JP5013423B2 - マイクロチップ - Google Patents

Description

本発明は、ＤＮＡ、タンパク質、細胞、免疫および血液等の生化学検査、化学合成ならびに、環境分析などに好適に使用されるμ−ＴＡＳ（Ｍｉｃｒｏ Ｔｏｔａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ）などとして有用なマイクロチップに関し、より詳しくは、その内部に流体回路を有するマイクロチップに関する。

近年、医療や健康、食品、創薬などの分野で、ＤＮＡ（Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）や酵素、抗原、抗体、タンパク質、ウィルスおよび細胞などの生体物質、ならびに化学物質を検知、検出あるいは定量する重要性が増してきており、それらを簡便に測定できる様々なバイオチップおよびマイクロ化学チップ（以下、これらを総称してマイクロチップと称する。）が提案されている。

かかるマイクロチップは、実験室で行なっている一連の実験・分析操作を、数ｃｍ角で厚さ数ｍｍ程度のチップ内で行なえることから、サンプルおよび試薬が微量で済み、コストが安く、反応速度が速く、ハイスループットな検査ができ、サンプルを採取した現場で直ちに検査結果を得ることができるなど多くの利点を有し、たとえば生化学検査用などとして好適に用いられている。

マイクロチップの中でも、内部に流体回路を有するマイクロチップは、該流体回路を構成する、適切な位置に配置された各部位およびこれらを適切に接続する微細な流路（たとえば、数百μｍ程度の幅）を用いて反応、混合、特定成分の検出などを行なうものである。このような流体回路内での一連の操作は、マイクロチップに遠心力を印加することにより行なうことができる。上記部位としては、たとえば検査・分析等の対象となるサンプルと反応（あるいは混合）させるための液体試薬を保持する液体試薬保持部、サンプルや液体試薬を計量する計量部、サンプルと液体試薬とを反応（あるいは混合）させる反応（混合）部、反応液（あるいは混合液）について分析および／または検査するための検出部などが挙げられる。

ところで、サンプル中に含まれる微量の目的物質を、抗原抗体反応を利用して定量的に検出する方法として、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ、サンドイッチ法ともいう）法は、よく用いられている好適な方法であり、目的物質を高感度で検出することができ、定量性にも優れているといった有利な特徴を有する。ＥＬＩＳＡ法は、たとえばビーズ等の固相に固定された抗体に、目的物質と酵素標識抗体との結合体を結合させた後、発色基質を添加して発色反応を起こさせ、生成した発色物質の吸光度を測定して定量を行なう方法である。ここで、ＥＬＩＳＡ法においては、固定化された抗体、目的物質および酵素標識抗体からなる結合体を形成した後、遊離の酵素標識抗体を除去するために、ビーズ等の固相を洗浄する工程が必須となり、遊離の酵素標識抗体が残存すると定量値に大きく影響することから、当該洗浄は入念に行なわれなければならない。

内部に流体回路を有するマイクロチップを用いて、ＥＬＩＳＡ法による目的物質の定量を行なう場合、上記ビーズを入念に洗浄する手段としては、マイクロチップにおけるビーズが充填されている部位（ビーズトラップ）に洗浄液を導入して通過させた後、これを排出するという操作を繰り返すことを挙げることができる。しかし、この方法は、ビーズトラップ内を通過させる度に洗浄液を廃棄するため、マイクロチップの外部に洗浄液供給装置および廃液回収装置が必要となるなど測定装置が非常に大掛かりになり、マイクロチップが本来有する簡便性が損なわれてしまう。

特許文献１には、基板の一方の表面に液溜まり部を有し、該液溜まり部内に、分析対象物質を固定化し、当該分析対象物質に特異的に結合可能なパートナーと標識物質との結合体を添加して結合反応を行ない、その後、未反応の標識化パートナーを除去して液溜まり部を洗浄することが記載されている。しかし、このマイクロチップにおいては、反応を行なう部位および洗浄すべき部位がマイクロチップ外側表面に形成されており、マイクロチップ内部の流体回路を洗浄するものではない。また、特許文献１のマイクロチップにおいては、洗浄液供給装置および廃液回収装置のような外部装置が必要となる。

以上のように、マイクロチップ内部の流体回路またはその一部を、マイクロチップの分解を伴うことなく効率的に洗浄できる構造を有するマイクロチップは、知られていないのが現状である。
特開２００５−１３４３４９号公報

たとえばＥＬＩＳＡ法による定量操作を、内部に流体回路を有するマイクロチップを用いて行なう場合において、効率的な洗浄を可能とするためには、該マイクロチップが、流体回路内の液体をある部位内で循環させることができる流体回路構造を有していることが極めて有効であると考えられる。このような流体回路構造部を有していると、一度ビーズトラップ内を通過した洗浄液を、再度ビーズトラップ内に導入することができ、必要に応じて何度でも循環を繰り返すことができるためである。

したがって本発明の目的は、流体回路内の液体をある部位内で循環させることができる流体回路構造を有するマイクロチップを提供することである。

本発明は、液体を流通させるための流体回路を内部に有するマイクロチップであって、該流体回路は、該液体の少なくとも一部を溜め置くための第１の液溜め部および第２の液溜め部と、第１の液溜め部と第２の液溜め部とを接続する第１の流路と、該第１の流路とは異なる位置で、第１の液溜め部と第２の液溜め部とを接続する第２の流路と、を有し、第１の液溜め部、第２の液溜め部、第１の流路および第２の流路は、該液体を循環可能な環状経路を構成する、マイクロチップである。

本発明のマイクロチップにおいては、上記液体は、環状経路内を一方向にのみ循環可能であることが好ましい。また、遠心力の印加により、流体回路内で液体を流通させるマイクロチップであって、該液体は、２方向の遠心力の印加により、環状経路内を循環可能であることが好ましい。

また、本発明のマイクロチップは、環状経路内のいずれかの位置に、充填物を充填するための部位を有していてもよい。充填物としては、抗体が固定化された粒状物を挙げることができ、このような充填物を備えることにより、ＥＬＩＳＡ法による目的物質の定量を、本発明のマイクロチップを用いて行なうことができる。

また、本発明のマイクロチップは、環状経路内のいずれかの位置に、液体を計量するための計量部を有していてもよい。

第１の流路および第２の流路は、マイクロチップの厚み方向に関して、同じ位置に形成されてもよく、異なる位置に形成されてもよいが、液体を計量するための計量部を有する場合には、異なる位置に形成されることが好ましい。

本発明のマイクロチップによれば、遠心力の印加により、第１の液溜め部、第２の液溜め部、第１の流路および第２の流路によって形成される環状経路内を、液体が繰り返し循環可能となる。かかる構造を有する本発明のマイクロチップは、同じ液体を、流体回路内のある部位内を繰り返し通過させることが必要な場合に好適に適用することができる。このような場合としては、たとえばＥＬＩＳＡ法における遊離の酵素標識抗体の洗浄除去、液体の複数回計量、マイクロチップ内での不均一触媒反応などを挙げることができる。

（第１の実施形態）
図１は、第１の実施形態のマイクロチップが有する流体回路の主要部分（環状経路部）の一例を示す概略上面図である。上述のように、本発明のマイクロチップは、液体試薬保持部および計量部、反応（混合）部、検出部等を有していてもよいが、これらの部位については従来公知の構造が適用できるため省略している。また、図１に示される主要部分は、マイクロチップの流体回路を構成するものであり、マイクロチップ内部に形成されているが、図１（図２〜６についても同様）においては、説明をより明確にするために、当該マイクロチップの内部構造を抜き出して示している。本実施形態のマイクロチップは、ＥＬＩＡＳＡ法による目的物質の定量を行なうためのチップとして好適に用いることができる。

本実施形態のマイクロチップは、図１に示される環状経路部１００を有している。環状経路部１００は、マイクロチップの流体回路内に導入された液体の少なくとも一部を溜め置くための第１の液溜め部１０１および第２の液溜め部１０２を有しており、これらは、その上部において第１の流路１０３によって接続されている。また、第２の液溜め部１０２の底部には、充填物を充填するためのカラム構造部１０５があり、カラム構造部１０５の底部と第１の液溜め部１０１の底部とは、第２の流路１０４によって接続されている。すなわち、第１の液溜め部１０１、第１の流路１０３、第２の液溜め部１０２および第２の流路１０４によって、液体がその内部を循環可能な循環経路が構成されている。マイクロチップの厚み方向に関していえば、第１の流路１０３と第２の流路１０４とは、同じ位置に形成されており、したがって、環状経路部１００は、マイクロチップ表面に対して平行（あるいは略平行）である。

さらに、第１の液溜め部１０１の上部他端には、液体を環状経路１００内に導入あるいは環状経路１００から排出するための第３の流路１０６が形成されている。カラム構造部１０５には、ＥＬＩＳＡ法に通常用いられる抗体が固定化されたビーズ１０５ａ（たとえばガラス、セファロース、キトパール製）が充填されている。

図１に示される環状経路部１００において、その内部に導入された液体は、一方向にのみ循環可能である。一方向とは、第１の液溜め部１０１→第１の流路１０３→第２の液溜め部１０２→第２の流路１０４→第１の液溜め部１０１の方向である。このように、一方向にのみ循環可能な構造は、具体的には次のような構成により実現されている。まず、第１の液溜め部１０１と第２の液溜め部１０２との位置関係に関していえば、第１の液溜め部１０１は、第２の液溜め部１０２と比較して、環状経路部１００に対して図１における左向きの遠心力を与える遠心中心（たとえば、図１における点Ｂ）により近い側に位置している。また、第１の液溜め部１０１は、第２の液溜め部１０２と比較して、環状経路部１００に対して図１における下向きの遠心力を与える遠心中心（たとえば、図１における点Ａ）により遠い側に位置している。

第２の流路１０４の流路径は、カラム構造部１０５の底部の直径より十分に小さい値（たとえば１０〜３００μｍ程度）を有しており、ビーズの流出を防止する。

次に、上記環状経路部１００を有する本実施形態のマイクロチップを用いた、ＥＬＩＳＡ法による目的物質の定量方法の一例について、図２を参照して説明する。まず、酵素で標識された抗体と目的物質との結合体を含有する液体２０１を第３の流路１０６から導入し、第１の液溜め部１０１に収容する（図２（ａ）参照）。次に、図２における左向きの遠心力（以下、単に左向きという。他の方向についても同様。）を印加することにより、液体２０１を、第１の流路１０３を介して第２の液溜め部１０２に移動させ、図２（ｂ）に示される状態とした後、下向きの遠心力を印加して、図２（ｃ）に示されるように、液体２０１を第２の液溜め部１０２下部に移動させてカラム構造部１０５内の、目的物質に対する抗体が固定化されたビーズ１０５ａに接触させ抗原抗体反応を行ない、固定化された抗体、目的物質および酵素標識抗体からなる結合体を形成する。さらなる下向き遠心力により、液体２０１の全量がカラム構造部１０５を通過し、抗原抗体反応が行なわれるとともに、第２の流路１０４を通って第１の液溜め部１０１に収容される（図２（ｄ）参照）。

次に、同様の手順にて、カラム構造部１０５に付着した遊離の酵素標識抗体を除去するために、カラム構造部１０５の洗浄が行なわれる。すなわち、洗浄液を第３の流路１０６から導入した後、左向きの遠心力により洗浄液を第２の液溜め部１０２に移動させて図２（ｂ）と同様の状態を得る。なお、洗浄液としては、たとえば純水、またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ：Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）やトリス緩衝食塩水（ＴＢＳ：Ｔｒｉｓ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）などの緩衝液等を用いることができる。次に下向きの遠心力を印加して、洗浄液を第２の液溜め部１０２の底部およびカラム構造部１０５内に移動させるとともに、カラム構造部１０５内を通過させる。これにより、カラム構造部の１回目の洗浄が行なわれる。通過した洗浄液は、第２の流路１０４を通って第１の液溜め部１０１に収容され、図２（ｄ）と同様の状態となる。次に、カラム構造部１０５内の洗浄を確実に行なうために、同様の手順にて洗浄液を循環させる。かかる循環洗浄は、必要に応じて複数回行なわれる。

洗浄終了後、発色基質を含有する溶液を同様にして、カラム構造部１０５内を通過させることにより発色反応を起こさせ、生成した発色物質の吸光度を測定して定量を行なう。吸光度測定用の検出光は、たとえばカラム構造部１０５に対して直接照射することができる。

以上のように、環状経路部を設けることにより、洗浄液を環状経路部１００内で繰り返し循環させることができるため、洗浄液を効率良く利用することができ、洗浄液供給装置や廃液回収装置のような大掛かりな外部装置を要しない。環状経路部１００内に設けられたカラム構造部は、循環される洗浄液により効率的に洗浄される。また、本実施形態の環状経路部１００によれば、下向きおよび左向きの少なくとも２方向の遠心力のみで液体を循環させることが可能であり、液体の循環操作が極めて容易である。

なお、上記説明においては、本実施形態の環状経路部を有するマイクロチップを、ＥＬＩＳＡ法による目的物質の定量方法に用いる場合について説明したが、この用途に限定されるものではない。たとえば、カラム構造部１０５内に不均一触媒を担持した担持体を充填し、反応試剤（たとえば各種モノマーなど）を含有する溶液を循環させることにより、マイクロチップ内で重合反応等各種有機反応を行なわせることも可能である。

（第２の実施形態）
図３は、第２の実施形態のマイクロチップが有する流体回路の主要部分（環状経路部）の一例を示す概略図であり、図３（ａ）はその概略上面図、図３（ｂ）は図３（ａ）のＩＩＩ−ＩＩＩ線における断面図である。本実施形態のマイクロチップは、第１の基板３１０、第２の基板３２０および第３の基板３３０を貼り合わせた３層構造を有しており、第２の基板３２０には、上側流路および下側流路からなる２層構造の流路を構成する溝が形成されている（図３（ｂ）参照）。本実施形態のマイクロチップは、第１の液溜め部３０１と、これに隣接して配置された計量部３０５と、第２の液溜め部３０２とを有しており、計量部３０５と第２の液溜め部３０２とは第１の流路３０３によって接続されている。計量部３０５の上部には、計量された液体を排出するための第３の流路３０６が設けられている。また、第１の液溜め部３０１および第２の液溜め部３０２には、それぞれ第２の基板３２０の下側に形成された第２の流路３０４に通じる開口部３０１ａ、３０２ａが形成されている。すなわち、第１の液溜め部３０１、計量部３０５、第１の流路３０３、第２の液溜め部３０２および第２の流路３０４により、環状経路部が形成されており、その内部を液体が循環可能となっている。本実施形態の環状経路部において第１の流路３０３と第２の流路３０４とは、マイクロチップの厚み方向に関して異なる位置に形成されており、したがって、該環状経路部は、マイクロチップ表面に対して垂直（あるいは略垂直）である。

環状経路部内に計量部を有する本実施形態のマイクロチップは、液体を当該環状経路部内で繰り返し循環させることができるため、当該計量部を用いた計量を繰り返し行なうことが可能となり、計量部容積の整数倍量の液体を計量することができる。

本実施形態のマイクロチップを用いた液体の計量方法について、図４を参照して説明する。まず、図４における下向きの遠心力を印加することにより、図４の矢印の方向から液体４０１（たとえば、マイクロチップを用いた検査・分析の対象となるサンプル）を計量部３０５に導入する（図４（ａ）参照）。この際、計量部３０５からオーバーフローした液体は、第１の流路３０３を通って第２の液溜め部３０２に収容される。次に、右向きの遠心力を印加することにより、計量された計量部３０５内の液体は、第３の流路３０６から排出されるとともに、オーバーフローした第２の液溜め部３０２内の液体は、開口部３０２ａを通して、下層の第２の流路３０４（図４において図示せず）に流れ込み、開口部３０１ａを通って第１の液溜め部３０１内に収容される（図４（ｂ））。第３の流路３０６から排出された液体は、特に限定されないが、液体試薬などと反応（あるいは混合）するための反応部（混合部）などに収容される。

第１の液溜め部３０１内の液体は、下向きの遠心力により、再度計量部３０５に導入されて計量される。以上のようなサイクルを繰り返すことにより、計量部３０５を用いて、液体の計量を複数回行なうことができる。本実施形態の環状経路部によれば、下向き、右向きの２方向の遠心力のみで液体を循環させ、計量することが可能であり、液体の循環操作が極めて容易である。

（第３の実施形態）
図５は、第３の実施形態のマイクロチップが有する流体回路の主要部分（環状経路部）の一例を示す概略図であり、図５（ａ）はその概略上面図、図５（ｂ）は図５（ａ）のＶ−Ｖ線における断面図である。本実施形態のマイクロチップは、第１の基板５１０、第２の基板５２０および第３の基板５３０を貼り合わせた３層構造を有し、第２の基板５２０には、上側流路および下側流路からなる２層構造の流路を構成する溝が形成されており（図５（ｂ）参照）、この点において上記第２の実施形態と同様である。本実施形態のマイクロチップは、第１の液溜め部５０１と、第２の液溜め部５０２とを有しており、これらは、上側流路である第１の流路５０３によって接続されている。第１の液溜め部５０１には、液体を環状経路部に導入または排出するための第３の流路５０６および第４の流路５０７が設けられている。また、第１の流路５０３は、上記第１の実施形態と同様のカラム構造部５０５を有しており、ＥＬＩＳＡ法に用いられる抗体が固定化されたビーズなどが充填される。

第１の液溜め部５０１および第２の液溜め部５０２には、それぞれ第２の基板５２０の下側に形成された第２の流路５０４に通じる開口部５０１ａ、５０２ａが形成されている。すなわち、第１の液溜め部５０１、第１の流路５０３、第２の液溜め部５０２および第２の流路５０４により、環状経路部が形成されており、その内部を液体が循環可能となっている。ここで、本実施形態の環状経路部において第１の流路５０３と第２の流路５０４とは、マイクロチップの厚み方向に関して異なる位置に形成されており、したがって、該環状経路部は、マイクロチップ表面に対して垂直（あるいは略垂直）である。このような構成の環状経路部によっても、上記第１の実施形態と同様の効果を得ることができる。

図６は、本実施形態のマイクロチップ使用方法の一例を示す概略工程図である。まず、液体が、下向きの遠心力の印加により、第３の流路５０６を通して環状経路部に導入され、第１の液溜め部５０１に収容される（図６（ａ））。液体としては、上記第１の実施形態において示したようなＥＬＩＳＡ法における洗浄液などを挙げることができるが、特に限定されるものではない。次に、左向きの遠心力の印加により、該液体は、第１の流路５０３およびカラム構造部５０５を通って、第２の液溜め部５０２に移動される（図６（ｂ））。ついで、第２の液溜め部５０２内の液体は、下向きの遠心力の印加により、開口部５０２ａから、第２の流路５０４に到るとともに、第１の液溜め部５０１の開口部５０１ａより流出して、再度、第１の液溜め部５０１内に収容される（図６（ｃ））。このような第１の液溜め部５０１と第２の液溜め部５０２との間の液体の循環は、必要に応じて、複数回行なうことができる。最後に、液体は、右向きの遠心力により、第４の流路５０７を通して環状経路部から排出される。

今回開示された実施の形態はすべての点で例示であって制限的なものではないと考えられるべきである。本発明の範囲は上記した説明ではなくて特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と均等の意味および範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。

第１の実施形態のマイクロチップが有する流体回路の主要部分の一例を示す概略上面図である。 環状経路部１００を有する第１の実施形態のマイクロチップを用いた、ＥＬＩＳＡ法による目的物質の定量方法の一例を示す概略工程図である。 第２の実施形態のマイクロチップが有する流体回路の主要部分の一例を示す概略図である。 第２の実施形態のマイクロチップを用いた液体の計量方法の一例を示す概略工程図である。 第３の実施形態のマイクロチップが有する流体回路の主要部分の一例を示す概略図である。 第３の実施形態のマイクロチップ使用方法の一例を示す概略工程図である。

符号の説明

１００ 環状経路部、１０１，３０１，５０１ 第１の液溜め部、１０２，３０２，５０２ 第２の液溜め部、１０３，３０３，５０３ 第１の流路、１０４，３０４，５０４ 第２の流路、１０５，５０５ カラム構造部、１０５ａ 抗体が固定化されたビーズ、１０６，３０６，５０６ 第３の流路、２０１ 酵素で標識された抗体と目的物質との結合体を含有する液体、３０１ａ，３０２ａ，５０１ａ，５０２ａ 開口部、３０５ 計量部、３１０，５１０ 第１の基板、３２０，５２０ 第２の基板、３３０，５３０ 第３の基板、４０１，７０１ 液体，５０７ 第４の流路。

Claims (6)

1. 遠心力の印加により液体を流通させるための流体回路を内部に有するマイクロチップであって、
   前記流体回路は、
   前記液体の少なくとも一部を溜め置くための第１の液溜め部および第２の液溜め部と、
   前記第１の液溜め部と前記第２の液溜め部とを接続する第１の流路と、
   前記第１の流路とは異なる位置で、前記第１の液溜め部と前記第２の液溜め部とを接続する第２の流路と、を有し、
   前記第１の液溜め部、前記第１の流路、前記第２の液溜め部および前記第２の流路は、前記液体をこの順で循環させるための環状経路を構成しており、
   前記環状経路において前記第１の液溜め部は、前記第２の液溜め部と比較して、前記液体を循環させるために印加される第１遠心力の第１遠心中心により近く配置されており、かつ、前記液体を循環させるために印加されるもう一つの遠心力であって、前記第１遠心力の方向に対して９０度の角度をなす方向の第２遠心力の第２遠心中心からより遠くに配置されている、マイクロチップ。
2. 前記環状経路内のいずれかの位置に、充填物を充填するための部位を有する請求項１に記載のマイクロチップ。
3. 前記充填物は、抗体が固定化された粒状物である請求項２に記載のマイクロチップ。
4. 前記環状経路内のいずれかの位置に、前記液体を計量するための計量部を有する請求項１に記載のマイクロチップ。
5. 前記第１の流路および前記第２の流路は、マイクロチップの厚み方向に関して、同じ位置に形成される請求項１〜３のいずれかに記載のマイクロチップ。
6. 前記第１の流路および前記第２の流路は、マイクロチップの厚み方向に関して、異なる位置に形成される請求項１〜４のいずれかに記載のマイクロチップ。

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