espera que separan el núcleo uno del otro. 2d) Segmentación del Núcleo En el jmbral del proceso de la segmentación del núcleo, tanto los valores de píxel de mediana y medio de la imagen componente del núcleo se calculan bajo consideración de la máscara del fe ndo. Lo mayor de estos valores se usa para crear una máscara de núcleo inicial a través del umbral de la imagen del componente del núcleo con este valor. Cualquier píxel que tiene un valor mayor que este umbral se establece al valor de umbral de manera que solamente los píxeles que tie nen un valor menor permanecen con su valor original en esta máscara de núcleo inicial. Si las máscaras de membrana están disponibles, cualquier píxel de máscara de núcleo potencial que i c$e dentro de una máscara de membrana se elimina.

Esta müscara de núcleo inicial o preliminar posteriormente se pasa abajo con un núcleo de 1.5 veces el téimaño de núcleo esperado para preparar la máscara de núcleo inicial para un procedimiento de segmentación o transformación de momento decisivo. La salida del procedimiento de segmentación de momento decisivo se combina con la máscara de núcleo inicial de manera quo solamente los píxeles de la máscara se establecen en donde la imagen de momento decisivo tiene cuencas de captura y la máscara de núcleo inicial tiene un valor de pixel por debajo de valor de umbral. La máscara de núcleo resultante posteriormente se finaliza mediante una etapa de limpieza incluyendo los orificios de llenado que tienen un área menor que aproximadamente un quinto del tamaño de núcleo esperado y removiendo los objetos que son más pequeños que aproximadamente un cuarto del tamaño de núcleo esperado. 2e) Segmentación del Citoplasma El proceso de segmentación del citoplasma usa un avance de dos vías para crear la máscara del ci tpplasma. Ambas vías usan la máscara del núcleo creada en la etapa previa como el punto de umbral Primero, la máscara del núcleo se invierte y se transforma a distancia. La primera máscara de c topl ae sma potencial se crea mediante binarizar la salida de la transformación a distancia de manera que todos los píxeles dentro del tamaño de célula esperado se incluyen en la máscara resultante Para enmascarar solamente el fondo, el la primer máscara de citoplasma potencial resu tante postepormente se combina con la máscara del fondo. Para la segunda máscara de cciitoplasma potencial, la máscara del núcleo de nuevo se invierte y posteriormente se transforma en el momento decisivo. Tanto la primera y segunda máscaras de citoplasma potencial p poosstteerriioorrmmeennttee se combinan para crear la primera máscara de citoplasma final. 2f) Refinamiento de la Segmentación Una ve2 que las máscaras de segmentación del citoplasma y el núcleo se han establecido, aquellas máscaras además se refinan usando el conocimiento de las máscaras combinadas Iniciando con la máscara del citoplasma, cada objeto segmentado en la máscara del citoplasma se identifica y se asocia con una imagen marcada, en donde cada objeto se identifica por un valor de píxel único Debido a la transformación de momento decisivo en la segmentación del citoplasma, los objetos marcados se separan uno de otro Como tal, la imagen marcada se dilata una vez para reconectar los objetos marcados La imagen marcada posteriormente se usa para refinar la máscara del núcleo Esto es, cada objeto marcado se binapza usando un umbral individual Para cada objeto marcado, el proceso es como sigue « Calcular el histograma para cada píxel perteneciente al objeto marcado y determinar el valor de píxel medio o Determinar un límite inferior y superior para la búsqueda del umbral El límite superior se determina mediante la integración del histograma iniciando desde el límite superior hasta que 20% del área del objeto se acumula El límite inferior se determina en una manera similar mediante integrar el histograma desde el limite inferior hasta que 20% del tamaño del núcleo esperado se acumula <* Si el límite inferior es menor que el limite superior, el umbral se calcula mediante aplicar el análisis de discriminación Fisher al rango de valores en el histograma entre los límites, de otra manera, el umbral es el valor medio de los límites inferior y superior ß Volver a dibujar el objeto en la máscara del núcleo mediante binanzar la imagen del componente del núcleo usando el valor de umbral justo determinado Después, los orificios en la máscara del núcleo que tienen un área menor de aproximadamente un quinto del tamaño del núcleo esperado se rellenan Para prevenir la bajo • OD máxima Cada característica se computa para el núcleo, el citoplasma y/o la célula completa, así como para cada uno de la luminiscencia, el tinte del marcador y el tinte de la marca del contador.

Usando la transmisión media determinada de la OD media, otro criterio de falla/paso se aplica a la célula. Esto es, si la transmisión media de la célula es mayor que un valor de umbral especificado en la configuración de la segmentación, la célula no se considera más y se desecha. 3a) Resultado Cjelular Con base en las características evaluadas para cada célula, un resultado puede atribuirse a esa célula despendiendo de la intensidad del marcador y la señal de proporción de ruido del mismo en el compartimiento señalado. Una célula se considera positiva cuando el contenido del marcador de esa célula en la densidad óptica del compartimiento señalado específico del marcador (intensidad) es significativamente mayor que en los compartimientos cercanos. Por ejemplo, si el marcador es ur marcador del núcleo, el contraste o señal para la proporción de ruido, se computa desde la medición de la densidad óptica específica del marcador en el núcleo en contra de de la densidad óptic a medida sobre el citoplasma. Porque el ruido de fondo no es específico por definición, la densidad óptica media del fondo total se mide sobre todo el compartimiento del citoplasma de l s células dentro de la región seleccionada de interés.

Marcador del Núcleo: Célula SNR = Núcleo MOD/Citoplasma MOD (28) Para facilitar la correlación óptima con el como el conocimiento del patólogo, el contrate requerido para designar una célula como siendo positiva puede adaptarse de lo fuerte a lo débil, dado que algunos patólogos consideran solamente núcleos muy intensos como siendo positivos, mientras que otros patólogos consideran cualquier marcado positivo casi imperceptible como siendo positivo. Dicha determinación positiva subjetiva con base en el nivel de contraste puede también afectarle por la patología particular siendo considerada.

Una célula es positiva para un marcador del núcleo si NúcleoMOD>CitoplasmaMOD+max[e, k(l-CitoplasmaMOD)] (29) • Pam ER (receptores del estrógeno) si se encuentra que e =0.02 y k = 0.1 1 ß Para PR (receptores de la progesterona) si se encuentra que e = 0.02 y k = 0.20.

Por consiguiente, como se muestra en la Figura 4, cualquier célula debajo de la curva es negativa y de ctra manera positiva. Esto es, la Figura 4 ilustra las curvas de OD del núcleo y el SNR definiendf, para el ER y PR, el estado negativo y positivo de una célula. Para dichos marcadores del núcleo, le Señal para la Proporción de Ruido (SNR) se evalúo como un radio de la OD del núcleo jara la OD de marcador citoplásmico. Si una célula cae arriba de la curva (esquina derecha superior) la célula se considera positiva y de otra manera negativa. Generalmente, entre más fuerte es la intensidad del núcleo, es menor la SNR que debe estar para llamar la célula positiva (y viceversa). 3b) Resultado Total Un resultado total puede atribuirse a un caso que refleja, para ese caso, la información solicitada por e l patólogo para establecer su diagnóstico/pronóstico. Resultado Total = 100*# células positivas/* células en ROÍ (30) En el caso de las pruebas ER y/o PR, el resultado total solicitado por el patólogo es el porcentaje de células positivas dentro de la región del tumor. Por lo tanto, una vez que el patólogo está confiado en su diagnóstico/pronóstico de la región propuesta de interés (dibujada manualmente ¡o automáticamente propuesta), el porcentaje de células positivamente resultantes se reporta.

Concepto de Integración Para investigar adicionalmente la contribución OD de los diferentes tintes cuando las concentraciones son muy altas y las limitaciones de la forma de bits de la cámara se alcanza, una estrategia basada en la integración del tiempo (velocidad de obturación) de la cámara puede implementarse. Esto es, el mismo campo de vista se forma en imágenes con la misma cámara, pero con diferentes tiempos de integración. Como se muestra en las Figuras 5 y 5A, la OD medida se normaliza con el tiempo de integración y medido, se retienen los valores no saturados correspondientes al tiempo máximo de integración en cada canal. Más particularmente, la Figura 5 muestra una célula particular con mayor intensidad del marcador que es capturada en imagen usando diferentes tiempos de integración (4000s'1 a 250s"1) para mejorar la resolución de los bits en las regiones más oscuras. De conformidad con esta metodología, la pixelación de la imagen de cromogen separado en el núcleo (solamente hematoxilina) sustancialmente desaparece cuando la resolución de bit apropiado se usa. La Figura 5A muestra las intensidad de luz transmitidas RGB, así como los valores de OD normalizada en tiempo para un píxel representativo capturado usando tiempos diferentes de integración (4000s'1 a 250s"1) para mejorar la resolución de bits en las regiones más escuras como se muestra en la Figura 5. La mejora en la resolución de bits se deriva de los valores de intensidad de luz transmitidos RGB que se seleccionan en cada uno de los canales RRGB para el tiempo de integración antes de la saturación.

Rompimiento del Límite 3D Usando la Entrada RGB: Separación del Cromogen 4D Un ejemplo de dicho procedimiento para la separación del cromogen 4D se proporciona por una comb nación de 4 tintes para un procedimiento PAP modificado, como se muestra en las Figuras 6-6A a saber Hematoxilina (Figura 6), Eosina (Figura 6A), Verde (Figura 6B) y DAB (Figura 6C). ?n este ejemplo, 3 canales (R, G, B) comprenden los canales de entrada, con 4 desconocidas (tintes). En dicho ejemplo, puede usarse un conocimiento a priori. Los tintes se representan en un plano equivalente Maxwell que incluye el plano del coeficiente de extinción en donde EcR+EcG+EcB =1. En este plano un tinte se representa por una ubicación XY única. En cada ubicación XY del plano, los tripletes RGB diferentes que muestran transmisión diferentes (intensidades diferentes de un tinte dado) pueden presentarse, en donde en el presente ejemplo, un triplete RGB |ue tiene lo más cercano a 50% de la transmisión se muestra en la Figura 7. Más particularmente, la Figura 7 muestra tripletes RGB diferentes, tal como el triplete RGB más cercano al 50% de la transmisión. Cada tinte se proyecta en el plano Ec basado en sus coeficientes de extinción en los canales rojo, verde y azul del dispositivo de captura de la imagen (cámara), con cada tinte siendo representado por su letra inicial.

Con respecto a la naturaleza de sus tintes respectivos, existen dos configuraciones de 3 tintes aceptada s entre 4 posibles configuraciones de los tres tintes, como se muestra en las Figuras 7A y 73, respectivamente, en donde estas dos configuraciones de 3 tintes son cada una resaltada por i n triángulo circundante. De un conocimiento a priori, se conoce que es poco probable que odos los 4 tintes estén significativamente presentes en la misma ubicación geográfica con respecto a la muestra. Por lo tanto, la separación del cromogen en este ejemplo considera solamente 3 configuraciones de tintes en donde los tres tintes podrían ubicarse con respecto a la muestra. Más particularmente, la Eosina y el Verde son tintes principalmente citoplásmicos que marcan las células con diferentes atributos citoplásmicos. Consecuentemente, estos tintes no están comúnmente presentes en la misma ubicación con respecto a la muestra aunque debido a la ubicación de la Hematoxilina entre la Eosina y los tintes Verdes en este plano de Coeficiente de extinción, una mezcla de Eosina y Verde podrían ser mal interpretados como Hematoxilina (pero es muy poco probable que se mal interprete para DAB).

Además para resolver el problema de 4D, el procedimiento de separación del cromogen se aplica mediants observar para cada triplete RGB de este FOV, en donde en la ubicación XY del mismo, podría localizarse el marcado correspondiente, la ubicación XY siendo la ubicación en ei plano de coeficiente de extinción en donde EcR+EcG+EcB=1. En este plano, la configuración 3D circundante o por omisión mediante la configuración 3D más cercana, se determina y usa para resolver las ecuaciones para la densidad óptica para los 3 tintes correspondientes, mientras la densidad óptica del tinte restante se establece en 0. Un experto en la técnica notará que la mayoría de las ubicaciones XY de los tripletes RGB investigados deberá caer dentro de una de las 2 configuraciones de 3 tintes aceptada. La Figura 8 ilustra un campo de vista que tiene todos los 4 tintes representados (es decir, un campo de vista de PAP modificado típico en donde los 4 tintes se representan, en donde la célula central oscura es DAB positiva, como se muestra en la Figura 8B). Las Figuras 8A-8D ilustran el mismo campo para cada uno de los 4 tintes.

Adaptación U tra-Rápida del Escáner para la Búsqueda de las Células Positivas DAB en un Ambiente PAP Modificado Los asipectos descritos de la separación del cromogen 4D y el e-marcado pueden, en algunos ejerr píos combinarse para formar otro aspecto de la presente invención. Más particularmenlje, en continuación del ejemplo anterior dirigido al uso de DAB y la Hematoxilina, un escáner puece implementarse que es capaz de leer las porciones del PAP modificado (una solución de emento raro DAB positivo), como se muestra en la Figura 9 (una imagen RGB de un campo de vista original). Entonces, con base en la separación del cromogen 4D y los procedimientos de e-marcado, la situación del 4 tinte puede resolverse. Una vez resulta, una imagen simulada puede reconstruirse usando un proceso de "e-marcado" que incluye solamente las contribuciones DAB y Hematoxilina, como se muestra en la Figura 9A. Además, la Hematoxiline y los canales solamente DAB podrían usarse como una entrada al escáner, de manera que el escáner podría configurarse para capturar una imagen de "solamente Hematoxilina y DAB", que podria producir una imagen sustancialmente la misma como se muestra en la Figura 9A. Además, una imagen de solo PAP simulada podría reconstruirse usando solamente las contribuciones de Hematoxilina, Eosina y Verde como se muestra en la Figura 9B.

Tomando a Distorsión de RGB en Consideración Para acomodar y/o compensar la distorsión RGB debido a la ruta de la imagen, los electrónicos y/o variaciones de marcado, puede considerarse una modificación de la separación del cromoc en. Esto es, la formación de imágenes de un material biológico marcado con solamente un tinte demuestra que el modelo del coeficiente de extinción que puede calcularse de cada triplete RGB dentro de la fuente FOV, varia ligeramente alrededor de la medición aceptada promedio. Consecuentemente, cuando una mezcla de tinte está presente, las soluciones múltiples de las mezclas de tiente podrían ser el de facto aceptado o aceptable. Diferentes fuentes de ruido podrían ser responsables de dicha distorsión RGB. Por ejemplo, adquirir la imagen con una cámara CMOS en lugar de una cámara 3CCD podría ser un factor.

Para compensar estas distorsiones, la solución de contribución respectiva al tinte para un triplete RGB dado y un modelo de tinte múltiple dado se computa en una manera ligeramente diferente. Más particularmente, el triplete RGB bajo investigación se considera como el centro de una esfera en el espacio del RGB que tiene un radio r dado. Todos los tripletes dentro de esta esfera se investigan para sus soluciones de contribución de tinte y las soluciones se promedian para cada tinte para todos los tripletes RGB que satisfacen el modelo de combinación de tinte. Si el triplete RGB no pertenece al modelo de combinación de tinte, el triplete RGB más cercado dentro de la esfera para el modelo de combinación de tinte es retenido como la solución candidata más potencial.

Procedimientos Dinámicos Tradicionalmente, todos los algoritmos y procedimientos computacionales usados en las aplicaciones de microscopio cuantitativo se implementan o construyen en el sistema por los ingenieros de jrogramas. Como tal, cada liberación de programa generalmente incluye un equipo limitado de algoritmos, que no pueden cambiarse sin modificación del programa ("actualizaciones de programa") Por ejemplo, una aplicación puede calcular el porcentaje de células positivas en una porción media ite calcular la proporción del número de células que tiene una densidad óptica media (MOD) de un mancha del marcador en el núcleo celular mayor que un valor de umbral para el número total ríe células en la porción. En una aplicación tradicional, el valor de umbral puede configurarse pero la fórmula usada para calcular la proporción continua fija, siempre compara el número de cé ulas sobre un cierto umbral para el número total de células. Incluso si un procedimiento i algoritmo permite el valor de umbral para variar en base en otras características extraídas, las fórmulas usadas para determinar el umbral aún son fijas.

Por consiguiente, otro aspecto de la presente invención comprende una metodología por medio de la cual los algoritmos o procedimientos se configuran para ser dinámicos (es decir, produciendo rebultados con base en las fórmulas ingresadas por el usuario). Esto es, en lugar de los algoritmos o procedimientos siendo codificados directamente en el programa, el programa puede evaluar las fórmulas a usarse en el tiempo de ejecución de análisis real. Más ppaarrttiiccuullaarrmmeennttee, una aplicación de microscopio cuantitativo implementando dichos algoritmos dinámicos prirrero calcula o de otra manera determina un juego general de características en varios niveles, ncluyen un nivel de porción, un nivel de centro TMA, un nivel de campo y un nivel celular. Dichas características generales pueden llegar a ser indistinguibles, además definiendo diferentes "var ables" que pueden combinarse en varias formas una con la otra usando por ejemplo, opera ciones matemáticas estándares, para formar características de nivel superior o para definir funciones. Como tal, en el tiempo de ejecución del análisis, la aplicación cargaría la lista de características siendo indistinguibles y las fórmulas aplicables. Cuando una fórmula es necesaria en el análisis, esa fórmula es dinámicamente evaluada y las características siendo indistinguibles usadas para a terar la fórmula son necesarias. Si una fórmula se recalcula frecuentemente, o es suficientemente compleja, dicha fórmula o porción de la misma puede compilarse para agilizar la ejecución. ¡ Dicho método además permite el juego de algoritmos o procedimientos implementados por la aplicación para ser actualizados, agregados o de otra manera modificados en el campo, sin requerir ninguna modificación externa al programa. Como tal, la aplicación proporciona flexibilidad a los usuarios, dado que la nueva funcionalidad puede crearse, como es necesario y/o deseado, sin requerir ningún desarrollo de programa externo complejo. Dichas funciones pueden por ejemplo, generar resultados numéricos para las porciones, centros, campos o células. Además o en la alternativa, dichas funciones pueden proporcionar una capacidad de filtración. Como un ejemplo de la aplicación de dichas funciones, un usuario puede definir una función que calcula un porcentaje positivo, como se describió anteriormente, en donde las fórmulas dinámicas pueden también usarse para definir una función que permite un despliegue para las células, campos o centros "positivos" resaltados. Dichas fórmulas dinámicas también pueden usarse para definir los rangos para los valores normales esperados o los recipientes nombrados tales como "0", "1+", "2+", etc.

Muchas modificaciones y otras modalidades de las invenciones establecidos en este documento llegarán a estar en mente de un experto en la técnica que estas invenciones pertinentes tien sn el beneficio de las enseñanzas presentadas en las descripciones precedentes y los dibujos asDciados. Por lo tanto, se entiende que las Invenciones no se limitan a las modalidades específicas descritas y que las modificaciones y otras modalidades se intenta que estén incluidas dentro del alcance de las reivindicaciones anexas. Aunque términos específicos se emplean en es e documento, se usan en un sentido descriptivo y genérico solamente y no para propósitos de limitación.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para marcar una muestra para la formación de imágenes en un microscopio por medio del c ial la imagen de la muestra marcada se configura para exhibir un contraste óptimo entre los coimonentes sub-celulares para el diagnóstico por un patólogo, dicho método comprendiendo marcar Lina muestra con un tinte; determinar un valor de transmisión del tinte desde una imagen en el microscopio de la muestra, formar una imagen artificial de la muestra del valor de transmisión determinado del tinte, variar ? valor de transmisión del tinte de manera que forme una serie de imágenes artificiales, seleccionar una imagen, de la serie de imágenes exhibiendo el contraste óptimo entre los componentes sub-celulares para el tinte y determinar el valor de transmisión correspondiente del tiente en una imagen y variar el marcado de la muestra con el tinte de manera que proporcione una muestra marcada que tiene el valor de transmisión del tinte correspondiente al contraste óptimo entre los componentes sub-celulares.

2. Un método de conformidad con la reivindicación 1 , en donde variar el valor de transmisión además comprende variar el valor de transmisión del tinte mediante aplicar uno del coeficiente de peso absoluto y un coeficiente de peso relativo a una densidad óptica correspondiente al mismo.

3. Un método de conformidad con la reivindicación 1 , que además comprende determinar una cantidad del tinte requerido para marcar la muestra de manera que proporcione una muestra marcada que t ene el valor de transmisión del tinte correspondiente al contraste óptimo entre los componentes sub-celulares.

4. Un método de conformidad con la reivindicación 1 , en donde determinar un valor de transmisión del tinte además comprende determinar un valor de transmisión del tinte en cada uno de un canal rojo, un canal verde y un canal azul de la muestra de microscopio de la muestra.

5. Un método para marcar artificialmente una muestra, dicho método comprendiendo: marcar una muestra con un primer tinte; determi ar un valor de transmisión y un coeficiente de extinción del primer tinte en cada uno de un canal rojo, un canal verde y un canal azul de un espacio de color RGB de una imagen en el microscopio de la muestra, formar jna imagen artificial de la muestra del valor de transmisión determinado del primer tinte en cada i no de los canales rojo, verde y azul y sustituir un coeficiente de extinción de un segundo tinte para el coeficiente de extinción del primer tinte, en cada uno de los canales rojo, verde y azul, de manera que marque artificialmente la muestra con el segundo tinte en el espacio de color RGB.

6. Un método para obtener las mediciones de una muestra de una imagen de la misma, comprendiendo seleccionar una región de interés en la muestra de una imagen RGB de la misma mediante: seleccionar una región positivamente contrastada de un borde de la misma en una imagen solamente del marcador correspondiente a la imagen RGB, la región positivamente contrastada incluyendo al menos uno de un núcleo relativamente mayor y una densidad celular relativamente alta que el borpe, segm ntar la región de interés en la imagen RGB para identificar cualquier objeto de interés en la misma mediante: aplicar un filtro de paso bajo a la imagen solamente del marcador de la muestra, la imagen solamente del marcador siendo obtenida a través de la separación del cromogen de la imagen RGB de la mueutra, determinar un histograma solamente del marcador de píxeles en la imagen solamente del marcador y binarizar la imagen solamente del marcador de conformidad con un umbral en el histograma solamente del marcador de manera que se forme una máscara para discriminación entre las regiones positiva y negativa de la muestra; implementar la extracción de la característica para determinar las mediciones para los objetos de interés identificados y determinar los resultados celulares con respecto a al menos una de la ubicación del marcador y la proporción de la señal al ruido.

7. Un método de conformidad con la reivindicación 6, en donde determinar un histograma solamente del marcador además comprende determinar un histograma solamente para el marcador para las regiones de no fondo de la imagen solamente del marcador, las regiones de no fondo siendo determinadas de una imagen de luminiscencia de la muestra.

8. Un método de conformidad con la reivindicación 6, que además comprende llegar cualquiera de os orificios indeterminados en la máscara, siguiendo la binarización de la imagen solamente de marcador, de manera que forme una máscara lisa definiendo aberturas correspondientes a las regiones positivas de la muestra.

9. Un método de conformidad con la reivindicación 8, que además comprende sobreponer la máscara lisa en la imagen RGB de la muestra de manera que las regiones positivas de la muestra en la imagen RGB aparece a través de la máscara lisa.

10. Un método para seleccionar una región de interés en una porción, la región siendo contrastada positivamente desde un borde de la misma en una imagen solamente del marcador correspondiente! a una imagen RGB de la muestra, la región positivamente contrastada incluyendo la menos uno de un núcleo relativamente más grande y una densidad celular relativamente mayor que el borde, comprendiendo: aplicar jn filtro de bajo paso a una imagen solamente del marcador de una muestra, la imagen solamente del marcador siendo obtenida a través de la separación del cromogen de la imagen RGB de la muestra, determinar un histograma solamente del marcador de píxeles en la imagen solamente del marcador y binarizár la imagen solamente del marcador de conformidad con un umbral en el histograma sol imente del marcador de manera que forme una máscara para discriminación entre las regiones positiva y negativa de la muestra.

1 1. Un método de conformidad con la reivindicación 10, en donde determinar un histograma solamente del marcador además comprende determinar un histograma solamente del marcador para las regiones de no fondo de la imagen solamente del marcador, las regiones de no fondo siendo determinadas desde una imagen de luminiscencia de la muestra.

12. Un método de conformidad con la reivindicación 10, que además comprende llenar cualquier orificio indeterminado en la máscara, siguiendo la binarización de solamente el marcador de manera qu forme una máscara lisa definiendo las aberturas correspondientes a las regiones positivas de la muestra.

13. Ui método de conformidad con la reivindicación 12, que además comprende sobreponer la ?náscara lisa en la imagen RGB de manera que las regiones positivas de la muestra en la imagen RGB aparezcan a través de la máscara lisa.

14. Un método para segmentar una muestra de una imagen del mismo, comprendiendo: determinar un componente de fondo de una imagen de RGB de la muestra vía un proceso de umbral mediante: convert r la imagen RGB a una imagen de luminiscencia correspondiente y determinar un nivel de luminiscencia de umbral de fondo de la imagen de luminiscencia con los píxeles de imbral anteriores en la imagen de luminiscencia correspondientes al componente de fondo y debajo de los píxeles de umbral en la imagen de luminiscencia correspondientes al componente de no fondo; segmentar la imagen mediante crear una imagen del componente de al menos uno de una membrana, un citoplasma y un núcleo, la imagen del componente siendo creada mediante aplicar un procedimiento de separación del cromogen a la imagen RGB de la muestra para al menos un tinte que indica uno de la membrana, el citoplasma y el núcleo; refinar a imagen segmentada y filtrar cualquier objeto indeseado de la imagen.

15. Un método de conformidad con la reivindicación 14, en donde determinar un nivel de luminiscencia ce umbral de fondo de la imagen de luminiscencia además comprende: suavizíir la imagen de luminiscencia; determinar un histograma de píxeles para la imagen de luminiscencia suavizada, el histograma ten endo una porción superior y una porción inferior y escasear el histograma, iniciando desde aproximadamente el extremo más alto del mismo para determinar un mínimo local correspondiente al nivel de luminiscencia de umbral.

16. Un método de conformidad con la reivindicación 15, que además comprende limitar el análisis del histograma de los píxeles que tienen menos de aproximadamente 90% de transmisión.

17. Un método de conformidad con la reivindicación 14, en donde segmentar la imagen además comppende: determinar una intensidad promedio de píxeles de un componente de no fondo de una imagen del corr ponente de la membrana, reemplazar cualquier píxel que tiene una intensidad mayor que la intensidad promedio con la intensidad promedio de tal manera que forme una máscara de membrana; generando una imagen de diferencia entre los núcleos de circunvolución de suavizado menor y grande de la imagen del componente de la membrana para formar una imagen de contraste; binariza ar la imagen de contraste usando un umbral de contraste local, formar un esqueleto de las máscaras de la membrana de la imagen de contraste binarizada; eliminar cualquier porción del esqueleto más pequeño que un tamaño mínimo; expand r el esqueleto de las máscaras de membrana por al menos un píxel en cada dirección y eliminar cualquier máscara de la membrana que no corresponda al esqueleto.

18. Un método de conformidad con la reivindicación 14, en donde segmentar la imagen además comprende: determi nar una intensidad promedio y una intensidad media de píxeles de un componente de no fondo de una imagen del componente del núcleo; reemplazar cualquier píxel que tiene una intensidad mayor que una intensidad de umbral que comprende lo mayor de la intensidad promedio y la intensidad media con la intensidad de umbral de manera que forme una máscara de núcleo inicial; filtrar con bajo paso la máscara de núcleo inicial con un núcleo de 1.5 veces un tamaño de núcleo esperado; transformar en el momento decisivo la segmentación de la máscara del núcleo inicial de manera que produzca una imagen de salida y combin ar la transformación en el momento decisivo de la segmentación de la imagen de salida con la rr aseara del núcleo inicial para formar una máscara de núcleo resultante y de esta manera los píxeles de la máscara se designan en donde la transformación en el momento decisivo de la segmentació n de la imagen de salida tiene una base de captura y en donde la máscara del núcleo tiene una intensidad de píxel debajo de la intensidad del umbral.

19. Un método de conformidad con la reivindicación 18, que además comprende si una máscara de mejm brana está disponible, eliminar cualquier píxel de la máscara de núcleo resultante dentro de la máscara de membrana.

20. Un método de conformidad con la reivindicación 18, que además comprende limpiar la máscara de núdleo resultante mediante llenar las porciones indeterminadas de la misma que tiene un área menor de aproximadamente un quinto del tamaño del núcleo esperado y eliminar los objetos más pequeños que aproximadamente un cuarto del tamaño del núcleo esperado.

21. Un hnétodo de conformidad con la reivindicación 18, en donde segmentar la imagen además comprende: invertir y transformar a distancia la máscara de núcleo resultante; binariza ' la máscara de núcleo resultante transformada a distancia e invertida de manera que los píxeles dentro de un tamaño de célula esperado se incluyen en una primera máscara de citoplasma potencial; combine r la primera máscara de citoplasma potencial con un componente de fondo de la imagen del componente del núcleo de manera que forme una máscara del componente de no fondo de la primera máscara del citoplasma potencial.

22. Un nnétodo de conformidad con la reivindicación 21 , que además comprende: invertir ) transformar a distancia la máscara del núcleo resultante para formar una segunda máscara del citoplasma potencial y combinar la primera y la segunda máscaras del citoplasma potenciales para formar una máscara de citoplasma resultante.

23. Un método de conformidad con la reivindicación 22, en donde refinar la imagen segmentada además comprende: identificar cada objeto segmentado en la máscara de citoplasma resultante; asociar cada objeto segmentado identificada con un objeto marcado en una imagen marcada, cada objeto segmentado identificado siendo identificado por un valor de píxel único mediante dilatar la imagen marcada, binarizar cada objeto marcado usando un umbral individual asociado con el mismo de manera que refine la máscara del núcleo resultante.

24. Un método de conformidad con la reivindicación 23, en donde binarizar cada objeto marcado para refinar la máscara del núcleo resultante comprende: determinar un histograma para los píxeles del objeto marcado, el histograma teniendo un límite superior y un límite inferior y determinando una intensidad media de los píxeles; determinar un borde superior y un borde inferior para un umbral, el borde superior siendo determinado por la integración del histograma iniciando desde el límite superior del mismo por aproximadamente 20% de un área del objeto marcado, el borde inferior siendo determinado mediante integrar el histograma iniciando desde el límite inferior del mismo por aproximadamente 20% del tamaño del núcleo esperado, si el borde inferior es menor que el borde superior, aplicar el análisis de discriminación Fisher al histograma entre los bordes superior e inferior para determinar el umbral, de otra manera, designar un medio de los bordes superior e inferior como el umbral y re-inselar el objeto marcado en la máscara del núcleo resultante mediante binarizar la imagen del componente del núcleo usando el umbral.

25. Un método de conformidad con la reivindicación 24, que además comprende: transformar a distancia la máscara del núcleo resultante y transformar en el momento decisivo la máscara del núcleo resultante siguiendo la transformación distante del mismo de manera que separe cualquier núcleo combinado y minimizar la bajo-segmentación.

26. Un método de conformidad con la reivindicación 25, que además comprende llenar las porciones indeterminadas de la máscara del núcleo resultante que tiene un área menor que aproximadamente un quinto del tamaño de núcleo esperado.

27. Un método de conformidad con la reivindicación 26, que además comprende remover cualquier obje? menor de aproximadamente un tercio del tamaño de núcleo esperado de la máscara del nú'cleo resultante de manera que produzca una máscara de núcleo refinada.

28. Un hnétodo de conformidad con la reivindicación 27, que además comprende: invertir y transformar a distancia la máscara de núcleo refinada; binarizíir la máscara de núcleo refinada transformada a distancia e invertida de manera que los píxeles dentro del tamaño de célula esperada estén incluidos en una primera máscara del citoplasma refinada potencial; combirar la primera máscara del citoplasma refinada potencial con un componente de fondo de la imagen del componente del núcleo de manera que forme una máscara de un componente de no fondo de la primera máscara del citoplasma refinada potencial.

29. Un método de conformidad con la reivindicación 28, que además comprende: invertir y transformar a distancia la máscara de núcleo refinada para formar una segunda máscara de citoplasma potencial y combinar la primera y segunda máscaras de citoplasma refinadas potenciales para formar una máscara de citoplasma refinada. imagen de la muestra mediante tabular una cantidad de píxeles en la imagen cada combinación de tres tintes en el plano del coeficiente de extinción.