JP4985755B2 - 培養カプセル内の培養ガス置換方法及び培養カプセル - Google Patents
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Description
本発明は、不妊治療、再生医療等で細胞培養等の分野で使用されている細胞培養カプセル内の培養ガス置換方法及び培養カプセルに関する。
細胞培養は、再生医療，不妊治療等の培養組織を得るために必要な技術であって、例えば、不妊治療の一つに体外受精があり、体外受精後の複数の受精卵等を含む組織細胞は、図１Ａに示す培養液１の充填されたディッシュ２に注入され、それらはガス緩衝液３の入った培養カプセル４内に保管し、インキュベーター内に培養される（特許文献１）。
培養中に専用カプセル４内は培養環境に最適な酸素濃度（例、Ｏ2：２％）や二酸化炭素濃度（例、Ｏ2：５％）に管理する必要があり、その方法は、所定のガス濃度に混合された外部のガスボンベよりガスラインHEPAフィルターを介し、無塵・無菌化後に供給され、培養カプセル４内を置換する方法がある。
この培養ガスの置換は、ガス供給チューブ５よりガスの供給が行われ、通常の場合、培養ガスは水分をほとんど含んでおらず、その置換時に培養カプセル４内には水分を含まない乾燥空気の気流が形成され、その作用によりディッシュ２内の培養液が図１Ａに点線で示す如く徐々に蒸発し、受精卵に対する浸透圧力が変化してしまう欠点があった。
また、ディッシュ２内の培養液１の蒸発を防止するガス置換方法として、図１Ｂに示す如くガス供給延長チューブ６をガス緩衝液３内に注入し、そのバブリング作用により培養カプセル内を保湿する手段もあるが、ガス緩衝液３のバブリングにより飛散する水滴３ａが専用ディッシュ２に付着するなどの衛生面の問題があった。
本発明は、上記の点に鑑みて、乾燥空気流によるディッシュ内の培養液の蒸発を抑え、かつ、ガス緩衝液中のバブリングによる水滴の発生をなくし、その飛散を防止することを目的とし、更に培養カプセル内の保湿性能を向上することも目的としている。
請求項１記載の発明は、培養カプセルにおける培養ガス置換方法であって、培養液を入れたディッシュを収容し得るディッシュ架台を有する密閉容器よりなり、底部にガス緩衝液を満たした培養カプセルの内部にガスを導入するに際して、前記ガスを供給するチューブを、前記ガス緩衝液面の直近に開口し、培養ガスを吹き当てることにより、積極的にガス緩衝液を蒸発させると共に、ガス緩衝液のバブリングによる水滴飛散を発生することなく培養カプセル内を保湿し、培養液の蒸発を防止している。
請求項２記載の発明は、細胞培養カプセルであって、専用ディッシュを収容し得るディッシュ架台を有し下部をガス緩衝液槽とした培養カプセル本体に、本体内部を密閉する蓋体を設けると共に、前記ガス緩衝液槽内に注入したガス緩衝液表面と１乃至３mmの間隙を有し該液表面の直近に開口したガス供給チューブを設けている。
請求項３記載の発明は、緩衝液表面とディッシュ架台下部との間に保湿用無菌不織布を設置した。
請求項２記載の発明は、細胞培養カプセルであって、専用ディッシュを収容し得るディッシュ架台を有し下部をガス緩衝液槽とした培養カプセル本体に、本体内部を密閉する蓋体を設けると共に、前記ガス緩衝液槽内に注入したガス緩衝液表面と１乃至３mmの間隙を有し該液表面の直近に開口したガス供給チューブを設けている。
請求項３記載の発明は、緩衝液表面とディッシュ架台下部との間に保湿用無菌不織布を設置した。
本発明にあっては、培養カプセルの内部にガスを導入するに際して、前記ガスを供給するチューブを、前記ガス緩衝液面の直近に開口して、培養ガスを液面に吹き当てることによって、積極的にガス緩衝液を蒸発させるために蒸発量を１／５以下に低減することが可能となり、かつ、ガス緩衝液のバブリング時に飛散する水滴汚染をも無くすることが可能となった。
更に緩衝液表面とディッシュ架台下部との間に保湿用無菌不織布を設置したことにより更に培養液の蒸発量を抑える事が出来る。
本発明が実施される組織細胞の培養は、例えば不妊治療の一つの体外受精で行われ、体外受精の複数の受精卵等を含む組織細胞１０は、図３に示す培養液１の充填されたディッシュ２内に注入され、それらは、ガス緩衝液３の入った培養カプセル４内に保管し、３７℃に制御されたインキュベーター（図示せず）内で適宜回数培養される。
その詳細を以下説明する。
培養カプセル４は底部にガス緩衝液３４を満たせるカプセル本体４ａと、メンブレンフィルター６及びガス供給チューブ５を有するカプセル蓋体４ｂとよりなり、カプセル本体４ａ内にはディッシュ架台８を内装している。ディッシュ架台８には複数段にディッシュ２をガス緩衝液３上の空間に支持している。ディッシュ２には組織細胞１０と培養液１を収容する。ディッシュ架台８の下部にはガス緩衝液３の液面との間隙内に予めガス緩衝液で湿らせた無菌の保湿用不織布９を適宜手段で支持し、培養液１の蒸発量を低減させるようにしている。
培養カプセル４は底部にガス緩衝液３４を満たせるカプセル本体４ａと、メンブレンフィルター６及びガス供給チューブ５を有するカプセル蓋体４ｂとよりなり、カプセル本体４ａ内にはディッシュ架台８を内装している。ディッシュ架台８には複数段にディッシュ２をガス緩衝液３上の空間に支持している。ディッシュ２には組織細胞１０と培養液１を収容する。ディッシュ架台８の下部にはガス緩衝液３の液面との間隙内に予めガス緩衝液で湿らせた無菌の保湿用不織布９を適宜手段で支持し、培養液１の蒸発量を低減させるようにしている。
カプセル蓋体４ｂには、ガス供給チューブ５が設けられているが、蓋体内において、該チューブ５は延長チューブ１２としてガス緩衝液３の水面方向に延長され、その先端の開口端１１はガス緩衝液３の表面の直近に開口している。
上記ガス供給チューブ５は軟質シリコン製であり、混合ガスボンベ１３への回路１４のチューブに密閉接続可能なコネクター１５が取り付けられている。
前記延長チューブ１２は、ガス供給チューブ５の伸縮性により完全密閉され、外部に漏れることなく、蓋体４ｂへの入口部位１６も、同様にその伸縮性で完全密閉が保持できる。ガス供給延長チューブ１２は、ガス緩衝液３の液面より１〜３mmの位置にて培養ガスが供給されるよう、予め長さが調整されており、ガス緩衝液３の液面の位置は、培養カプセル４の液面印に合わせ充填することで一定に管理できる。
前記延長チューブ１２は、ガス供給チューブ５の伸縮性により完全密閉され、外部に漏れることなく、蓋体４ｂへの入口部位１６も、同様にその伸縮性で完全密閉が保持できる。ガス供給延長チューブ１２は、ガス緩衝液３の液面より１〜３mmの位置にて培養ガスが供給されるよう、予め長さが調整されており、ガス緩衝液３の液面の位置は、培養カプセル４の液面印に合わせ充填することで一定に管理できる。
本発明にあって、図３に示す如く培養カプセル４に対して、予め所定のガス濃度に調整された混合ガスがボンベ１３から減圧弁１７，流量調整弁１８，電磁弁１９，ガスラインヘパフィルター２０を通りガス供給チューブ５から培養カプセル４内に送られる。供給する培養ガスの圧力を約０．２ＭＰａに調整する。
培養ガスの供給量は、不妊治療用の専用培養カプセルの場合に約１０ml／min、角型細胞培養ディッシュ用カプセルの場合には約３０ml／minなどと、供給されるカプセル容器の容量により指定され、流量調整弁１８にて制御する。
基本的には供給される混合ガスは無菌・無塵ではあるが、配管中や電磁弁の潜在的に残留する付着物の再離散があるため、培養カプセル４の直前にガスラインヘパフィルター２０を装着し、その後に接続されたガス供給チューブ５より培養カプセル４内に培養ガスを供給する。
培養カプセル４内への培養ガス供給構造の詳細を図４に示す。
基本的には供給される混合ガスは無菌・無塵ではあるが、配管中や電磁弁の潜在的に残留する付着物の再離散があるため、培養カプセル４の直前にガスラインヘパフィルター２０を装着し、その後に接続されたガス供給チューブ５より培養カプセル４内に培養ガスを供給する。
培養カプセル４内への培養ガス供給構造の詳細を図４に示す。
培養カプセル４内の培養ガスは、延長チューブ１２を通って，その開口端部１１から培養液１の表面に吹き付けられ培養液１は蒸発し、カプセル本体４ａ内の湿度を高めることになる。
培養ガスが置換された後の培養カプセル４内の空気は、図５に示す培養ガス出口より排出されるが、万が一に培養ガスが供給されなかった場合の逆流を考慮し、孔径０．２μmのメンブレンフィルター６を装着している。
培養ガスが置換された後の培養カプセル４内の空気は、図５に示す培養ガス出口より排出されるが、万が一に培養ガスが供給されなかった場合の逆流を考慮し、孔径０．２μmのメンブレンフィルター６を装着している。
従来の直接培養ガスを置換する方法、及び、ガス緩衝液にバブリングし置換する方法と、本発明の培養ガス新置換方法の培養液の蒸発量を比較する。また対象としてガス緩衝液とディッシュ架台間に保湿用の無菌不織布を設置した場合の蒸発量を示す。
本発明により、従来の直接培養ガスを置換する方法に対し、蒸発量を１／５以下に低減することができ、かつ、ガス緩衝液のバブリング時に飛散する水滴汚染を無くし、ほぼ同等の培養液の蒸発量とすることが可能となった。また、その保湿効果は保湿用の無菌不織布を設置することにより、更に培養液の蒸発量を抑えることができる。
本発明により、従来の直接培養ガスを置換する方法に対し、蒸発量を１／５以下に低減することができ、かつ、ガス緩衝液のバブリング時に飛散する水滴汚染を無くし、ほぼ同等の培養液の蒸発量とすることが可能となった。また、その保湿効果は保湿用の無菌不織布を設置することにより、更に培養液の蒸発量を抑えることができる。
１ 培養液
２ ディッシュ
３ ガス緩衝液
４ 培養カプセル
４ａ カプセル本体
４ｂ カプセル蓋体
５ ガス供給チューブ
６ メンブレンフィルター
８ ディッシュ架台
９ 保湿用不織布
１０ 組織細胞
１１ 開口端
１２ 延長チューブ
１３ 混合ガスボンベ
１４ 回路
１５ コネクター
１６ 入口部位
１７ 減圧弁
１８ 流量調整弁
１９ 電磁弁
２０ ヘパフィルター
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４ａ カプセル本体
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９ 保湿用不織布
１０ 組織細胞
１１ 開口端
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Claims (3)
- 培養液を入れたディッシュを収容し得るディッシュ架台を有する密閉容器よりなり、底部にガス緩衝液を満たした培養カプセルの内部にガスを導入するに際して、前記ガスを供給するチューブを、前記ガス緩衝液面の直近に開口し、培養ガスを吹き当てることにより、積極的にガス緩衝液を蒸発させると共に、ガス緩衝液のバブリングによる水滴飛散を発生することなく培養カプセル内を保湿し、培養液の蒸発を防止することを特徴とする培養カプセルにおける培養ガス置換方法。
- 専用ディッシュを収容し得るディッシュ架台を有し下部をガス緩衝液槽とした培養カプセル本体に、本体内部を密閉する蓋体を設けると共に、前記ガス緩衝液槽内に注入したガス緩衝液表面と1乃至３ｍｍの間隙を有し該液表面の直近に開口したガス供給チューブを設けたことを特徴とする細胞培養カプセル。
- 緩衝液表面とディッシュ架台下部との間に保湿用無菌不織布を設置したことを特徴とする請求項２記載の細胞培養カプセル。
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