JP4696090B2 - サツマイモ由来エクスパンシン遺伝子のｃＤＮＡおよびこれを用いた高生産性形質転換植物体 - Google Patents
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Description
本発明は、高生産性形質転換植物体を製作するためのサツマイモ由来エクスパンシン遺伝子のｃＤＮＡに係り、さらに詳しくは、サツマイモ由来エクスパンシン遺伝子のｃＤＮＡ、このｃＤＮＡを含む形質転換用ベクター、およびこのベクターを用いた、植物体の生体重および/または種子生産量が増加する高生産性形質転換作物の生産方法に関する。
エクスパンシン(Expansin)は、Ｃｏｓｇｒｏｖｅとその同僚らによって発見(McQueen-Mason et al., 1992, Plant Cell 4, 1425-1433)されて以来、広範囲な研究が行われてきた。研究の初期には、エクスパンシンは、主に、ｐＨによって調節される細胞壁の軟化を通じた細胞の拡張に関与する酵素として知られていた(Cosgrove, 2000, Nature 407, 321-326)。以後、エクスパンシンがα−、β−の２つの形で存在することが明らかになった(Shcherban et al., 1995, PNAS 92, 9245-9249)。
最近では、エクスパンシンは、細胞拡張の他に、植物の形態形成(Ruan et al., 2001, Plant Cell 13, 47-60)、果物の軟化(Rose et al., 2000, Plant Physiology 123, 1583-1592; Civello et al., 1999, Plant Physiology 121, 1273-1280)、花粉管の伸長(Cosgrove et al., 1997, PNAS 94, 6559-6564)、根の屈地性反応成長(Zhang and Hasenstein, 2000, Plant Cell Physiology 41, 1305-1312)、根細胞の伸長(Lee et al., 2003, Plant Physiology 131, 985-997)などにも関与することが明らかになっている(for review, Lee et al., 2001, Cur. Opin. Plant Biol. 4, 527-532)。
更に、淡水稲とトマトにおけるエクスパンシンの発現の様相についても研究されている。トマトでは葉の原基の発達が始まる頂端にエクスパンシンが発現することを確認した(Reinhardt et al., 1998, Plant Cell 10, 1427-1437)。トマト果物成熟特異的なエクスパンシン（Ｅｘｐ１）をクローニングして形質転換体を製作して、Ｅｘｐ１がトマト果物の軟化に関連することを究明した(Brummell et al., 1999, Plant Cell, 11: 2203-2216)。また、淡水稲の速い成長と細胞壁の軟化程度が増加する直前にエクスパンシンのｍＲＮＡが増加し(Cho and Kende, 1997a, Plant Cell 9, 1661-1671; 1997b, Plant Physiology 113, 1137-1143; 1998, Plant Journal 15, 805-812)、エクスパンシンが細胞の伸長に関与しており、このようなエクスパンシンが過多発現された形質転換稲植物体の子葉の長さは野生種と比較して３１〜９７％増加した(Choi et al., 2003 Plant Cell, 15: 1386-1398)ことが分かる。ところが、前記の形質転換稲植物体は、雄性不稔性を示して種子を結ぶことが不可能であった。
一方、穀物の種子はヒトの主食として多く用いられているから、穀物栽培において、種子生産量の増加は非常に意味が大きいといえる。また、穀物の種子は６０〜７０％が澱粉から構成されているので、科学者らは、以前から、穀物種子の澱粉含量を増大させることにより穀物生産量の増大を図ろうと努力してきた。
ＡＤＰ−グルコースリン酸化酵素（ＡＧＰａｓｅ）は、抑制剤（Ｐｉ）と促進剤（３ＰＧＡ）によってその活性が調節されるアロステリック酵素(allosteric enzyme)であって、植物体内の澱粉の合成を調節する酵素として知られている。この酵素をコード化する遺伝子を用いて穀物種子の澱粉合成量を変化させる研究が行われてきた。トウモロコシのＡＧＰａｓｅ遺伝子に６つの塩基配列が添加されて２つ（チロシンとセリン(tyrosine and serine)のアミノ酸が添加された突然変異（Ｓｈ２−Ｒｅｖ６）は、ＡＧＰａｓｅの抑制剤に対する感受性を低下させ、その結果トウモロコシ種子内の澱粉合成を促進させることにより、重量を１１〜１８％増加させた(Giroux et al., 1996, PNAS 93, 5824-5829)。トウモロコシの突然変異ＡＧＰａｓｅ遺伝子（Ｓｈ２ｒ６ｈｓ）は、抑制剤に対する感受性を低下させ、ＡＧＰａｓｅの小さいサブユニット(small subunit)と大きいサブユニット(large subunit)間の結合を一層安定化させる。ＣａＭＶ３５ＳプロモータとＳｈ２ｒ６ｈｓを用いた形質転換小麦の場合、種子の生産量が野生種と比較して３８％増加した(Smidansky et al., 2002, PNAS 99, 1724-1729)。内胚乳(endosperm)特異的なプロモータ（トウモロコシのユビキチンプロモータ）とＳｈ２ｒ６ｈｓを用いた形質転換稲の場合、野生種と比較して種子および植物体の生産量が２０％増大した(Smidansky et al., 2003, Planta, 216, 656-664)。
したがって、作物の生産性を画期的に増大させるために、遺伝子導入を用いた高生産性形質転換作物体の製作が強く求められてきた。
そこで、本発明は、上述した技術的要求に応えるためのもので、その目的とするところは、高生産性形質転換作物を生産するためのサツマイモエクスパンシン遺伝子（ＩｂＥｘｐａｎｓｉｎ）のｃＤＮＡを提供することにある。
本発明の他の目的は、ＩｂＥｘｐａｎｓｉｎ遺伝子のｃＤＮＡを含む植物体形質転換用ベクターを提供することにある。
本発明の別の目的は、高生産性作物を生産しようとする場合、前記サツマイモエクスパンシン遺伝子（ＩｂＥｘｐａｎｓｉｎ）を含むベクターを用いて製造された形質転換植物体を提供することにある。
上記目的を達成するために、本発明者らは、サツマイモエクスパンシン（ＩｂＥｘｐａｎｓｉｎ）遺伝子のｃＤＮＡをクローニングして植物体形質転換用発現ベクターを製作し、同一のベクターを用いてシロイヌナズナ形質転換体を製作してその生産性を確認したところ、形質転換シロイヌナズナの生体量が著しく増加し、特に種子の生産性が３倍増加したことを見出し、本発明を完成するに至った。
したがって、本発明は、配列番号１の塩基配列を有する単離されたサツマイモエクスパンシン遺伝子のｃＤＮＡを提供する。
前記ｃＤＮＡ塩基配列は、合計１，２１３ｂｐであって、３３ｂｐの５’非翻訳領域、７１７ｂｐのＯＲＦ（配列番号１１, Open Reading Frame、２３８個のアミノ酸）、および４６３ｂｐの３’非翻訳領域からなることを特徴とする。
本発明の他の目的を達成するために、本発明は、前記ＯＲＦによって翻訳され、配列番号２のアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチドを提供する。
本発明の別の目的を達成するために、本発明は、前記サツマイモ由来エクスパンシン遺伝子のｃＤＮＡを含む植物形質転換用発現ベクター（ｐＩｂＥｘｐａｎｓｉｎ）を提供する。
前記植物体形質転換用ベクターは、外来遺伝子を導入された植物体内で永久的に発現させることが可能な形質転換用バイナリーベクターである。
また、前記本発明に係るサツマイモエクスパンシン遺伝子（ＩｂＥｘｐａｎｓｉｎ）のｃＤＮＡは、ｐＭＢＰ１ベクターのＣａＭＶ３５ＳプロモータとＮＯＳタミネータとの間に位置する。本発明ではｐＭＢＰ１ベクターを使用したが、他の植物形質転換用ベクターで置換し得ることは、当業者にとって自明である。
本発明は、前記本発明に係るサツマイモエクスパンシン遺伝子（ＩｂＥｘｐａｎｓｉｎ）のｃＤＮＡを含むバイナリーベクターによって形質転換されたシロイヌナズナ植物体を提供する。
前記バイナリーベクターは、アグロバクテリウムを用いる方法、あるいは遺伝子銃を利用する方法などで植物体を形質転換させることができる。本発明では、その例として、フローラルディップ(floral dip)方法(Clough and Bent, 1998, Plant J.)によってシロイヌナズナを形質転換させた。
また、本発明に係るサツマイモエクスパンシン遺伝子は、シロイヌナズナの他に、生体量を高め且つ種子生産量を増大させようとするいずれの植物にも導入できる。
ひいては、本発明は、本発明に係るサツマイモエクスパンシン遺伝子（ＩｂＥｘｐａｎｓｉｎ）のｃＤＮＡ断片を増幅するための配列番号５または配列番号６で表されるＰＣＲ用プライマーを提供する。
本発明は、エクスパンシン遺伝子をバイナリーベクターに組み込んだ後、これを植物体に導入する段階を含むことを特徴とする、種子生産量および/または生体重を増加させる方法を提供する。上述したように、エクスパンシン遺伝子が一部公開されているが、エクスパンシン遺伝子が種子生産量に寄与するという事実は、未だ報告されたことがなく、本発明によって最初に発見された。様々な由来のエクスパンシン遺伝子が種子生産量および/または生体重の増加のために植物体に導入できる。
本発明は、サツマイモ(Ipomoea batatas cv Jinhongmi)由来エクスパンシン遺伝子（ＩｂＥｘｐａｎｓｉｎ）のｃＤＮＡに関するものであって、これは、植物体の成長を促進させて生体量を増加させるとともに、種子生産量を増大させる。これにより、本発明は、高生産性形質転換植物体の開発に効果的に利用できる。
以下、本発明を好適な実施例によって詳細に説明する。ところが、下記実施例は本発明を説明するためのもので、本発明の権利範囲を限定するものではない。
〔実施例１：サツマイモエクスパンシン遺伝子ｃＤＮＡのクローニング〕
サツマイモの幼い塊根からＲＮＡを抽出してＥＳＴ(Expressed Sequence Tag)ライブラリーを構築した後、２，８５９個のＥＳＴをクローニングしてＮＣＢＩに登録した（ＮＣＢＩ受託番号：ＢＵ６９０１１９〜ＢＵ６９２９７７、You et al., 2003, FEBS Letters 536, 101-105）。これらのＥＳＴのうち、ＩｂＥｘｐａｎｓｉｎ（ＮＣＢＩ受託番号：ＢＵ６９１４５２）は、約１ｋｂであって、一番目のＡＴＧコドンがない部分ｃＤＮＡである。したがって、サツマイモエクスパンシン遺伝子ＩｂＥｘｐａｎｓｉｎの全長を確保するために、構築されていたサツマイモ塊根の肥大初期のESTライブラリーを鋳型としてＩｂＥｘｐａｎｓｉｎ遺伝子特異的なプライマー（配列番号３）とＴ３ベクタープライマーを用いて増幅させたところ、予想される５’全長サイズ部位からバンドを確認することができなかった（図１）。
サツマイモの幼い塊根からＲＮＡを抽出してＥＳＴ(Expressed Sequence Tag)ライブラリーを構築した後、２，８５９個のＥＳＴをクローニングしてＮＣＢＩに登録した（ＮＣＢＩ受託番号：ＢＵ６９０１１９〜ＢＵ６９２９７７、You et al., 2003, FEBS Letters 536, 101-105）。これらのＥＳＴのうち、ＩｂＥｘｐａｎｓｉｎ（ＮＣＢＩ受託番号：ＢＵ６９１４５２）は、約１ｋｂであって、一番目のＡＴＧコドンがない部分ｃＤＮＡである。したがって、サツマイモエクスパンシン遺伝子ＩｂＥｘｐａｎｓｉｎの全長を確保するために、構築されていたサツマイモ塊根の肥大初期のESTライブラリーを鋳型としてＩｂＥｘｐａｎｓｉｎ遺伝子特異的なプライマー（配列番号３）とＴ３ベクタープライマーを用いて増幅させたところ、予想される５’全長サイズ部位からバンドを確認することができなかった（図１）。
よって、予想される全長位置の部位をアガロースゲルから溶出した後、これを鋳型として遺伝子特異的なネスティドプライマー(nested primer)（配列番号４）とＴ３プライマーを用いて２次ＰＣＲを行った結果、約３５０ｂｐのＰＣＲ産物を得た（図２）。
前記得られた産物をさらにｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクターに組み込んで塩基配列の分析を行ったところ、ＩｂＥｘｐａｎｓｉｎの５’塩基配列であることを確認することができた。この塩基配列に基づいて、両端にＢａｍＨＩとＫｐｎＩ制限酵素認識部位を添加させた５’と３’の遺伝子特異的なプライマー（配列番号５と配列番号６）を製作し、全長ＩｂＥｘｐａｎｓｉｎをＲＴ−ＰＣＲ方法でクローニングした（図３）。
〔実施例２：全長ＩｂＥｘａｐａｎｓｉｎ塩基配列の決定および分析〕
約１．２ｋｂの全長ｃＤＮＡの塩基配列をＰＣＲでクローニングしてｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクターに組み込んだ後、プラスミドＤＮＡを抽出して塩基配列を決定した結果、ＩｂＥｘｐａｎｓｉｎは、合計１２１３ｂｐ、具体的に３３ｂｐの５’ＵＴＲ、７１７ｂｐ ＯＲＦおよび４６３ｂｐ ３’ＵＴＲから構成されていた。この全長ＩｂＥｘｐａｎｓｉｎのｃＤＮＡをＮＣＢＩに登録した（受託番号：ＤＱ５１５８００）。ＩｂＥｘｐａｎｓｉｎの２３９個のアミノ酸配列は、Ｎ末端領域を除いてはお互いに高い相同性を示すアミノ酸配列の保存度が非常に高く（図４）、トマト、唐辛子などのエクスパンシンアミノ酸配列と７８％の高い相同性を示すことが分かった（図5）。
約１．２ｋｂの全長ｃＤＮＡの塩基配列をＰＣＲでクローニングしてｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクターに組み込んだ後、プラスミドＤＮＡを抽出して塩基配列を決定した結果、ＩｂＥｘｐａｎｓｉｎは、合計１２１３ｂｐ、具体的に３３ｂｐの５’ＵＴＲ、７１７ｂｐ ＯＲＦおよび４６３ｂｐ ３’ＵＴＲから構成されていた。この全長ＩｂＥｘｐａｎｓｉｎのｃＤＮＡをＮＣＢＩに登録した（受託番号：ＤＱ５１５８００）。ＩｂＥｘｐａｎｓｉｎの２３９個のアミノ酸配列は、Ｎ末端領域を除いてはお互いに高い相同性を示すアミノ酸配列の保存度が非常に高く（図４）、トマト、唐辛子などのエクスパンシンアミノ酸配列と７８％の高い相同性を示すことが分かった（図5）。
〔実施例３：組織別ノーザン(Northern)分析〕
（１）ノーザン分析方法
ＩｂＥｘｐａｎｓｉｎの発現様相を確認するために、貯蔵根が発達する前の個体からの根（ＦＲＮ）、茎（Ｓｔｅｍ−ＦＲＮ）、葉（Ｌｅａｆ−ＦＲＮ）および葉柄（Ｐｅｔｉｏｌｅ−ＦＲＮ）、貯蔵根発達初期の個体からの根（ＦＲＥＳ）、貯蔵根段階の個体からの貯蔵根（ＳＲ）、茎（Ｓｔｅｍ−ＳＲ）、葉（Ｌｅａｆ−ＳＲ）および葉柄（Ｐｅｔｉｏｌｅ−ＳＲ）、並びに貯蔵根が完全に成長した後の個体からの根組織（ＦＲＬＳ）（図6参照）より、全ＲＮＡを４．４Ｍ グアニジウム−ＳＤＳ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ(chirgwin et al., 1979)と５．７Ｍ ＣｓＣｌ グラジエント方法(Glisin et al., 1974)を用いて抽出した後、約２０μｇの総ＲＮＡを１％アガロース−ホルムアルデヒドゲルに電気泳動し、Ｔｒｏｐｉｌｏｎ−ｐｌｕｓＴＭ（Ｔｒｏｐｉｘ、ＵＳＡ）ナイロン膜に転移(transfer)させた。
（１）ノーザン分析方法
ＩｂＥｘｐａｎｓｉｎの発現様相を確認するために、貯蔵根が発達する前の個体からの根（ＦＲＮ）、茎（Ｓｔｅｍ−ＦＲＮ）、葉（Ｌｅａｆ−ＦＲＮ）および葉柄（Ｐｅｔｉｏｌｅ−ＦＲＮ）、貯蔵根発達初期の個体からの根（ＦＲＥＳ）、貯蔵根段階の個体からの貯蔵根（ＳＲ）、茎（Ｓｔｅｍ−ＳＲ）、葉（Ｌｅａｆ−ＳＲ）および葉柄（Ｐｅｔｉｏｌｅ−ＳＲ）、並びに貯蔵根が完全に成長した後の個体からの根組織（ＦＲＬＳ）（図6参照）より、全ＲＮＡを４．４Ｍ グアニジウム−ＳＤＳ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ(chirgwin et al., 1979)と５．７Ｍ ＣｓＣｌ グラジエント方法(Glisin et al., 1974)を用いて抽出した後、約２０μｇの総ＲＮＡを１％アガロース−ホルムアルデヒドゲルに電気泳動し、Ｔｒｏｐｉｌｏｎ−ｐｌｕｓＴＭ（Ｔｒｏｐｉｘ、ＵＳＡ）ナイロン膜に転移(transfer)させた。
プローブは、１ｋｂ Ｅｘｐａｎｓｉｎ ＥＳＴクローンを含んでいる２．５ｎｇのプラスミド、ｄＣＴＰを除いた１００μＭ ｄＮＴＰ ｍｉｘ、１００μＭのｄＣＴＰ−ｂｉｏｔｉｎ、１０μＭのベクター（ｐＢｌｕｓｃｒｉｐｔII）プライマーＴ３（５’−ＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧ−３’；配列番号７）と、Ｔ７（３’−ＣＧＧＧＡＴＡＴＣＡＣＴＣＡＧＣＡＴＡＡＴＧ−５’；配列番号８）、１×ＰＣＲバッファと１ユニットのＴａｑポリメラーゼをそれぞれ添加して最終体積を１０μＬに調整し、９５℃で５分間処理した。その後、９５℃１０秒、６５℃３０秒、７２℃３０秒を１サイクルとして、３５サイクルの増幅を行って製作した。
前記ＰＣＲで増幅されたビオチン標識プローブ(biotinylated probe)は、ＱＩＡｑｕｉｃｋＴＭ ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ、ドイツ）で精製し、約１００ｎｇを膜に添加して６５℃で１８時間ハイブリダイゼーションした。その後、１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣを用いて室温で５分（２回）、１％ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣを用いて１５分（２回）、そして１×ＳＳＣを用いて室温で５分間（２回）を処理した。プローブ検出は、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ−ｓｔａｒＴＭｋｉｔ（Ｔｒｏｐｉｘ、ＵＳＡ）を用いて行った。ブロットをブロッキングバッファ（１×ＰＢＳ、０．２％Ｉ−ＢｌｏｃｋＴＭ Ｒｅａｇｅｎｔと０．５％ＳＤＳ）で処理し、ストレプトアビジン結合アルカリ性ホスファターゼ(Alkaline phosphatase conjugated streptavidin)を付けた後、ＣＤＰ−ＳｔａｒＴＭ(Ｒｅａｄｙ−ｔｏ−Ｕｓｅ)を処理した。膜はＸ線フィルム（富士フィルム、日本）に１０分〜１時間３０分露出させた。
（２）ＩｂＥｘｐａｎｓｉｎの発現様相の確認
ＩｂＥｘｐａｎｓｉｎは、貯蔵根発達前の根組織と葉柄で強く発現し、茎と葉においても発現した。ところが、貯蔵根発達後の塊根組織ではその発現量が著しく低下したことを確認することができ、茎と葉における発現量が非常に減少した（図7）。このような発現様相は、ＩｂＥｘｐａｎｓｉｎが、長さ生長が活発に起こっている組織で強く発現していることを示唆している。
ＩｂＥｘｐａｎｓｉｎは、貯蔵根発達前の根組織と葉柄で強く発現し、茎と葉においても発現した。ところが、貯蔵根発達後の塊根組織ではその発現量が著しく低下したことを確認することができ、茎と葉における発現量が非常に減少した（図7）。このような発現様相は、ＩｂＥｘｐａｎｓｉｎが、長さ生長が活発に起こっている組織で強く発現していることを示唆している。
〔実施例４：バイナリーベクターの製作〕
ＩｂＥｘｐａｎｓｉｎ全長ｃＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲで増幅するときに使用したプライマーに既にＢａｍＨＩとＫｐｎＩ制限酵素認識部位を添加させたプライマー（配列番号５および配列番号６）を使用したため、過多発現用バイナリーベクター製作のために、ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクターに入っているｃＤＮＡをＢａｍＨＩとＫｐｎＩで切断した後、ｃＤＮＡをｐＭＢＰ１ベクターのＣａＭＶ３５ＳＳプロモータとＮＯＳタミネータとの間に挿入し、この挿入をコロニーＰＣＲ(colony PCR)と制限酵素処理によって確認して（図8）バイナリーベクターｐＩｂＥＸｐａｎｓｉｎを製作した（図9）。
ＩｂＥｘｐａｎｓｉｎ全長ｃＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲで増幅するときに使用したプライマーに既にＢａｍＨＩとＫｐｎＩ制限酵素認識部位を添加させたプライマー（配列番号５および配列番号６）を使用したため、過多発現用バイナリーベクター製作のために、ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクターに入っているｃＤＮＡをＢａｍＨＩとＫｐｎＩで切断した後、ｃＤＮＡをｐＭＢＰ１ベクターのＣａＭＶ３５ＳＳプロモータとＮＯＳタミネータとの間に挿入し、この挿入をコロニーＰＣＲ(colony PCR)と制限酵素処理によって確認して（図8）バイナリーベクターｐＩｂＥＸｐａｎｓｉｎを製作した（図9）。
〔実施例５：製作されたｐＩｂＥｘｐａｎｓｉｎベクターを用いたシロイヌナズナ形質転換〕
実施例４で製作されたｐＩｂＥｘｐａｎｓｉｎベクターをアクロバクテリウム(Agrobacterium tumefaciens C58C1)に冷解凍(Freeze-thaw)方法(An, G. 1987, Methods in Enzymology)によって導入した。
実施例４で製作されたｐＩｂＥｘｐａｎｓｉｎベクターをアクロバクテリウム(Agrobacterium tumefaciens C58C1)に冷解凍(Freeze-thaw)方法(An, G. 1987, Methods in Enzymology)によって導入した。
形質転換されたアグロバクテリアを２日間２８℃で振とう培養した後、これをフローラルディップ方法(Clough and Bent, 1998, The Plant Journal)に基づいてシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana cv. columbia)の開花直前の柱頭に接種してシロイヌナズナ植物体を形質転換させた。
〔実施例６：形質転換シロイヌナズナの選抜および確認〕
実施例５で製造されたシロイヌナズナ形質転換体から種子を収穫した後、カナマイシン（３０ｍｇ／Ｌ）含有ＭＳ培地に塗末して抵抗能のある形質転換植物体Ｔ１を選別し、ＩｂＥｘｐａｎｓｉｎ ｃＤＮＡがシングルコピー(single copy)で導入されてカナマイシン抵抗性に対する分離比が３：１のＴ２植物体を区別し、同型接合種子(homozygous seed)を確保した。これらの中から任意に３ライン（Ｅｘｐ−１、Ｅｘｐ−４、Ｅｘｐ−２２）を選択してＩｂＥｘｐａｎｓｉｎの発現量を調査した。
実施例５で製造されたシロイヌナズナ形質転換体から種子を収穫した後、カナマイシン（３０ｍｇ／Ｌ）含有ＭＳ培地に塗末して抵抗能のある形質転換植物体Ｔ１を選別し、ＩｂＥｘｐａｎｓｉｎ ｃＤＮＡがシングルコピー(single copy)で導入されてカナマイシン抵抗性に対する分離比が３：１のＴ２植物体を区別し、同型接合種子(homozygous seed)を確保した。これらの中から任意に３ライン（Ｅｘｐ−１、Ｅｘｐ−４、Ｅｘｐ−２２）を選択してＩｂＥｘｐａｎｓｉｎの発現量を調査した。
形質転換シロイヌンズナにおけるＩｂＥｘｐａｎｓｉｎの発現量を調査するために、シロイヌナズナの葉からＴｒｉ−Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を用いて全ＲＮＡを抽出した後、ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）とＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭIII（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を用いて逆転写させた。内的対照群(internal control)としてシロイヌナズナｅＩＦ４Ａ１遺伝子を使用した。ＩｂＥｘｐａｎｓｉｎの遺伝子特異プライマー（５’−ＧＴＡＧＧＡＴＣＣＣＡＴＴＣＣＴＣＴＡＣＣＡＡＴＴＣＡＡＣＴＧＡＡ−３’(配列番号５)、５’−ＧＡＴＧＧＴＡＣＣＡＣＴＧＴＣＴＣＣＡＣＡＣＴＣＡＧＣＡＴＴ−３’(配列番号６)）、およびｅＩＦ４Ａ１プライマー（５’−ＧＣＴＣＴＣＣＣＧＴＧＧＴＴＴＣＡＡＧＧＡＣＣＡＧＡＴＣ−３’（配列番号９）、５’−ＧＴＣＴＧＴＧＡＧＣＣＡＡＴＣＡＡＣＣＴＴＡＣＧＣＣＴＧ−３’（配列番号１０））を共に使用して９４℃で５分間変性した。その後、９４℃３０秒、５８℃３０秒、７２℃１分を１サイクルとして、３０サイクル繰り返し行った後、７２℃で７分間合成(extension)させた。ＰＣＲ産物をアガロースゲルで電気泳動し、野生型にはないＩｂＥｘｐａｎｓｉｎ転写物を形質転換体から確認した（図10）。
〔実施例７：形質転換シロイヌナズナ成長の分析〕
ＩｂＥｘｐａｎｓｉｎシロイヌナズナ形質転換体の成長を野生型と比較した。このために、Ｅｘｐ−１、Ｅｘｐ−４およびＥｘｐ−２２を野生型と共に土壌に播種して育てた後、花軸が出る直前に葉の成長度合いを比較した。Ｅｘｐ−１、Ｅｘｐ−４およびＥｘｐ−２２は、野生型と比較し、花軸が出る前の葉の枚数にはあまり変わりがなかったが、葉の成長速度が速くて葉の長さと幅がさらに長かった（図11）。
ＩｂＥｘｐａｎｓｉｎシロイヌナズナ形質転換体の成長を野生型と比較した。このために、Ｅｘｐ−１、Ｅｘｐ−４およびＥｘｐ−２２を野生型と共に土壌に播種して育てた後、花軸が出る直前に葉の成長度合いを比較した。Ｅｘｐ−１、Ｅｘｐ−４およびＥｘｐ−２２は、野生型と比較し、花軸が出る前の葉の枚数にはあまり変わりがなかったが、葉の成長速度が速くて葉の長さと幅がさらに長かった（図11）。
〔実施例８：形質転換シロイヌナズナの種子生産量の分析〕
ＩｂＥｘｐａｎｓｉｎシロイヌナズナ形質転換体の種子の大きさを調査し、野生型と比較した。Ｔ3世代の同型接合体種子を用いた。それぞれ形質転換体の種子を顕微鏡の下で観察したところ、Ｅｘｐ−１、Ｅｘｐ−４、Ｅｘｐ−２２はいずれも野生型と比較して種子の大きさが増大したことを確認した（図１2）。
ＩｂＥｘｐａｎｓｉｎシロイヌナズナ形質転換体の種子の大きさを調査し、野生型と比較した。Ｔ3世代の同型接合体種子を用いた。それぞれ形質転換体の種子を顕微鏡の下で観察したところ、Ｅｘｐ−１、Ｅｘｐ−４、Ｅｘｐ−２２はいずれも野生型と比較して種子の大きさが増大したことを確認した（図１2）。
〔実施例９：形質転換シロイヌナズナ種子の澱粉含量の分析〕
ＩｂＥｘｐａｎｓｉｎシロイヌナズナ形質転換体の種子に含有されている澱粉量を調査し、野生型と比較した。形質転換体シロイヌナズナと野生型シロイヌナズナの種子としては、Ｔ４世代の同型接合体種子を用いた。種子に液体窒素を加えて乳鉢に細かく擂った後、それぞれ１ｇの量を、２５ｍＬの蒸留水が入っている１５０ｍＬの三角フラスコに移した。移されたサンプルを３分間沸かしながら攪拌した後、滅菌器を用いて１３５℃で１時間澱粉を分解し、常温から約６０℃になるまで降温して安定化させた。このように準備された水溶液に１００ｍＬの蒸留水を添加し、Ｓｔａｒｃｈ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＳＩＧＭＡ）を用いて、製造社から提供された方法に準じて澱粉含量を分析した。その結果、ＩｂＥｘｐａｎｓｉｎシロイヌナズナ形質転換体Ｅｘｐ−１、Ｅｘｐ−４、Ｅｘｐ−２２の種子１個当たりの澱粉含量はそれぞれ１．５５±０．１３、１．４８±０．０３、１．５４±０．０６μｇであって、野生型シロイヌナズナの０．９８±０．０６μｇより多いことを確認することができた（図１3）。
ＩｂＥｘｐａｎｓｉｎシロイヌナズナ形質転換体の種子に含有されている澱粉量を調査し、野生型と比較した。形質転換体シロイヌナズナと野生型シロイヌナズナの種子としては、Ｔ４世代の同型接合体種子を用いた。種子に液体窒素を加えて乳鉢に細かく擂った後、それぞれ１ｇの量を、２５ｍＬの蒸留水が入っている１５０ｍＬの三角フラスコに移した。移されたサンプルを３分間沸かしながら攪拌した後、滅菌器を用いて１３５℃で１時間澱粉を分解し、常温から約６０℃になるまで降温して安定化させた。このように準備された水溶液に１００ｍＬの蒸留水を添加し、Ｓｔａｒｃｈ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＳＩＧＭＡ）を用いて、製造社から提供された方法に準じて澱粉含量を分析した。その結果、ＩｂＥｘｐａｎｓｉｎシロイヌナズナ形質転換体Ｅｘｐ−１、Ｅｘｐ−４、Ｅｘｐ−２２の種子１個当たりの澱粉含量はそれぞれ１．５５±０．１３、１．４８±０．０３、１．５４±０．０６μｇであって、野生型シロイヌナズナの０．９８±０．０６μｇより多いことを確認することができた（図１3）。
〔実施例１０：形質転換シロイヌナズナ種子のタンパク質含量の分析〕
ＩｂＥｘｐａｎｓｉｎシロイヌナズナ形質転換体種子のタンパク質含量を調査し、野生型と比較した。種子としては、Ｔ３世代の同型接合体種子を用いた。種子１個当たりのタンパク質含量を分析するために、形質転換体と野生型のＴ３世代種子１００個をタンパク質抽出溶液（２５０ｍＭスクロース、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２ｍＭ ＤＴＴ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、タンパク質阻害剤カクテル）に添加し、ドリルとプラスチック棒を用いて細かく擂った後、４℃で１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上澄み液を新規チューブ内に移し、タンパク質分析キット（ＢｉｏＲａｄ）を用いて種子１個当たりのタンパク質量を決定した。その結果、ＩｂＥｘｐａｎｓｉｎシロイヌナズナ形質転換体Ｅｘｐ−４、Ｅｘｐ−２２がいずれも野生型に比べて多くのタンパク質含量を持つことを確認したうえ、このことを、それぞれのサンプル２μＬずつを１２％ ＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲルにロードして電気泳動した後、ＣＢＢ(coomassie brilliant blue)染色試薬を用いたゲル染色を行うことにより、再確認した（図１4）。
ＩｂＥｘｐａｎｓｉｎシロイヌナズナ形質転換体種子のタンパク質含量を調査し、野生型と比較した。種子としては、Ｔ３世代の同型接合体種子を用いた。種子１個当たりのタンパク質含量を分析するために、形質転換体と野生型のＴ３世代種子１００個をタンパク質抽出溶液（２５０ｍＭスクロース、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２ｍＭ ＤＴＴ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、タンパク質阻害剤カクテル）に添加し、ドリルとプラスチック棒を用いて細かく擂った後、４℃で１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上澄み液を新規チューブ内に移し、タンパク質分析キット（ＢｉｏＲａｄ）を用いて種子１個当たりのタンパク質量を決定した。その結果、ＩｂＥｘｐａｎｓｉｎシロイヌナズナ形質転換体Ｅｘｐ−４、Ｅｘｐ−２２がいずれも野生型に比べて多くのタンパク質含量を持つことを確認したうえ、このことを、それぞれのサンプル２μＬずつを１２％ ＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲルにロードして電気泳動した後、ＣＢＢ(coomassie brilliant blue)染色試薬を用いたゲル染色を行うことにより、再確認した（図１4）。
〔実施例１１：形質転換シロイヌナズナの種子生産量の分析〕
ＩｂＥｘｐａｎｓｉｎ形質転換植物全体の種子生産量を調査するために、種子の千粒重、植物体当たりの種子莢の個数、１莢当たりの種子の個数、全種子の個数、全種子の重量などをＥｘｐ−４を対象として調査した。図１5に示すように、ＩｂＥｘｐａｎｓｉｎシロイヌナズナ形質転換体が野生型に比べて千粒重も重かったし、植物体当たりの種子莢の個数、１莢当たりの種子の個数、全種子の個数が全て多かった。結果として、１植物体当たり生産する種子の生産量は、野生種が１４９．７３±０．１９ｍｇであり、ＩｂＥｘｐａｎｓｉｎ形質転換体が４４４．２７±０．６２ｍｇであって、ＩｂＥｘｐａｎｓｉｎ形質転換体が野生種に比べて約３倍高い種子生産量を示した（図１5）。
ＩｂＥｘｐａｎｓｉｎ形質転換植物全体の種子生産量を調査するために、種子の千粒重、植物体当たりの種子莢の個数、１莢当たりの種子の個数、全種子の個数、全種子の重量などをＥｘｐ−４を対象として調査した。図１5に示すように、ＩｂＥｘｐａｎｓｉｎシロイヌナズナ形質転換体が野生型に比べて千粒重も重かったし、植物体当たりの種子莢の個数、１莢当たりの種子の個数、全種子の個数が全て多かった。結果として、１植物体当たり生産する種子の生産量は、野生種が１４９．７３±０．１９ｍｇであり、ＩｂＥｘｐａｎｓｉｎ形質転換体が４４４．２７±０．６２ｍｇであって、ＩｂＥｘｐａｎｓｉｎ形質転換体が野生種に比べて約３倍高い種子生産量を示した（図１5）。
よって、本発明に係るＩｂＥｘｐａｎｓｉｎ ｃＤＮＡは、生体量の高い形質転換植物体、特に種子生産量が画期的に高い形質転換作物体の生産などに効果的に利用できる。
上述したように、本発明は、サツマイモ(Ipomoea batatas cv Jinhongmi)由来エクスパンシン遺伝子（ＩｂＥｘｐａｎｓｉｎ）のｃＤＮＡに関するものであって、この遺伝子は、植物体の成長を促進させて生体量を増加させるとともに、種子の生産量を増大させることができる。これにより、本発明は、高生産性形質転換植物体の開発に効果的に利用できる非常に有用な発明である。
Claims (1)
- 配列番号１または１１の塩基配列からなる単離されたＤＮＡを含む植物形質転換用バイナリーベクターをシロイヌナズナに導入する段階を含むことを特徴とする、種子生産量および/または生体重を増加させる方法。
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