JP4787608B2 - 血小板凝集反応測定方法、および血小板凝集反応測定装置 - Google Patents
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Description
本発明は、血小板を多数含む多血小板血漿試料で生じる血小板の凝集反応の度合を測定する血小板凝集反応測定方法、および血小板凝集反応測定装置に関するものである。
血小板凝集反応測定装置は脳梗塞や心筋梗塞など血栓性の疾患を診断する装置の一つとして広く使用されている。血小板凝集反応は、反応初期に単一の血小板が集まり小さな凝集塊が形成され、続いてこの小さな凝集塊同士が集まって更に大きな凝集塊を形成して進行する反応であるが、血小板凝集反応測定装置は、たとえば血小板試料にADP（アデノシン二燐酸）やコラーゲンなどの凝集惹起剤を作用させ、多数の血小板どうしが凝集し血小板の塊が生じることを利用し、光学測定を介して凝集の変化を測定するよう構成されている。
従来より、この種の血小板凝集測定装置としては、主に透過光計測法、およびレーザ粒子散乱計測法を用いた二つの測定方式が広く用いられている。
透過光計測法を用いた装置は、濁度計の原理を応用し、血小板試料に光を照射し血小板凝集に伴って生じる透過光量の変化を測定するよう構成されている。一方、レーザ粒子散乱計測法を用いた装置は、血小板凝集で生成される凝集塊にレーザ光を照射し、凝集塊からの散乱光信号を計測して凝集塊粒子の大きさと数を測定する装置である（たとえば特許文献１、および特許文献２）。
特開平６−０５０８７５号公報
特開平６−１７４７２４号公報
上記のうち、透過光計測法を用いた装置は、血小板試料に光を照射し血小板凝集に伴って生じる透過光量の変化を測定するものであるが、この手法は血小板試料全体の濁度を大まかに測定する。
これに対して、レーザ粒子散乱計測法を用いた血小板凝集測定装置は、血小板試料液中で生成される血小板凝集塊にレーザ光束を照射し、測定領域中を通過する凝集塊からの散乱光信号を測定することにより、個々の凝集塊粒子の大きさとその数を時系列的に測定する。
図７は、従来のレーザ粒子散乱計測法による凝集測定装置の構成（上記特許文献１のものと同等）を示している。
図７において、散乱光強度測定のための半導体レーザ（４０ｍＷ）光源７１は、駆動回路７９により駆動されてレーザ光を発生する。このレーザ光は、集光レンズ７２によってコリメートされ、血小板等の血球浮遊液を含む試料ガラスセル７３に照射される。試料セル７３内の血球浮遊液は３７℃の一定温度に保たれ、スターラーバー（撹拌棒）７４とマグネチックスターラ７５によって１０００ｒｐｍで回転撹拌される。
血球浮遊液からの散乱光は受光レンズ７６を介して複数の受光素子のフォトダイオード７８（７８ａ〜７８ｄ）によって電気信号として測定される。各々のフォトダイオードの前部に、統計的に凝集塊１個のみが測定できる観察領域からの散乱光を受光するためにピンホ−ル（１０×ｌ００μｍ）７７が配置される。フォトダイオード７８の出力は増幅器８０により電流電圧変換、増幅後、ＡＤ変換器８１によりＡＤ変換されてコンピュ−タ８２に入力される。
コンピュータ８２では、凝集塊の粒径に応じて設けられた複数のコンパレータにより散乱光強度信号のレベルが識別され、コンパレータから出力信号をカウンタにより計数することにより所定の粒径の凝集塊が何個あったかが測定される。その場合、凝集塊の一部がピンホール７７の縁部を通過することにより誤って計測される凝集塊の粒径は、統計的確率論と標準粒子の測定結果からとの式を用いたパーソナルコンピュータの測定ソフトによって補正される。
図８は、図７のフォトダイオード７８ａ〜７８ｄで測定された血小板凝集時の散乱光強度信号の変化状態が図示されている。凝集塊からの散乱光は、凝集塊の大きさに相関したピーク信号８３ａ〜８３ｄとして測定され、凝集していない個々の血小板からの散乱光はバックグランド信号８４ａ〜８４ｄとして測定される。
そこでこのバックグランド信号の影響をなくするために、図９に示すように、２個の受光素子のフォトダイオード７８ａ、７８ｂからの各々の出力信号がそれぞれ演算増幅器８５に入力され減算される。それにより未凝集の血小板からの散乱光によるバックグランド信号が相殺され、８６で示すように凝集塊のみからの散乱光強度変化のみが測定される。このバックグランド信号が除去された信号は絶対値回路８７に入力される。絶対値回路８７の出力は符号８８に示すように、バックグランドのないピーク信号だけの信号となる。
この絶対値回路からの出力信号はそれぞれウインドコンパレータ９０＿１、９０＿２．．．９０＿ｎに入力され、そのレベルが識別される。各コンパレータは凝集塊の粒径に対応したレベル比較を行なうので、コンパレータの各出力は凝集塊の粒径に対応した信号となっている。この信号がそれぞれカウンタ９１＿１、９１＿２．．．９１＿ｎでカウントされ、その粒径の凝集塊の数が計数される。この計数されたデータは演算回路９２に入力され、たとえば検出した凝集塊の粒径とその数を演算するなどの所定のデータ処理に用いられる。
上記のようなレーザ粒子散乱計測法による測定装置は、１個のみの凝集塊からの散乱光を測定できるよう、たとえば測定領域中に複数の凝集塊が存在しないように、上記のピンホールなどを配置することにより、測定領域を約５０μｍ立方の微小容量（市販装置ではたとえば２０μｍ×６０μｍ×１４５μｍ程度）としている。このため、レーザ粒子散乱計測法による測定装置は、測定領域を超える大きさの凝集塊からの光散乱信号の強度は真の値より小さくなる欠点があり、透過光計測法を用いた血小板凝集装置に比べ高感度な測定が可能であるものの、大きな凝集塊が生成する強い血小板凝集反応の測定には適していない。
以上のように、血小板凝集測定装置で用いられる透過光計測法は血小板試料全体の濁度を測定するいわばマクロ的方法であり、一方、レーザ粒子散乱計測法は血小板試料の微小領域での凝集塊粒子の大きさと数とを測定するミクロ的方法であり、それぞれ相反する特徴がある。すなわち、透過光計測法では、試料の濁度を計測するものであり、高感度に、たとえば血小板粒子の数を問題にするような領域での測定は不得意である一方、レーザ粒子散乱計測法は、これとは反対に高感度な測定が可能であるが大きな凝集塊に対する測定には適していない。
本発明の課題は、上記の問題に鑑み、透過光計測法と、レーザ粒子散乱計測法の双方の特徴を生かして組合せることにより、両計測法の欠点を補ない、また、血小板凝集の度合を客観的に評価可能な新規な測定値を出力できる信頼性の高い血小板凝集測定を行なえるようにすることにある。
本発明は、上記課題を解決するため、血小板を多数含む多血小板血漿試料で生じる血小板の凝集反応の度合を測定する血小板凝集反応測定方法および血小板凝集反応測定装置において、
試料セルに収容した多血小板血漿試料の透過率を測定する透過率計測過程と、
レーザ粒子散乱計測により、前記多血小板血漿試料の散乱光強度を測定する散乱光強度計測過程と、
前記透過率計測過程で測定された透過率と前記散乱光強度計測過程で測定された散乱光強度の相関値（R^2）、および前記透過率計測過程で測定された透過率の最大値（Ｔmax）に基づき異なる演算式を選択することにより、前記散乱光強度計測過程で測定された散乱光強度（Ｙs, Ｙm, Ｙl,）を用いて演算し出力する血小板凝集能の評価値（PAIndex）を補正する演算過程を含み、
前記散乱光強度計測過程において、大きさの異なる凝集塊を含む多血小板血漿試料に対して散乱光強度の測定を大きさが小（Ｓ）、中（Ｍ）、大（Ｌ）の凝集塊ごとに行ない、前記大きさの異なる凝集塊から各々得られた散乱光強度の時間積分値のうち、前記相関値（R^2）および前記透過率計測過程で測定された透過率の最大値（Ｔmax）に基づいて行なう演算式選択により、前記血小板凝集能の評価値（PAIndex）の演算に用いられる時間積分値（∫Ｙs+m+lまたは∫Ｙs+m）が決定され、
前記相関値（R^2）および前記透過率の最大値（Ｔmax）に基づく演算式選択により、前記大きさの異なる凝集塊から各々得られた散乱光強度の時間積分値のうち、前記散乱光強度計測過程の測定領域を超える大きな凝集塊が形成されている場合には、測定領域を超えない大きさの凝集塊から得られた散乱光強度の時間積分値（∫Ｙs+m）のみを用いて前記血小板凝集能の評価値（PAIndex）の演算が行なわれる構成を採用した。
試料セルに収容した多血小板血漿試料の透過率を測定する透過率計測過程と、
レーザ粒子散乱計測により、前記多血小板血漿試料の散乱光強度を測定する散乱光強度計測過程と、
前記透過率計測過程で測定された透過率と前記散乱光強度計測過程で測定された散乱光強度の相関値（R^2）、および前記透過率計測過程で測定された透過率の最大値（Ｔmax）に基づき異なる演算式を選択することにより、前記散乱光強度計測過程で測定された散乱光強度（Ｙs, Ｙm, Ｙl,）を用いて演算し出力する血小板凝集能の評価値（PAIndex）を補正する演算過程を含み、
前記散乱光強度計測過程において、大きさの異なる凝集塊を含む多血小板血漿試料に対して散乱光強度の測定を大きさが小（Ｓ）、中（Ｍ）、大（Ｌ）の凝集塊ごとに行ない、前記大きさの異なる凝集塊から各々得られた散乱光強度の時間積分値のうち、前記相関値（R^2）および前記透過率計測過程で測定された透過率の最大値（Ｔmax）に基づいて行なう演算式選択により、前記血小板凝集能の評価値（PAIndex）の演算に用いられる時間積分値（∫Ｙs+m+lまたは∫Ｙs+m）が決定され、
前記相関値（R^2）および前記透過率の最大値（Ｔmax）に基づく演算式選択により、前記大きさの異なる凝集塊から各々得られた散乱光強度の時間積分値のうち、前記散乱光強度計測過程の測定領域を超える大きな凝集塊が形成されている場合には、測定領域を超えない大きさの凝集塊から得られた散乱光強度の時間積分値（∫Ｙs+m）のみを用いて前記血小板凝集能の評価値（PAIndex）の演算が行なわれる構成を採用した。
従来の透過光計測法または散乱光計測法のみに基づく装置とは異なり、これらの両者の測定結果を組合せる、すなわち、透過光計測法で得た透過率に基づき、散乱光計測により求めた散乱光強度から血小板凝集能の評価値を演算し、出力することができる。
そして、このように透過光計測法および散乱光計測法の測定結果を組合せることにより、前述のような従来方式における問題を解決し、レーザ粒子散乱計測に基づく高精度な測定が可能であるとともに、凝集塊が大きい測定領域においても、依然として信頼性の高い血小板凝集能評価値PAIndexを出力することができる。
以下、発明を実施する最良の形態を説明する実施例を示す。以下では、透過光計測手段およびレーザ粒子散乱計測手段の両方を備えた血小板凝集反応測定装置における測定方法につき説明する。
図１に本発明を採用した血小板凝集測定装置の構成を示す。図１において、半導体レーザ１１から照射される散乱光強度測定のためのレーザ光は集光レンズ１２によってシート光にコリメートされ、血小板血漿を収容した試料セル１３（たとえばガラス製）内の内壁近傍に照射される。また、透過光測定のため、発光ダイオード（ＬＥＤ）１４の光を試料ガラスセルに照射する。
試料セル１３内の試料溶液１６は３７℃の一定温度に保たれ、スターラーバー（攪拌棒）２５およびマグネチックスターラー１５によって１０００ｒｐｍで回転攪拌される。
試料溶液１６中の凝集塊からの散乱光は、受光レンズ１７を介して複数の受光素子のフォトダイオードからなるフォトダイオードアレイ１８によって測定され、測定結果は電気信号として出力される。
本実施例の散乱光測定系は、図７〜図９に示した従来構成とほぼ同等である。すなわち、フォトダイオードアレイ１８のフォトダイオードには、統計学的に凝集塊１個のみが測定できる観察領域からの散乱光を受光できる受光面積のものを用いる。フォトダイオードアレイ１８の出力は増幅器１９により電流電圧変換された後、ＡＤ変換器２０によりＡＤ変換され、コンピュータ２１に入力される。
デジタル信号に変換された散乱光測定信号は、たとえば、パーソナルコンピュータのハードウェアなどを用いて構成したコンピュータ２１により信号処理される。
コンピュータ２１には、ハードウェアまたはソフトウェアから構成したコンパレータ手段（図９のウインドコンパレータ９０＿１、９０＿２．．．９０＿ｎ）、カウンタ手段（図９のカウンタ９１＿１、９１＿２．．．９１＿ｎ）、および演算手段（図９の演算回路９２）を設けておき、レーザ粒子散乱計測に関しては次のような処理を行なう。
まず、コンパレータ手段により凝集塊の粒径に対応したレベル比較を行ない、カウンタ手段により、粒径ごとに散乱光強度信号、および凝集塊の数を計測する。たとえば、以下の実施例では、小（Ｓ）、中（Ｍ）、大（Ｌ）の粒径の凝集塊ごとに、少なくとも散乱光強度信号を計測する必要がある。
さらにこの小、中、大の粒径の凝集塊ごとの散乱光強度信号、および凝集塊数のデータは演算手段に入力され、後述の演算処理を行ない、ここでは透過光測定結果との相関演算を行なうことにより、凝集反応の指標を測定値として出力できるよう表示するためのデータ演算を行なう。
一方、試料セル１３中の試料溶液１６を通過した透過光は、フォトダイオード２２により受光され、透過光量に応じた電気信号に変換され、その出力信号は増幅器２３により電流電圧変換され増幅された後、ＡＤ変換器（不図示）によりＡＤ変換されコンピュータ２１に入力され、上記同様の演算手段により試料溶液の透過率が計算される。ここで透過率は、血小板を含まない血漿試料を測定した時の透過光量を１００％（最大透過光量）、とし、血小板を含む血漿試料を測定した時の小透過光量の側を０％にとった尺度で演算されるものとする。
なお、本発明においては、凝集反応の測定中に後述のように散乱光測定結果と透過光測定結果の双方の結果を用いて算出した評価値を出力するので、散乱光測定のための半導体レーザ１１の発光波長と、透過光測定のため発光ダイオード１４の発光波長を異なる波長領域に設定する（波長分割構成）か、あるいは可能な限り短周期で散乱光測定と透過光測定を交互に行なう（時分割構成）よう構成する。これにより散乱光測定と透過光測定が相互に影響を受けずに済む。
以下、上述の構成における血小板凝集度の測定例につき説明する。
本実施例では、ボランティアから採血した血漿液から遠心分離により約30万個／μｌの血小板を含む多血小板血漿（PRP）を調製し、図１の装置を用いて測定を行なった。
本実施例では、レーザ粒子散乱計測および透過光測定により凝集反応を測定する。このうち、レーザ粒子散乱計測においては、小凝集塊（以下Ｓとも略記する。凝集塊径：９μｍ〜３０μｍ）、中凝集塊（同Ｍ。凝集塊径：３０μｍ〜４０μｍ）、大凝集塊（同Ｌ。凝集塊径：４０μｍ以上）の各粒径ごとに、少なくとも散乱光強度信号を計測する。
図２（ａ）は、Ｓ、Ｍ、Ｌの凝集塊を含む試料について、それぞれＰＲＰ試料３００μｌにＡＤＰ（アデノシン二燐酸）２μＭ（終濃度）を添加して血小板凝集反応を惹起させ、透過光計測により測定した透過率（Ｔ：凝集率）、およびレーザ粒子散乱計測により測定したＳ、Ｍ、Ｌの各凝集塊の単位時間当たりの総散乱光強度（Ｙ）を血小板凝集反応の時間経過に対応させて表示したものである。
なお、図２（ａ）ないし以下に参照する図面に示す（あるいは文中に表形式で示す）表示例は、いずれもコンピュータ２１のディスプレイで表示出力、あるいはプリンタで記録出力可能である。
さらに、Ｓ、Ｍ、Ｌの各凝集塊の散乱強度信号Ｙおよび透過率信号Ｔから、透過率Ｔに対するＳ、Ｍ、Ｌの散乱強度、およびＳ＋Ｍ、Ｓ＋Ｍ＋Ｌの各散乱強度の和との相関（関数式と相関係数）を演算する。
図２（ｂ）は、上記の血小板凝集反応におけるＳ、Ｍ、Ｌの各凝集塊の散乱強度Ｙ（縦軸）および透過率Ｔ（横軸）を表示した例である。さらに、図２（ｂ）の透過率Ｔに対するＳ、Ｍ、Ｌ、およびＳ＋Ｍ、Ｓ＋Ｍ＋Ｌの散乱強度Ｙの関係を求めた結果を図３に示す。
ここで、凝集惹起剤であるＡＤＰによる種々の濃度の凝集反応の多数の例からこれらの関係を求めた結果、図３に示すように透過率Ｔが０〜３０％の間ではＴとＳ＋Ｍ＋Ｌの散乱強度Ｙが直線関係にあること、および図４に示すように透過率Ｔが３０％を超える領域（この領域を以下３０％〜１００％と略記する）の間ではＴとＳ＋Ｍの散乱強度Ｙが直線関係にあることを見出した。
そこで、これらの直線関係を、Ｔ：０〜３０％においては
（Ｓ＋Ｍ＋Ｌ）の散乱強度＝Ｙｓ＋ｍ＋ｌ＝ＡＴ＋Ｃ （Ａ、Ｃ：定数） （式１）
また、Ｔ：３０％〜１００％においては
（Ｓ＋Ｍ）の散乱強度＝Ｙｓ＋ｍ＝ＢＴ＋Ｄ （Ｂ、Ｄ：定数） （式２）
の各１次式により近似し、上記の２つの１次式により定義される直線の傾きＡおよびＢ、軸切片のＣおよびＤ、相関係数Ｒ＾２（＾は文中において羃乗を示す）を求めた（下記の表１）。
（Ｓ＋Ｍ＋Ｌ）の散乱強度＝Ｙｓ＋ｍ＋ｌ＝ＡＴ＋Ｃ （Ａ、Ｃ：定数） （式１）
また、Ｔ：３０％〜１００％においては
（Ｓ＋Ｍ）の散乱強度＝Ｙｓ＋ｍ＝ＢＴ＋Ｄ （Ｂ、Ｄ：定数） （式２）
の各１次式により近似し、上記の２つの１次式により定義される直線の傾きＡおよびＢ、軸切片のＣおよびＤ、相関係数Ｒ＾２（＾は文中において羃乗を示す）を求めた（下記の表１）。
ここで、透過率Ｔが０〜３０％の間では、（Ｓ＋Ｍ＋Ｌ）の散乱強度は透過率Ｔの増加に対しＹs+m+l＝11.37Ｔ＋3.38の直線式にしたがって増加する。ところで、透過率Ｔ＝30％の時、Ｙs+m+lの値は約300〜400であるので、C の値3.38はほぼ０と見なすことができ、したがって、Ｙs+m+l＝11.37Ｔと表すことができる。
また、Ｔが３０〜１００％の間では、（Ｓ＋Ｍ）の散乱強度は透過率Ｔの増加に対しＹs+m＝−2.62Ｔ＋246の直線式にしたがって減少する。Ｙs+mが０の時、透過率Ｔは93.9でほぼ１００％に近い数値となる。このことは、凝集率１００％の時のＳとＭの凝集塊はほぼ無くなることを意味し、Ｙs+m＝−2.62Ｔ＋262と表すことができる。
ここで、Ｙs+m+lがＴ＝３０％を越えるとＹs+m+l＝11.37Ｔの直線から逸脱する理由は、レーザ粒子散乱計測手段の測定領域を超える大きな凝集塊が形成されるためと考えられる。また、レーザ粒子散乱計測手段測定領域を超える大きな凝集塊が形成されるとＳとＭの凝集塊が減少し、Ｙs+mと透過率ＴはＹs+m＝−2.62Ｔ＋262の直線関係をもって変化することが明らかとなった。
従来、血小板凝集反応の強さは透過光計測法による透過率Ｔ（凝集率）の大きさで評価されている。そして、上記のように透過率Ｔと散乱強度Ｙs+m+lおよびＹs+mとの間に直線関係があることが明らかになったので、したがって、散乱強度Ｙs+m+lまたはＹs+mを適宜選択して演算処理を行なうことにより、血小板凝集反応の強さの評価指標を算出できる、と考えられる。
すなわち、透過率、あるいはさらに透過率と散乱強度の相関値に基づき、散乱強度Ｙs+m+l またはＹs+mを適宜選択して演算処理を行なうことにより、血小板凝集反応の強さの評価指標を算出する。特に、透過率と散乱強度の相関値に基づき、凝集がかなり進んだ、レーザ粒子散乱計測手段の測定領域を超える大きな凝集塊が形成されていると考えられる測定領域においては、散乱強度Ｙs+m を用い（測定領域を超えない大きさの小、および中の凝集塊から得られた散乱光強度のみを用いる）、それ以外の測定領域では散乱強度Ｙs+m+l を用いる（小、中、大の凝集塊から得られた散乱光強度を用いる）ようにするのである。
具体的には、本実施例では以下のようにして散乱強度Ｙs+m+l またはＹs+m を用いて、血小板凝集反応の強さを評価する指標PAIndexを演算し、出力（表示ないし印刷出力による）する。
まず、遠心分離した多血小板血漿（PRP）300μlを試料セル１３に投入し、測定を開始して１分後に凝集惹起剤ADPを添加する。
そして、Ｓ、Ｍ、Ｌ散乱強度信号Ｙおよび透過率信号Ｔから、Ｔが０〜３０％の領域においてはＹs+m+l＝aＴの定数aおよび相関係数R^2を、またＴが３０〜１００％の領域においてはＹs+m＝bＴ + d の定数 bおよび相関係数R^2を演算し、出力（表示／印刷）する。
同時に、ADP添加時から４分間のＹs+m+lの時間積分値∫Ｙs+m+l（AUC：曲線下面積）、および透過率Ｔが３０％を超えてから４分間のＹs+mの時間積分値∫Ｙs+m（AUC：曲線下面積）を演算し、出力（表示／印刷）する。
次に、コンピュータ２１の演算ソフトウェアにより、下記、および図５のフローチャートに示すような演算を行ない、血小板凝集反応の強さを評価する指標 PAIndexを算出する。
まず、透過率Ｔの値に応じて、散乱強度の時間積分値∫Ｙs+m+lまたは∫Ｙs+mのいずれかを算出するが、この時、
（１）透過率Ｔの最大（Ｔmax）が４０％以下の場合は∫Ｙs+m+lを（図５ステップＳ１１〜Ｓ１２）、
（２）透過率Ｔの最大（Ｔmax）が４０％以上で式Ｙs+m＝bＴ + dの相関係数R^2<0.70の場合は∫Ｙs+m+lを（同Ｓ１３〜Ｓ１２）、
（３）透過率Ｔの最大（Ｔmax）が４０％以上の凝集反応で式Ｙs+m＝bＴ + dの相関係数R^2が0.70以上の場合は∫Ｙs+mを（同Ｓ１３〜Ｓ１４）
を求め、さらに、
（４）∫Ｙs+m+lを用いる場合は PAIndex＝∫Ｙs+m+l×11.37／ａ （式３）（図５ステップＳ１５）
（５）∫Ｙs+mを用いる場合は PAIndex＝13000−∫Ｙs+m×11.37／ａ （式４）（同Ｓ１６）
の各（式３）、（式４）のいずれかにより求めた血小板凝集能の評価値PAIndexを出力（表示／印刷）する（図５ステップＳ１７）。
（１）透過率Ｔの最大（Ｔmax）が４０％以下の場合は∫Ｙs+m+lを（図５ステップＳ１１〜Ｓ１２）、
（２）透過率Ｔの最大（Ｔmax）が４０％以上で式Ｙs+m＝bＴ + dの相関係数R^2<0.70の場合は∫Ｙs+m+lを（同Ｓ１３〜Ｓ１２）、
（３）透過率Ｔの最大（Ｔmax）が４０％以上の凝集反応で式Ｙs+m＝bＴ + dの相関係数R^2が0.70以上の場合は∫Ｙs+mを（同Ｓ１３〜Ｓ１４）
を求め、さらに、
（４）∫Ｙs+m+lを用いる場合は PAIndex＝∫Ｙs+m+l×11.37／ａ （式３）（図５ステップＳ１５）
（５）∫Ｙs+mを用いる場合は PAIndex＝13000−∫Ｙs+m×11.37／ａ （式４）（同Ｓ１６）
の各（式３）、（式４）のいずれかにより求めた血小板凝集能の評価値PAIndexを出力（表示／印刷）する（図５ステップＳ１７）。
なお、ここで、多数の測定例より算出されたＹs+m+lの最大値は約９０００、∫Ｙs+mの最小値は約１０００、最大値は約５０００であるので、（式４）PAIndex＝13000−∫Ｙs+m×11.37／ａ 中の定数は１３０００（＝９０００＋（５０００−１０００））に設定してある。
また、個々の測定例において、測定したＰＲＰの血小板濃度や測定装置の感度の違いにより Ｙs+m+l＝ａＴ （式１）の定数ａは異なるため、（式３）および（式４）のように一定値（本例ではaの平均値11.37）を個々の測定で得られた定数ａで除して補正するようにしている。たとえば、血小板濃度が高い場合や測定装置の感度が高い場合に定数ａは大きくなるため、定数ａで除することによりこれを補正することができる。
さらに、本実施例で算出される PAIndexは０〜１３０００の値となるが、この値の範囲は式（３）および（４）の定数部分 11.37／ａ の 11.37 を変えることにより変更することができる。たとえば、PAIndex を０〜１０００の範囲の値にしたい場合は、11.37 を 0.769 に変更すればよい。測定用途に応じて上記のような PAIndex の出力値範囲調節を行なえるよう、コンピュータ２１の演算ソフトウェアを構成しておけば便利である。
ここで、ある ADP凝集の測定例において算出された PAIndex の値を表２に示す。
また、従来の透過光計測法または散乱光計測法のみに基づく装置とは異なり、これらの両者を組合せる、いわば、透過光計測法で得た透過率に基づき、散乱光計測により求めた散乱光強度から計算される血小板凝集能評価値PAIndexを補正（あるいはその演算を制御）するようになっているため、前述のような従来方式における欠点がなく、レーザ粒子散乱計測に基づく高精度な測定が可能であるとともに、凝集塊が大きい測定領域においても、依然として信頼性の高い血小板凝集能評価値PAIndexを出力することができる。
なお、血小板凝集能評価値PAIndexの出力（表示／印刷）においては、任意の表示／印刷フォーマットを用いることができるが、たとえば、血小板凝集能評価値PAIndexの算出に、式（３）または式（４）のいずれが用いられているか（あるいはさらにその時の透過率Ｔの値）を併せて表示／印刷（たとえば計算式を表示／印刷）するようにしてもよい。これにより、検者はより具体的に測定内容（演算方式）、あるいはさらに測定結果を把握することができる。
なお、以上では、血小板凝集能評価値PAIndexの出力方法として表示あるいは印刷を考えたが、もちろん他のコンピュータや他の測定機器に対して適当な通信インターフェース、あるいはネットワークインターフェースなどを介して血小板凝集能評価値PAIndexを送信するような処理も当然本発明でいう血小板凝集能評価値PAIndexの出力処理に含まれるのはいうまでもない。
以上では、ADP（アデノシン二燐酸）を凝集惹起剤として用いる場合の測定方法につき説明したが、以下では凝集惹起剤としてコラーゲンを用いる場合に好適な測定方法につき説明する。装置のハードウェアは、図１に示したものと同様である。
本実施例においても、血小板凝集能評価値PAIndexの演算方式を決定するため、まず、実施例１と同様に、Ｓ、Ｍ、Ｌ散乱強度信号Ｙおよび透過率信号Ｔから、透過率Ｔに対するＳ、Ｍ、ＬおよびＳ＋Ｍ、Ｓ＋Ｍ＋Ｌの散乱強度と相関を求めた。
ＰＲＰ試料３００μｌにコラーゲン１μｇ／ｍｌ（終濃度）を添加し、透過率Ｔに対するＳ、Ｍ、ＬおよびＳ＋Ｍ、Ｓ＋Ｍ＋Ｌの散乱強度との関係を求めた。凝集惹起剤であるコラーゲンによる凝集反応の多数例からこれらの関係を求めた結果、実施例１でのＡＤＰ凝集と同様に、Ｔが０〜３０％の間ではＴとＳ＋Ｍ＋Ｌは直線関係にあること、Ｔが３０％〜１００％の間ではＴとＳ＋Ｍが直線関係にあることを見出した。
本実施例においては、Ｔ：０〜３０％においては、
（Ｓ＋Ｍ＋Ｌ）の散乱強度＝Ｙｓ＋ｍ＋ｌ＝ＡＴ ＋ Ｃ （Ａ、Ｃ：定数） （式５）
Ｔ：３０％〜１００％においては、
（Ｓ＋Ｍ）の散乱強度＝Ｙｓ＋ｍ＝ＢＴ ＋ Ｄ （Ｂ、Ｄ：定数） （式６）
の各１次式により近似し、上記の２つの１次式により定義される直線の傾きＡおよびＢ、軸切片のＣおよびＤ、相関係数Ｒ＾２を求めた（下記の表３）。
（Ｓ＋Ｍ＋Ｌ）の散乱強度＝Ｙｓ＋ｍ＋ｌ＝ＡＴ ＋ Ｃ （Ａ、Ｃ：定数） （式５）
Ｔ：３０％〜１００％においては、
（Ｓ＋Ｍ）の散乱強度＝Ｙｓ＋ｍ＝ＢＴ ＋ Ｄ （Ｂ、Ｄ：定数） （式６）
の各１次式により近似し、上記の２つの１次式により定義される直線の傾きＡおよびＢ、軸切片のＣおよびＤ、相関係数Ｒ＾２を求めた（下記の表３）。
ここで、透過率Ｔが０〜３０％の間では、（Ｓ＋Ｍ＋Ｌ）の散乱強度はＴの増加に対しＹs+m+l＝7.46Ｔ−5.8の直線式にしたがって増加する。ところで、Ｙs+m+lの値はＴ＝30％の時、約300〜400であるので、C の値−5.8はほぼ０と見なすことができ、したがって、Ｙs+m+l＝7.46Ｔと表すことができる。なお、ADP凝集のA値は11.37±2.75（Mean±S.D.）であり、上記のコラーゲン凝集のA値に比べ統計的に有意に大きい。
また、透過率Ｔが３０〜１００％の間では、（Ｓ＋Ｍ）の散乱強度はＴの増加に対しＹs+m＝−2.30Ｔ＋227の直線式にしたがって減少する。Ｙs+mが０の時、Ｔは98.6でほぼ１００％に近い数値となった。すなわち、凝集率１００％の時のＳとＭの凝集塊は無くなることを意味しており、Ｙs+m＝−2.30Ｔ＋230と表すことができる。なお、ADP凝集のB値は-2.62±0.58（Mean±S.D.）であり、上記のコラーゲン凝集のB値と有意な差はない。
上記の結果から、本実施例では、以下のようにしてＹs+m+lおよびＹs+mから、血小板凝集反応の強さを評価する指標PAIndexを演算し、出力（表示ないし印刷出力による）する。
まず、多血小板血漿（PRP）300μlを試料セル１３に投入し、測定を開始して１分後に凝集惹起剤コラーゲンを添加する。
そして、Ｓ、Ｍ、Ｌ散乱強度信号および透過率Ｔ信号から、Ｔが０〜３０％でＹs+m+l＝aＴのaおよび相関係数R^2を、Ｔが３０〜１００％でＹs+m＝bＴ + dのbおよび相関係数R^2を演算し、出力（表示／印刷）する。
同時に、ADP添加時から４分間のＹs+m+lの時間積分値∫Ｙs+m+l（AUC：曲線下面積）および透過率Ｔが３０％を超えてから４分間のＹs+mの時間積分値∫Ｙs+m（AUC：曲線下面積）を演算し、出力（表示／印刷）する。
次に、コンピュータ２１（図１）の演算ソフトウェアにより、下記、および図６のフローチャートに示すような演算を行ない、血小板凝集反応の強さを評価する指標 PAIndex を算出する。
（１）透過率Ｔの最大（Ｔmax）が４０％以下の場合は∫Ｙs+m+lを（図６ステップＳ２１〜Ｓ２２）、
（２）透過率Ｔの最大（Ｔmax）が４０％以上で式Ｙs+m＝bＴ + dの相関係数R^2が0.9以下の場合は∫Ｙs+m+lを（同Ｓ２３〜Ｓ２２）、
（３）透過率Ｔの最大（Ｔmax）が４０％以上の凝集反応で式Ｙs+m＝bＴ + dの相関係数R^2が0.9以上の場合は∫Ｙs+mを（同Ｓ２３〜Ｓ２４）
求め、さらに、
（４）∫Ｙs+m+lを用いる場合は PAIndex＝∫Ｙs+m+l×7.46／ａ （式７） （図６ステップＳ２５）
（５）∫Ｙs+mを用いる場合は PAIndex＝10000−∫Ｙs+m×7.46／ａ （式８） （同Ｓ２６）
の各（式７）、（式８）のいずれかにより求めた血小板凝集能の評価値PAIndexを出力（表示／印刷）する（図６ステップＳ２７）。
（２）透過率Ｔの最大（Ｔmax）が４０％以上で式Ｙs+m＝bＴ + dの相関係数R^2が0.9以下の場合は∫Ｙs+m+lを（同Ｓ２３〜Ｓ２２）、
（３）透過率Ｔの最大（Ｔmax）が４０％以上の凝集反応で式Ｙs+m＝bＴ + dの相関係数R^2が0.9以上の場合は∫Ｙs+mを（同Ｓ２３〜Ｓ２４）
求め、さらに、
（４）∫Ｙs+m+lを用いる場合は PAIndex＝∫Ｙs+m+l×7.46／ａ （式７） （図６ステップＳ２５）
（５）∫Ｙs+mを用いる場合は PAIndex＝10000−∫Ｙs+m×7.46／ａ （式８） （同Ｓ２６）
の各（式７）、（式８）のいずれかにより求めた血小板凝集能の評価値PAIndexを出力（表示／印刷）する（図６ステップＳ２７）。
なお、ここで、多数の測定例より算出されたＹs+m+lの最大値は約６０００、∫Ｙs+mの最小値は約１０００、最大値は約５０００であるので、PAIndex＝10000−∫Ｙs+m×7.46／a（式８）中の定数は１００００（＝６０００＋（５０００−１０００））に設定してある。
また、個々の測定例において、測定したＰＲＰの血小板濃度や測定装置の感度の違いにより、Ｙs+m+l＝aＴのaは異なるため、（式７）および（式８）のように一定値（本例ではａの平均値7.46）を個々の測定で得られたａで除して補正する。たとえば、血小板濃度が高い場合や測定装置の感度が高い場合にaは大きくなるので、ａで除することによりこれを補正することができる。
さらに、本実施例で算出されるPAIndexは０〜１００００の値となるが、この値の範囲は式（７）および式（８）の7.46／ａの7.46を変えることにより変更することができる。たとえば、PAIndexを０〜１０００の値にする場合は、7.46を 0.746に変更すればよい。これらの演算も演算装置（PCソフト）で演算し表示した。本実施例においても、測定用途に応じて上記のような PAIndex の出力値範囲調節を行なえるよう、コンピュータ２１の演算ソフトウェアを構成しておけば便利である。
ここで、あるコラーゲン凝集の測定例において算出された PAIndexの値を表４に示す。
また、本実施例においても、従来の透過光計測法または散乱光計測法のみに基づく装置とは異なり、これらの両者を組合せる、いわば、透過光計測法で得た透過率に基づき、散乱光計測により求めた散乱光強度から計算される血小板凝集能評価値PAIndexを補正（あるいはその演算を制御）するようになっているため、前述のような従来方式における欠点がなく、レーザ粒子散乱計測に基づく高精度な測定が可能であるとともに、凝集塊が大きい測定領域においても、依然として信頼性の高い血小板凝集能評価値PAIndexを出力することができる。
本実施例においても、実施例１の最後に示した変形例が適用可能なのはいうまでもない。
なお、実施例１と実施例２の比較から明らかなように、両者の実施例の相違は凝集惹起剤によって演算式中の定数および演算式選択のためのしきい値などの定数部分が異なるのみである。したがって、ＡＤＰやコラーゲンのような凝集惹起剤ごとに測定モードを設けておき、使用する凝集惹起剤に適した測定モードで血小板凝集能の評価値の演算を行なうように血小板凝集反応測定装置を構成しておくことが考えられる。
本発明の演算方法は、図１のコンピュータの制御プログラムなどとして実装することができ、種々の記憶媒体（ＲＯＭ、ＣＤＲＯＭ、ＭＯなど）経由でコンピュータに供給することができる。また、本発明の演算方法を実装したコンピュータの制御プログラムは、記憶媒体経由ではなく、ネットワークを経由してコンピュータに供給し、またアップデートすることができる。
１１ 半導体レーザ
１２ 集光レンズ
１３ 試料セル
１４ 発光ダイオード（ＬＥＤ）
１５ マグネチックスターラー
１６ 試料溶液
１７ 受光レンズ
１８ フォトダイオードアレイ
１９ 増幅器
２０ ＡＤ変換器
２１ コンピュータ
２２ フォトダイオード
１２ 集光レンズ
１３ 試料セル
１４ 発光ダイオード（ＬＥＤ）
１５ マグネチックスターラー
１６ 試料溶液
１７ 受光レンズ
１８ フォトダイオードアレイ
１９ 増幅器
２０ ＡＤ変換器
２１ コンピュータ
２２ フォトダイオード
Claims (2)
- 血小板を多数含む多血小板血漿試料で生じる血小板の凝集反応の度合を測定する血小板凝集反応測定方法において、
試料セルに収容した多血小板血漿試料の透過率を測定する透過率計測過程と、
レーザ粒子散乱計測により、前記多血小板血漿試料の散乱光強度を測定する散乱光強度計測過程と、
前記透過率計測過程で測定された透過率と前記散乱光強度計測過程で測定された散乱光強度の相関値（R^2）、および前記透過率計測過程で測定された透過率の最大値（Ｔmax）に基づき異なる演算式を選択することにより、前記散乱光強度計測過程で測定された散乱光強度（Ｙs, Ｙm, Ｙl,）を用いて演算し出力する血小板凝集能の評価値（PAIndex）を補正する演算過程を含み、
前記散乱光強度計測過程において、大きさの異なる凝集塊を含む多血小板血漿試料に対して散乱光強度の測定を大きさが小（Ｓ）、中（Ｍ）、大（Ｌ）の凝集塊ごとに行ない、前記大きさの異なる凝集塊から各々得られた散乱光強度の時間積分値のうち、前記相関値（R^2）および前記透過率計測過程で測定された透過率の最大値（Ｔmax）に基づいて行なう演算式選択により、前記血小板凝集能の評価値（PAIndex）の演算に用いられる時間積分値（∫Ｙs+m+lまたは∫１Ｙs+m）が決定され、
前記相関値（R^2）および前記透過率の最大値（Ｔmax）に基づく演算式選択により、前記大きさの異なる凝集塊から各々得られた散乱光強度の時間積分値のうち、前記散乱光強度計測過程の測定領域を超える大きな凝集塊が形成されている場合には、測定領域を超えない大きさの凝集塊から得られた散乱光強度の時間積分値（∫Ｙs+m）のみを用いて前記血小板凝集能の評価値（PAIndex）の演算が行なわれることを特徴とする血小板凝集反応測定方法。 - 請求項１に記載の血小板凝集反応測定方法を実施するハードウェア手段を含むことを特徴とする血小板凝集反応測定装置。
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