JP4729660B2 - ブドウ種子を原材料としたポリフェノールの製造方法 - Google Patents

Description

本発明は易水溶性に転換されたプロアントシアニジンを含むポリフェノールを得るためのブドウ種子を原材料としたポリフェノールの製造方法に関するものである。

植物体に含まれるポリフェノールは抗酸化作用を有するため従来から多くの食品、医薬品あるいは化粧品に用いられている。特に抗酸化作用が強いポリフェノールの一種としてプロアントシアニジンが挙げられる。特許文献１に示すようにプロアントシアニジンはブドウ、リンゴ、カキ、マツ等の植物体に多く含まれるポリフェノールであって、特に抗酸化作用が強いことから例えば特許文献１の段落番号００３１〜００３４に示す如く多くの用途に用いられている。
特開２００１−１５８７３９号公報

ところで、プロアントシアニジンは一般に自然界に存在する形態では水に難溶の状態であることが多い。例えば上記ブドウの果実では皮、果肉、種にそれぞれプロアントシアニジンが含まれているものの、いずれも難水溶性である。そのため、プロアントシアニジンの利用範囲は比較的限定される傾向にあった。例えば、化粧品として利用する場合においてこれをクリームに含有させることはできても、アルコール無添加の化粧水には含有させられなかった。また、経口で利用される場合（食品等）でも一般に難水溶性プロアントシアニジンは吸収されにくいので使用は避けられ抗酸化作用は劣るものの他の易水溶性のポリフェノールが使用されることが多い。従って、実際に食品等の含有成分としてプロアントシアニジンが挙げられていてもそれが難水溶性プロアントシアニジンである限り抗酸化作用が十分発揮されていないのが現実であった。一部の植物体では易水溶性プロアントシアニジンを成分として含むものもあるが、大量の易水溶性プロアントシアニジンを安定供給できるものではなく、そのための工業的技術が望まれていた。
本発明は、このような従来の技術に存在する問題点に着目してなされたものである。その目的は、易水溶性のプロアントシアニジンを含むポリフェノールをブドウの種子から工業的に生産することできるポリフェノールの製造方法を提供することにある。

上記課題を解決するために請求項１の発明では、果汁除去後のブドウの種子を同ブドウ種子単独で、あるいは種皮とともに乾燥させる乾燥工程と、同乾燥工程において乾燥させた同ブドウ種子を、５０〜７０℃で加熱するようにした加熱工程と、同加熱工程と同時、あるいは同加熱工程に続いて同ブドウ種子に含水させる含水工程と、同加熱工程において加熱するとともに、同含水工程において含水させた同ブドウ種子を発芽に最適な温度領域で発芽あるいは発芽分化させる発芽誘導工程とを備え、同発芽誘導工程を経た後のブドウ種子から易水溶性に転換されたプロアントシアニジンを含むポリフェノールを抽出するようにしたことをその要旨とする。
また請求項２の発明では請求項１の発明の構成に加え、前記乾燥工程における乾燥度の指標を前記ブドウ種子の含水率とし、その含水率の目標値を９〜１２％としたことをその要旨とする。
また請求項３の発明では、請求項１又は２の発明の構成に加え、前記含水工程における含水量の指標を前記ブドウ種子の含水率とし、その含水率の目標値を１７％以上としたことをその要旨とする。

上記のような構成とすることでブドウ種子を発芽させ、あるいは発芽分化させることができ、そのようなブドウ種子を使用して易水溶性に転換されたプロアントシアニジンを含むポリフェノールを抽出することが可能となる。
通常、ブドウ種子に含有されるプロアントシアニジンは難水溶性である。従って、これを易水溶性のプロアントシアニジンとする必要がある。そのために発明者はまず、果汁除去後のブドウの種子を同ブドウ種子単独で、あるいは種皮とともに乾燥させるようにしている。乾燥させることでブドウ種子中の含水率を低下させ、ブドウ種子を一種の休眠状態に導く。

乾燥の意義についてより詳しく植物生理学的に説明する。乾燥工程は果汁を除去し内部の種子を外気に曝露させ自然にあるいは強制的に乾燥させることで、ブドウ種子中のデンプンの蓄積型デンプンへの分化及び発芽関連物質の分化を図るものである。乾燥は種子の自由水の体外への排出だけでなく同時に乾燥という外的刺激による種子自身のこれら物質の分化による結合水の体外への排出も促進する。例えば完熟したブドウ果実から直接取り出した種子を発芽に最適な温度領域で播種しても発芽率は極めて低い（ブドウでは通常２〜３％程度）。これは発芽させるための生理的条件が十分で整っていなかったことによる。一方、乾燥工程を経ることによって種子は発芽の必要条件を備えることとなる。但し、ブドウの特性としてこのような休眠状態を経たとしても休眠状態を経たある種の植物のように発芽率が極端に向上するわけではない。しかし、少なくとも乾燥工程を経なければ発芽率を向上させることは困難である。
乾燥が進むと同時にブドウ種子は一種の休眠状態に移行する。本発明ではブドウ種子はこのように休眠状態あるいは休眠状態に近い状態（理論的には蓄積型デンプンへの分化及び発芽関連物質の分化がなされていればよい）にあればよく。そのような状態にあるかどうかは含水率を指標とすることができる。本発明の趣旨からして乾燥によって目標とされる好ましい含水率は９〜１２％であり、より好ましいのは９〜１１％である。ブドウ果実中の種子の含水率はブドウの種類によらず１４％程度が一般的である。ブドウ種子は生理活性がある限り（つまり生きている限り）発芽分化をしなければこの１４％の含水率以上に含水することはない。

また、乾燥工程は短時間に行うよりはブドウ種子の分化のための時間が必要であるため、日数をかけてゆっくり乾燥させることが発芽率向上の観点から好ましい（数週間〜数ヶ月）。
種子を自然に乾燥させる手段としては、例えばジュース用あるいは白ワインを醸造するために搾汁した後のかす（いわゆるジュースポマス）や赤ワインの醸造過程で出るかす（いわゆるワインポマス）を流用することが可能である。これらかすを一定期間野積みして乾燥させたものを原材料とすれば上記のようにゆっくりした乾燥にもなるので好ましく低コスト化を図ることもできる。また、野積みによって種皮を腐らせ、後述する洗浄工程で種と皮を離れやすくするという効果も期待できる。強制的に乾燥させる乾燥手段としては例えば大型扇風機やヒータによるものが想定できるが、この場合でも乾燥後直ちに次工程に移行するよりも上記のように数週間〜数ヶ月静置するほうが発芽率が向上する。

また、発明者はこのような乾燥工程を経た後、ブドウ種子を発芽に最適な温度よりも高い温度領域であって同ブドウ種子内のタンパク質成分が加熱変成しない加熱条件で加熱させるようにしている。
乾燥によって休眠したブドウ種子を強く加熱することで発芽率を飛躍的に向上させることを企図している。この段階でブドウ種子は種皮を除去することが好ましいが、種皮が残った状態でも構わない。
ここで「加熱する温度はブドウ種子を発芽に最適な温度」とは若干の誤差もあるが２０〜４５℃、より好ましい領域は２３〜４０℃の範囲と考えられている。そして、「ブドウ種子内のタンパク質が加熱変成しない加熱条件よりも高い温度領域」とは必ずしも極端に高い温度を排除する意味ではない。ブドウ種子は種皮で保護されているため、熱は直接的には内部に伝わらない。そのため、短時間であればタンパク質が変性するような高温（例えば６５〜７０℃程度）で処理することも可能であることを意味する。逆に比較的低い温度（例えば５０℃程度）であれば長時間加熱することになる。場合によっては蒸気釜等で１００℃以上の加熱を行うことも可能である。温度と加熱時間は反比例する。但し、この加熱は乾燥工程や次工程の発芽誘導工程と比較するとごく短時間で終了する工程である。言い換えれば短時間に急激に加熱する工程でもある。

このような加熱工程は休眠中のブドウ種子に強い外的刺激を与えて発芽を促進する効果がある。ブドウ種子は休眠状態から発芽分化状態に移行する。
ここに発明者は加熱工程と同時、あるいは同加熱工程に続いて同ブドウ種子に含水させるようにしている。加熱によってブドウ種子は休眠状態から発芽分化状態に移行し、発芽分化の開始に伴ってブドウ種子は大量に水分を吸収することとなるからである。もちろん、ここで次工程の発芽誘導工程において継続的に含水させることを排除するものではない。
発芽分化によって上昇する含水率は少なくとも１７％以上であることが好ましい。つまり、逆に言えば１７％以上の含水率が検証されることでブドウ種子は休眠状態から発芽分化状態に移行したかどうかをチェックすることが可能である。この場合、種子が発芽分化していなければ水に浸漬しても前記１４％の含水率以上に含水することはない。尚、加熱工程以降においては、発芽促進ホルモンを添加することは可能である。

次いで、発明者は十分含水させたブドウ種子を発芽に最適な温度領域で養生させ発芽誘導するようにしている。これによってブドウ種子の発芽、あるいは発芽分化が促進される。本発明では上記各工程を経ているため従来に比べ格段に発芽率の向上が認められる。条件がよければ９５％以上の発芽率が認められる。植物生理的にはこの発芽分化の活性作用によってブドウ種子内のポリフェノールの変成を検証した。ブドウ種子中のポリフェノールは現在３０種類ほどが同定されているが、本発明では特にプロアントシアニジンの変性に着目した。ブドウ種子の発芽分化に伴ってプロアントシアニジンに糖が配糖することで極性が発現し、プロアントシアニジンが難水溶性から易水溶性に変性することが認められる。

以下、本発明のブドウ種子を原材料としたポリフェノールの製造方法について説明する。
（製造手段について）
まず、ブドウ種子から易水溶性に変性したポリフェノールを工業的に抽出する手段についてその一例を説明する。尚、各工程において使用される機器は一例であって各工程における処理が実行できれば下記機器に限定されるものではない。
最も大量入手が容易な原材料としてはワインポマス及びジュースポマスである。これら原材料は搾汁後に所定期間乾燥しやすい条件で放置し、含水率を下げたものを使用する。尚、これらの原材料は通常の何も処理を行わない条件下では極めて発芽率が悪く、特にワインポマスではジュースポマス以上に発芽率が悪く、これはエチルアルコールによる発芽抑制作用によると考えられている。
（選別・洗浄工程）
この工程で単独の洗浄されたブドウ種子を得ることを目的とする。
パンチングメタルを備えた選別装置によってブドウ種子と皮とを選別し、更に分別されたブドウ種子を洗浄機で攪拌してよく汚れを落とす。
（加熱工程）
上記選別・洗浄工程で得られたブドウ種子を煮沸釜に投入。所定の温度と時間で加熱する。これによってブドウ種子は休眠状態から脱する。
（発芽誘導工程）
上記加熱工程で加熱されたブドウ種子を取り出し、所定の発芽好適温度に保持された養生釜にて発芽誘導する。養生釜内においてブドウ種子は発芽分化を始め、含水率が急激に上がる。
（抽出工程）
上記工程で発芽、あるいは発芽分化が進行したブドウ種子を破砕装置に投入し、破砕して水と混合させて乳化状態とする。この段階で食塩や硫安等の塩を加え、タンパク質の沈殿（塩析）と非水溶性物質の溶解（塩溶）を図るようにしてもよい。
（濾過工程）
沈殿層は更に有機溶媒（エチルアルコール等）によって他の成分の抽出を行う。水溶部については公知の脱塩処理を施した後、減圧装置によって水分を蒸発させて濃縮状態で易水溶性に転換されたプロアントシアニジンを含むポリフェノールを得る。残渣からは更に有機溶剤によって難水溶性成分を抽出する。

本発明に従って易水溶性ポリフェノールが得られることをシミュレーションした結果を実施例として以下に説明する。
（実施例１）
１）シミュレーション条件
６ヶ月間野積みにしたジュースポマス由来のブドウ種子（リースリング種：含水率９．５〜１１．０）から選別したものを２５ｇ使用した。流水で洗浄後した後５０℃の１００ｐｐｍアンチホルミン溶液（アンチホルミンは殺菌剤）に浸漬し、1時間保温した。1時間後、溶液から種子を取り出し、４０℃の１００ｐｐｍアンチホルミン溶液に浸漬し、４時間時間保温した。さらに種子を取り出し、蒸留水で洗浄後、柔らかい紙で水を取り除いた。これに１０ｐｐｍアンチホルミン溶液を含んだスポンジに播種し、２４℃で放置した。２４℃はブドウ種子では最適な発芽温度であるが、堅い種子の吸水を促進させるためにこの最適温度の前に４０℃のような若干高い温度帯に置く発芽準備期間を設けた。種子が乾燥しないように１２時間おきに１０ｐｐｍアンチホルミン溶液を灌水した。
２）発芽種子の抽出
２４時間（１日）、４８時間（２日）、９６時間（４日）、１６８時間（７日）のそれぞれのタイミングで種子１００粒（４，１２ｇ）を選別し、１０ｍｌの緩衝液（蒸留水）を加え、乳鉢、乳棒で破砕した。これを１００００×ｇで１５分間、遠心分離し、その上清を試料とした。
３）易水溶性ポリフェノールの測定
上記試料について分光光度計にて２２０ｎｍ、２８０ｎｍ、５５０ｎｍの各波長における吸光度を測定した。５５０ｎｍについては０．１％塩化鉄（III）０，５ｍｌを試料液４ｍｌに加え試料を着色して測定した。波長２２０ｎｍではアミノ酸、タンパク質に特異的に吸光が見られ、波長２８０ｎｍではベンゼン環を有する物質に特異的に吸光が見られ、波長５５０ｎｍではフェノールを有する物質に特異的に吸光が見られるものである。ポリフェノールであれば波長２８０ｎｍと波長５５０ｎｍの両方で吸光が見られる。
また、フェノール試薬を用いて、没食子酸を標準としてポリフェノール量を滴定した。 また、上記試料はジュースポマスの異なる部位から複数採取したブドウ種子を原材料としたものであって、同様に得られた試料を使用してトータルで１０回の測定を行った平均値とした。その結果を表１に示す。
また、試料中のポリフェノールの存在の確認は公知のフォーリン・チオカルト法によって行った。配糖体の存在の確認は公知のフェノール・硫酸法によって行った。

４）結果
波長２２０ｎｍの吸光度は１日目を最大にその後、若干の増減を繰り返しほぼ横這いに推移している。つまりアミノ酸、タンパク質の増大は確認できなかった。一方、波長２８０ｎｍの吸光度は日を追う毎に大きく増大している。つまり、ベンゼン環を有する物質が増えていることが伺える。これはポリフェノールであると予想されるが、その他の主要成分であるタンパク質やアミノ酸が増えている可能性も残る。そのため、波長５５０ｎｍの吸光度も測定した。すると、波長５５０ｎｍでも大幅な増大が確認できた。これらの結果から増大した物質はポリフェノールと判断した（波長２８０ｎｍと波長５５０ｎｍの両方で吸光を示すアミノ酸もあるが一般的ではなく、量から判断してもその可能性はない）。
また、薄層クロマトグラフを使用して確認したところポリフェノールと糖を含む物質について明確な反応が得られた。つまり試料中に比較的多量に配糖体ポリフェノール（水溶性）が存在することが確認された。ブドウ種子中でもっとも特異的で割合の高いポリフェノールがプロアントシアニジンであることからこの配糖体ポリフェノールはプロアントシアニジンの配糖体を多く含むことが予想される。

（比較例１）
１）シミュレーション条件
６ヶ月間野積みにしたジュースポマス由来のブドウ種子（リースリング種：含水率９．５〜１１．０）から選別したものを２５ｇ使用した。流水で洗浄後したものから１００粒（４，１２ｇ）を選別し、１０ｍｌの緩衝液（蒸留水）を加え、乳鉢、乳棒で破砕した。これを１００００×ｇで１５分間、遠心分離し、その上清を試料とした。比較例１のブドウ種子では特に発芽のための処理はせず、そのまま洗浄後のものを使用した。
２）易水溶性ポリフェノールの測定
上記実施例１と同様分光光度計にて２２０ｎｍ、２８０ｎｍ、５５０ｎｍの各波長における吸光度を測定した。
また、フェノール試薬を用いて、没食子酸を標準としてポリフェノール量を滴定した。 実施例１と同様異なる部位の原材料を使用してトータルで１０回の測定を行った平均値とした。その結果を表２に示す。
３）結果
比較例１では実施例１の一日経過したブドウ種子と比較して約半分のポリフェノール量であった。このポリフェノールは元来水溶性であり、実施例１のように増加することはない。
また、薄層クロマトグラフを使用して確認したところポリフェノールと糖の両方を含む物質についての反応はわずかしか得られなかった。これは、発芽分化に伴う配糖体ポリフェノールの合成がないからである。つまり試料中にポリフェノール（水溶性）が存在することは確認されるものの、その存在形態はほとんどが配糖体ポリフェノールではないことが確認された。これはおそらく比較的低分子のポリフェノールであると考えられる。

（比較例２）
（実施例１）
１）シミュレーション条件
実施例１で使用した試料の残渣を濾過し、水分を除去したものを１０ｍｌの緩衝液（９５％エチルアルコール）を加え、加温状態で８時間攪拌した。これを１００００×ｇで１５分間、遠心分離し、その上清を試料とした。
２）易水溶性ポリフェノールの測定
上記実施例１と同様分光光度計にて２２０ｎｍ、２８０ｎｍ、５５０ｎｍの各波長における吸光度を測定した。
また、フェノール試薬を用いて、没食子酸を標準としてポリフェノール量を滴定した。 実施例１と同様トータルで１０回の測定を行った平均値とした。その結果を表３に示す。
３）結果
比較例３では難水溶性のポリフェノールが抽出されることとなる。１日目のポリフェノール量は多い。しかし、日を追う毎に減少していくことが確認された。この現象は難水溶性のポリフェノールが配糖して易水溶性の配糖体ポリフェノールに変化したものと考えることができる。

Claims (3)

1. 果汁除去後のブドウの種子を同ブドウ種子単独で、あるいは種皮とともに乾燥させる乾燥工程と、
   同乾燥工程において乾燥させた同ブドウ種子を、５０〜７０℃で加熱するようにした加熱工程と、
   同加熱工程と同時、あるいは同加熱工程に続いて同ブドウ種子に含水させる含水工程と、
   同加熱工程において加熱するとともに、同含水工程において含水させた同ブドウ種子を発芽に最適な温度領域で発芽あるいは発芽分化させる発芽誘導工程とを備え、
   同発芽誘導工程を経た後のブドウ種子から易水溶性に転換されたプロアントシアニジンを含むポリフェノールを抽出するようにしたことを特徴とするブドウ種子を原材料としたポリフェノールの製造方法。
2. 前記乾燥工程における乾燥度の指標を前記ブドウ種子の含水率とし、その含水率の目標値を９〜１２％としたことを特徴とする請求項１に記載のブドウ種子を原材料としたポリフ
   ェノールの製造方法。
3. 前記含水工程における含水量の指標を前記ブドウ種子の含水率とし、その含水率の目標値を１７％以上としたことを特徴とする請求項１又は２に記載のブドウ種子を原材料としたポリフェノールの製造方法。