JP4843505B2 - ナノ黒鉛構造体−金属ナノ粒子複合体 - Google Patents

ナノ黒鉛構造体−金属ナノ粒子複合体 Download PDF

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Description

本発明は、フェリチン等のケージタンパク質の表面にナノ黒鉛構造体認識ペプチドを融合又は化学的に結合させたタンパク質や、該タンパク質を用いて作製した、ナノ黒鉛構造体に無機金属原子又は無機金属化合物のナノ粒子を複数担持させたナノ黒鉛構造体−金属ナノ粒子複合体等に関する。例えば、ナノメートルスケールの微細構造を有する黒鉛構造化合物とこれを特異的に認識する融合フェリチン等のケージタンパク質を介して、ナノ粒子を複数担持させたナノ黒鉛構造体−金属ナノ粒子複合体は、半導体・ナノバイオテクノロジーなどに有利に用いることができる。
炭素の結晶構造としてはダイヤモンドとグラファイトが古くから知られているが、１９８５年にはスモーリー（R.E.Smalley）、カール（R.F.Curl）、クロトー（H.W.Kroto）らにより（Ｃ６０）が発見された（例えば、非特許文献１）。Ｃ６０は１２個の５角形と２０個の６角形からなるサッカーボール状の構造をしており、Ｃ６０のほかにもＣ７０、Ｃ７６などの大きな籠状分子が存在し、これら一連の分子は「フラーレン」と呼ばれている。また、１９９１年には飯島澄男により「カーボンナノチューブ」（非特許文献２、特許文献１）、１９９９年には同じく飯島澄男により「カーボンナノホーン」（非特許文献３、特許文献１）といった、それまで存在が知られていなかった新しい構造を持った炭素系化合物が相次いで発見された。これら、フラーレン、カーボンナノチューブ、カーボンナノホーンはいずれも炭素原子の６員環と５員環から構成されており、ナノメートルスケールの微細構造体を形成することから、「ナノ黒鉛構造体」として近年大きな注目を集めている。
ナノ黒鉛構造体が注目を集める理由をいくつか上げてみると、「カーボンナノチューブが、そのカイラリティーの違いにより金属と半導体の両方の性質をもつことができる」（非特許文献４）、「金属導入フラーレンが超電導を示す」（非特許文献５）、「カーボンナノホーンの示す選択的な気体貯蔵能力」（非特許文献６）、「カーボンナノホーンのもつ医薬化合物の担持、徐放能力」（特許文献２、非特許文献７)などがある。これらの特徴的な性質を利用して、新しい電子材料や触媒、光材料、その他の分野で、より具体的には、半導体配線、蛍光表示管、燃料電池、ガス貯蔵、遺伝子治療ベクター、化粧品、薬品送達システム、バイオセンサーなどへのナノ黒鉛構造体の応用利用が期待されている。
発明者の一人、芝清隆らはナノ黒鉛構造体の一つであるカーボンナノホーンに結合するペプチドモチーフを、ファージ提示法により単離している（特許文献３、非特許文献８）。
一方、フェリチンタンパク質は、「必須の金属であるが、毒性も同時に備えもつ『鉄』分子」を生体内で貯蔵するタンパク質として、古くから知られている。フェリチンは動・植物からバクテリアまで普遍的に存在していて、生体あるいは細胞中の鉄元素のホメオスタシスに深く関わっている。ヒトやウマなどの高等真核生物のフェリチンは、分子量約２０ｋＤａのペプチド鎖が直径約１２ｎｍの２４量体からなる球核状構造を形成し、内部に７−８ｎｍの空間を持つ。この内部空間に、ナノ粒子状の酸化鉄のかたまりとして鉄分子を貯蔵している。タンパク質球殻（ケージ）を構成する２４個のサブユニットには２種類のタイプ（Ｈタイプ、Ｌタイプ）があり、その組成比は生物種、組織により異なっている。
天然には鉄のナノ粒子を内部に貯蔵するフェリチンであるが、しかしながら人工的には、鉄以外にも、ベリリウム、ガリウム、マンガン、リン、ウラン、鉛、コバルト、ニッケル、クロムなどの酸化物、また、セレン化カドミウム、硫化亜鉛、硫化鉄、硫化カドミウムなどの半導体・磁性体などのナノ粒子を貯蔵できることが示されており、半導体材料工学分野や保険医療分野での応用研究が盛んにおこなわれている。
特開２００１−６４００４ 特願２００４−１３９２４７ 特開２００４−１２１１５４ Nature, 318:162-163, 1985 Nature, 354:56-58, 1991 Chem. Phys. Lett., 309: 165-170, 1999 Nature, 391:59-62 Nature, 350:600-601 日経サイエンス、42, 8月号, 2002 Mol Pharmaceutics 1: 399 Langmuir, 20, 8939-8941, 2004
優れた特性をもつナノ黒鉛構造体と、金属内包フェリチン分子を組合せることができると、これまでにない新しい機能をもった複合材料の開発が期待できる。この場合、カーボンナノチューブ、カーボンナノホーンなどのナノ黒鉛構造体をフェリチン分子が効率良く認識し、結合させる技術が必要となる。本発明の課題は、無機金属原子又は無機金属化合物のナノ粒子形成能をもつフェリチン分子の持つ能力をナノ黒鉛構造体認識ペプチドに融合することで、カーボンナノチューブ・カーボンナノホーン、あるいはその修飾体を効率良く、認識し、機能性化合物を担持させることを可能にすることにある。また、フェリチン分子は界面で二次元結晶形成能を有し、分子配列能を持つことから、ナノ黒鉛構造体認識ペプチドを融合したフェリチンの分子配列能を利用したカーボンナノチューブ・カーボンナノホーンの整列を可能にすることにある。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究し、ウマ脾臓由来Ｌタイプフェリチン分子のアミノ末端をコードするｃＤＮＡに、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチドをコードするＤＮＡを融合させ、大腸菌を利用して、配列番号２６に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を発現し、このタンパク質を精製し、得られた融合タンパク質の内部空間に、酸化金属ナノ粒子を保持させ、ナノ黒鉛構造体上にナノ粒子を複数担持させることができることを確認し、本発明を完成させるに至った。
すなわち本発明は、（１）ケージタンパク質表面に、ナノ黒鉛構造体認識ペプチドを融合又は化学的に結合させたタンパク質の内部空間に、無機金属原子又は無機金属化合物のナノ粒子を保持させ、ナノ黒鉛構造体認識ペプチドのナノ黒鉛構造体との親和性を利用して、ナノ黒鉛構造体に無機金属原子又は無機金属化合物のナノ粒子を複数担持させたナノ黒鉛構造体−金属ナノ粒子複合体や、（２）フェリチンが、高等真核生物由来のフェリチンであることを特徴とする上記（１）記載のナノ黒鉛構造体−金属ナノ粒子複合体や、（３）高等真核生物由来のフェリチンが、ウマ脾臓由来Lタイプのフェリチンであることを特徴とする（２）記載のナノ黒鉛構造体−金属ナノ粒子複合体や、（４）ナノ黒鉛構造体認識ペプチドが、配列番号１〜２０のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるペプチドであることを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれか記載のナノ黒鉛構造体−金属ナノ粒子複合体や、（５）ナノ黒鉛構造体認識ペプチドが、配列番号１〜２０のいずれかに示されるアミノ酸配列の全部又はその一部を含むナノ黒鉛構造体に結合能を有するペプチドであることを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれか記載のナノ黒鉛構造体−金属ナノ粒子複合体や、（６）配列番号１〜２０のいずれかに示されるアミノ酸配列が、ＤＹＦＳＳＰＹＹＥＱＬＦ（配列番号１）であることを特徴とする上記（４）又は（５）記載のナノ黒鉛構造体−金属ナノ粒子複合体や、（７）配列番号１〜２０のいずれかに示されるアミノ酸配列が、ＹＤＰＦＨＩＩ（配列番号２）であることを特徴とする上記（４）又は（５）記載のナノ黒鉛構造体−金属ナノ粒子複合体や、（８）無機金属原子又は無機金属化合物のナノ粒子が、金属ナノ粒子であることを特徴とする上記（１）〜（７）のいずれか記載のナノ黒鉛構造体−金属ナノ粒子複合体や、（９）無機金属原子又は無機金属化合物のナノ粒子が、金属化合物ナノ粒子であることを特徴とする上記（１）〜（７）のいずれか記載のナノ黒鉛構造体−金属ナノ粒子複合体や、（１０）金属化合物ナノ粒子が、酸化金属ナノ粒子であることを特徴とする上記（９）記載のナノ黒鉛構造体−金属ナノ粒子複合体や、（１１）金属化合物ナノ粒子が、磁性材料ナノ粒子であることを特徴とする上記（９）記載のナノ黒鉛構造体−金属ナノ粒子複合体や、（１２）金属が、鉄、ベリリウム、ガリウム、マンガン、リン、ウラン、鉛、コバルト、ニッケル、亜鉛、カドミウム又はクロムであることを特徴とする上記（１）〜（１１）のいずれか記載のナノ黒鉛構造体−金属ナノ粒子複合体や、（１３）無機金属原子又は無機金属化合物のナノ粒子が、酸化鉄ナノ粒子、セレン化カドミウムナノ粒子、セレン化亜鉛ナノ粒子、硫化亜鉛ナノ粒子、又は硫化カドミウムナノ粒子であることを特徴とする上記（１）〜（７）のいずれか記載のナノ黒鉛構造体−金属ナノ粒子複合体や、（１４）ナノ黒鉛構造体が、カーボンナノチューブ又はカーボンナノホーンであることを特徴とする上記（１）〜（１３）のいずれか記載のナノ黒鉛構造体−金属ナノ粒子複合体や、（１５）カーボンナノチューブ又はカーボンナノホーンが、構成する炭素構造に官能基が付加されていることを特徴とする上記（１４）記載のナノ黒鉛構造体−金属ナノ粒子複合体や、（１６）ナノ黒鉛構造体が基板上で二次元に整列されていることを特徴とする上記（１）〜（１５）のいずれか記載のナノ黒鉛構造体−金属ナノ粒子複合体や、（１７）金属ナノ粒子が基板上で二次元に整列されていることを特徴とする上記（１）〜（１５）のいずれか記載のナノ黒鉛構造体−金属ナノ粒子複合体や、（１８）ケージタンパク質が除去されていることを特徴とする上記（１６）記載のナノ黒鉛構造体−金属ナノ粒子複合体に関する。
また本発明は、（１９）フェリチンのＮ末端又はループ構造部位に、ナノ黒鉛構造体認識ペプチドを融合させたタンパク質の内部空間に、無機金属原子又は無機金属化合物のナノ粒子を添加して保持させ、ナノ黒鉛構造体認識ペプチドのナノ黒鉛構造体との親和性を利用して、ナノ黒鉛構造体に無機金属原子又は無機金属化合物のナノ粒子を複数担持させる方法に関する。
さらに本発明は、（２０）フェリチンのＮ末端又はループ構造部位に、ナノ黒鉛構造体認識ペプチドを融合させたタンパク質の内部空間に、無機金属原子又は無機金属化合物のナノ粒子を添加して保持させ、ナノ黒鉛構造体認識ペプチドのナノ黒鉛構造体との親和性を利用して、ナノ黒鉛構造体に無機金属原子又は無機金属化合物のナノ粒子を複数担持させ、加熱処理によりタンパク質部分を取り除き、ナノ黒鉛構造体と無機金属化合物のナノ粒子との複合体を作る方法や、（２１）フェリチンのＮ末端又はループ構造部位に、ナノ黒鉛構造体認識ペプチドを融合させたタンパク質の内部空間に、無機金属原子又は無機金属化合物のナノ粒子を添加して保持させ、ナノ黒鉛構造体認識ペプチドのナノ黒鉛構造体との親和性を利用して、ナノ黒鉛構造体に無機金属原子又は無機金属化合物のナノ粒子を複数担持させ、電子線処理によりタンパク質部分を取り除き、ナノ黒鉛構造体と無機金属化合物のナノ粒子との複合体を作る方法に関する。
ウマ脾臓由来のＬタイプのフェリチン（ＬＦ）の結晶構造とＤＹＦＳＳＰＹＹＥＱＬＦ（配列番号１；Ｎ１配列）の提示部位を示す図である。ウマ脾臓由来Ｌフェリチン（ＬＦ０）の結晶構造のＮ末端部位を赤で示した。図１に示されるように、ＬＦ０のＮ末端は、分子の外側に位置するため、Ｎ末端にＮ１配列を融合することで、Ｎ１配列を多重に提示することができる。 Ｎ１−ＬＦ発現ベクター ｐＫＩＳ２構築の模式図である。 Ｎ１−ＬＦ組換えフェリチン発現ベクターｐＫＩＳ２は、ウマ脾臓由来Ｌフェリチン発現ベクターであるｐＫＩＴＯを制限酵素BamHIとSacIで切断し、アニーリングした配列番号２２及び２３の合成ＤＮＡを挿入し、次にBamHIで切断する。そこに、ｐＫＩＴＯをBamHIで切断したときに生じる短いDNA断片を挿入し作製した。 Ｎ１−ＬＦの最終精製標品のポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す図である。 Ｎ１−ＬＦ最終精製標品３μｇをポリアクリルアミドゲル電気泳動により、その均一性を評価した。１５〜２５％の濃度勾配ゲルにより分離をおこない、クマシーブリリアントブルーによる染色をおこなったところ、目的のＮ１−ＬＦの分子量に相当する位置にのみタンパク質のバンドが観察されたことから、非常に純度の高い標品であることが確認できた。左のレーンは分子量マーカーで、上から９７．４、６６．３、４２．４、３０．０、２０．１、１４．４ｋＤａに相当する。右のレーンはＮ１−ＬＦ最終精製標品。 Ｎ１−ＬＦの内部空間における酸化鉄ナノ粒子形成を示す図である。 Ｎ１−ＬＦの内部空間に酸化鉄ナノ粒子を形成させた時の溶液の様子。Controlは、フェリチンタンパク質溶液を含まないもの。溶液の色からフェリチンの内部空間に酸化鉄ナノ粒子が形成されたことが分かる。 Ｎ１−ＬＦ内部空間に酸化鉄ナノ粒子が形成されていることを示す透過型電子顕微鏡写真を示す図である。 １％ 金グルコースにより染色したＮ１−ＬＦ像を日本電子JEOL1010, １００ｋＶで観察した。 ＬＦ０内部空間に酸化鉄ナノ粒子が形成されていることを示す透過型電子顕微鏡写真を示す図である。 １％ 金グルコースにより染色したＮ１−ＬＦ像を日本電子JEOL1010, １００ｋＶで観察した。 カーボンナノホーン上に担持された酸化金属ナノ粒子を示す図である。 カーボンナノホーンに結合能を有するペプチドを、フェリチンタンパク質に提示することで、Ｎ１−ＬＦはカーボンナノホーン上に金属酸化物ナノ粒子を特異的に複数担持にすることができた（左）。ウマ脾臓由来のＬタイプのフェリチン（ＬＦ０）ではカーボンナノホーン上に金属酸化物ナノ粒子を担持にすることができない（右）。 単層カーボンナノチューブ上に担持された酸化金属ナノ粒子を示す図である。カーボンナノホーンに結合能を有するペプチドを、フェリチンタンパク質に提示することで、Ｎ１−ＬＦは単層カーボンナノチューブ上に複数の金属酸化物ナノ粒子を担持することができた。
本発明のナノ黒鉛構造体−金属ナノ粒子複合体としては、ケージタンパク質表面に、ナノ黒鉛構造体認識ペプチドを融合又は化学的に結合させたタンパク質の内部空間に、無機金属原子又は無機金属化合物のナノ粒子を保持させ、ナノ黒鉛構造体認識ペプチドのナノ黒鉛構造体との親和性を利用して、ナノ黒鉛構造体に無機金属原子又は無機金属化合物のナノ粒子を複数担持させた複合体であれば特に制限されるものではなく、また、タンパク質としては、ケージタンパク質表面に、ナノ黒鉛構造体認識ペプチドを融合又は化学的に結合させたタンパク質であれば特に制限されるものではなく、ここで、本発明のケージタンパク質とは、内部に空間をもち、物質内包能力のある蛋白質をいう。
上記ケージタンパク質としては、フェリチンタンパク質ファミリーや、細菌に由来するものや、ウイルス粒子を挙げることができる。フェリチンタンパク質ファミリーとしては、フェリチンやアポフェリチンを挙げることができ、例えば、ウマ脾臓由来Lタイプのフェリチン等の高等真核生物由来のＬタイプやＨタイプのフェリチンを好適に例示することができる。細菌に由来するケージタンパク質としては、ＤｐｓＡタンパク質やＭｒｇＡタンパク質を挙げることができる。また、ウイルス粒子としては、例えば、レトロウイルス、アデノウィルス、ロタウィルス、ポリオウィルス、サイトメガロウイルス、カリフラワーモザイクウイルス等のウイルス粒子を挙げることができる。
上記ナノ黒鉛構造体としては、カーボンナノチューブ、カーボンナノホーンの他、カーボンナノチューブやカーボンナノホーンが構成する炭素構造に、アミノ基、水酸基、カルボキシル基等の官能基が付加されているような修飾されたナノ黒鉛構造体も挙げることができる。
上記ナノ黒鉛構造体認識ペプチドとしては、配列番号１〜２０に示されるアミノ酸配列からなるペプチド（特許文献３、非特許文献８参照）や、配列番号１〜２０のいずれかに示されるアミノ酸配列の全部又はその一部を含むナノ黒鉛構造体に結合能を有するペプチドを挙げることができるが、中でもＤＹＦＳＳＰＹＹＥＱＬＦ（配列番号１）やＹＤＰＦＨＩＩ（配列番号２）のペプチドを好適に例示することができる。
ナノ黒鉛構造体認識ペプチドを融合又は化学的に結合させるケージタンパク質表面の部位としては、ナノ黒鉛構造体認識ペプチドがナノ黒鉛構造体と結合しうる部位であれば特に制限されないが、例えばフェリチンの場合、アミノ末端以外にも、フェリチン表面に露出したループ構造部位などを例示することができる。
フェリチン等のケージタンパク質表面にナノ黒鉛構造体認識ペプチドを融合する方法としては、実施例に記載されているように、Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989.、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38,John Wiley & Sons (1987-1997)等に記載の方法に準じて行うことができる。また、フェリチン等のケージタンパク質表面にナノ黒鉛構造体認識ペプチドを化学的に結合させる方法としては、文献（Proteins second edition, T. E. Creighton, W. H. Freemen and Company, New York, 1993. と、G. T. Hermanson, in Bioconjugate Techniques, ed. G. T. Hermanson, Academic Press, San Diego CA, 1996, pp. 169-186.）記載の方法を挙げることができる。
上記無機金属原子又は無機金属化合物のナノ粒子としては、鉄、ベリリウム、ガリウム、マンガン、リン、ウラン、鉛、コバルト、ニッケル、亜鉛、カドミウム、クロム等の金属のナノ粒子や、これら金属の酸化物、水酸化物、炭酸塩等のナノ粒子、磁性材料ナノ粒子などの金属化合物ナノ粒子を挙げることができるが、酸化鉄ナノ粒子、セレン化カドミウムナノ粒子、セレン化亜鉛ナノ粒子、硫化亜鉛ナノ粒子、硫化カドミウムナノ粒子を好適に例示することができる。
上記のケージタンパク質表面にナノ黒鉛構造体認識ペプチドを融合又は化学的に結合させたタンパク質に、さらに機能性ペプチド、例えばチタンに結合能を有するペプチドを融合又は化学的に結合させ、チタン基盤上にナノ黒鉛構造体を配列し、尚且つナノ黒鉛構造体にナノ粒子を複数担持させることもできる。
フェリチン等の二次元結晶形成能を有するケージタンパク質の場合、かかるケージタンパク質を二次元結晶化することで、ナノメータサイズのパターン作製が可能となる。例えば、ケージタンパク質表面に、ナノ黒鉛構造体認識ペプチドを融合又は化学的に結合させたタンパク質の内部空間に、無機金属原子又は無機金属化合物のナノ粒子を保持させ、ナノ黒鉛構造体認識ペプチドのナノ黒鉛構造体との親和性を利用して、ナノ黒鉛構造体に無機金属原子又は無機金属化合物のナノ粒子を複数担持させ、加熱処理又は電子線処理によりタンパク質部分を取り除くと、ナノ黒鉛構造体が基板上で二次元に整列されているナノ黒鉛構造体−金属ナノ粒子複合体や、金属ナノ粒子が基板上で二次元に整列されているナノ黒鉛構造体−金属ナノ粒子複合体を得ることができる。得られた複合体は、デバイス・メモリーなど、半導体分野における、デバイス・メモリーなどの高集積化の基本技術となりうる。
また、ケージタンパク質を、例えば、グルタールアルデヒドのような複数の官能基を有する化合物とタンパク質を構成するアミノ酸の側鎖との間の反応性を利用して、タンパク質同士及び基板との間に架橋結合を形成させることにより、タンパク質を基材上に固定化する方法や、官能基を持つＳＡＭ（膜自己形成能力を持つ分子）を基材上に配置し、その官能基とタンパク質を構成するアミノ酸の側鎖との間に結合を形成させてタンパク質を固定化する方法等により、二次元のアレイに構成することによっても、ナノ黒鉛構造体が基板上で二次元に整列されているナノ黒鉛構造体−金属ナノ粒子複合体や、金属ナノ粒子が基板上で二次元に整列されているナノ黒鉛構造体−金属ナノ粒子複合体を得ることができる。得られた複合体は、デバイス・メモリーなど、半導体分野における、デバイス・メモリーなどの高集積化の基本技術となりうる。
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
ウマ脾臓由来のＬタイプのフェリチン（ＬＦ）に配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるナノ黒鉛構造体認識ペプチド（Ｎ１）を融合した融合フェリチンタンパク質（Ｎ１−ＬＦ、図１）発現のためのＤＮＡ（ｐＫＩＳ２）の作製は、以下の手順でおこなった。すなわち、互いに相補的で開始コドンであるＭｅｔに続いて、配列番号２１で示されるアミノ酸配列をコードし、開始コドン側に制限酵素BamHIリンカー配列を、反対側に制限酵素SalIリンカー配列を持つような配列番号２２及び配列番号２３の合成ＤＮＡ、各１００ｐｍｏｌｅ/μｌを５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２中で混合し、７０℃で１０分間加温した後、ゆっくりと室温に戻すことで、アニーリング反応をおこなった。次に、ウマ脾臓由来のＬタイプフェリチンｃＤＮＡが、ｔａｃプロモーター下流にクローニングされたプラスミドｐＫＩＴＯ(Okuda et al. 2003, Biotechnology and Bioengineering, Vol 84, No. 2, p187-194)を制限酵素BamHI、SalIで消化、１％アガロースゲル電気泳動により、分離される約６ｋｂの大きなＤＮＡフラグメントをGene Clean II kit(BIO101社)により精製し、先述のアニールしたＤＮＡと混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合させた。
次に、このＤＮＡとｐＫＩＴＯを、それぞれBamHIで消化し、１％アガロースゲル電気泳動により分離されるＤＮＡフラグメント、前者は約６ｋｂのフラグメント、後者は約３００ｂｐのフラグメントをGene Clean II kit (BIO101社)により精製し、Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅを用いて結合させた。結合したＤＮＡを大腸菌XLI-blue株（hsdR17、supE44、recA1、endA1、gyrA46、thi、relA1、lac/F’［proAB＋、lacIｑ△（lacZ）Ｍ１５：：Tn10（tetR）］）に、常法（Molecular Cloning Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press）に従いクローン化し、ｐＫＩＴＯの約３００ｂｐのBamHIフラグメント内のプライマー（配列番号２４）を用いて、ＤＮＡシークエンスにより、目的の方向に約３００ｂｐのBamHIフラグメントが挿入されているクローンをダイデオキシターミネイト法により決定した（CEQ DTCS Quick start kit、ベックマン社、カルフォルニア）。反応産物の泳動とデータ解析には、オートキャピラリーシーケンサー（CEQ2000、ベックマン）を用いた。（図２）
ウマ脾臓由来のＬ型フェリチンにナノ黒鉛構造体認識ペプチドを融合した融合フェリチンタンパク質の発現・精製は以下のようにおこなった。
大腸菌XLI-blue株に、常法に従いｐＫＩＳ２を形質転換し、コロニーを滅菌した楊枝で拾いあげ、５ｍｌのＬＢ培地で３７℃、１６−１８時間震盪培養した。つぎに、この培養液を、１ｌｉｔｅｒのＬＢ培地に植え継ぎ３７℃でさらに１６−１８時間震盪培養をおこなった。大腸菌を、遠心分離（Beckman J2-21M, JA-14ローター, ５０００ｒｐｍ，５分）により集菌した。集菌した大腸菌を、８０ｍｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０で洗浄し、再び、遠心分離（クボタ社、5922, RA410M2ローター，４０００ｒｐｍ，１０分）により集菌した。３０ｍｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０に懸濁した後、超音波破砕機（BRANSON, SONIFIER 250, 微量チップ、出力最大、duty cycle ５０％，２分を３〜４回繰り返す）を用いて、大腸菌破砕液を得た。大腸菌破砕液を、遠心分離（クボタ社、5922, RA410M2ローター, ８０００ｒｐｍ，３０分）により、可溶性の画分を回収し、６５℃で２０分間温浴することで、共雑タンパク質の変性を行った。遠心分離（クボタ社、5922, RA410M2ローター, ８０００ｒｐｍ，３０分）により、沈澱を形成する変成した共雑タンパク質を取り除き、上清を回収した。
回収した上清に終濃度０．５Ｍになるように５Ｍ ＮａＣｌを添加・撹拌し、室温で５〜１０分静置した後、遠心分離（クボタ社、5922, RA410M2ローター, ５０００ｒｐｍ，１０分）により沈澱を回収した。沈澱を２０ｍｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に溶解し、再び終濃度０．５Ｍになるように５Ｍ ＮａＣｌを添加・撹拌し、室温で５−１０分静置した後、遠心分離（クボタ社、5922, RA410M2ローター, ５０００ｒｐｍ，１０分）により沈澱を回収した。さらに、沈澱を２０ｍｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に溶解し、今度は終濃度０．３７５Ｍになるように５Ｍ ＮａＣｌを添加・撹拌し、室温で５−１０分静置した後、遠心分離（クボタ社、5922, RA410M2ローター, ５０００ｒｐｍ， １０分）により沈澱を回収した。回収した沈澱を、１０ｍｌの５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．０）に溶解した。
さらに、必要に応じてゲルろ過クロマトグラフィーによる精製をおこなっている。すなわち、上述の精製標品２００〜５００μｌを５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５），１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＮａＮ３で平衡化したＳＷ４０００ＸＬカラム（ＴＯＳＯ）に注入し、流速１ｍｌ／ｍｉｎでクロマトグラフィーによる分離精製をおこない、フェリチン２４量体に相当するフラクションを回収した（図３）。
実施例１で得られたＮ１−ＬＦがリコンビナントアポフェリチンと同様に、内部空間に酸化鉄のナノ粒子形成能を有することを、以下の手順で確認した。
５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．０），０．５ｍｇ／ｍｌ Ｎ１−ＬＦ溶液に、５０ｍＭ 硫酸アンモニウム鉄（ＩＩ）６水和物を１／１０体積添加（終濃度５ｍＭ）し、室温で終夜静置した（図４）。その後、遠心分離（クボタ社、5922, RA410M2ローター, ３０００ｒｐｍ，１０分）に余分な酸化鉄を沈澱させ取り除く操作を２回繰り返した。次に、超遠心分離器（ベックマン, TLA 100.4 ローター, ５０，０００ｒｐｍ，１時間）による遠心操作により、Ｎ１−ＬＦを沈澱させた。この沈澱を５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．０）により溶解し、等量の１５％ 蔗糖溶液の上に重層して、再び超遠心分離器（ベックマン, TLA 100.4 ローター, ５０，０００ｒｐｍ，１時間）による遠心操作により蔗糖画分にあるＮ１−ＬＦを回収した。回収したＮ１−ＬＦは、酸化鉄のナノ粒子が形成されていることを透過型電子顕微鏡（JEOL1010, １００ｋＶ，１％ 金グルコース染色、図５）により確認し、回収したＮ１−ＬＦは、５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．０）に透析した後、BioRad Protein Assay（バイオラッド社、）により定量し、他の実験に用いた。
（比較例１）
ウマ脾臓由来のＬタイプのフェリチン（ＬＦ０）も実施例１と同様に、組換え体を用いた。組換え体の調製は、以下のようにおこなった。大腸菌XLI-blue株に、常法に従いｐＫＩＴＯを形質転換し、コロニーを滅菌した楊枝で拾いあげ、５ｍｌのＬＢ培地で３７℃、１６−１８時間震盪培養した。つぎに、この培養液を、１ ｌｉｔｅｒのＬＢ培地に植え継ぎ３７℃でさらに１６−１８時間震盪培養をおこなった。大腸菌を、遠心分離（Beckman J2-21M, JA-14ローター, ５０００ｒｐｍ, ５分）により集菌した。集菌した大腸菌を、８０ｍｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で洗浄し、再び、遠心分離（クボタ社、5922, RA410M2ローター, ４０００ｒｐｍ, １０分）により集菌した。３０ｍｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に懸濁した後、超音波破砕機（BRANSON, SONIFIER 250, 微量チップ、出力最大、ｄｕｔｙ ｃｙｃｌｅ ５０％, ２分を３〜４回繰り返す）を用いて、大腸菌破砕液を得た。大腸菌破砕液を、遠心分離（クボタ社、5922, RA410M2ローター, ８０００ｒｐｍ，３０分）により、可溶性の画分を回収し、６５℃で２０分間温浴することで、共雑タンパク質の変性を行った。遠心分離（クボタ社、5922, RA410M2ローター, ８０００ｒｐｍ, ３０分）により、沈澱を形成する変成した共雑タンパク質を取り除き、上清を回収した。
上清を、５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．０）で平衡化した陰イオン交換クロマト担体であるQ-sepharose HP (アマシャム)に注入し、１００ｍｌの１００−５００ｍＭ塩化ナトリウム濃度勾配（３ｍｌ／ｍｉｎ）により溶出した。ＬＦ０を含む画分約４０ｍｌを、セントリプレップ１０（アミコン）により２．５〜３ｍｌに濃縮し、５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．０）， １５０ｍＭ ＮａＣｌ（以下ＴＢＳ）で平衡化した６０ｃｍ長のゲルろ過クロマトグラフ・セファアクリルＳ−４００に注入し、流速１．５ｍｌ／ｍｉｎでクロマトグラフィーをおこなった。ＬＦ０を含む各画分〜１００μｌを５０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ ｐＨ７．５， １５０ｍＭ ＮａＣｌ， １ｍＭ ＮａＮ３で平衡化したＳＷ４０００ＸＬカラム、流速１ｍｌ／ｍｉｎでクロマトグラフィーによる分析をおこない、フェリチン２４量体に相当する画分を確認し、以下の実験に用いた。
（比較例２）
比較例１で得られたＬＦ０の内部空間への酸化鉄のナノ粒子形成は、実施例２と同じ手順でおこなった。ナノ粒子形成の確認も同じく、実施例２と同様におこなった（図６）。
実施例２で得られた酸化鉄のナノ粒子を内部空間に持つＮ１−ＬＦ（配列番号２６）は特異的にナノ黒鉛構造体に結合するが、比較例２で得られた酸化鉄のナノ粒子を内部空間に持つＬＦ０（配列番号２５）はナノ黒鉛構造体に結合することができないことを示すために、以下の実験をおこなった。
Ａｒガスの６ｘ１０４Ｐａ雰囲気圧内の焼結丸棒状炭素表面に高出力のＣＯ２ガスレーザ光（出力１００Ｗ、パルス幅２０ｍｓ、連続発振）を照射し、生じたすす状物質をエタノールに懸濁し、超音波撹拌（周波数４０ｋＨｚ、時間６０分）とデカンテーションとを４回繰り返して単層カーボンナノホーンを得た。この単層カーボンナノホーン約２００ｍｇを、濃度約７０％の硝酸４０ｍｌ中に入れ、１３０℃で１時間還流をおこなった。終了後、イオン交換水でうすめて遠心分離を行い上澄みを捨てることを繰り返して中和洗浄し、官能基（カルボキシル基を含む）をもつ水溶性の単層カーボンナノホーンを調製した。
このカーボンナノホーンを、１ｍｇ／ｍｌになるように０．１％牛胎児血清アルブミン・０．０５％Polyoxyethylenesorbitan monolaurate［以下Ｔｗｅｅｎ−２０（シグマ社、Ｓｔ．Louis）］含有ＴＢＳ（以下ＴＢＳ−ＢＴ）に溶解した。カーボンナノホーンを、遠心操作（クボタ社、5922, AT-2018Mローター，１５０００ｒｐｍ, １５分）により沈澱させ、１ｍｇ／ｍｌになるようにＴＢＳ−ＢＴで懸濁した。この操作を３回繰り返したのち、沈澱したカーボンナノホーンを、１ｍｇ／ｍｌになるように０．１ｍｇ／ｍｌの酸化鉄ナノ粒子をコアに持つＮ１−ＬＦあるいはＬＦ０含有ＴＢＳ−ＢＴで懸濁した。１２時間、室温でタイテック社製rotator RT-50を用いて回転撹拌した。結合しなかったフェリチン分子を取り除くために、カーボンナノホーンを遠心操作（クボタ社、5922, AT-2018Mローター, １５０００ｒｐｍ, １５分）により沈澱させ、４００μｌの０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０含有ＴＢＳで５回洗浄した後、滅菌水に置換して脱塩したものを、透過型電子顕微鏡（TOPCON EM-002B, , 加速電圧１２０ｋＶ）観察をおこない、Ｎ１−ＬＦをカーボンナノホーンと混合したとき、酸化鉄ナノ粒子がカーボンナノホーンに複数担持され、一方ＬＦ０の場合、酸化鉄ナノ粒子がカーボンナノホーン上に観察されないことから、Ｎ１−ＬＦが特異的にカーボンナノホーンに結合能を有しており、この能力を利用したナノ黒鉛構造体上へのナノ粒子担持法の有効性を確認した（図７）。
化学的気相成長法で合成された単層カーボンナノチューブであるＨｉｐｃｏ（カーボンナノテクノロジーズ社、テキサス）を１７５０℃、１ｘ１０−５ Ｔｏｒｒで５時間処理したあと、濃度７０％の硝酸中、約１３０℃で３０分還流をおこなった。終了後、水酸化ナトリウムで中和し、蒸留水で洗浄し、官能基（カルボキシル基を含む）をもつ単層カーボンナノチューブを調製した。
この単層カーボンナノチューブを、実施例３と同様に、ＴＢＳ−ＢＴに溶解した。単層カーボンナノチューブを、遠心操作（クボタ社、５９２２，ＡＴ−２０１８Ｍローター，１５０００ｒｐｍ，１５分）により沈澱させ、再びＴＢＳ−ＢＴで懸濁した。この操作を３回繰り返したのち、沈澱した単層カーボンナノチューブに実施例３と同様に酸化鉄ナノ粒子をコアに持つＮ１−ＬＦ含有ＴＢＳ−ＢＴで懸濁した。１２時間、室温でタイテック社製ｒｏｔａｔｏｒ ＲＴ−５０を用いて回転撹拌した。結合しなかったフェリチン分子を取り除くために、単層カーボンナノチューブを遠心操作（クボタ社、５９２２，ＡＴ−２０１８Ｍローター，１５０００ｒｐｍ，１５分）により沈澱させ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０含有ＴＢＳで５回洗浄した後、滅菌水に置換して脱塩したものを、透過型電子顕微鏡（ＴＯＰＣＯＮ ＥＭ−００２Ｂ，１２０ｋＶ）観察をおこない、Ｎ１−ＬＦを単層カーボンナノチューブと混合したとき、酸化鉄ナノ粒子がカーボンナノホーンに複数担持されることを確認した（図８）。

Claims (21)

  1. フェリチンのＮ末端又はループ構造部位に、ナノ黒鉛構造体認識ペプチドを融合させたフェリチンの内部空間に、無機金属原子又は無機金属化合物のナノ粒子を添加して保持させ、ナノ黒鉛構造体認識ペプチドのナノ黒鉛構造体との親和性を利用して、ナノ黒鉛構造体に無機金属原子又は無機金属化合物のナノ粒子を複数担持させたナノ黒鉛構造体−金属ナノ粒子複合体。
  2. フェリチンが、高等真核生物由来のフェリチンであることを特徴とする請求項１記載のナノ黒鉛構造体−金属ナノ粒子複合体。
  3. 高等真核生物由来のフェリチンが、ウマ脾臓由来Ｌタイプのフェリチンであることを特徴とする請求項２記載のナノ黒鉛構造体−金属ナノ粒子複合体。
  4. ナノ黒鉛構造体認識ペプチドが、配列番号１〜２０のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるペプチドであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載のナノ黒鉛構造体−金属ナノ粒子複合体。
  5. ナノ黒鉛構造体認識ペプチドが、配列番号１〜２０のいずれかに示されるアミノ酸配列の全部又はその一部を含むナノ黒鉛構造体に結合能を有するペプチドであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載のナノ黒鉛構造体−金属ナノ粒子複合体。
  6. 配列番号１〜２０のいずれかに示されるアミノ酸配列が、ＤＹＦＳＳＰＹＹＥＱＬＦ（配列番号１）であることを特徴とする請求項４又は５記載のナノ黒鉛構造体−金属ナノ粒子複合体。
  7. 配列番号１〜２０のいずれかに示されるアミノ酸配列が、ＹＤＰＦＨＩＩ（配列番号２）であることを特徴とする請求項４又は５記載のナノ黒鉛構造体−金属ナノ粒子複合体。
  8. 無機金属原子又は無機金属化合物のナノ粒子が、金属ナノ粒子であることを特徴とする請求項１〜７のいずれか記載のナノ黒鉛構造体−金属ナノ粒子複合体。
  9. 無機金属原子又は無機金属化合物のナノ粒子が、金属化合物ナノ粒子であることを特徴とする請求項１〜７のいずれか記載のナノ黒鉛構造体−金属ナノ粒子複合体。
  10. 金属化合物ナノ粒子が、酸化金属ナノ粒子であることを特徴とする請求項９記載のナノ黒鉛構造体−金属ナノ粒子複合体。
  11. 金属化合物ナノ粒子が、磁性材料ナノ粒子であることを特徴とする請求項９記載のナノ黒鉛構造体−金属ナノ粒子複合体。
  12. 金属が、鉄、ベリリウム、ガリウム、マンガン、リン、ウラン、鉛、コバルト、ニッケル、亜鉛、カドミウム又はクロムであることを特徴とする請求項１〜１１のいずれか記載のナノ黒鉛構造体−金属ナノ粒子複合体。
  13. 無機金属原子又は無機金属化合物のナノ粒子が、酸化鉄ナノ粒子、セレン化カドミウムナノ粒子、セレン化亜鉛ナノ粒子、硫化亜鉛ナノ粒子、又は硫化カドミウムナノ粒子であることを特徴とする請求項１〜７のいずれか記載のナノ黒鉛構造体−金属ナノ粒子複合体。
  14. ナノ黒鉛構造体が、カーボンナノチューブ又はカーボンナノホーンであることを特徴とする請求項１〜１３のいずれか記載のナノ黒鉛構造体−金属ナノ粒子複合体。
  15. カーボンナノチューブ又はカーボンナノホーンが、構成する炭素構造に官能基が付加されていることを特徴とする請求項１４記載のナノ黒鉛構造体−金属ナノ粒子複合体。
  16. ナノ黒鉛構造体が基板上で二次元に整列されていることを特徴とする請求項１〜１５のいずれか記載のナノ黒鉛構造体−金属ナノ粒子複合体。
  17. 金属ナノ粒子が基板上で二次元に整列されていることを特徴とする請求項１〜１５のいずれか記載のナノ黒鉛構造体−金属ナノ粒子複合体。
  18. ケージタンパク質が除去されていることを特徴とする請求項１６記載のナノ黒鉛構造体−金属ナノ粒子複合体。
  19. フェリチンのＮ末端又はループ構造部位に、ナノ黒鉛構造体認識ペプチドを融合させたタンパク質の内部空間に、無機金属原子又は無機金属化合物のナノ粒子を添加して保持させ、ナノ黒鉛構造体認識ペプチドのナノ黒鉛構造体との親和性を利用して、ナノ黒鉛構造体に無機金属原子又は無機金属化合物のナノ粒子を複数担持させる方法。
  20. フェリチンのＮ末端又はループ構造部位に、ナノ黒鉛構造体認識ペプチドを融合させたタンパク質の内部空間に、無機金属原子又は無機金属化合物のナノ粒子を添加して保持させ、ナノ黒鉛構造体認識ペプチドのナノ黒鉛構造体との親和性を利用して、ナノ黒鉛構造体に無機金属原子又は無機金属化合物のナノ粒子を複数担持させ、加熱処理によりタンパク質部分を取り除き、ナノ黒鉛構造体と無機金属化合物のナノ粒子との複合体を作る方法。
  21. フェリチンのＮ末端又はループ構造部位に、ナノ黒鉛構造体認識ペプチドを融合させたタンパク質の内部空間に、無機金属原子又は無機金属化合物のナノ粒子を添加して保持させ、ナノ黒鉛構造体認識ペプチドのナノ黒鉛構造体との親和性を利用して、ナノ黒鉛構造体に無機金属原子又は無機金属化合物のナノ粒子を複数担持させ、電子線処理によりタンパク質部分を取り除き、ナノ黒鉛構造体と無機金属化合物のナノ粒子との複合体を作る方法。
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