JP2012202925A - 分析チップ、分析システムおよび分析方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】競合反応による定量分析が可能な分析チップを提供する。
【解決手段】液体試料中の測定対象物質を分析するための分析チップであって、基体と、該基体の表面に形成された、上流側から下流側へ前記液体試料を流すための流路と、を備える。流路は、液体試料を流路に導入するための導入部と、該導入部の下流側に設けられた、液体試料を競合反応させるための反応部と、該反応部の下流側に設けられた排出部と、反応部と排出部との間に設けられた、反応部から排出部に前記液体試料が流れるのを抑制するための堰き止め部と、を含む。反応部は、測定対象物質が特異的に結合する特異的結合物質または測定対象物質の競合物質が予め固定化された担体を収納する。
【選択図】図1
【解決手段】液体試料中の測定対象物質を分析するための分析チップであって、基体と、該基体の表面に形成された、上流側から下流側へ前記液体試料を流すための流路と、を備える。流路は、液体試料を流路に導入するための導入部と、該導入部の下流側に設けられた、液体試料を競合反応させるための反応部と、該反応部の下流側に設けられた排出部と、反応部と排出部との間に設けられた、反応部から排出部に前記液体試料が流れるのを抑制するための堰き止め部と、を含む。反応部は、測定対象物質が特異的に結合する特異的結合物質または測定対象物質の競合物質が予め固定化された担体を収納する。
【選択図】図1
Description
本発明は、分析チップ、分析システムおよび分析方法に関し、特に、競合反応による定量分析が可能な分析チップ、分析システムおよび分析方法を提供する。
近年、医療、健康、食品および創薬などの分野で、DNA、酵素、抗原、抗体、タンパク質、ウィルスおよび細胞などの生体物質、ならびに化学物質を検出して定量する重要性が増している。これに対応し、上記生体物質および化学物質などを簡便に測定するための様々なバイオチップおよびマイクロ化学チップ(以下、これらを総称して「分析チップ」と称する。)が提案されている。
分析チップは、実験室で行なわれている一連の分析操作を、数cm角で厚さ数mm〜1cm程度のチップ内で簡易に行なえるように作られているため、検体および試薬の使用量が微量で済む。このように、分析チップは、低コストで、ハイスループットな検査ができるため、検体を採取した現場で直ちに検査結果を得ることができるなどの多くの利点を有している。このような分析チップは、たとえば血液検査または唾液検査などの生化学検査用として好適に用いられている。
たとえば、特許文献1には、水性液体試料中の検体の存在または濃度を測定するための電気化学的試験デバイスが開示されている。特許文献1においては、かかる電気化学的試験デバイスを用いることで、血液のような水性液体試料中のグルコース濃度などを簡便な操作で測定することができるとされている。
しかしながら、タンパク質の化学反応系においては、低分子量の単純な分子が生成されることはまれであり、グルコースの化学反応系ように、酸化還元性の高いH2O2の生成やO2の消費に結び付けることが難しい。このため、多くのタンパク質は、酵素標識免疫測定法(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay:ELISA)のような複雑な方法を介さなければ、分析することができない。
なかでも、コルチゾールのような分子量の小さいタンパク質を分析する場合には、競合法を用いる必要がある。しかし、競合法による分析は分析操作が複雑であるために、分析チップを用いた簡易な分析の実現はさらに困難となっている。このため、分析に競合法が必要となるタンパク質の分析は、ウェル内に特異的な処理を施したマイクロウェルを用いて行なうのが一般的である。
しかしながら、マイクロウェルを用いる方法では、特殊な器具、装置が必要であったため、たとえば、検体(液体試料)を採取した場所でのフローアッセイが難しいのが実情であった。また、その操作も複雑であったため、操作者の熟練性も必要であった。上記のような事情から、分析チップを用いた分析方法のような簡易な方法で、競合法による分析を行なうことは未だ困難であるのが実情である。
したがって、本発明は、競合法による分析を簡便に実現可能な分析チップ、分析システム、および分析方法を提供することを目的とする。
本発明は、液体試料中の測定対象物質を分析するための分析チップであって、基体と、該基体の表面に形成された、上流側から下流側へ液体試料を流すための流路と、を備え、流路は、液体試料を流路に導入するための導入部と、該導入部の下流側に設けられた、液体試料を競合反応させるための反応部と、該反応部の下流側に設けられた排出部と、反応部と排出部との間に設けられた、反応部から排出部に液体試料が流れるのを抑制するための堰き止め部と、を含み、反応部は、測定対象物質が特異的に結合する特異的結合物質または測定対象物質の競合物質が予め固定化された担体を収納する、分析チップである。
上記分析チップにおいて、堰き止め部の流路幅が反応部の流路幅よりも狭いことが好ましい。
また、上記分析チップにおいて、堰き止め部を構成する流路が撥液性であることが好ましい。
また、上記分析チップにおいて、導入部の流路幅が反応部の流路幅よりも狭いことが好ましい。
また、上記分析チップにおいて、排出部は、反応部から流出する液体試料を吸収するための吸収体を収納することが好ましい。
また、本発明は、上記分析チップと、該分析チップの反応部で発生する蛍光、発光および吸光からなる群から選択されるいずれか1つの応答に基づいて、測定対象物質を分析するための分析装置と、を備える分析システムである。
また、本発明は、上記分析チップを用いて、液体試料中の測定対象物質を分析する分析方法であって、標識部を有する特異的結合物質または標識部を有する競合物質と、液体試料とを含有する反応液を反応部内に導入する工程と、反応部内で、反応液と、担体に予め固定化された特異的結合物質または競合物質とを競合反応させる工程と、競合反応させる工程の後に、反応液を排出部に流出させる工程と、流出させる工程の後に、反応部内に残存する標識部を有する競合物質または標識部を有する特異的結合物質に由来する蛍光、発光および吸光からなる群から選択されるいずれか1つの応答に基づいて、測定対象物質を分析する工程と、を含む、分析方法である。
上記分析方法において、導入する工程は、反応液を導入部から導入する工程を含むことが好ましい。
また、上記分析方法において、流出させる工程は、反応部に洗浄液を流入させる工程を含むことが好ましい。
また、上記分析方法において、標識部が蛍光、発光および吸光からなる群から選択されるいずれか1つの応答を発することが好ましい。
また、上記分析方法において、分析する工程は、標識部と酵素反応する基質を含有する基質溶液を反応部に流入させる工程を含み、基質は、標識部と酵素反応することによって、蛍光、発光および吸光からなる群から選択されるいずれか1つの応答を引き起こす物質であることが好ましい。
本発明の分析チップ、分析システムおよび分析方法によれば、簡便に、競合法による分析を行なうことができる。
以下、図面に基づいて本発明の実施の形態を説明する。なお、以下の図面において同一または相当する部分には、同一の参照符号を付し、その説明は繰り返さない。なお、本明細書において、「液体」とは、液体試料、反応液、洗浄液および基質溶液のそれぞれを含み得る概念である。
<分析チップ>
図1に、実施の形態における分析チップの模式的な平面図を示す。
図1に、実施の形態における分析チップの模式的な平面図を示す。
図1に示す分析チップ100は、競合反応を用いることによって液体試料中の測定対象物質を分析するための分析チップである。本実施の形態においては、測定対象物質として、コルチコイドの一種であってストレスによって体内濃度が変化するホルモンとして知られているコルチゾールを用いる場合について説明するが、これに限られるものではない。
図1を参照し、分析チップ100は、基体10と、該基体10の表面に形成された流路11と、流路11内に配置された担体21および吸収体22とを備えている。
図2および図3に、図1の基体の模式的な平面図および斜視図を示す。
図2および図3を参照し、基体10の材質は特に限定されないが、透明基板であることが好ましい。透明基板としては、たとえば、アクリル系樹脂などの樹脂基板、または、ガラス、シリコン、あるいは石英などの無機材料基板を用いることができる。基体10の形状は特に限定されず、たとえば、図1中左右方向の長さが75〜90mm、図1中の上下方向の幅が14〜18mm、厚みが3〜10mmの直方体とすることができる。
図2および図3を参照し、基体10の材質は特に限定されないが、透明基板であることが好ましい。透明基板としては、たとえば、アクリル系樹脂などの樹脂基板、または、ガラス、シリコン、あるいは石英などの無機材料基板を用いることができる。基体10の形状は特に限定されず、たとえば、図1中左右方向の長さが75〜90mm、図1中の上下方向の幅が14〜18mm、厚みが3〜10mmの直方体とすることができる。
基体10の表面に形成された流路11は、上流側の導入部12と、導入部12の下流側に設けられた反応部13と、反応部13の下流側に設けられた排出部14と、反応部13と排出部14との間に設けられた堰き止め部15とから構成される。なお、各図の流路11は、図中左側(導入部12側)が上流側、右側(排出部15側)が下流側となる。
流路11は、液体試料、その他競合反応に用いられる洗浄液、基質溶液などの液体を上流側から下流側へ流すための流路であり、流路11中における隣接する各部は互いに連通している。このような流路11は、たとえば、基体10の表面を切削することによって形成することができる。流路11の深さは特に限定されないが、たとえば、1〜5mmとすることができる。なお、流路11は、少なくとも、導入部12、反応部13、排出部14および堰き止め部15を含んでいればよい。
流路11のうちの導入部12は、狭い流路幅を有する直線状に形成されており、液体試料を流路11に導入するために用いることができる部分である。導入部12から液体試料を導入することにより、液体試料は、導入部12の下流側に位置する反応部13へと流れることができる。液体試料の導入部12への導入方法としては、たとえば、導入部12よりもさらに上流側の基体10の表面に液体試料を配置する方法がある。このように液体試料を配置することによって、液体試料を自重によって導入部12内に落ち込ませることができるため、結果的に、流路11内に液体試料を導入することができる。また、導入部12の流路幅W12を狭くすることにより、毛細管現象によって液体試料を導入部12内に早い速度で導入することができ、さらに反応部13に向けて流れさせることができる。
なかでも、図1〜3に示すように、導入部12の流路幅W12を反応部13の流路幅W13よりも狭くし、導入部12の上流側を閉塞させ、導入部12の流路長(図1〜3中の左右方向)を流路幅W12よりも十分に長くすることが好ましい。導入部12がこのような形状を有することによって、基体10の表面に液体試料を配置した際の液体試料の速度などの運動状態の影響を、流路壁との摩擦で平坦化(均一化)することができるため、反応部13内での競合反応のばらつきを抑制することができる。たとえば、導入部12は、流路長が10mm、流路幅W12が1mmの直線形状とすることができる。なお、本明細書において、流路幅とは、流路11の上流側から下流側に向かう方向に直交する方向における流路11の幅である。
流路11のうちの反応部13は、図1〜図3に示すように、上流側から下流側にかけて流路幅が連続的に増大した後に引き続き連続的に減少する形状に形成されており、液体試料中の測定対象物質を競合反応させることができる部分である。反応部13は、図1〜図3に示すような形状を有することにより、導入部12側から流入した液体試料を反応部13内に均一に分散させることができる。たとえば、反応部13は、流路長12〜15mmで、流路幅が、上流側から下流側にかけて1mm(導入部12の流路幅W12)から連続的に増大して最大となる部分の流路幅W13が6mmとなった後、連続的に減少して1mm(堰き止め部15の流路幅W15)まで狭くなる形状とすることが好ましい。また、反応部13は、たとえば、流路長12〜15mmで、流路幅が、上流側から下流側にかけて1mmから連続的に増大して6mmに到達した後、その最大流路幅の部分を所定長さ、たとえば3mm維持し、引き続き連続的に減少して1mmまで狭くなる形状に形成されてもよい。
流路11のうちの堰き止め部15は、液体試料が、反応部13から排出部14に流出するのを抑制することのできる部分である。堰き止め部15を反応部13の下流側に隣接して配置させることにより、堰き止め部15の上流側に液体試料を留めおくことができるため、反応部13内での均一な競合反応を促進させることができる。
堰き止め部15の流路幅W15は、反応部13の流路幅W13よりも狭いことが好ましい。この形状により、反応部13から排出部14に液体試料が流出するのを抑制することができる。この場合、図1〜図3に示すように、堰き止め部15は反応部13の下流側を狭窄した構造となる。たとえば、堰き止め部15の形状は、流路長が1mm、流路幅W15が1mmの形状することができる。また、堰き止め部15を構成する流路を、液体試料を流路の表面ではじくことが可能な撥液性にすることによっても、反応部13から排出部14に反応液が流出するのを抑制することができる。この場合、たとえば、堰き止め部15を構成する基体10の壁部をフッ素コートすることによって撥液性の堰き止め部15を構成できる。特に、図1〜図3に示すように、堰き止め部15を狭窄してその流路幅W15を反応部13の流路幅W13よりも十分に狭くし、さらに、堰き止め部15を構成する流路を撥液性とすることによって、液体試料の排出部14への流出を抑制する効果を高めることができる。
このように、堰き止め部15は、たとえば、開閉可能なバルブ構造のような複雑な構造ではなく、狭窄構造および/または撥液性を付与した構造のような簡素な構造とすることによって、反応部13から排出部14への液体試料の流れを抑制することができる。また、堰き止め部15の構造をこのような構造とすることにより、堰き止め部15より上流側の流路11内の液量が所定量(堰き止め部15が流出を抑制可能な液量)を超えた場合には、反応部13から排出部14への液体の流出を可能とする。このように、堰き止め部15においては、反応部13から排出部14への液体試料の流出の有無を容易に制御することができる。したがって、堰き止め部15が反応部13から排出部14への液体試料の流出を抑制する(無とする)ことによって、反応部13内において均一な競合反応を促進させることができる。一方、堰き止め部15が反応部13から排出部14への液体試料の流出を可能とする(有とする)ことによって、競合反応後の液体試料を排出部14へ容易に流出させることができるため、反応部13内の液体を、競合反応後の定量分析に必要な液体に容易に置換することができる。
流路11のうちの排出部14は、広い流路幅を有する直線状に形成されており、反応部13から流出してきた液体試料を内部に留めて逆流させないようにするための部分である。反応部13から堰き止め部15を介して排出部14に流入した液体試料は排出部14内に留めおかれる。このため、排出部14の形状は特に限定されないが、液体試料の逆流を抑制することのできる形状であることが好ましい。たとえば、排出部14は、流路長が47〜59mm、流路幅W14が8〜12mmの長方形状とすることができる。この場合、排出部14は反応部13と比較して大きな容量を有するため、一度排出部14に流入してきた液体試料などの液体が反応部13に逆流するのを抑制することができる。
また、流路11は、基体10の上面に載置される蓋体(図示せず)などによって、閉塞されていてもよい。この場合、蓋体の導入部12に対応する領域の一部に導入口を設けることによって、液体試料などの液体を流路11内へ簡便に導入することができる。分析チップ100が、基体10の上面(流路11が形成されている面)に蓋体を有することによって、クリーンな環境での分析が可能となり、分析の制度を向上させることができる。
また、図1に示すように、反応部13には、測定対象物質であるコルチゾールの競合物質が予め固定化された担体21が収納される。これにより、反応部13は、反応部13内に流入した液体試料中のコルチゾールの競合反応の場として機能することができる。
図4に、担体21の構成の一例を説明するための模式図を示す。担体21の表面には、BSA(牛血清アルブミン)32が固定されており、BSA32に競合物質としてのコルチゾール31が固定されている。このような担体21は、たとえば、以下のように作製することができる。
すなわち、まず、担体21の一例としてのメンブレンを準備する。次に、準備したメンブレンを、コルチゾールとBSAとを結合させたBSA−CORT結合体を含む溶液に浸漬してインキュベーションし、さらに、このメンブレンを5%FBS(非働化ウシ胎仔血清)溶液などに浸漬してインキュベーションする。そして、浸漬後のメンブレンをリン酸バッファーなどで洗浄した後、室温環境下などで乾燥させる。なお、BSA−CORT結合体は、市販品を用いてもよく、適宜作製してもよい。以上の処理により、図4に示すように、リンカーであるBSA32を介して、コルチゾール31が固定化された担体21が作製される。
担体21の材料は特に限定されないが、タンパク質の吸着能に優れたメンブレン、たとえば、ポリスチレン、塩化ビニル、ニトロセルロースなどからなるメンブレンを好適に用いることができる。また、担体21の形状も特に限定されないが、反応部13内における液体の流れに影響を及ぼさない形状、たとえば、円、楕円状であることが好ましい。なお、担体21は、反応部13内に固定されていてもよく、反応部13内に交換可能に配置されてもよい。担体21を交換可能な状態で反応部13内に配置することにより、分析チップ100の繰り返しの利用が可能となり、分析コストの低減に繋がる。
また、図1に示すように、排出部14には、吸収体22が収納されていることが好ましい。吸収体22は、液体試料などの液体を吸収することができる部材であればよく、たとえば、吸収性繊維、多孔性樹脂、高分子吸収体、または海綿により構成される部材が好ましい。とくに、ポリスチレン、塩化ビニルなどを好適に用いることができる。排出部14内への吸収体22の配置は必要不可欠ではないが、このような吸収体22を排出部14に収納させることにより、排出部14の液体の吸収性能を高めることができる。また、吸収体22を収納することにより、排出部14に流入した液体を吸収体22に留めおくことができるため、一度排出部14に流入した液体が堰き止め部15を介して反応部13に逆流するのを効果的に抑制することができる。なお、吸収体22は、排出部14に固定されていてもよく、交換可能に配置されていてもよい。
以上説明したように、本実施の形態の分析チップ100によれば、反応部13から排出部14への液体試料の流れを抑制することが可能な堰き止め部15を備えることにより、反応部13内に液体試料を留めおいて、反応部13内での競合反応を十分かつ均一的に行わせることができる。また、競合反応後は、反応部13内の液体試料を容易に排出部14に流出させることができるため、競合反応を利用した定量分析を容易に実現することが可能となる。
<分析方法>
図5は、本発明の実施の形態における分析方法を示すフローチャートである。図6(a)〜(d)は、本発明の実施の形態における分析方法の各工程を概略的に示す平面図である。図7(a)〜(d)は、本発明の実施の形態における分析方法の各工程を概略的に示す断面図である。図8(a)〜(c)は、反応部における競合反応を説明するための模式図である。以下、図5〜図8を参照して、一実施の形態における分析チップ100を用いた分析方法、より具体的には、液体試料中のコルチゾールの濃度を測定する分析方法について説明する。なお、図7には、図1に一点破線で示す中心線に沿った断面を示している。
図5は、本発明の実施の形態における分析方法を示すフローチャートである。図6(a)〜(d)は、本発明の実施の形態における分析方法の各工程を概略的に示す平面図である。図7(a)〜(d)は、本発明の実施の形態における分析方法の各工程を概略的に示す断面図である。図8(a)〜(c)は、反応部における競合反応を説明するための模式図である。以下、図5〜図8を参照して、一実施の形態における分析チップ100を用いた分析方法、より具体的には、液体試料中のコルチゾールの濃度を測定する分析方法について説明する。なお、図7には、図1に一点破線で示す中心線に沿った断面を示している。
まず、図5に示すように、調製された反応液を反応部13内に導入する(ステップS1)。なお、本実施の形態において、反応液とは、コルチゾールの濃度が不明である液体試料と、標識部を有する特異的結合物質(以下、「標識化特異的結合物質」という。)とを含有する液体を示す。
このような反応液を反応部13内に導入する方法としては、たとえば、図6(a)および図7(a)に示すように、予め調製された、液体試料に標識化特異的結合物質を混合させた反応液40を導入部12上に配置する方法がある。これにより、導入部12上の反応液40は、反応液40の自重により、導入部12内に導入される。導入部12内に導入された反応液40は、たとえば、図6(b)および図7(b)に示すように反応部13内に流入する。
導入部12から反応部13内に流入する際の反応液40の流速は、導入部12の流路幅W12が狭いことによって、比較的大きな速度となる。反応液40の速度は、導入部12よりも広い流路幅W13を有する反応部13内で減速する。このとき、反応部13の下流側には、堰き止め部15が隣接しているため、反応部13から排出部14へと向かう流れは、堰き止め部15によって抑制される。したがって、反応液40は、反応部13内に均一に分散されるとともに、反応部13内に留めおかれる。
また、液体試料と、標識化特異的結合物質を含有する液体とを、それぞれ別々に導入部12上にマウントしてもよい。この場合、導入部12内に順に導入された液体試料と標識化特異的結合物質を含有する液体とが流路11内で混合されるため、図6(b)および図7(b)に示すように、反応部13内において、反応液40として存在することができる。なお、堰き止め部15が流出を抑制できる反応液40の容量は、反応部13の容量および堰き止め部15の形状などによって適宜変化するため、あらかじめ、堰き止め部15によって流出を抑制することが可能な反応液40の液量を調べておくことが好ましい。
次に、図5に示すように、反応部13内において、競合反応を行なう(ステップS2)。この競合反応について、図8(a)および(b)を用いて説明する。
図8(a)を参照し、本工程において、反応部13内には、担体21の表面にBSA32を介して固定化されたコルチゾール(以下、「固定化コルチゾール」という。)31と、反応液40中の液体試料に由来するコルチゾール33と、標識化特異的結合物質34とが存在している。なお、標識化特異的結合物質34としては、たとえば、特異的結合物質としてのコルチゾール抗体34aに、標識としてのHRP(西洋わさび由来のHorseradish Peroxidase)34bが結合された物質を用いることができる。固定化コルチゾール31、コルチゾール33、コルチゾール抗体34aが反応部13内に存在することにより、図8(b)に示すように、固定化コルチゾール31とコルチゾール33とが競合してコルチゾール抗体34aと結合する競合反応が起こる。
上述のように、本工程においては、反応液40が存在する反応部13内で、コルチゾール抗体34aを、固定化コルチゾール31とコルチゾール33とに均一に競合反応させることができる。なお、この競合反応を反応部13内でより均一に行なうためには、反応液40を反応部13内に30秒以上留めておくことが好ましく、1分以上留めておくことがより好ましい。
次に、図5に示すように、反応部13内の反応液40を排出部14に排出する(ステップS3)。具体的には、図6(c)および図7(c)に示すように、流路11のうちの堰き止め部15の上流側の液量が、堰き止め部15が抑制可能な液量より多くなるように、導入部12から洗浄液41を導入する。洗浄液41を流路11内に流入させて、堰き止め部15の上流側に存在する液体の容量を堰き止め部15が抑制可能な液量を超えさせることによって、反応部13内の反応液40を排出部14へと排出させることができる。
堰き止め部15から流出した反応液40は、排出部14の流路幅W14が堰き止め部15の流路幅W15よりも十分に広いことにより、大きな流速で排出部14に流入させることができる。また、排出部14に流入した反応液40は吸収体22で吸収されるため、反応液30の逆流を効果的に抑制することができる。なお、図7(c)中に、吸収体22に吸収された液体22aを概念的に示している。
本工程により、反応部13内の反応液40を排出部14に流出させることができるため、図8(c)に示すように、標識化特異的結合物質34と結合したコルチゾール33や、未結合の標識化特異的結合物質34を反応部13から除去することができる。なお、このとき、堰き止め部15よりも上流側には洗浄液41が存在していることになる(図6(c)および図7(c)参照)。
次に、図5に示すように、標識化特異的結合物質34のHRP34bに由来する蛍光、発光および吸光からなる群から選択されるいずれか1つの応答を測定する(ステップS4)。本工程は、たとえば、以下のように行なうことができる。
すなわち、図6(d)および図7(d)に示すように、標識部であるHRP34bの基質を含有する基質溶液42を反応部13に導入する。具体的には、導入部12から流路11内へ基質溶液42を導入することによって、反応部13内の洗浄液41が排出部14へ流出させられるとともに、反応部13内に基質溶液42が満たされる。反応部13内において、基質溶液42中の基質は、固定化コルチゾール31に結合した標識化特異的結合物質34のHRP34bとの酵素反応によって、蛍光を発する化合物、特異的な波長の光を発光する化合物、および特異的な波長を吸光する化合物のいずれか1種に変化する。
このような基質の化学変化に由来する蛍光、発光および吸光の少なくとも1つの応答を、分光光度計、フルオロメーターなどを用いて検出し、定量化することによって、固定化コルチゾール31に結合したコルチゾール抗体34aの量を算出することができる。そして、このコルチゾール抗体34aの量から、液体試料中のコルチゾール33の量を算出することができる。
HRP34bの基質としては、たとえば、Amplex(登録商標)REDを用いることができる。Amplex(登録商標)REDは非蛍光物質であり、HRPによって化学変化することによって、蛍光物質であるレゾルフィンへと変化する。このため、レゾルフィン由来の蛍光を測定することによって、固定化コルチゾール31に結合したコルチゾール抗体34aの量を算出することができ、これに基づいて液体試料中のコルチゾール33の濃度を算出することができる。
また、標識部自体が、蛍光、発光および吸光からなる群から選択されるいずれか1つの応答を発する化合物であってもよい。たとえば、フルオレセインなどの蛍光物質を標識部として用いることによって、上述のような基質溶液を用いなくても、固定化コルチゾール31に結合したコルチゾール抗体34aの量を、標識部自体の蛍光の強度から算出することができる。
また、本実施の形態の分析方法において、洗浄液41を導入する工程を行わなくても良い。この場合、基質溶液42を反応部13内に過剰に流入させて、反応液40を反応部13から排出させるとともに、反応部13内に基質溶液42を満たすことによって、ステップS4とステップS5を同時に行なうことができる。この場合には、ステップS4とステップS5とを1つの工程で行なうことができるため、分析方法をより簡易にすることができる。
以上説明したように、本実施の形態の分析方法によれば、競合法を用いた定量分析を、上述の分析チップ100を用いて簡便に行なうことができる。
<分析システム>
図9は、本実施の形態における分析システムを示す模式図である。以下、図9を参照して、一実施の形態における分析システムを説明する。
図9は、本実施の形態における分析システムを示す模式図である。以下、図9を参照して、一実施の形態における分析システムを説明する。
図9を参照し、分析システム200は、分析チップ100と、測定装置50とを備える。測定装置50は、分析チップ100の反応部13からの蛍光、発光および吸光からなる群から選択されたいずれか1つの応答に基づいて、液体試料中のコルチゾール33を定量分析できる装置であれば特に限定されない。たとえば、上述のように、HRP34bの基質として、Amplex(登録商標)REDを用いた場合、測定装置50は、レゾルフィンの励起波長を出射する光出射器51と、レゾルフィンから発生する蛍光を測定する検出器52とを含む構成であればよい。この場合、たとえば、検出器52が検出した蛍光の強度とレゾルフィンの検量線とを比較することによって、液体試料中のコルチゾールの濃度を測定することができる。
また、図9に示すように、分析システム200は、測定結果を示すモニター53を備えていてもよい。モニター53を備えることにより、測定者が測定結果を容易に確認することができる。また、分析システム200は、パーソナルコンピュータ(PC)と接続される構成であってもよい。この場合、分析システム200の分析結果を容易にPCで処理することができる。
以上、本発明の分析チップの一実施形態、本発明の分析方法の一実施形態、および本発明の分析システムの一実施形態について、図1〜図9を用いて説明した。
本発明の分析チップによれば、反応部13が、競合物質が予め固定化された担体21を収納することができ、また、反応部13の下流側に隣接する堰き止め部15が、液体試料を含有する反応液を反応部13内に留めおくことができる。これにより、反応部13内での均一な競合反応が可能となる。また、堰き止め部15は、堰き止め部15よりも上流側に留めおかれている液量が堰き止め部15がその下流側への流出を抑制できる液量を超えた場合に、反応部13から下流側への液体の流出を許すことができる。これにより、反応部13内の液体の置換が容易となり、競合反応に基づく蛍光、発光および吸光からなる群から選択されたいずれか1種を測定することができる。したがって、本発明の分析チップによれば、競合法を利用した測定対象物質の定量が容易となる。
また、本発明の分析方法によれば、本発明の分析チップを用いて、簡便に、競合法を用いた測定対象物質の定量を行なうことができる。また、マイクロウェルを用いた分析方法では、洗浄処理などの操作が複雑であり、高い定量性を維持するためには、その操作に熟練性が必要とされていたが、本発明の分析方法によれば、少なくとも、反応液の液量を調節することによって、簡便に高い定量性を維持することができる。
また、本発明の分析システムによれば、本発明の分析チップおよび分析方法を用いて、競合法を用いた定量が可能となる。また、蛍光、発光および吸光からなる群から選択される少なくとも1種を測定する分光光度計、フルオロメーターのような測定装置は小さく設計することが可能であるため、本発明の分析システムは容易に持ち運び可能な構成とすることができる。したがって、たとえば、液体試料を採取した場所でのフローアッセイを容易に行なうことができる。
また、本発明の分析チップ、分析方法および分析システムは、試験紙上の発色の有無基づいて、測定対象物質の有無を分析するような技術と異なり、液体中での蛍光、発光または吸光を測定して測定対象物質の濃度を分析することができる。このため、たとえば、分光測定の際のバックグラウンドを十分に低くすることができ、より高い定量性を維持することができる。特に、標識物質との反応によって蛍光を発する化合物へと変化する基質を用いることにより、感度の高い酵素反応を短時間で行なうことができ、もって、感度の高い迅速な定量分析が可能となる。また、試験紙を用いた場合と異なり、競合反応や酵素反応を液体中で行なうことができるため、各反応時のばらつきを低減することができ、もってよりばらつきのない正確な定量分析が可能となる。
なお、本実施の形態では、液体試料中の測定対象物質(濃度不明のコルチゾール)の競合物質(濃度既知のコルチゾール)を担体21に固定化し、特異的結合物質(濃度既知の標識化されたコルチゾール抗体)と液体試料とを含有する反応液を流路11内に導入した場合について説明したが、本発明はこれに限られない。たとえば、液体試料中の測定対象物質(濃度不明のコルチゾール)の特定的結合物質(濃度既知のコルチゾール抗体)を担体21に固定化し、競合物質(濃度既知の標識化されたコルチゾール)と液体試料とを含有する反応液を流路11内に導入してもよい。この場合、担体21と結合した競合物質の標識部に由来する発光などを測定することにより、液体試料中のコルチゾールの濃度を分析することができる。
また、上述の本発明の説明では、コルチゾールを分析する場合について詳細に説明したが、反応部13内の担体21に固定化する物質を入れ替えることにより、競合法で分析可能な他のタンパク質を測定することができる。
(分析チップ)
基体10として、幅14mm、長さ75mm、厚さ3mmの直方体のアクリル樹脂基板を用いた。基体10の表面には、長さ10mm、流路幅1mmの導入部12、長さ12mm、最大流路幅6mmの反応部13、長さ47mm、流路幅9mmの排出部14、および長さ1mm、流路幅1mmの部15から構成される、図1〜図3に示すような流路11を形フッ素コートが施された堰き止め成した。なお、流路11の深さは2mmとした。
基体10として、幅14mm、長さ75mm、厚さ3mmの直方体のアクリル樹脂基板を用いた。基体10の表面には、長さ10mm、流路幅1mmの導入部12、長さ12mm、最大流路幅6mmの反応部13、長さ47mm、流路幅9mmの排出部14、および長さ1mm、流路幅1mmの部15から構成される、図1〜図3に示すような流路11を形フッ素コートが施された堰き止め成した。なお、流路11の深さは2mmとした。
担体21として、直径6mmのポリスチレンメンブレンを用い、その一方の表面に、BSA−CORT結合体を固定化したメンブレンを用い、吸収体として、幅12mm、長さ50mm、厚さ1mmのセルロースからなる吸収体22を用いた。なお、担体21は、以下のようにして作製した。
すなわち、まず、ポリスチレンメンブレンを、BSA−CORT結合体(Fitzgerald社製)を0.8μg/mLの濃度で含有するPBSバッファーに浸漬して37℃で12時間インキュベートした。次に、このポリスチレンメンブレンを、5%FBS溶液に浸漬して37℃で30分インキュベートした。次に、このポリスチレンメンブレンをPBS−T溶液で洗浄し、37℃で静置乾燥させて、担体21を作製した。
上記担体21を反応部13内に収納し、上記吸収体22を排出部14内に収納し、この基体10の上面に、蓋体として、幅14mm、長さ75mm、厚さ3mmの直方体のアクリル樹脂基板を設置し、基体10と蓋体がずれないように、両者を接着剤で接着させた。なお、蓋体のうち、導入部12の最上流側に対応する部分に、導入口として直径1mmの孔を設けた。以上の操作により、分析チップ100を準備した。
(反応液)
液体試料として、コルチゾール(シグマアルドリッチ社製)の濃度が、それぞれ0ng/ml、0.01ng/ml、0.1ng/ml、1ng/ml、および100ng/mlのPBS溶液を準備した。また、標識化特異的結合物質34として、HRP34bが標識されたコルチゾール抗体34aを0.6μg/mlの濃度で含有するPBSバッファーを準備した。そして、各溶液(コルチゾール含有のPBS溶液およびコルチゾール抗体含有のPBSバッファー)を1:1で混合することによって、反応液を調製した。
液体試料として、コルチゾール(シグマアルドリッチ社製)の濃度が、それぞれ0ng/ml、0.01ng/ml、0.1ng/ml、1ng/ml、および100ng/mlのPBS溶液を準備した。また、標識化特異的結合物質34として、HRP34bが標識されたコルチゾール抗体34aを0.6μg/mlの濃度で含有するPBSバッファーを準備した。そして、各溶液(コルチゾール含有のPBS溶液およびコルチゾール抗体含有のPBSバッファー)を1:1で混合することによって、反応液を調製した。
(洗浄液および基質溶液)
洗浄液として、PBS−Tを準備した。また、基質溶液として、260mgのAmplex(登録商標)REDを5mlのPBS溶液に含有させた第1溶液と、2mMの過酸化水素を含むPBS溶液からなる第2溶液とを準備した。なお、基質溶液は、導入口から流路内に導入させる直前に第1溶液と第2溶液とを混合して調製した。
洗浄液として、PBS−Tを準備した。また、基質溶液として、260mgのAmplex(登録商標)REDを5mlのPBS溶液に含有させた第1溶液と、2mMの過酸化水素を含むPBS溶液からなる第2溶液とを準備した。なお、基質溶液は、導入口から流路内に導入させる直前に第1溶液と第2溶液とを混合して調製した。
(分析方法)
まず、分析チップ100の蓋体の導入口上に100μlの反応液をマウントし、流路11内に反応液を導入させた。導入後、反応液は迅速に反応部13内に流入し、反応部13内に溜まった(ステップS1)。その状態で分析チップ100を1分間静置して、反応部13内での競合反応を行なった後(ステップS2)、洗浄液を導入口から500μl導入して、反応部13内の反応液を排出部14に排出させた(ステップS3)。そして、第1溶液と第2溶液とを1:1で混合した基質溶液を導入口から200μl導入して、反応部13内でのHRPと基質の酵素反応を3分間行い、この反応部13に向けて、フルオロメーターを用いて、波長560nmの励起光を照射して、波長590nmの蛍光を測定した(ステップS4)。なお、反応液の導入開始から酵素反応の終了までの操作は5分間以内で行うことができた。
まず、分析チップ100の蓋体の導入口上に100μlの反応液をマウントし、流路11内に反応液を導入させた。導入後、反応液は迅速に反応部13内に流入し、反応部13内に溜まった(ステップS1)。その状態で分析チップ100を1分間静置して、反応部13内での競合反応を行なった後(ステップS2)、洗浄液を導入口から500μl導入して、反応部13内の反応液を排出部14に排出させた(ステップS3)。そして、第1溶液と第2溶液とを1:1で混合した基質溶液を導入口から200μl導入して、反応部13内でのHRPと基質の酵素反応を3分間行い、この反応部13に向けて、フルオロメーターを用いて、波長560nmの励起光を照射して、波長590nmの蛍光を測定した(ステップS4)。なお、反応液の導入開始から酵素反応の終了までの操作は5分間以内で行うことができた。
(測定結果)
各反応液の競合反応後の測定結果を図10のグラフに示す。図10において、各反応液中のコルチゾール濃度が増加するに連れて、測定されたレゾルフィン由来の蛍光の強度が相対的に低下していることがわかった。したがって、競合反応を用いて、短期間で、高い感度でコルチゾールの濃度を測定することができた。また、たとえば、コルチゾールの各濃度に対応した検量線などを予め作成しておくことで、コルチゾールの濃度が未知の液体試料中のコルチゾール濃度を分析することができることがわかった。
各反応液の競合反応後の測定結果を図10のグラフに示す。図10において、各反応液中のコルチゾール濃度が増加するに連れて、測定されたレゾルフィン由来の蛍光の強度が相対的に低下していることがわかった。したがって、競合反応を用いて、短期間で、高い感度でコルチゾールの濃度を測定することができた。また、たとえば、コルチゾールの各濃度に対応した検量線などを予め作成しておくことで、コルチゾールの濃度が未知の液体試料中のコルチゾール濃度を分析することができることがわかった。
本発明の分析チップ、分析方法及び分析システムは、競合法による測定対象物質の定量に好適に利用することができる。
10 基体、11 流路、12 導入部、13 反応部、14 排出部、15 堰き止め部、21 担体、22 吸収体、31 固定化コルチゾール、32 BSA、33 コルチゾール、34 標識化特異的結合物質、34a コルチゾール抗体、34b HRP、40 反応液、41 洗浄液、42 基質溶液、50 測定装置、51 光出射器、52 検出器、53 モニター、100 分析チップ、200 分析システム。
Claims (11)
- 液体試料中の測定対象物質を分析するための分析チップであって、
基体と、該基体の表面に形成された、上流側から下流側へ前記液体試料を流すための流路と、を備え、
前記流路は、前記液体試料を前記流路に導入するための導入部と、該導入部の下流側に設けられた、前記液体試料を競合反応させるための反応部と、該反応部の下流側に設けられた排出部と、前記反応部と前記排出部との間に設けられた、前記反応部から前記排出部に前記液体試料が流れるのを抑制するための堰き止め部と、を含み、
前記反応部は、前記測定対象物質が特異的に結合する特異的結合物質または前記測定対象物質の競合物質が予め固定化された担体を収納する、分析チップ。 - 前記堰き止め部の流路幅が前記反応部の流路幅よりも狭い、請求項1に記載の分析チップ。
- 前記堰き止め部を構成する流路が撥液性である、請求項1または2に記載の分析チップ。
- 前記導入部の流路幅が前記反応部の流路幅よりも狭い、請求項1から3のいずれかに記載の分析チップ。
- 前記排出部は、前記反応部から流出した前記液体試料を吸収するための吸収体を収納する、請求項1から4のいずれかに記載の分析チップ。
- 請求項1から5のいずれかに記載の分析チップと、
前記分析チップの前記反応部で発生する蛍光、発光および吸光からなる群から選択されるいずれか1つの応答に基づいて、前記測定対象物質を分析するための分析装置と、を備える分析システム。 - 請求項1から6のいずれかに記載の分析チップを用いて、液体試料中の測定対象物質を分析する分析方法であって、
標識部を有する特異的結合物質または前記標識部を有する競合物質と、前記液体試料とを含有する反応液を前記反応部内に導入する工程と、
前記反応部内で、前記反応液と、前記担体に予め固定化された前記特異的結合物質または前記競合物質とを競合反応させる工程と、
前記競合反応させる工程の後に、前記反応液を前記排出部に流出させる工程と、
前記流出させる工程の後に、前記反応部内に残存する前記標識部を有する競合物質または前記標識部を有する特異的結合物質に由来する蛍光、発光および吸光からなる群から選択されるいずれか1つの応答に基づいて、前記測定対象物質を分析する工程と、を含む、分析方法。 - 前記導入する工程は、前記反応液を前記導入部から導入する工程を含む、請求項7に記載の分析方法。
- 前記流出させる工程は、前記反応部に洗浄液を流入させる工程を含む、請求項7または8に記載の分析方法。
- 前記標識部が、蛍光、発光および吸光からなる群から選択されるいずれか1つの応答を発する、請求項7から9のいずれかに記載の分析方法。
- 前記分析する工程は、前記標識部と酵素反応する基質を含有する基質溶液を前記反応部に流入させる工程を含み、前記基質は、前記標識部と酵素反応することによって、蛍光、発光および吸光からなる群から選択されるいずれか1つの応答を引き起こす物質である、請求項7から9のいずれかに記載の分析方法。
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