JP4787737B2 - 真核生物における糖タンパク質の改変におけるエンドマンノシダーゼ - Google Patents
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Description
本出願は、米国特許出願第10/695,243号への優先権を主張する。米国特許出願第10/695,243号は、米国特許出願第10/371,877号(2003年2月20日出願)の一部継続出願である。
本発明は、一般的には、高等哺乳動物(特にヒト)由来のタンパク質のグリコシル化により近く似せるための、真菌または他の下等真核生物において発現された組換えタンパク質のグリコシル化構造を改変(modify)する方法に関する。本発明はまた、新規の酵素および、その酵素をコードする核酸および、その酵素を発現するように操作された宿主、修飾された糖タンパク質を宿主において産生するための方法、およびそのように産生された、修飾された糖タンパク質に関する。
DNAがタンパク質に転写および翻訳された後、さらなる翻訳後プロセシングは、糖残基の結合を包含する(グリコシル化として公知のプロセス)。種々の生物体は、種々のグリコシル化酵素(グリコシルトランスフェラーゼおよびグリコシダーゼ)を産生し、そして利用可能な種々の基質(ヌクレオチド糖)を有し、その結果、グリコシル化型および個々のオリゴ糖の組成は、1つの同じタンパク質でさえも、特定のタンパク質が発現される宿主系に依存して異なる。細菌は、代表的には、タンパク質をグリコシル化せず、もしそうである場合も、非常に非特異的様式でだけである(MoensおよびVanderleyden,Arch.Microbiol.168(3):169−175(1997))。下等真核生物(例えば、糸状菌および酵母)は、主としてマンノースおよびマンノシルホスフェート糖を付加し、他方昆虫細胞(例えば、Sf9細胞)は、さらに別の方法でタンパク質をグリコシル化する。R.K.Bretthauerら,Biotechnology and Applied Biochemistry 1999 30:193−200(1999);W.Martinetら,Biotechnology Letters 1998 20:1171−1177(1998);S.Weikertら,Nature Biotechnology 1999 17:1116−1121(1999);M.Malissardら,Biochem.Biophys.Res.Comm.2000 267:169−173(2000);D.Jarvisら,Curr.Op.Biotech.1998 9:528−533(1998);ならびにTakeuchi,Trends in Glycoscience and Glycotechnology 1997 9:S29−S35(1997)を参照のこと。
1.チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)、マウス線維芽細胞およびマウス骨髄腫細胞のような高等真核生物(R.Wernerら,Arzneimittel−Forschung−Drug rResearch 1998 48:870−880(1998));
2.ヤギ、ヒツジ、マウスなどのようなトランスジェニック動物(Denteら,Genes and Development 2:259−266(1988);Coleら,J.Cell.Biochem.265:補遺18D(1994);P.McGarveyら,Biotechnology 13:1484−1487(1995);Bardorら,Trends in Plant Science 4:376−380(1999))
3.植物(Arabidopsis thaliana、タバコなど)(Staubら, Nature Biotechnology 18:333−338(2000);McGarveyら, Biotechnology 13: 1484−1487 (1995); Bardorら,Trends in Plant Science 4:376−380(1999));
4.組換えバキュロウイルス(例えば、鱗翅類細胞に感染するAutographa californica多核体病ウイルス)と組み合わせた昆虫細胞(Spodoptera frugiperda Sf9,Sf21,Trichoplusia niなど)(Altmannら,Glycoconjugate Journal 16:109−123(1999))。
非哺乳動物真核生物株を遺伝的に操作することによってグリコシル化N−グリカンを改変するために、方法が開発された。この非哺乳動物真核生物株は、組み換え糖タンパク質を産生し得、この組み換え糖タンパク質は、それらのヒト対応物と実質的に等しい。これらの細胞株(懸濁培養液中で増殖された酵母、糸状菌、昆虫細胞、および植物細胞が挙げられる)は、ヒトにおける糖タンパク質のプロセシングを模倣する一連の酵素反応が起こる、遺伝的に改変されたグリコシル化経路を有する。本明細書において記載されるように、株は、触媒作用的に活性なエンドマンノシダーゼ遺伝子を発現して、よりヒト様のグリカン構造を得ることを全般的な目標としたN−連結グリカン構造のプロセシングを増強するように開発された。さらに、新規のヒトおよびマウスのエンドマンノシダーゼのクローニングおよび発現も、また開示される。本発明の方法は、治療用タンパク質の産生において有用な所望のグリコシル化構造を有する細胞株を操作するように、適合され得る。
本明細書中、他に定義されない限り、本発明に関連して使用される科学技術用語は、当業者に一般的に理解される意味を有する。さらに、文脈によって他に必要とされない限り、単数形の用語は、複数形を含み、複数形の用語は、単数形を含む。本発明の方法および技術は概して、当該分野で周知の従来法に従って行なわれる。概して、本明細書中に記載される、生化学、酵素学、分子生物学、細胞生物学、微生物学、遺伝学、タンパク質化学および核酸化学ならびにハイブリダイゼーションと関連して使用される術語、およびそれらの技術は、当該分野において周知であり、一般に使用されている。本発明の方法および技術は、概して、当該分野で周知の従来法、および他に示されない限り本明細書を通して引用され、考察される種々の一般的な参考文献およびより特定の参考文献に記載される従来法に従って実施される。例えば、Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboraory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.(1989);Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology、Greene Publishing Associates(1992、および2002への補遺);HarlowおよびLane Antibodies:A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.(1990);Introduction to Glycobiology、Maureen E.Taylor、Kurt Drickamer、Oxford Univ.Press(2003);Worthington Enzyme Manual、Worthington Biochemical Corp.Freehold,NJ;Handbook of Biochemistry:A節 Proteins I巻 1976 CRC Press;Handbook of Biochemistry:A節 Proteins II巻 1976 CRC Press;Essentials of Glycobiology、Cold Spring Harbor Laboratory Press(1999)を参照のこと。本明細書中で記される生化学および分子生物学と関連して使用される術語、ならびにそれらの研究室手順および技術は、当該分野において周知であり、一般に使用されている。
本明細書中で使用される場合、用語「N−グリカン」とは、N結合したオリゴ糖(例えば、アスパラギン−N−アセチルグルコサミン結合によってポリペプチドのアスパラギン残基に結合しているオリゴ糖)をいう。N−グリカンは、Man3GlcNAc2(「Man」とは、マンノースをいい;「Glc」とは、グルコースをいい;「NAc」とは、N−アセチルをいい;GlcNAcとは、N−アセチルグルコサミンをいう)の一般的な五糖のコアを有する。N−グリカンは、Man3GlcNAc2(「Man3」)コア構造に付加される末梢糖(peripheral sugar)(例えば、フコースおよびシアル酸)を含む枝(アンテナ)の数の点で異なる。N−グリカンは、それらの分枝した構成要素(例えば、高マンノース、複合体またはハイブリッド)に従って分類される。「高マンノース」型N−グリカンは、5個以上のマンノース残基を有する。「複合」型N−グリカンは、代表的に1,3マンノースアームに結合した少なくとも一つのGlcNAcおよび「トリマンノース」コアの1,6マンノースアームに結合した少なくとも一つのGlcNAcを有する。「トリマンノースコア」は、Man3構造を有する五糖コアである。複合Nグリカンはまた、必要に応じてシアル酸または誘導体(「NeuAc」、ここで、「Neu」とはノイラミン酸をいい、「Ac」とはアセチルをいう)で改変されたガラクトース(「Gal」)残基を有し得る。複合N−グリカンはまた、「二分」GlcNAcおよびコアフコース(「Fuc」)を含む鎖内置換を有し得る。「ハイブリッド」Nグリカンは、トリマンノースコアの1,3マンノースアームの末端に少なくとも1個のGlcNAc、およびトリマンノースコアの1,6マンノースアーム上に0個以上のマンノースを有する。
ハイブリダイゼーションの特定のストリンジェンシーを達成するためにこれらのパラメーターをどのように変化させるかは、当業者には、既知である。
ラットエンドマンノシダーゼがクローニングされている(Spiroら,J.Biol.Chem.272(46):29356−29363(1997))。ラットエンドマンノシダーゼは、現在までにこのファミリーのうちで唯一クローニングされたメンバーであり、このORF(特に、ラットエンドマンノシダーゼ触媒ドメイン)に対して有意な相同性を示す遺伝子およびESTが、データベースに存在する。ラットエンドマンノシダーゼタンパク質配列(Genbank gi:2642187)を使用してタンパク質BLAST検索を行うことによって、本発明者らは、ラットエンドマンノシダーゼ配列と有意な相同性の領域を有する、Genbankの2つの仮想ヒトタンパク質を同定した(実施例2;図3A〜3C)。1つのORFに、これらの2つの仮想タンパク質の5’領域および3’領域を組み合わせると、462個の推定アミノ酸配列(図4)および54kDaの予測分子量を生じた。この推定のヒトエンドマンノシダーゼ配列と公知のラット配列とのアライメントにより、これらのタンパク質のC末端は高度に保存されているが、N末端はより異なることが示された(図7)。保存領域(すなわち、モチーフ「DFQ(K/R)SDRIN」〜C末端)は、各エンドマンノシダーゼの触媒ドメイン、または少なくとも活性に不可欠な領域に対応するようである。
マウスエンドマンノシダーゼ遺伝子は、マウスエンドマンノシダーゼ遺伝子とヒトエンドシダーゼ遺伝子との間の推定される相同な領域と相補的なプライマーを設計し、PCR増幅することによってクローン化され、マウスエンドマンノシダーゼをコードする全長cDNAを取り出すために用いられ得るプローブを作製する(実施例2)。マウスエンドマンノシダーゼのオープンリーディングフレーム(ORF)のヌクレオチドおよび予想されるアミノ酸配列は、図6およびそれぞれ配列番号3および配列番号4として示される。
ヒト肝臓エンドマンノシダーゼおよび推定マウスエンドマンノシダーゼは、グリコシド酵素の新たに生じた、現れたファミリーの第2および第3のメンバーである(第1のこのようなメンバーであるラットエンドマンノシダーゼ酵素と同じく)。ヒトORF、マウスORFおよびラットORFの配列比較(図7)は、「DFQ(K/R)SDRI」モチーフからこの配列のC末端までと高い相同性を示し、このことは、この領域が、このタンパク質の必須フラグメント、そして潜在的には触媒ドメインをコードすることうを示唆する。対照的に、このタンパク質のN末端における低い相同性は、進化的な分岐を示す。大多数のグリコシダーゼおよびグリコシルトランスフェラーゼの大部分のように、このマウスおよびヒトの酵素は、膜貫通ドメインを示す疎水性領域を有する。このようなドメインは、分泌経路におけるこの酵素の配向および局在化を容易にする。対照的に、ラットエンドマンノシダーゼは、位置2に膜貫通ドメインを有さないが、グリシン残基を有する(Spiro 1997、前出)。この最後から二番目のグリシン残基は、ミリストイル化される可能性を有し、次々に膜局在化のための機構を提供する(Boutin,Cell Signal 9:15−35(1997))。あるいは、ミリストイル化は、ゴルジ装置にラットエンドマンノシダーゼを局在化させる手段でなくてもよく(Zuber 2000,前出)−タンパク質−タンパク質の相互作用が、決定機構であり得る。
ヒトおよびマウスのエンドマンノシダーゼ酵素または触媒ドメイン(およびこのような活性をコードする本発明の核酸分子)は、各々、例えば、特定のグリコシル化構造を改変するため、特に、グルコシル化されたグリカン構造上の少なくとも1つのグルコース残基、および1つのマンノース残基を含む組成を加水分解するために、有用である(図1および図2)。1つの実施形態において、コードされる酵素は、グリコシル化されたグリカン前駆体の少なくとも1つのグルコース残基および1つのマンノース残基を含む、二糖、三糖、または四糖の組成の切断を触媒する(図1)。別の実施形態において、コードされる酵素はまた、多数のグリコシル化構造(Glc1−3Man9−5GlcNAc2を含む)を改変する(図2)。本発明の1つ以上の核酸および/またはポリペプチドは、選択した宿主細胞内に導入され、その宿主細胞により産生される糖タンパク質を改変する。
グルコシダーゼは、ERにおける高度のマンナングリカンに作用するが、いくつかのマンナンは、適切に修飾されることなくERを逃れ、従って、望ましくなくグリコシル化されたマンナンが、分泌経路を通って移動する。以前の研究は、より高等な真核生物において、グリコシル化マンノース構造の画分は、実際にERの品質制御を迂回し、そして、エンドマンノシダーゼが、その後のコンパートメントに存在し、この画分を回収することを示唆する。従って、本発明の特徴において、エンドマンノシダーゼは、ERを迂回した、グリコシル化マンノース構造を修飾する。好ましい実施形態において、本発明の核酸によりコードされるエンドマンノシダーゼ酵素は、ゴルジ、トランスゴルジ網、輸送小胞またはERに局在化する。この酵素は、酵母において、グルコシル化された高度のマンナングリカンのトリミングに関与する。例えば、ERのグルコシダーゼI酵素およびグルコシダーゼII酵素を迂回した、グリコシル化構造GlcMan9GlcNAc2は、エンドマンノシダーゼにより修飾され、ここで、少なくとも1つのグルコース−マンノース残基が加水分解されて、Man8GlcNAc2を生じる。本発明のエンドマンノシダーゼ酵素は、ゴルジにおいて品質制御工程として機能し、グリコシル化された高度のマンナングリカンを回収し、少なくとも1つのグルコース残基および1つのマンノース残基を含む組成を除去する。
本発明の別の局面において、新規エンドマンノシダーゼタンパク質をコードする1つ以上のキメラ核酸分子は、例えば、細胞標的化シグナルペプチドをコードするDNAフラグメントと、エンドマンノシダーゼ酵素をコードするDNAフラグメントもしくはその触媒活性フラグメントとのインフレームライゲーションによって、エンドマンノシダーゼ酵素と細胞標的化シグナルペプチドとの間で融合タンパク質を形成することによって、構築される。好ましくは、1つ以上の融合タンパク質は、エンドマンノシダーゼのコンビナトリアルDNAライブラリーの背景において作製される。一般的には、WO 02/00879および米国出願番号10/371,877の公報(2003年2月20日出願)(この各々が、その全体において、本明細書中に参考として援用される)を参照のこと。エンドマンノシダーゼDNAライブラリーは、例えば、pRCD259のような組み込み型プラスミド(実施例5)を使用することによって、目的の宿主細胞において発現される、広範種々の融合構築物を含む。
別の有用なサブライブラリーは、ER、ゴルジ、トランスゴルジ網内の特定の位置へのタンパク質の局在化を生じる、標的化シグナルペプチドをコードする核酸配列を含む。これらの標的化ペプチドは、遺伝子操作される宿主生物から、そして、他の関連する生物、または無関係の生物から選択され得る。一般に、このような配列は、以下の3つのカテゴリーに分類される:(1)サイトゾルテイル(ct)、膜貫通ドメイン(tmd)およびステム領域(sr)の一部または全てをコードするN末端配列(一緒になってか、または個々に、ゴルジの内側(管腔)膜へとタンパク質を係留する);(2)HDELテトラペプチドまたはKDELテトラペプチドのような、C末端において一般に見出される想起シグナル;ならびに(3)ゴルジに局在することが公知の、種々のタンパク質(例えば、ヌクレオチド糖トランスポーター)に由来する膜架橋領域(membrane spanning region)。
プラスミドに挿入される本発明のコンビナトリアルDNAライブラリーに由来するエンドマンノシダーゼ融合構築物の代表例は、プライマー(配列番号5および配列番号6)から構築される短縮型Saccharomyces MNN11(m)標的化ペプチド(SwissProt P46985からのMNN11のヌクレオチド1〜303)を含み、ラットのエンド−α1,2−マンノシダーゼの48N末端アミノ酸欠失(Genbank AF 023657)にインフレームで連結された、pSH280である。従って、本明細書中で使用される命名法は、グリコシル化酵素の標的化ペプチド/触媒ドメイン領域を、Saccharomyces MNN11(m)/ラットエンドマンノシダーゼΔ48と呼ぶ。コードされる融合タンパク質は、そのエンドマンノシダーゼ触媒ドメイン活性を保持しつつ、MNN11標的化ペプチド配列によってゴルジに局在し、より下等な真核生物においてMan4GlcNAc2のようなグリコシル化されていないN−グリカンを生成し得る。pSH280で形質転換されたP.pastoris RDP25の株(och1 alg3)において発現されるレポーター糖タンパク質K3に由来するグリカンプロフィールは、とりわけ、Man4GlcNAc2の質量に対応する1099m/z[c]、およびヘキソース6の質量に対応する1424m/z[a]にピークを示す(図10B;実施例11および実施例12を参照のこと)。YSH97と命名されたこの新しいP.pastoris株は、グリコシル化されたヘキソース6の構造がレポーター糖タンパク質から除去される程度によって証明される、約95%より高いエンドマンノシダーゼ活性を示す。
本発明の別の特徴は、エンドマンノシダーゼをコードする核酸配列の組換え発現である。この核酸配列は、適切な発現ベクター中の発現コントロール配列に作動可能に連結され、そして適切な宿主細胞において形質転換される(実施例3)。当該分野で容易に利用可能な広範な種々の適切なベクターは、種々の宿主細胞において本発明の融合構築物を発現するために使用される。ベクターpSH278、ベクターpSH279およびベクターpSH280(実施例4)は、下等真核生物Pichia pastorisにおけるエンドマンノシダーゼ活性の発現に適切な、本明細書中で記載される選り抜きのいくつかの例である。選択された宿主細胞におけるエンドマンノシダーゼ活性の発現に適切な広範な種々のベクターは、本発明内に包含されることが理解されるべきである。
本発明の別の局面において、ラット肝臓エンドマンノシダーゼ(Genbank gi:2642186)、ヒトエンドマンノシダーゼ(Genbank gi:20547442)またはマウスマンノシダーゼ(Genbank AK030141)は、構成プロモーターの制御下で酵母組込みプラスミドにクローン化され、細胞に対する副作用を制限すると同時にエンドマンノシダーゼ活性の量を最適化する。これは、プロモーター強度を改変(alter)する工程を包含し、そして必要に応じて、これらのタンパク質の発現をより良好に制御するために誘発性プロモーターを使用する工程を包含する。
本発明の核酸は、一次アミノ酸配列の1つ以上の変化(例えば、保存的アミノ酸の置換、付加、欠失またはこれらの組み合わせ)をもたらすのを最適化されたコドンであり得ることもまた、検討される。
本発明の別の特徴において、可溶性分泌エンドマンノシダーゼは、宿主細胞において発現される。好ましい実施形態において、可溶性マウスエンドマンノシダーゼまたは可溶性ヒトエンドマンノシダーゼは、組み換え的に発現される。可溶性エンドマンノシダーゼは、ゴルジ装置に正常に局在化するかまたは細胞膜に結合する、細胞局在化シグナルを欠損する。可溶性組換え酵素(これは、膜貫通ドメインを欠損する)を産生するエンドマンノシダーゼの触媒的ドメインの発現は、インフレームで、第2ドメインに融合し得るか、またはその精製を促進するタグに融合し得る。P.pastoris由来の本発明の分泌ラットエンドマンノシダーゼおよびヒトエンドマンノシダーゼは、図9に示される(実施例8)。
多くの宿主細胞は、本発明のエンドマンノシダーゼを発現するために使用され得る。例えば、上記エンドマンノシダーゼは、哺乳動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、真菌細胞、酵母細胞、藻細胞または細菌細胞において発現され得る。目的のタンパク質上でのグルコシル化の改変(modification)については、好ましい宿主細胞は、Glcl〜3Man9〜5GlcNAc2構造を産生する下等真核生物である。さらに、グルコシル化グリカンの混合物を産生する他の宿主細胞が、選択される。例えば、非グルコシル化構造(例えば、Man6GlcNAc2およびその異性体)に加えてグルコシル化構造(例えば、GlcMan5GlcNAc2)を産生する宿主細胞(例えば、P.pastoris RDP25)が、選択される。
本発明の別の局面において、本発明のエンドマンノシダーゼを導入および発現することによってグルコシル化グリカンを改変するための方法が、本明細書中で提供される。図1は、強調されるように、モノグルコシル化グリカン、ジグルコシル化グリカン、およびトリグルコシル化グリカンのエンドマンノシダーゼ切断(第2のグルコース残基および第3のグルコース残基によって表される)を示す。従って、本発明のエンドマンノシダーゼ酵素は、脱グルコシル化の効率を高めるために宿主(例えば、酵母)のゴルジに導入され、従って、さらなる糖の付加の前にマンナン構造の続いての切り出しを高め、よりヒト様のN結合型グルコシル化構造を産生する(図2)。
さらに、一組の改変されたグリコシル化酵素が、細胞の局在化、および目的の糖タンパク質を産生する活性を高めるために宿主細胞に導入される。これは、変動する長さの触媒的ドメインの、酵母内因性ターゲッティング領域への融合を包含する(WO 02/00879に記載されるような)。1つの実施形態において、宿主細胞P.pastoris YSH97(och1 alg3エンドマンノシダーゼ)は、グリコシル化酵素またはその触媒的に活性なフラグメント(α1,2−マンノシダーゼIおよびα1,2−マンノシダーゼII、GnT I(N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼI)、GnT II、GnT III、GnT IV、GnT V、GnT VI、ガラクトシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼならびにフコシルトランスフェラーゼからなる群より選択される)の導入および発現によって改変される。同様に、酵素のそれぞれの輸送体およびこれらの基質(例えば、UDP−GlcNAc、UDP−Gal、CMP−NANA)は、宿主細胞に導入され、そしてこの宿主細胞で発現される。WO 02/00879を参照のこと。
本発明の別の局面において、コードされたエンドマンノシダーゼは、約5.0と約8.5との間に、好ましくは約5.2と約7.2との間に、より好ましくは約6.2に、最適pHを有する。別の実施形態において、上記コードされた酵素は、小胞体、ゴルジ装置もしくはER間の輸送小胞、ゴルジもしくは宿主生物体のトランスゴルジ網に標的化され、ここで、このコードされた酵素は、オリゴ糖上に存在するグルコシル化構造を除去する。図15は、ヒトエンドマンノシダーゼ(配列番号2)の最適pHプロファイルを示す(実施例9)。
Escherichia coli株TOP10またはDH5αを、組換えDNA研究のために使用した。酵母株におけるタンパク質発現を、室温で、増殖培地として1%酵母抽出物、2%ペプトン、100mMリン酸カリウム緩衝液(pH6.0)、1.34%酵母窒素塩基、4×10−5%ビオチン、および1%グリセロールを含む、緩衝化グリセロール複合培地(BMGY)を備える96ウェルプレート形式で行った。誘発培地は、BMGY中のグリセロールの代わりに1.5%メタノールを含む、緩衝化メタノール天然培地(BMMY)であった。最小培地は、1.4%酵母窒素塩基、2%デキストロース、1.5%寒天および4×10−5%ビオチン、ならびに適切に補充されたアミノ酸である。制限酵素および修飾酵素を、New England BioLabs(Beverly,MA)から得た。オリゴヌクレオチドを、Dartmouth College Core facility(Hanover,NH)またはIntegrated DNA Technologies(Coralville,IA)から得た。MOPS、カコジル酸ナトリウム、塩化マンガンを、Sigma(St.Louis,MO)から得た。トリフルオロ酢酸(TFA)を、Sigma/Aldrich,Saint Louis,MOから得た。酵素N−グリコシダーゼF、マンノシダーゼ、およびオリゴ糖を、Glyko(San Rafael,CA)から得た。DEAE ToyoPearl樹脂を、TosoHaasから得た。金属キレート「HisBind」樹脂を、Novagen(Madison,WI)から得た。96ウェル溶解物清浄化プレート(lysate−clearing plate)を、Promega(Madison,WI)から得た。タンパク質結合96ウェルプレートを、Millipore(Bedford,MA)から得た。塩および緩衝剤を、Sigma(St.Louis,MO)から得た。MALDIマトリックスを、Aldrich(Milwaukee,WI)から得た。
ポジティブコントロールとして、本発明者らは、特異的プライマー:
ヒトエンドマンノシダーゼの酵母分泌形態を産生するために、推定触媒ドメインをコードする領域を、EasySelect Pichia Expression kit(Invitrogen)で製造者により推奨されるように発現させた。手短に言うと、PCRを使用し、プライマーhEndoΔ59順方向およびプライマーhEndoΔ停止逆方向:
ラットエンドマンノシダーゼの触媒ドメインを、プライマーのラットエンドマンノシダーゼΔ48AscIおよびrEndo PacI:
酵母においてラットエンドマンノシダーゼタンパク質を発現するために、触媒ドメインをコードするcDNAを、ベクターpSH229を産生する発現ベクターpRCD259にクローン化した(実施例4を参照のこと)。続いて、Gls1(s)リーダー、Van1(s)リーダーおよびMnn11(m)リーダーをコードするcDNAを、プラスミドpSH278(rEndo Δ48 Gls1sリーダー)、pSH279(rEndo Δ48 Van1sリーダー)およびpSH280(rEndo Δ48 Mnn11mリーダー)を産生するラットエンドマンノシダーゼ触媒ドメインをコードするcDNAに対して5’側にクローン化した。組込みをコロニーPCRによって確認し、結果として得られたポジティブクローンを分析し、分泌レポータータンパク質のNグリカン構造を決定した。
ヒトエンドマンノシダーゼ転写物の組織分布を、組織の各々に由来の2μgの精製ポリA+RNAを表すヒトMultiple Tissue Northernブロット(Clontech)を製造者の指示書に従って使用して決定した。使用した547bpヒトエンドマンノシダーゼDNAプローブ(843〜1389)を、RadPrime DNA Labeling System(Invitrogen,Carlsbad,CA)および[32P]dCTPを使用して産生した。この結果を、図8に示す。
P.pastoris由来の培地を、Bio−Rad Mini−Protean II装置を使用して、サンプルを10% SDS−PAGE(Laemmli,U.K.(1970)Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.Nature,227,680−685)上で泳動することによって、エンドマンノシダーゼ分泌について分析した。次いで、このタンパク質をニトロセルロース膜(Schleicher & Schuell,Keene,NH)上に転写した。組換えエンドマンノシダーゼを、製造者の指示書に従ってヤギ抗マウスHRP結合体化二次抗体と組み合わせて抗FLAG M2モノクローナル抗体を使用して検出し、そしてECL Western検出システム(Amersham Biosciences)を使用して可視化した。GS115(Invitrogen,Carlsbad,CA)由来の培地を、コントロールとして使用した。この結果を、図9に示す。
GlcMan5GlcNAc2(エンドマンノシダーゼアッセイのための基質)を、och1 alg3変異株RDP25(WO 03/056914A1)(Davidsonら,2003(近刊))から単離した。2−アミノベンズアミド標識化GlcMan5GlcNAc2を、10μlの培地上清に添加し、そして37℃で、8時間または一晩、インキュベートした。次いで、Choiら,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100(9):5022−5027(2003)のプロトコルに従って、10μlの水を添加し、続いてグリカンを、Econosil NH2 4.6×250mm、5ミクロンビーズ、アミノ結合シリカカラム(Altech,Avondale,PA)を使用して、サイズおよび電荷によって分離した。
蛍光標識化GlcMan5GlcNAc2(0.5μg)を、種々のpH(表2)に調節した20μLの上清に添加し、そして8時間室温でインキュベートした。インキュベート後、このサンプルを、Econosil NH2 4.6×250 mm、5ミクロンビーズ、アミノ結合シリカカラム(Altech,Avondale,PA)を使用して、HPLCにより分析した。流速は、40分間1.0ml/分であり、そしてこのカラムを30℃に維持した。定組成的に(isocratically)(68% A:32% B)3分間溶出した後、直線的な溶媒勾配(68% A:32% B〜40% A:60% B)を27分にわたって使用し、グリカン(18)を溶出した。溶媒A(アセトニトリル)および溶媒B(ギ酸アンモニウム)は、50mM、pH4.5であった。このカラムを、流出の間の20分間、溶媒(68% A:32% B)で平衡化した。以下の表は、種々のpHにおいてGlcMan5GlcNAc2から生じたMan4GlcNAc2の量(%)を示す(図15、表2)。
(タンパク質精製)
Kringle 3(K3)ドメイン(アルコールオキシダーゼ1(AOX1)プロモーターの制御下)を、モデルタンパク質として使用した。Beckman BioMek 2000サンプル操作ロボット(Beckman/Coulter Ranch Cucamonga,CA)で96ウェル形式を使用して、Kringle 3を精製した。Kringle 3を、C末端ヘキサ−ヒスチジンタグ(Choiら 2003、前出)を使用して発現培地から精製した。自動化精製は、NovagenによってそれらのHisBind樹脂について提供されたプロトコルの適応である。手短に言うと、150μL(μL)固定体積の樹脂を、96ウェル溶解物結合プレートのウェルに注ぎ、3倍容量の水で洗浄し、そして5倍容量の50mM NiSO4で満たし、そして3倍容量の結合緩衝液(5mMイミダゾール、0.5M NaCI、20mM Tris−HCL pH7.9)で洗浄する。このタンパク質発現培地を、3:2、培地/PBS(60mM PO4、16mM KC1、822mM NaCl pH7.4)に希釈し、そして上記カラム上にロードする。排液後、このカラムを10倍体積の結合緩衝液および6倍体積の洗浄用緩衝液(30mMイミダゾール、0.5M NaCI、20mM Tris−HCl pH7.9)で洗浄し、そして上記タンパク質を、6倍体積の溶出緩衝液(1Mイミダゾール、0.5M NaCI、20mM Tris−HCl pH7.9)で溶出する。溶出した糖タンパク質を凍結乾燥によって乾燥するまでエバポレートする。
以前に報告された方法(Papacら,Glycobiology 8(5):445−54(1998))の改変によって、グリカンを、糖タンパク質から解離および分離する。96ウェルMultiScreen IP(イモビロン−P膜)プレート(Millipore)のウェルを、100μLのメタノールで湿らせ、3×150μLの水および50μLのRCM緩衝液(8M尿素、360mM Tris、3.2mM EDTA pH8.6)で洗浄し、各々の添加後に緩やかな減圧によって排液した。上記乾燥タンパク質サンプルを、30μLのRCM緩衝液に溶解し、そして10μLのRCM緩衝液を含むウェルに移した。このウェルを排液し、そしてRCM緩衝液で2回洗浄した。このタンパク質を、RCM緩衝液中60μLの0.1M DTTの添加によって、1時間37℃で還元した。このウェルを、300μLの水で3回洗浄し、そして60μLの0.1Mヨード酢酸の添加によって、30分間、暗所で、室温においてカルボキシメチル化した。このウェルを、水で3回再度洗浄し、そして上記膜を、水中1% PVP360を100μL添加することによって、1時間、室温でブロッキングした。このウェルを排液し、そして300μLの水で3回洗浄し、そして、1ミリ単位のN−グリカネーゼ(Glyko)を含む10mM NH4HCO3 pH8.3を30μL添加することによって脱グルコシル化した。16時間、37℃でのインキュベートの後、上記グリカンを含む溶液を、遠心分離によって取り除き、そして乾燥するまで蒸発させた。
グリカンの分子量を、ディレイドエクストラクション(delayed extraction)を用いるVoyager DE PRO linear MALDI−TOF(Applied Biosciences)質量分析計を使用して決定した。各ウェルからの乾燥グリカンを、15μLの水に溶解し、そしてステンレス鋼サンプルプレート上に0.5μLスポットし、そして0.5μLのS−DHBマトリックス(1:1水/アセトニトリル0.1% TFA中、9mg/mLのジヒドロキシ安息香酸、1mg/mLの5−メトキシサリチル酸(methoxysalicilic acid))と混合し、そして乾燥させた。
(キメラエンドマンノシダーゼタンパク質を生成するためのコンビナトリアルライブラリー)
最適温度および最適pHの範囲を有する触媒ドメインによって特徴付けられる、ヒトエンドマンノシダーゼ、マウスエンドマンノシダーゼ、ラットエンドマンノシダーゼおよび/または混合エンドマンノシダーゼの任意の組み合わせのライブラリーは、公表された手順(例えば、WO 02/00879;Choiら、2003、前出、および米国出願番号10/371,877(2003年2月20日出願)の公報を参照のこと)に従って作製される。このライブラリーは、酵母のような下等な真核宿主細胞で発現された場合に、レポータータンパク質のグリコシル化パターンを改変して所望のグリカン構造を産生することにおいて最適に機能するエンドマンノシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする1以上の配列を選択するのに有用である。特定の細胞区画に対するエンドマンノシダーゼの触媒ドメインを標的するのが有利であることが期待される。DNAコンビナトリアルライブラリーアプローチ(標的ペプチドと酵素ドメインとの間のインフレーム融合)は、選択のために使用される宿主細胞において、所望もしくは効率的な様式でエンドマンノシダーゼ活性を発現するキメラ分子を同定することを可能にする。エンドマンノシダーゼ配列は、多くの発現系(細菌細胞、酵母細胞および哺乳動物細胞が挙げられる)において発現され、コードされたタンパク質が特徴付けされる。
Claims (15)
- (a)細胞標的化シグナルペプチドに融合した
(b)エンドマンノシダーゼE.C.3.2.1.130触媒ドメイン
を含む融合タンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドであって、前記細胞標的化シグナルペプチドが、前記エンドマンノシダーゼE.C.3.2.1.130触媒ドメインを、宿主細胞の小胞体、ゴルジまたは輸送小胞に標的化する、ポリヌクレオチド。 - 前記融合タンパク質のエンドマンノシダーゼE.C.3.2.1.130触媒ドメインが
(a)配列番号1または3によりコードされる触媒ドメイン;および
(b)配列番号2または4をコードする核酸配列によりコードされる触媒ドメイン
からなる群より選択される、請求項1の単離されたポリヌクレオチド。 - 前記エンドマンノシダーゼE.C.3.2.1.130触媒ドメインが、5.2と7.2との間のpHにおいて最適活性を有する、請求項1または2に記載のポリヌクレオチド。
- 前記エンドマンノシダーゼE.C.3.2.1.130触媒ドメインが、6.2のpHにおいて最適活性を有する、請求項3に記載のポリヌクレオチド。
- 前記エンドマンノシダーゼE.C.3.2.1.130触媒ドメインが、グリコシル化グリカン上に少なくとも1つのグルコース残基と1つのマンノース残基とを含む組成物を加水分解する、請求項1〜4のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記エンドマンノシダーゼE.C.3.2.1.130触媒ドメインが、オリゴ糖におけるGlcα1,3Manダイマー、Glc2α1,3ManトリマーまたはGlc3α1,3Manテトラマーを加水分解する、請求項1〜5のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記エンドマンノシダーゼE.C.3.2.1.130触媒ドメインが、Glc1−3Man5GlcNAc2、Glc1−3Man6GlcNAc2、Glc1−3Man7GlcNAc2、Glc1−3Man8GlcNAc2、Glc1−3Man9GlcNAc2またはグリコシル化高級マンナングリカン上の少なくとも1つのグルコース残基と1つのマンノース残基とを加水分解する、請求項1〜5のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記細胞標的化シグナルペプチドが、MNN11遺伝子の核酸1−303(配列番号:30)によりコードされる、請求項1〜7のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドによりコードされる、融合タンパク質。
- 目的のタンパク質上に改変された糖形態を産生する、請求項10に記載の融合タンパク質。
- Glcα1,3Man、Glc2α1,3ManまたはGlc3α1,3Manを加水分解する、請求項10に記載の融合タンパク質。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
- 前記宿主細胞が、哺乳動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、真菌細胞、酵母細胞または藻類細胞である、請求項13に記載の宿主細胞。
- 前記宿主細胞が、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)、ピキア・フィンランディカ(Pichia finlandica)、ピキア・トレハロフィラ(Pichia trehalophila)、ピキア・コクラマエ(Pichia koclamae)、ピキア・メンブラナエファシエンス(Pichia membranaefaciens)、ピキア・オプンティアエ(Pichia opuntiae)、ピキア・サーモトレランス(Pichia thermotolerans)、ピキア・サリクタリア(Pichia salictaria)、ピキア・グエルキューム(Pichia guercuum)、ピキア・ピジュペリ(Pichia pijperi)、ピキア・スティプティス(Pichia stiptis)、ピキア・メタノリカ(Pichia methanolica)、ピキア種(Pichia sp.)、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、サッカロマイセス種(Saccharomyces sp.)、ハンゼヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)、クルイベロミセス種(Kluyveromyces sp.)、クルイベロミセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、アスペルギルス・ニドウランス(Aspergillus nidulans)、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、アスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)、クリソスポリウム・ラックノウエンス(Chrysosporium lucknowense)、フザリウム種(Fusarium sp)、フザリウム・グラミネウム(Fusarium gramineum)、フザリウム・ベネナツム(Fusarium venenatum)およびノイロスポラ・クロッサ(Neurospora crassa)からなる群より選択される、請求項13に記載の宿主細胞。
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