JP4745764B2

JP4745764B2 - Ａｍｐｋ活性化剤

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Publication number: JP4745764B2
Application number: JP2005257047A
Authority: JP
Inventors: 孝利村瀬
Original assignee: Kao Corp
Current assignee: Kao Corp
Priority date: 2004-09-09
Filing date: 2005-09-05
Publication date: 2011-08-10
Anticipated expiration: 2025-09-05
Also published as: JP2007063241A

Description

本発明は、肥満、糖尿病、動脈硬化症等の生活習慣病の抑制に有用なＡＭＰＫ（AMP-activated protein kinase）活性化剤に関する。

近年、肥満人口が増大し、それに伴って糖尿病等のいわゆる生活習慣病が大きな社会問題となっている。肥満は、摂取エネルギー量が消費エネルギー量を上回り、エネルギー過剰となることにより生じる。したがって、肥満やそれに伴って発症する糖尿病の予防・改善は、例えば、食事量を減らすこと等により摂取エネルギー量を減らすこと、又は運動を行うこと等により消費エネルギー量を増やすことが基本となる。

しかし、現代社会においては、食生活の欧米化により脂質摂取量が増えると同時に、自動車の普及等により運動量が減少しエネルギー消費量が低下し、その結果として肥満人口が増大し、それに伴って糖尿病等のいわゆる生活習慣病の増加が大きな社会問題となっている。運動はエネルギー代謝を促進することにより、肥満や糖尿病をはじめとする各種の生活習慣病の予防・改善に有効であることは広く認識されているが、実生活において日常的に運動を行うことは、なかなか容易なことではない。従って、運動以外の何らかの方法により、運動によりもたらされるのと同様の効果をもたらすことや、限られた運動であってもその作用をより有効に引き出すことができれば有用である。すなわち、運動しなくとも運動したのと類似の効果を発揮する運動代替手段の開発が望まれている。

これまでに肥満を予防・改善する物質として、例えば、大豆エキス（特許文献１）、シアニジン３−グルコシド（特許文献２）、サトウキビポリフェノール（特許文献３）、Ｄ−システノール酸（特許文献４）、共役トリエン酸系油脂（特許文献５）等多くの化合物やエキス類が見出されてきた。しかしながら、これらの多くは肥満改善における作用機構が明らかにされておらず、また、食経験に乏しいことから安全性の確認が十分になされておらず、その有用性は十分明確にされていないのが実情である。

一方、エネルギー代謝や肥満、糖尿病発症機構に関する研究が進み、ＡＭＰＫがきわめて重要な働きをしていることが明らかになってきた（非特許文献１）。ＡＭＰＫ（ＡＭＰ−ａｃｔｉｖａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅ）は、筋肉や肝臓など生体に広く存在するタンパク質であり、細胞内ＡＴＰレベルが低下するような状況下において活性が上昇することにより、代謝を促進してＡＴＰ合成を促すタンパク質（"ｍｅｔａｂｏｌｉｃｓｅｎｓｏｒ"）であることが知られている。すなわち、ＡＭＰＫは、活性化によりエネルギー消費を促進することが知られている。ところが最近の研究によって、ＡＭＰＫが単に細胞内のエネルギーレベルにより調節されるだけではなく、筋肉運動、レプチン（非特許文献２）、アディポネクチンのような脂肪細胞由来ホルモン（非特許文献３）、糖尿病治療薬であるメトフォルミン（非特許文献４）等によっても活性化され、それらによって惹起される脂肪酸酸化やグルコース利用促進作用の細胞内メディエーターであると考えられるようになってきた。例えば、ＡＭＰＫは、長鎖脂肪酸をミトコンドリア内に取り込むカルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ−１）をアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）の活性制御を通して活性化することにより、脂肪酸酸化を促進することが知られている。すなわち、ＣＰＴ−１は、ＡＣＣの産物であるマロニルＣｏＡによって強く阻害されるが、ＡＭＰＫは、当該ＡＣＣのＳｅｒ７９をリン酸化することにより、ＡＣＣの活性を抑制していると考えられている。このことから、ＡＭＰＫを活性化するような薬剤は、脂肪酸酸化を促し、またエネルギー消費量を増大させ、肥満や糖尿病をはじめとする生活習慣病の予防及び治療や、運動と類似の効果を発揮することにより運動不足の解消に有用であると考えられている。

従来ＡＭＰＫを活性化する化合物としては、上記のレプチン、アディポネクチンやメトフォルミンの他、ＡＩＣＡＲ（５−アミノイミダゾール−４−カルボキサミド）が知られているが、食経験が豊富で安全性が高く、入手が容易で加工性にも優れた素材は現時点においては殆どなかった。

ヌートカトンは、４，４ａ，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−６−イソプロペニル−４，４ａ−ジメチル−２（３Ｈ）−ナフタレノンなるセスキテルペンケトンであり、グレープフルーツ果皮等に存在し、グレープフルーツの特徴的な香味を有するため香料としては非常に注目されている物質であるが（非特許文献５）、これまでその生理作用についてはほとんど報告されていない。また、グレープフルーツに関しては、グレープフルーツオイル（精油）を含有する香料組成物が、交感神経系を活性化することにより、抗肥満作用を示すこと（特許文献６）、グレープフルーツオイルを含有する皮膚外用剤（特許文献７）が報告されているが、ヌートカトンが抗肥満作用を有することについては全く知られていない。
特開２００３−２８６１８０号公報特開２００３−２５２７６６号公報特開２００３−１３７８０３号公報特開２００３−１０４８７９号公報特開２００２−１８６４２４号公報特開２００２−１９３８２４号公報特開２００５−４７９３５号公報 Molecular Medicine,Vol.39,No.4,p.398-407、2002 Nature,Vol.415,p.339-343,2002 Nature,Vol.423,p.762-769,2003 J.Clin.Invest.,Vol.108,p.1167-1174,2001 荒井綜一編、「最新香料の事典」、第１版、朝倉書店、2000年5月10日、p.112、p.254

本発明の目的は、食経験が豊富で安全性が高く、入手が容易で加工性にも優れたＡＭＰＫ活性化剤を提供することにある。

本発明者らは、食経験が豊富な天然物素材を探索したところ、ヌートカトンにＡＭＰＫ活性化作用があり、これを摂取することにより、肥満、高脂血症、糖尿病、動脈硬化症等の生活習慣病の予防、治療及び改善や運動不足の解消に有用であることを見出した。

すなわち本発明は、ヌートカトンを有効成分とするＡＭＰＫ活性化剤を提供するものである。

また本発明は、ヌートカトンを有効成分とする脂質代謝活性化剤を提供するものである。

また本発明は、ヌートカトンを有効成分とする肥満抑制剤を提供するものである。

また本発明は、ヌートカトンを有効成分とする糖尿病抑制剤を提供するものである。

また本発明は、ヌートカトンを有効成分とする動脈硬化抑制剤を提供するものである。

また本発明は、ヌートカトンを有効成分とする高脂血症抑制剤を提供するものである。

また本発明は、ヌートカトンを有効成分とする運動代替剤を提供するものである。

また本発明は、ヌートカトンを含有し、生活習慣病抑制作用を有することを特徴とし、そのために用いる旨の表示を付した飲食品を提供するものである。

また本発明は、ヌートカトンを含有し、脂質代謝促進作用を有することを特徴とし、そのために用いる旨の表示を付した飲食品を提供するものである。

また本発明は、ヌートカトンを含有し、運動代替機能を有することを特徴とし、その旨の表示を付した飲食品を提供するものである。

本発明のＡＭＰＫ活性化剤、脂質代謝活性化剤、肥満抑制剤、糖尿病抑制剤、動脈硬化抑制剤、高脂血症抑制剤及び運動代替剤は、脂質代謝や糖代謝等のエネルギー代謝の活性化を誘導し、安全性に優れることから、肥満、高脂血症、糖尿病及び動脈硬化症等の生活習慣病の予防、治療及び／又は改善や、運動と類似の効果を発揮し、運動不足の解消に有効である。

本発明において、ヌートカトンとは、４，４ａ，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−６−イソプロペニル−４，４ａ−ジメチル−２（３Ｈ）−ナフタレノンなるセスキテルペンケトンをいう。当該ヌートカトンには、８種類の光学異性体が存在する。本発明のＡＭＰＫ活性化剤においては、それら異性体を単独又は混同して用いることができるが、次の構造式（Ｉ）で表される（＋）−ヌートカトンを用いるのが好ましい。

本発明で用いるヌートカトンは、公知の有機化学的合成、微生物を用いた合成等により製造することができ、例えば、特開２００４−１２３５６１公報、特開２００３−２５０５９１公報、特表平１１−５０１０５２公報に記載の方法により得ることができる。

また、本発明で用いるヌートカトンは、ヌートカトンを含有する天然物から公知の方法により抽出することにより得ることもできる。ここで、抽出は、例えば、水、熱水、アルコール水、有機溶剤等を用いて行う抽出操作と高速液体クロマトグラフやカラムクロマトグラフ等による精製操作や蒸留操作を適宜組み合わせて行う方法により行うことができる。ヌートカトンを含有する天然物としては、例えばグレープフルーツが挙げられる。グレープフルーツから抽出する場合、その原料としては例えば、グレープフルーツ果実、グレープフルーツ果皮、グレープフルーツオイル、グレープフルーツ濃縮果汁、グレープフルーツ果汁搾汁後の残渣等を用いることができる。

上記合成や抽出により得られるヌートカトンは、単数又は複数工程の精製等により夾雑物が除かれた高純度のものを用いることが好ましいが、本発明の効果を奏する限り粗精製物であってもよい。

本発明のヌートカトンは、後記実施例に示すとおり、筋細胞において強いＡＭＰＫ活性化作用を有するため、ＡＭＰＫ活性化剤として用いることができる。ＡＭＰＫ活性化は、脂質酸化を促進し、エネルギー消費の促進をもたらす。また、ＡＭＰＫ活性化により、グルコース輸送体（GLUT）を介したグルコース取り込みが増加し、グルコースの利用を促進する。従って、ヌートカトンは、ＡＭＰＫ活性化剤、脂質代謝活性化剤、肥満抑制剤、糖尿病抑制剤、動脈硬化抑制剤及び高脂血症抑制剤として、肥満、高脂血症、糖尿病、動脈硬化症等の生活習慣病の予防、治療及び／又は改善に有用である。また、ヌートカトンは、前記の運動不足が原因の一つとなっている種々の症状を改善することから、運動と類似の効果をもたらす運動代替剤、特に肥満、体脂肪蓄積、糖尿病、脂肪肝、生活習慣病などの予防改善を目的とする運動代替剤として有用である。当該ＡＭＰＫ活性化剤等は、ヒト及び動物に投与することができる他、各種飲食品、医薬品、ペットフード等に配合して摂取することができる。飲食品とする場合には、一般の飲食品の他、肥満、高脂血症、糖尿病、動脈硬化症等の生活習慣病の予防及び／又は改善、高血糖、インスリン抵抗性、脂質代謝促進等の生理機能をコンセプトとする機能性飲食品、病者用食品、特定保健用食品に応用できる。医薬品として使用する場合は、例えば、錠剤、顆粒剤等の経口用固形製剤や、内服液剤、シロップ剤等の経口用液体製剤とすることができる。

尚、経口用固形製剤を調製する場合には、本発明のヌートカトンに賦形剤、必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤等を加えた後、常法により錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等を製造することができる。また、経口用液体製剤を調製する場合は、矯味剤、緩衝剤、安定化剤、矯味剤等を加えて常法により内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等を製造することができる。

飲食品、医薬品、ペットフード等に対するヌートカトンの配合量は、その使用形態により異なるが、飲食品やペットフード等として用いる場合には、通常０．０００２〜５質量％、更に０．００１〜３質量％、特に０．０２〜２質量％とするのが好ましい。医薬品、例えば錠剤、顆粒剤、カプセル剤等の経口用固形製剤、内服液剤、シロップ剤等の経口用液体製剤等として用いる場合には、通常０．０１〜９５質量％、更に０．１〜９５質量％、特に２〜８０質量％とするのが好ましい。

本発明のＡＭＰＫ活性化剤、脂質代謝活性化剤、肥満抑制剤、糖尿病抑制剤、動脈硬化症抑制剤、高脂血症抑制剤及び運動代替剤の投与量（有効摂取量）は、ヌートカトンとして、一日当り１〜２０００ｍｇ／６０ｋｇ体重とするのが好ましく、特に２〜１０００ｍｇ／６０ｋｇ体重、更に５〜５００ｍｇ／６０ｋｇ体重とするのが好ましい。

実施例１
ヌートカトンのＡＭＰＫ活性化作用を、筋細胞株(Ｃ２Ｃ１２)を用い、ＡＭＰＫα及びβのリン酸化を指標として、次法により評価した。

マウス筋細胞株（Ｃ２Ｃ１２）を２５ｃｍ²フラスコにまき、ＤＭＥＭ（＋１０％ＦＢＳ、＋抗菌剤）中３７℃で１〜２日培養した。コンフルエントになった時点で培養液を除去し、ＰＢＳ（−）で洗浄後、ＤＭＥＭ（２％（V/V）Ｈｏｒｓｅｓｅｒｕｍ）に置き換え、２〜３日毎に培養液を交換しながら更に７〜８日培養した。その後培養液を除去し、ＰＢＳ（−）で洗浄後、ＤＭＥＭ（−ＦＢＳ）に置き換え、更に１日培養した。培養液を除去後、所定濃度のヌートカトン（和光純薬社製）を含むＤＭＥＭ（−ＦＢＳ）を加え、６０分間培養した。次いで培養液を除去、ＰＢＳ（−）で洗浄後、細胞溶解液（１０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）、５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、３０ｍｍｏｌ／Ｌピロリン酸ナトリウム、０．５％（Ｖ／Ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ｐｒｏｔｅａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｃｏｃｋｔａｉｌ（ＳＩＧＭＡＰ２７１４）、ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｃｏｃｋｔａｉｌ−１（ＳＩＧＭＡＰ２８５０）、ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｃｏｃｋｔａｉｌ−２（ＳＩＧＭＡＰ５７２６））を２００μＬ添加し、セルスクレイパーで細胞溶解液を回収した。回収した細胞溶解液は、２３Ｇの針付シリンジを３回通すことにより良くホモジナイズし、その後３０分間氷上に放置した。１５０００ｒ／ｍｉｎで１５分間、４℃で遠心した後、その上清蛋白を以下の測定に用いた。

上清蛋白質の濃度を測定後、サンプル間の蛋白濃度を一定に調整した。その四分の一量のＳＤＳバッファー（２５０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ、１２．５質量％ＳＤＳ、２０質量％グリセリン）を加えた後、更に２−メルカプトエタノール及びブロモフェノールブルーを加え、９５℃で熱変性、４℃で急冷し、電気泳動用のサンプルを調製した。

上記泳動用サンプルを、一定量（約２０〜４０μｇ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％ゲル）に供し、膜へ転写後、ａｎｔｉ−ｐｈｏｓｐｈｏ−ＡＭＰＫα（Ｔｈｒ７２）抗体（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇ社製）又はａｎｔｉ−ｐｈｏｓｐｈｏ−ＡＭＰＫβ（Ｓｅｒ１０８）抗体ｇｎａｌｉｎｇ社製）を一次抗体、ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ−ＨＲＰ抗体（アマシャム社（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇ社製）を一次抗体、ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ−ＨＲＰ抗体（アマシャム社製）を二次抗体、ｐｈｏｔｏｔｏｐｅ−ＨＲＰＷｅｓｔｅｒｎＤｅｔｅｃｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇ社製）を検出試薬として用いて、ｐｈｏｓｐｈｏ−ＡＭＰＫαおよびｐｈｏｓｐｈｏ−ＡＭＰＫβを検出した。ＡＭＰＫ活性化の度合いは、検出されたバンドの強度を画像解析（ＥＤＡＳ２９０画像解析システム：ＫＯＤＡＫ）により数値（ピクセル）化し、コントロール（サンプル無添加群）を１００とし、それに対する相対値として示した。

表１からヌートカトンは、筋細胞において強いＡＭＰＫ活性化作用を有することがわかる。

実施例２ヌートカトンの効果
ヌートカトンの抗肥満・抗糖尿病・抗生活習慣病効果を下記のように評価した。
７週齢のＣ５７ＢＬ／６系雄性マウスを各群１０匹ずつ３群に分け、表２記載の組成の各食餌で飼育した。

２２週後体重を測定するとともに、エーテル麻酔下で非絶食条件下、採血を行い血清グルコース、コレステロール、トリグリセリド、インスリン、レプチン値を測定した。また、内臓脂肪量（副睾丸脂肪、後腹膜脂肪および腎周囲脂肪）を測定した。結果を表３に示す。

第２群では第１群に比し、顕著な体重の上昇及び内臓脂肪量増加が認められたのに対して、第３群では第２群に比し、体重増加量及び全内臓脂肪量は顕著に低下した。すなわち、本発明のヌートカトンは優れた抗肥満効果を有していることが明らかとなった。血液分析の結果を表４に示す。

第２群では第１群に比較し、顕著な血糖値（グルコース）の上昇が認められたのに対して、第３群においては第１群に対しての血糖値上昇は認められず、また第２群に対しても血糖値は低値を示した。本発明のヌートカトンは、血糖値上昇抑制効果に優れ、糖尿病の抑制に有効であると考えられた。

第２群では第１群に比較し、顕著なコレステロール値の上昇が認められたのに対して、第３群においては第１群に対してのコレステロール値の上昇は少なく、また第２群に対してコレステロール値は低値を示した。本発明のヌートカトンは、血中コレステロール値上昇抑制に優れ、動脈硬化の抑制に有効であると考えられた。

第２群では第１群に比較し、顕著なトリグリセリド値の上昇が認められたのに対して、第３群においては第１群に対してのトリグリセリド値の上昇は少なく、また第２群に対してトリグリセリド値は低値を示した。本発明のヌートカトンは、血中トリグリセリド値上昇抑制に優れ、高脂血症の抑制に有効であると考えられた。

第２群では第１群に比較し、顕著なインスリン値の上昇が認められたのに対して、第３群においては第１群に対してのインスリン値の上昇は少なく、また第２群に対してインスリン値は低値を示した。本発明のヌートカトンは、血中インスリン値上昇抑制に優れ、高インスリン血症の抑制に有効であると考えられた。また、本結果は、ヌートカトンがインスリン抵抗性を伴う２型糖尿病の発症を抑制していることを示している。

第２群では第１群に比較し、顕著なレプチン値の上昇が認められたのに対して、第３群においては第１群に対してのレプチン値の上昇は少なく、また第２群に対してレプチン値は低値を示した。本発明のヌートカトンは、血中レプチン値上昇抑制に優れ、高レプチン血症の抑制に有効であると考えられた。

実施例３脂質代謝活性化効果
７週齢のＢａｌｂ／ｃ系雄性マウスを２群に分け、生理食塩水（コントロール）または２００ｍｇ／ｋｇ体重となるようヌートカトンを１０日間、連続して経口投与した。その後、肝臓及び骨格筋（腓腹筋＋ひらめ筋）を採取した。肝臓及び骨格筋はそれぞれ緩衝液（250 mM sucrose,1 mM EDTA in10 mM HEPES (pH 7.2)）中でホモジナイズし、不溶性の組織残渣を遠心分離し上清を得た。得られた上清について蛋白量の測定を行い、各サンプル間の蛋白量を一定に合わせ、脂質代謝活性（β酸化活性）の測定に用いた。１００μｇの上清タンパク質を、終容量２００μＬの緩衝液（50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 40 mM NaCl, 2 mM KCl, 2 mM MgCl_2,1 mM DTT, 5 mM ATP, 0.2 mM L-carnitine, 0.2 mM NAD, 0.06 mM FAD, 0.12 mM CoA, 3 mM α-cyclodextrin）中、０．１μＣｉ［¹⁴Ｃ］−パルミチン酸と３７℃で２０分間反応させた。２００μＬの０．６Ｎｐｅｒｃｈｌｏｒｉｃａｃｉｄで反応を停止後、１ｍＬのヘキサンで３回、未反応の［¹⁴Ｃ］−パルミチン酸を除去し、水層の放射活性を測定することにより、脂質分解活性を評価した。
測定結果を表５に示す。コントロールの脂質分解活性を１００とし、その相対値で表示した。ヌートカトンを摂取することにより、肝臓及び骨格筋の脂質分解活性（β酸化活性）が顕著に増加した。したがって、ヌートカトンは脂質代謝の活性化に有効であることが明らかとなった。また、ＡＭＰＫ活性化作用を介して前記運動不足が原因の一つとなっている種々の症状を改善することから、運動と類似の効果をもたらす運動代替剤、特に肥満、体脂肪蓄積、糖尿病、脂肪肝、生活習慣病などの予防改善を目的とする運動代替剤として有用であることが明らかとなった。

実施例４製剤例
下記（１）〜（７）の各種製剤を製造した。
（１）生活習慣病予防・改善用カプセル剤
カプセル化剤中に下記組成物（３００ｍｇ）を封入した。

（２）生活習慣病予防・改善用錠剤
下記組成物（１錠＝２５０ｍｇ）を打錠し、錠剤を製造した。

（３）生活習慣病予防・改善用顆粒剤
下記組成物（１袋＝５００ｍｇ）を混合し顆粒剤を製造した。

（４）肥満、生活習慣病予防・改善用飲料
下記組成物を混合し、果汁飲料を製造した。

（５）肥満、生活習慣病予防・改善用飲料
下記組成物を混合し、果汁飲料を製造した。

（６）肥満、生活習慣病予防・改善用飲料
下記組成物を混合し、茶飲料を製造した。

（７）肥満、生活習慣病予防・改善用飲料
下記組成物を混合し、スポーツタイプ飲料を製造した。

（８）運動代替機能性飲料
下記組成の炭酸飲料を製造した。

（９）運動代替機能性飲料
下記組成の炭酸飲料を製造した。

（１０）運動代替機能性食品
下記組成物（１錠＝１０００ｍｇ）を打錠し、チュアブルタイプのタブレット食品を製造した。

（１１）運動代替機能性飲料
下記組成の炭酸飲料を製造した。

（１２）肥満、生活習慣病予防・改善用飲料
下記組成物を混合し、飲料を製造した。

（１３）肥満、生活習慣病予防・改善用飲料
下記組成物を混合し、果汁飲料を製造した。

（１４）生活習慣病予防・改善用錠剤
下記組成物（１錠＝２５０ｍｇ）を打錠し、錠剤を製造した。

Claims

ヌートカトンを有効成分とするＡＭＰＫ活性化剤。
ヌートカトンを有効成分とする脂質代謝活性化剤。
ヌートカトンを有効成分とする肥満抑制剤。
ヌートカトンを有効成分とする糖尿病抑制剤。
ヌートカトンを有効成分とする動脈硬化抑制剤。
ヌートカトンを有効成分とする高脂血症抑制剤。
ヌートカトンを有効成分とする運動代替剤。