JP4700807B2 - 製造方法およびその方法によって製造される物品 - Google Patents
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Description
技術の分野:
本発明は、細胞培養物、支持体上で行われる合成反応、およびこれらの分野に関係する分野における、各種の液体から基質を濃縮するための各種の吸着法において支持体として使用することができる媒体の製造に関する。
【0002】
媒体の用語は、孔の体積を加えたマトリックスを指す。
液体クロマトグラフィーの固定相は、マトリックスから構成され、そしてほとんどはベッド(bed)へ充填された多孔質または非多孔質の粒子の形態であるか、または多孔質の一体物(monolith)の形態である。マトリックスは、例えば小さい直径の粒子を充填したカラムで分離を行う場合、圧縮または破砕されることなく高い流速が可能なように充分に強固でなければならない。マトリックスはさらに化学的および物理的に不活性で、そして極端なpHの条件に耐えなければならない。
【0003】
逆相クロマトグラフィー(RPC)、特にペプチドおよびタンパク質の分離において、シリカゲルは長い間好ましい固定相であった。このようなマトリックスは強固であって、高い流量に充分耐える。しかしながら、シリカゲルは、8.0より高いpHでは安定ではない。近年になって、逆相高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)に使用するための合成ポリマー物質に関して、特にモノ−、ジ−等のビニル化合物の重合に基づいた樹脂、とりわけスチレンおよびジビニルベンゼン間の共重合体のようなポリビニル炭化水素が強調されつつ、興味が増大してきている。これらの媒体は、1〜14の範囲のpHを有する溶出剤にしばしば安定であり、そして優れた分離をしばしば与える。膨潤の量は、架橋剤のモノマーに対する比率およびこれらが接触する液体によって広範囲に変化する。これらは通常、(架橋剤のモノマーに対する比率によるが)ある程度の遊離の未反応の残余のビニル基を含み、そして通常HPLCで適用される圧力では圧縮されない。
【0004】
架橋重合体/共重合体を得るためのビニル化合物の重合は、第1工程で直鎖非架橋ポリマーを得て、そして次いで第2工程で温度を上げて架橋を起こさせる(硬化)ことにより段階的に行ってもよい。これら2つの工程の間では、しばしば何も除去されず、または何も加えられないが、このことは、かなりの量の開始剤と未反応のビニル基を持つモノマーまたはオリゴマーとが工程1から残存し、そして第2工程で使用されることを意味する。第1工程からの重合体は、軟らかくそして加熱によって成型可能であることによって特徴付けられる。第2工程はしばしば硬化と呼ばれ、そしてこのようにして架橋された共重合物が得られる。硬化の概念は、重合反応でしばしば使用され、例えばUS4,977,222;EP286071(工程e);WPI受入番号JP81−82583D(=JP56122814)およびWPI受入番号81−75832D(DD149672)を参照されたい。
【0005】
WPI受入番号91−257239(=JP03168204)は、porogens、モノマー、開始剤等が加熱工程で除去される架橋産物について記載している。
重合したビニル化合物を基礎とする従来技術のマトリックスに伴なう技術的問題
媒体の剛性は、カラムの充填中および分離中における、高圧に耐える能力に関して、鍵となる問題である。粒子の形態の媒体の充填は、物質の懸濁物を数百バールの圧力でカラムに注入することにより行われる。高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)中のカラムをわたる圧力降下は、200〜400バールのように高いことがありえる。
【0006】
これらの必要性を満足するために、高度に架橋したマトリックスが必要である。さらに、粒子中のポリマーマトリックスのパーセントは低すぎてはならない。不幸にして、媒体中のマトリックスのパーセントが高ければ、媒体は有機溶剤中でさらに膨潤する。
【0007】
ビニル化合物を基礎とする媒体の有機溶媒の存在中で膨潤する能力は、高圧を使用するクロマトグラフィーのような固定相を通しての流れが必要な用途における固定相として使用される場合、主な不利益の一つである。これは溶媒の変更を必要とする方法、例えば逆相クロマトグラフィー(RPC)のような溶媒グラディエントを使用する場合においては、特に問題となる。
【0008】
本発明の目的
第一の目的は、上記の欠点に関して改良された媒体を製造する方法を提供することである。
【0009】
第二の目的は、これらの欠点が減少された媒体を提供することである。
本発明
媒体の成分を変更せずに、ビニル基礎媒体の膨潤を減少する方法が見出された。したがって、本発明の一つの態様は、本発明の技術分野中の支持体として使用するための、好ましくは有機溶媒との接触を必要とし、所望により液体の圧力を受ける方法において使用するための、媒体を製造する方法である。出発媒体はビニル化合物の架橋重合体であり、好ましくはモノビニル化合物と2つ以上の(好ましくは2つ)のビニル基を有する化合物との間の共重合体であり、これにより共重合体(媒体)は残余のビニル基を有することとなる。これは、本発明の方法で使用される共重合体は、重合反応後には本質的にすべての残余のモノマーおよび/または残存する開始剤が、および/または重合中に存在する場合にはポロゲンが除去されてしまっていなければならないという意味で、既製のもの(ready-made)であることを意味する。本方法を特徴である構成は、媒体(支持体)が加熱工程に供されることであり、好ましくはこのことは、酸素の限定接触で行われる。
【0010】
加熱工程中の温度は、膨潤度が減少するようなものでなければならない。実際の温度は、ポリマーおよび加熱時間によって変えることができる。長時間の加熱は,例えばより低い温度を補うことができる。媒体の望ましい特性に有害である分解が開始するほど加熱しないことが重要である。したがって加熱温度および時間は炭化が起こらないようなものでなければならない。通常温度は500℃より低く、かつ75℃より高い。代表的な範囲は120〜350℃であり、多くの場合180〜300℃の範囲が好ましい。この原則は特にスチレン−ジビニルベンゼンのような不飽和炭化水素(ビニル炭化水素)を基礎とするマトリックスに適用される。
【0011】
酸素の限定接触(reduced access of oxygen)は、加熱工程を減圧下または不活性ガス、例えばアルゴンもしくは窒素下で行うことができることを意味している。主要な点は、酸素の圧力が、常圧の空気中の酸素の分圧と比較して減少していることである。この用語はさらに、マトリックスが液体、例えば炭化水素液体によって囲まれることによって大気との接触から保護されていることをも意図している。炭化水素液体のような不活性液体中に、例えば粒子であれば懸濁することができ、一体物性のマトリックスであれば浸漬することができる。不活性液体と、液体上に不活性(例えばアルゴンまたは窒素)雰囲気を適用することとを組み合わせることは、しばしば利益のあることである。
【0012】
熱処理のための上記の条件によって、マトリックスが充填ベッド中で減少した背圧を示す結果となることが見出された。
さらに、熱処理中の酸化を防ぐことが困難であること、そしてマトリックスがクロマトグラフィーに使用される場合、形成された酸化された基が性能に否定的な影響を有することが見出された。したがって、熱処理中に形成された酸化された基を還元させる条件下でマトリックスを後処理することが有利であることが見出された。例示的な還元剤は、例えばアルデヒドおよびケトン中にあるようなカルボニル基を、アルコール基または炭化水素に還元するものである。特に、水素化ホウ素ナトリウムおよび水素化アルミニウムリチウムに言及することができる。他の場合に使用されていると同様の条件が、これら代表的な還元剤に適用される。
【0013】
ビニル化合物は、ビニル炭化水素(ビニルアリールおよびアルケン)、ビニルエーテル、アクリレートおよびメタクリレート、アクリルアミドおよびメタクリルアミド等の中にあるような、重合可能な炭素−炭素二重結合を有する化合物である。ビニル化合物の用語は、モノ−、ジ−、トリ−等のビニル化合物を包含する。ビニル化合物の特に好ましい基はビニル炭化水素、とりわけビニルアリールの形態(例えばスチレンおよびジビニルベンゼン)の、各種の異性体および置換された形態である。ビニル炭化水素の他の例は、ブテンおよび1,3−ブタジエンである。ビニル化合物は、C1-26、特に強調すればC1-16アルキル基、および意図する共重合反応に親和性の官能基のような各種の置換体を含んでいてもよい。これは典型的には各種ビニルベンゼンの場合である。ビニル化合物の、特にスチレンおよびジビニルベンゼン間の共重合体は、本発明の分野で商業的に入手可能な支持体として、非常に長い時間使用されてきた。
【0014】
本発明に使用される媒体の一般的な特性は、これが、有機溶媒(例えばメタノール、アセトニトリル、テトラヒドロフランおよび液体クロマトグラフィーで使用される他の有機溶媒)との接触で膨潤することである。膨潤は、例えば水から既述の有機溶媒のいずれかに変更した場合の、充填ベッドの体積の差を測定することによって検討することができる。この欠点の最小化するとの要求が常に存在するため、本発明は、主として、ごく微小の膨潤を示す媒体に対してすら利益を提供する。この後者については、本発明が、水から上記の溶媒のいずれかに変更した場合に、0.5%(体積)より大きい高い膨潤度(充填ベッドまたは一体物ベッドの体積として測定)を有するすべての媒体に対して、利点を提供することができるという事実によって説明してよい。膨潤の減少は、有機液体中の、マトリックスが本発明によって加熱される前および後のマトリックスを含むベッドをわたって見られる圧力降下の低下によってよりよく示される(充填圧力、適用した流量等は、比較のためすべて同一である)。
【0015】
重合体中の残存ビニル基の数は、典型的には熱処理が始まる前は0.1〜5mmol/gの範囲であるべきであり、そして典型的には熱処理中に1〜50%減少するものである(臭素化により測定)。減少は、適用した特定の条件および方法によって異なる場合がある。例えば、減圧での処理により、液体中の処理より減少を少なくすることができる。
【0016】
マトリックスは、多孔質の一体物の形態または多孔質もしくは非多孔質の粒子の形態とすることができる。孔度(間隙率、porosity)は、異なった方法:マトリックスg当たりの表面積、マトリックスg当たりの孔容積、および平均孔直径で測定することができる。全表面積は窒素吸着によって測定することができる(BET法)。25オングストロームより大きい直径の孔の容積は、水銀ポロシメトリーによって測定することができ、そしてより小さい孔は、窒素脱着によって測定することができる。
【0017】
ある孔度を有するマトリックスの選択は、主として意図する媒体の用途に依存する。
クロマトグラフィーおよび他の分離目的においては、この選択はクロマトグラフィーの種類、何をクロマトグラフィーに供するのか等に依存する。さらにマトリックスを通して、拡散性物質移動のみを所望するのか、または拡散性および伝達性の物質移動を所望するのかにもよるであろう。そこで拡散性物質移動は、通常1μmより小さいサイズの孔で満足され、そして伝達性物質移動は、主として1μmより大きい孔で行われる(貫通孔(flow through pore))。粒子の形態のマトリックスにおいて、孔サイズおよび粒子直径の比は、貫通孔においては通常0.05〜0.5の範囲でなければならない。したがって孔サイズの直径は、数オングストローム、例えば50オングストロームから非常に大きい値、例えば50μmまでの範囲とすることができる。一般的な条件では、孔の直径が粒子の直径より有意に小さいものが常に適用される。
【0018】
この分野で使用される孔度は、典型的には:50〜1000m2/マトリックスgの範囲の表面積、0.5〜3ml/マトリックスgの範囲の孔容積、そして100〜2000オングストロームで変化してもよい平均孔直径である。
【0019】
多孔質の一体物においては、対応する孔度の範囲はさらに幅広く、例えば孔直径のサイズは50オングストローム〜50μmとすることができる。
細胞培養においては、媒体は多孔質または非多孔質とすることができる。多くの場合、孔が、培養される細胞を収容できるようなサイズおよび形態の場合に利益があるものである。
【0020】
実験の部で証明するように、熱処理は、孔度にいかなる変化も起こす必要はない。
微粒子状マトリックスにおいては、粒子のサイズは通常1〜500μmの範囲である。微粒子マトリックスは、モノサイズ(単分散)またはポリサイズ(多分散)とすることができる。モノサイズのマトリックス、は、典型的にはマトリックス粒子の集団が、集団の粒子の平均直径の±5%以内のサイズの粒子を95%より多く有することを意味する。
【0021】
熱処理後、マトリックスを当技術で公知のように誘導することができる。これは、例えばマトリックスに適当な親水性/疎水性の均衡を設定することにより、および/または、特異的結合基、例えば親和性基、詳細には生体特異的親和基、イオン交換基(カチオンまたはアニオン交換基)、両性基、疎水基、キレート化基、π−π相互作用を可能にする基、および共有結合クロマトグラフィーを可能にする基等の中から選択されるような基を付加することによる。本発明の方法の最大の利益の一つは、有機溶媒と共に使用することができるマトリックスの調製であることから、誘導がほとんどの場合、ある程度の疎水性を保持しなければならないことをしばしば意味する。本発明により得られるマトリックスは、主として有機溶媒を使用するクロマトグラフィー、特に強調して高圧液体クロマトグラフィー(HPLC)に、使用することを意図している。HPLCにおいては、適用される圧力は、しばしば30〜300バール、例えば50〜200バールである。上限が500バールまたはさらに高くなることを予見することができる。一般的な有機溶媒はアセトニトリル、メタノールおよびテトラヒドロフランである。然しながら、これは、マトリックスがさらに水性溶媒と共に、または固相合成、例えばオリゴポリペプチドおよびオリゴヌクレオチド合成の担体/支持体のような、細胞培養の担体/支持体のような、等の完全に他の分野の支持体として使用することができることを除外しない。マトリックスは、さらに支持体が吸着剤として機能する液体からの吸着を含む他の方法に使用してもよい(例えば先に検討した各種の親和性基に基づくバッチ方式の方法)。
【0022】
本発明は、特許請求の範囲においてさらに定義され、そしてこれから実験の部によって例示されるであろう。
実験の部
収縮/膨潤の挙動を減少し、そしてビニルモノマーから作られた合成ポリマーに基づく逆相クロマトグラフィー媒体の剛性を増加する企図において、以下の経路にしたがって作業が進められた:a)基剤粒子の開発、b)他の化学的修飾、そしてc)熱処理。熱処理の別の方法は最も有望な結果を与え、そしてしたがってさらに開発された。下記を参照されたい。
【0023】
検討のモデル物質として使用した媒体は、ジビニル−ベンゼン(80%)およびエチルビニルベンゼン(20%)の共重合体の粒子であった。媒体を、Ugelstad(US−A−4,336,173;US4,336,173およびUS−A−4,459,378)によって概略記載されているように調製し、そしてモノサイズの5μmまたは15μmの多孔性粒子の形態で得た。5μmの粒子の孔特性は:1.67mmol/gのビニル基において、表面積634m2/g、孔容積:1.25ml/gであった。さらに使用する前に、種粒子、プロゲンおよび残っている可能性のあるモノマーおよび開始剤を除去するために、粒子を有機溶媒で充分に抽出した。
【0024】
熱処理(方法 1 ): 基剤粒子を濾過し、そしてインキュベーター中で50℃で一晩乾燥した。乾燥した粒子(10gの5μm粒子)を、加熱する前に減圧した真空オーブンに入れた。温度が所定の値に達した時に時間を記録した。所定の加熱時間後、加熱を止め、そして試料を真空中で冷却した。温度が50℃より下がった時点で真空ポンプを停止し、そして試料をオーブンから取り出した。条件は、表1に示したように変化させた。
【0025】
熱処理(方法 2 ): 乾燥した粒子(10g、15μm粒子)を、ヘキサデカン(100ml)中に加えた。混合物を200℃で4時間不活性雰囲気(アルゴン)下で加熱した。混合物を50℃に冷却し、濾過し、そしてアセトン(600ml)およびメタノール(600ml)で洗浄した。
【0026】
還元処理: 乾燥した、加熱処理された媒体(240℃で15時間、4g)を、エタノール(35ml)に加え、そして超音波で15分間処理した。次いでスラリーを反応器に移し、そしてエタノール(5ml)を使用して洗浄した。水素化ホウ素ナトリウム(0.025g)を加えた。混合物を室温で30分間撹拌してから、濾過し、そして20%エタノール(200ml)で洗浄した。
【0027】
媒体の背圧( back pressure )試験: 試験は以下の機器を使用して行った:
器機:AKTA XT(Amersham Pharmacia Biotech AB,Uppsala,Sweden)
溶媒A:メタノール
溶媒B:水
流量:1.0ml/分
カラム:4.6×150mm Jour Research 鋼製カラム
充填溶液:100%メタノール
充填圧力:700バール
充填時間:1時間
スラリー濃度:全体積25ml中に沈殿物15ml
充填容器:4.6/250mm
注記: 媒体がメタノールに膨潤しない場合、水およびメタノールの圧力差は、溶液の粘度に対して補正される。水の粘度は20℃で1.00cpであり、そしてメタノールは20℃で0.59cpである。したがって、膨潤しない媒体は、水と比較してメタノールに41%低い圧力を与えるであろう。比較される媒体を同じ圧力で充填することが重要である。
【0028】
【表1】
【0029】
表1は、熱処理前の媒体において、メタノール中のカラムの背圧が水中よりも28%高いことを示している。この背圧の増加は、有機溶剤(メタノール)中の粒子の膨潤によって起こっている。熱処理後、媒体の減少した収縮の挙動によりメタノールの背圧は水よりも10〜20%低い。
【0030】
検討されたその他の変化
A)熱処理は、表面積および孔容積にわずかな変化しか起こさなかった。
B)FT−IRスペクトルは、次の種類の基の存在の変化を示した:a)ビニル基の量が減少し、b)恐らくは架橋により、芳香族の置換が増加し、c)恐らくはアルデヒドおよび/またはケトン基の導入により、カルボニル基が増加した。
【0031】
熱処理中に適用される温度、時間および圧力の影響(減圧):
A)温度の影響。温度は180℃〜250℃で変化させた。加熱時間は15時間であった。収縮/膨潤と温度の関係をグラフで表示したものは、媒体(粒子)の収縮/膨潤特性が約230℃までは減少し、その後安定となるように見受けられることを示した。
【0032】
B)加熱時間の影響。加熱時間は4〜17時間の範囲で変化させた。温度は240℃で一定に保った。結果は加熱時間が収縮/膨潤に関してある程度の重要性があることを示した。240℃において、収縮/膨潤の量は最初の8時間減少するように見受けられ、その後更なる変化が起こらないように見受けられることを示した。
【0033】
C)圧力の影響。圧力は0.02〜50mbの範囲で変化させた。温度は240℃であり、そして加熱時間は15時間であった。媒体(粒子)の収縮/膨潤と圧力間の関係は見出すことができなかった。FT−IRによれば、圧力が2mbまでの範囲に主たる寄与を伴ない、酸化の量に大きな影響を有することが認められた。
【0034】
この特定の媒体の収縮/膨潤を減少するための最適な条件は、表1から見出すことができる。
クロマトグラフィーによる試験:
これは、PTHアミノ酸、ブラジキニンペプチドおよびアンギオテンシンの各種の混合物の分離で行った。
【0035】
結果は、この試験混合物の熱処理媒体によるクロマトグラフィーが、熱処理を受けない媒体と比較して最も狭いピークを与えた。さらに、結果は、熱処理により酸化された基を導入されたマトリックスが、良好でないクロマトグラフィーの性能(電荷/双極子の相互作用により、より低いピーク高さおよびより幅広いピーク)を与えることを示した。
【0036】
優先権期間中の追加事項
本発明による加熱工程中、非不活性液体または反応性物体を含む不活性溶液中で出発共重合体を加熱する場合、さらに利益のある誘導反応が起こるらしいことが認められた。したがって、例えば:
* 0.05Mのp−トルエンスルホン酸を含むデカノール中で120℃に加熱することは、残余のビニル基のいずれかの炭素原子にデシルエーテル基を導入する。p−トルエンスルホン酸が存在しない場合、デカノールとの反応は検出されなかった。
* (C2H4OH)2NH中で200℃に加熱することは、アミノ基を挿入する。
* H2NC3H6O(C2H4O)2C3H6NH2の存在中で加熱することは、さらにアミノ基を架橋共重合体に導入する。
【0037】
したがって、本発明の更なる態様において、加熱は、1以上の官能基を有し、少なくともその一つが共重合体と反応性である化合物の存在中で、それによって前記化合物が前記共重合体と共有結合するように適用される条件下で行われる。化合物は、典型的には有機化合物である。加熱は、共重合体を液体中に浸漬するか、あるいはしないかの、いずれかで行うことができる。液体はそれ自体、反応性の官能基を有していてもよく、またはそのような基を有する化合物の溶解した形態を含んでいてもよい。先に記載したように、好ましくは加熱は、酸素との限定接触で行われるべきである。共重合体を囲む媒体中には意図する特定の誘導を助長する物質を存在させることができる。したがって、加熱は、適当とみなされる場合には、酸または塩基の存在中で行うことができる。
【0038】
本発明のこの態様において、アミノ基、ヒドロキシ基、オキシエチレン基、エーテル基、炭化水素基等のような基および他の官能基を導入することができる。本発明のこの態様はさらに親水性化の目的に使用できることにつながる。
Claims (12)
- 重合されたビニル化合物を基礎とし、かつ未反応の残余のビニル基を有する架橋された重合体から支持媒体を製造する方法であって、重合反応後に残存する残余のモノマーおよび/または開始剤を除去してから、該重合体を、酸素の限定接触下で加熱工程に供することを特徴とする方法。
- 前記モノマーおよび/または開始剤が有機溶媒での抽出によって除去される、請求項1に記載の方法。
- 重合体が、加熱処理の間、液体に囲まれていることを特徴とする、請求項1又は請求項2に記載の方法。
- 熱処理後の重合体が、熱処理の間に形成される酸化された基を還元する条件に供されることを特徴とする、請求項1乃至請求項3のいずれか1項に記載の方法。
- 重合体が、多孔質の一体物であることを特徴とする、請求項1乃至請求項4のいずれか1項に記載の方法。
- 重合体が、非多孔質または多孔質の1〜500μmの範囲のサイズをもつ粒子の形態であり、かつ、孔が存在する場合は、孔が50オングストローム〜5000オングストロームの範囲であることを特徴とする、請求項1乃至請求項5のいずれか1項に記載の方法。
- 重合体が、1〜500μmの範囲の平均サイズをもつビーズ/粒子の形態であることを特徴とする、請求項1乃至請求項4および6のいずれか1項に記載の方法。
- ビニル化合物の少なくとも1つまたは2つが、アルキル基、または官能基で置換されていてもよいビニルスチレン、および少なくとも2つのビニル基をもつベンゼンから選択されるものであることを特徴とする、請求項1乃至請求項7のいずれか1項に記載の方法。
- 重合体が、熱処理後に誘導されることを特徴とする、請求項1乃至請求項8のいずれか1項に記載の方法。
- 加熱工程の間の重合体が、重合体と反応する1以上の官能基を含む有機化合物と接触するが、このとき適用される条件が、それにより有機化合物の重合体への共有結合を可能にするものであることを特徴とする、請求項1乃至請求項9のいずれか1項に記載の方法。
- 有機化合物の共有結合が、アミノ基、ヒドロキシ基、オキシエチレン基、エーテル基、炭化水素基の中から選択される官能基を導くものであることを特徴とする、請求項10に記載の方法。
- 請求項1乃至請求項11のいずれか1項に記載の方法により製造される支持媒体の、液体クロマトグラフィーにおける使用。
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