JP4690043B2 - 神経に対し活性な化合物 - Google Patents

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Description

本発明は、神経に対し活性な化合物、該化合物の調製方法、及び医薬用又は獣医用の薬剤としての該化合物の使用、具体的には神経状態の治療のため、より具体的にはアルツハイマー病などの神経変性状態の治療のための使用に関する。
本明細書で引用される特許又は特許出願を含む全ての引用文献は参照により本明細書にインコーポレートされる。いずれの引用文献も先行技術を構成するとは認められない。引用文献の考察はそれらの著者らが主張することを記載しており、出願人は引用文書の正確性及び妥当性に意義を唱える権利を保有する。幾つかの先行技術の刊行物が本明細書に引用されるが、この引用がこれらの文書のいずれもオーストラリア又は他のいずれかの国の技術において一般常識の一部をなすことを容認するものでないことは明白に理解されるであろう。
寿命は個々の種について生物学的に定められていると考えられ、ヒトの寿命の長さは不確実であるが、１２０歳までであろう。今世紀に平均寿命は著しく上昇したため、高齢者は人口の増加部分であり、彼らの医療ニーズは数十年間成長し続けるであろう。
正常な老化はヒトの脳の質量及び体積の穏やかな減少を特徴とし、それは脳細胞の萎縮及び／又は死によるものであるらしい。これらの変化は神経変性状態に陥る患者の脳において遥かに深刻である。これらの状態の大半は散発性（即ち遺伝子の突然変異によらない）で原因不明であるが、多数の遺伝子における何百もの異なる突然変異が幾つかの神経変性状態の家族性（遺伝性）変異体を惹起することが示されている。これらの突然変異を抱える１ダース以上の遺伝子の多数は、まさにこの十年間において神経変性状態の遺伝的根拠を究明するための探求で発見された。神経変性状態は、特定の脳領域の進行性変性（即ち神経細胞の機能障害及び死）により長期にわたり脳が正常に機能した後しだいに進展する。疾患症状の発現は、神経細胞の喪失が罹患した脳領域により行われる連続機能（例えば記憶、運動）の「閾値」を越える際に起きるため、実際の脳変性は臨床的発現の何年も前に始まる。
知的な及びより統合的な認知能力は痴呆につながる神経状態において徐々に低下し日常生活動作を妨げる。高齢世代の正確な痴呆の罹患率は知られていないが、６５歳を越える人口の１５％であり、５％は重症で１０％は軽度から中度の痴呆症であろう。重度の痴呆症の罹患率は６５歳で１％から８５歳で４５％まで増加する。痴呆症には多数の原因があるが、アルツハイマー病（ＡＤ）は６５歳を越える痴呆患者の５０％を占める。
ＡＤは脳の主要な変性疾患である。記憶、思考、理解、計算、言語、学習能力、及び判断などの認知機能の進行的な衰退により特徴づけられる。これらの衰退が個人の日常生活動作を妨げるのに十分な場合に痴呆症と診断される。ＡＤは潜行性発症を示し徐々に悪化する。この疾患は加齢に伴う通常の認知機能の衰退と明白に識別される必要がある。通常の衰退は、はるかに少なく、はるかに漸進的であり、より軽症の障害をもたらす。ＡＤの発症は普通６５歳以後であるが、より若い発症も珍しくない。年齢が進むにつれ、罹患率は急速に増加する（５歳毎におおよそ倍になる）。人口の平均寿命が上昇しているため、これは該疾患と個体生存の合計数について明白な関係を有する。
ＡＤの痴呆の病因は不明である。幾つかのＡＤ型についてはかなりの遺伝的な素因の証拠があり（非特許文献１に概説されている）、ＡｐｏＥのある種のイソ型の発現もＡＤのより高い危険性と関連している（非特許文献２；非特許文献３）。アルミニウムの毒性蓄積がＡＤの原因物質として示唆されたが、この仮説は現在おおむね破棄されている。ＡＤ患者の脳はβ−アミロイド・タンパク質（Ａβ）を含む異常な沈着物を示す。
Ａβはある種の神経変性疾患を患う個体の脳に存在することが知られているが、それが基礎疾患過程の症状であるのか否か又は実際に該疾患の病因に関与するのか否かは知られていない。例えば、幾人かの著者はＡβの沈着物が正常な脳の防御機構を示しうると考えており、該機構では脳がＡβを隔離しようとし、このような沈着物は正常な個体の脳に存在し得る。神経原線維がもつれるタウ・タンパク質の突然変異があるが、アミロイド斑は脳に存在せず、この状態はタウオパシー（tauopathy）として知られる。
提案される一つのＡＤ治療法は脳でのＡβの生産を阻害することである。ＢＡＣＥ１及びγ−セクレターゼによるＡＰＰのタンパク質分解切断の結果、全長のＡβが生成した、これは次いで細胞から放出される（非特許文献４）。従って、ＢＡＣＥ１又はγ−セクレターゼのいずれかの阻害剤は治療価値がありうる。あるいは、幾つかの研究により、コレステロールはＡβの放出を左右できることが示された（非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８、非特許文献９）。しかしながら、コレステロール値を下げる価値に関しては当分野でいくらか意見の相違があり、コレステロールが実際に有益であると考える研究者もいる。例えば、ジら（非特許文献１０）は、コレステロールへのＡβの結合がそのオリゴマー形成を阻害することによりＡβの毒性を抑制しうることを示唆した。
代替的アプローチにおいて、Ａβアミロイド単量体を形成するアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のタンパク質分解プロセシングを解明することにより、幾つかの考えられる治療標的が可能になりうることが提唱されており（非特許文献１１、非特許文献１２）、このアプローチは臨床開発の初期段階にある。Ａβを用いた免疫化により脳からＡβの一掃を促す試みは、ＡＤのトランスジェニック・マウス・モデルでは有効である（非特許文献１３）一方、顕著な副作用を有することが見出された（非特許文献１４）。
アミロイド様原繊維の沈着は他の神経変性疾患でも重要でありうると示唆されている。該疾患にはパーキンソン病、レーヴィ小体の形成を伴う痴呆、多系統萎縮症、ハレルボーデン−シュパッツ病及び瀰漫性レーヴィ小体病が含まれる。
ＡＤの病因について競合する理論の一つは、その原因となる段階（単数又は複数）がＡβアミロイド・タンパク質の脳内生合成及び蓄積の経路内にあることである（非特許文献１５による最近の概説を参照せよ；非特許文献１６；非特許文献１７）。しかしながら、今日まで、この経路を標的にする薬物又は物質は、該疾患の臨床発現を変える上で又はアルツハイマー病を含む神経変性疾患に関連する認知機能の低下を防止若しくは改善する上で持続的影響を有することが証明されていない。
更なる仮説は、Ａβアミロイドの毒性を有する蓄積により、一部には銅及び亜鉛といった最も罹患した領域に豊富にある金属イオンの過剰結合により、ＡＤが惹起されるというものである。更に、Ｚｎ２＋イオン及びＣｕ２＋イオンがＡβと相互作用する際に、原繊維及びプラークへのＡβの凝集が起きることが示唆され（非特許文献１８）、これはシナプスのＺｎ２＋が不足した動物から得た最近のデータにより確認された（非特許文献１９）。酸化還元的に活性なＣｕ２＋−Ａβ相互作用はＯ２からＨ２Ｏ２を形成できることも示唆された（非特許文献２０）。Ｃｕ２＋及びＺｎ２＋の両方がＡβ−脂質膜の相互作用に影響を及ぼすことが示された（非特許文献２１）。
脳は金属イオンを濃縮する器官であり、最近の証拠により、金属恒常性の崩壊は加齢に伴う様々な神経変性疾患において重要な役割を果たすことが示唆されている。これらの疾患の共通の特徴は、異常に折り畳まれたタンパク質の沈着（それぞれの疾患はその独自の特異的アミロイド・タンパク質を有する）及び酸化的ストレスの結果としての多大な細胞の損傷を含む。事実、現在では、データが急速に蓄積されてきており、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、クロイツフェルト−ヤコブ病（ＣＪＤ）や、感染性海綿状脳症（ＴＳＥ）を含むプリオン病、白内障、ミトコンドリア疾患、パーキンソン病及びハンチントン病などのアミロイド形成性神経疾患の基礎をなす共通点として金属化学反応が浮上している。これらの例において、特定タンパク質の病的凝集は遷移金属及び市販の還元剤の存在により類型化される生理学的環境における異常な酸化還元活性により促進される（非特許文献２２（Curr Opin Chem Biol. 2000年4月;4（2）:184-91））。
抗生物質であるヨードクロロヒドロキシキノリン（クリオキノール（ＣＱ）としても知られる）を用いたＡＤの治療法は、ピイ．エヌ．ゲロミラトス・エス．エイ．による米国特許第５，９９４，３２３号（特許文献１）及び第６，００１，８５２号（特許文献２）並びにブッシュらによる米国特許出願第０９／９７２，９１３号（特許文献３）に開示され請求されている。長期間にわたって並びにおそらく当時推奨された用量より高用量でＣＱを服用したと考えられる患者に１９６０年代の日本にのみ観察された珍しい神経学的症候群である亜急性脊髄視神経障害（ＳＭＯＮ）との関連性があるため、該薬物は１９７０年に抗生物質としての使用が撤回された（非特許文献２３）。しかしながら、最近の証拠は、ＳＭＯＮが非常に脆弱な集団の過剰使用に伴うビタミンＢ１２不足により引き起こされたため、臨床的な環境における研究用に復帰できることを示唆している（非特許文献２４、非特許文献２５）。
しかしながら、動物モデル又はヒトのインビボ結果はゲロミラトスとブッシュの特許で提示されていない。米国特許第５，９９４，３２３号（特許文献１）はＣＱ及びビタミンＢ１２を含む組成物並びにＣＱの「有害な副作用を抑制しながらＣＱ投与に応答する疾患又は障害」の治療のための使用を開示している。これらの疾患はＡＤを含む。米国特許第６，００１，８５２号（特許文献２）は、好ましくはビタミンＢ１２とともにＣＱを用いたＡＤの治療法を開示している。米国特許第５，９９４，３２３号（特許文献１）及び米国特許第６，００１，８５２号（特許文献２）の両方は１日当たり１０〜７５０ｍｇの用量を示唆し、米国特許第５，９９４，３２３号（特許文献１）は、治療が長期にわたる場合、ＣＱが１回に３週間までで、その後１〜４週間の「洗浄」期間を設けて、断続的に投与すべきであることを推奨している。
米国出願第０９／９７２，９１３号（特許文献３）では、ＣＱはＡβ沈着物を解離させる能力について専ら言及されている。他の神経毒性の機構は論議されていない。ゼネラル・ホスピタル・コーポレーションによるＰＣＴ／ＵＳ９９／０５２９１（特許文献４）は、アミロイド斑の溶解を促進し並びにアミロイドプラークの形成及び／又はＡβによるＲＯＳの生産を阻害するために特定の銅及び亜鉛のキレート剤と組み合わせたＣＱの使用を開示している。
米国特許第６，００１，８５２号（特許文献２）もＣＱ及びビタミンＢ１２を含む組成物がパーキンソン病の治療で使用できることを示唆しているが、この文脈においてＣＱは主として黒質から鉄を除去することを介して作用することが示唆される。
米国特許第５，９９４，３２３ 米国特許第６，００１，８５２ ０９／９７２，９１３ ＰＣＴ／ＵＳ９９／０５２９１ セント・ジョージ−ヒスロップ，2000 コルダーら，1993 チェコら，1994 ヌナンとスモール，2000 シモンズら，1998 ハートマン，2001 ファスベンダーら，2001 フリアーズら，1999 フリードホッフら，2001 ジら，2002 シアーマンら，2000 シンハら，1999 シェンクら，1999 ブロワー，2002 セルコエ，2001 ベイリュザーら，2001 ブッシュ，2001 アットウッドら，1998 リーら，2002 フアングら，1999 カーテンら，2001 ブッシュ，2000 シラキ，1975 ヤシンら，2000 ブッシュとマスターズ，2001
ＡＤの治療におけるＣＱの効能は、ＣＮＳに入り、次いで種々のＡβ体から遷移金属のＣｕ、Ｚｎ及びＦｅを隔離することによりＡβの毒性を低減させ、それを遊離させて除去するその能力に依存する。ＣＱの有効性は経口による生体利用を制限するその低い水溶性により限定される。ＣＱはかなりの抱合体代謝を受けることや上述したように毒性歴を有することも知られている。ＣＱが二座金属配位子であるという事実は、捕捉された全ての金属イオンにつき少なくとも二個の分子の参加を必要とさせる。
本発明はタンパク質と金属との異常な反応を特徴とする神経状態を含む神経状態を治療する手段を提供する。
ここに、本発明者らは１位に窒素原子及び８位にヒドロキシ基又はメルカプト基を有する二融合６員環を有し、少なくとも一つの環が一つ以上の下記の性質の集団最適化により芳香族化されている複素環式化合物を開発した。
（ａ）金属のキレート化（以下に定義する）、
（ｂ）水溶性、
（ｃ）細胞毒性の低減、
（ｄ）アミロイド分散特性、
（ｅ）ＣＮＳ侵入に適した膜透過性、及び
（ｆ）代謝安定性。
これらの化合物は、能動輸送によりＣＮＳで濃縮される治療例を含み、それらの金属キレート特性に加えて時には金属キレート特性の強化をもたらす抗酸化活性を含み、並びにＣＮＳ侵入を有利にするため８−ヒドロキシ部分又は８−メルカプト部分を隠蔽しそして血液脳関門（ＢＢＢ）の内面に存在する既知のエステラーゼ活性を利用するプロドラッグ戦略を実証する。
本発明に従って、その必要がある被験者に有効量の式Ｉの化合物
（式中、
ＲはＯ又はＳであり、
Ｒ１はＨ、置換されていても良いアルキル、置換されていても良いアルケニル、置換されていても良いアルキニル、置換されていても良いアリール、置換されていても良いヘテロシクリル、抗酸化剤、標的化部分、ＣＮ、ハロ、ＣＦ３、ＳＯ３Ｈ、及びＯＲ２、ＳＲ２、ＳＯＲ２、ＳＯ２Ｒ２、ＮＲ２Ｒ３、（ＣＨ２）ｎＮＲ２Ｒ３、ＨＣＮＯＲ２、ＨＣＮＮＲ２Ｒ３、ＣＯＮＲ２Ｒ３、ＣＳＮＲ２Ｒ３、ＮＣＯＲ２、ＮＣＳＲ２、ＣＯＲ２、ＣＯ２Ｒ２、ＣＳＲ２又はＳＯ２ＮＲ２Ｒ３から独立して選択され、上式中、Ｒ２及びＲ３はそれぞれＨ、置換されていても良いアルキル、置換されていても良いアルケニル、置換されていても良いアルキニル、置換されていても良いアリール、置換されていても良いヘテロシクリル、抗酸化剤又は標的化部分から独立して選択され、ｎは１から１０の整数であり、
ＸはＣＨ、ＣＯ、Ｎ及びＮＨから独立して選択され、
ＺはＣＨ、ＣＯ、Ｎ、ＮＨ及びＯから独立して選択され、
Ｙは存在しない又はＹが結合する環とともに５員若しくは６員の置換されていても良いアリール又は５員若しくは６員の置換されていても良いヘテロシクリルを形成し、
ｍは１から３の整数であり、並びに
ｐは１から４の整数である）
その塩、水和物、溶媒和物、誘導体、プロドラッグ、互変異性体及び／又は異性体を、
（ｉ） Ｘ及びＺの少なくとも一つはＣＨ以外であり、
（ｉｉ） そのファンキノン又は互変異性体は除外する、即ちＲがＯであり、７位のＲ１がＯＨであり、ＸがＣＨであり且つＹが存在しない場合は、Ｚは
ではなく、
（ｉｉｉ）ＲがＯであり、Ｙが存在せず、ＺがＣＨであり、Ｘが３位以外のＣＨであって、
ＸがＮ、ｍが２、Ｒ １ が3位の
である場合には、2位のＲ １ は
でも
でもなく、及び、
（ｉｖ）クリオキノール、即ち、ＲがＯであり、Ｙが存在せず、Ｚ及びＸがＣＨでｍが２である場合には、
５位のＲ １ は塩素ではなく、7位のＲ １ はヨウ素ではない、
という条件の下で、投与する工程を含む神経状態の治療方法、改善方法及び／又は予防方法が提供される。
更に本発明に従って、神経状態の治療、改善及び／又は予防のための医薬の製造における式Ｉの化合物の使用が提供される。
本発明は神経状態の治療、改善及び／又は予防のための式Ｉの化合物の使用も提供する。
本発明は更に神経状態の治療、改善及び／又は予防で使用するための式Ｉの化合物を提供する。
本発明は更に医薬品として、好ましくは神経治療薬又は神経保護薬として、より好ましくは抗アミロイド生成薬としての式Ｉの化合物の使用を提供する。神経状態は、好ましくは神経変性状態であり、より好ましくはアルツハイマー病又はパーキンソン病などの神経変性アミロイド症である。
ＲはＯであることが好ましい。
Ｒ１は、ハロ、置換されていても良いアリール、置換されていても良いヘテロシクリル、置換されていても良いアルキル、ＯＲ２、ＳＲ２、（ＣＨ２）ｎＮＲ２Ｒ３、ＣＯＮＲ２Ｒ３及びＮＣＯＲ２であることが好ましく、上式中、ｎ、Ｒ２及びＲ３は上記で定義した通りである。Ｒ１は、フッ素（fluoro）、ヨウ素（iodo）、塩素（chloro）、４−ハロフェニル、例えば４−フルオロフェニル又は４−クロロフェニルなどの置換されていても良いフェニル、イミダゾリル又はピリジニルなどの１〜４個の窒素原子を含む置換されていても良い３〜６員の不飽和へテロ単環式基、イミダゾリジニル又はピペラジニルなどの１〜４個の窒素原子を含む置換されていても良い３〜６員の飽和へテロ単環式基、モルホリニルなどの１〜２個の酸素原子及び１〜３個の窒素原子を含む置換されていても良い３〜６員の飽和ヘテロ単環式基、メチル又はエチルなどの置換されていても良いＣ１−４アルキル、シクロプロピルなどの置換されていても良いＣ２−６シクロアルキル、置換されていても良いＣ１−６アルコキシ、置換されていても良いチオ、ＣＨ２ＮＲ４Ｒ５（Ｒ４及びＲ５は独立してＨ及びＣ１−４アルキルから選択される）又はＣＯＮＨ（ＣＨ２）２Ｒ６（Ｒ６は置換されていても良いヘテロシクリルである）であることがより好ましい。
Ｙは、置換されていても良いフェニル、イミダゾリル又はピリジニルなどの１〜４個の窒素原子を含む置換されていても良い５員又は６員の不飽和へテロ単環式基、又はモルホリニルなどの１〜２個の酸素原子及び１〜３個の窒素原子を含む置換されていても良い５員又は６員の飽和ヘテロ単環式基であることが好ましい。
理論に束縛されることを望まないが、置換基Ｒ１は本発明の化合物のキレート特性において電子的に又は立体的に限定効果を有すると考えられている。従って、置換は、細胞毒性並びに水素結合の供与体及び受容体の数、親油性（ＣｌｏｇＰ、ＥｌｏｇＰ及びＬｏｇＤ）、溶解度及び極性表面積を含む物理化学的特性などの他のパラメータを調節するために使用できる。これらのパラメータの調節は該化合物の薬物動態プロファイルの最適化に寄与する。置換基Ｒ１が２位及び／又は７位に位置する場合、該置換基がキレート特性を供与するならば、調節に加えて、細胞毒性及び物理化学的特性は活性にも影響を及ぼしうるであろうことを前提とする。
化学式Ｉの化合物の具体的な種類は下記の通りである。
８−ヒドロキシ−４（３Ｈ）−キナゾリノン
８−ヒドロキシ−キナゾリン
８−ヒドロキシ−キノキサリン
［１，６］ナフチリジン−８−オル
９−ヒドロキシピリミド［１，６−ａ］ピリミジン−４−オン
８−ヒドロキシ−シンノリン
６−ヒドロキシ−フェナジン
４−ヒドロキシ−アクリジン
４，７（４，１０）−フェナントロリン−５−オル
９−ヒドロキシピリド［１，２−ａ］ピリミジン−４−オン
ピリド［３，２−ｄ］ピリミジン−４−オル
ピリド［２，３−ｄ］ピリダジン−８−オル
［１，７］ナフチリジン−８−オル
［１，５］ナフチリジン−４，８−ジオール
［１，５］ナフチリジン−８−オル
ピリド［３，４−ｂ］ピラジン−８−オル
ピリド［３，４−ｂ］ピラジン−５−オル
ピリドール［４，３−ｄ］ピリミジン−８−オル
４−ヒドロキシ−４ａ，８ａ−ジヒドロ−ピラノ［３，２，ｂ］ピリジン−２−オン
８−ヒドロキシ−６Ｈ−［１，６］ナフチリジン−５−オン
８−ヒドロキシ−６Ｈ−［１，６］ナフチリン−５−オン
ジベンゾ［ａ，ｇ］キノリジン−８−オン
４−ヒドロキシ−１Ｈ−ピリド［３，２−ｄ］ピリジン−２−オン
上式中、Ｒ１、ｍ、ｎ及びｐは上記で定義した通りであり、ｑは１又は２の整数である。
式Ｉの化合物の８−ヒドロキシ基又は８−メルカプト基は保護してプロドラッグ、とりわけエステル・プロドラッグを形成してもよい。８−ヒドロキシ基又は８−メルカプト基は式Ｉの化合物の代謝の重要部位に相当し、即ちグルクロン酸又は硫酸塩と抱合して容易に排出される親水性種を生じる。このような抱合体はおそらく血液脳関門を通過しないであろう。エステル・プロドラッグは抱合から式Ｉの化合物を保護しうる。血液脳関門に組み込まれたエステラーゼは次に該関門を通過する際にＣ８−ヒドロキシ又はメルカプトを遊離させＣＮＳにおけるその役割を果たさせるためにれ該化合物を活性化する。
式Ｉの好ましい化合物は式ＩＡの化合物である。
上式中、Ｒ、Ｒ１及びｍは上記で定義した通りであり；
ＷはＣＨ、Ｎ又はＮＨであり、
ＵはＣＨ、ＣＯ又はＮであり、且つ
Ｙ’は、存在しない、又はそれが結合する環とともに、６員のＮを含む置換されていても良いヘテロシクリルを形成する。
式ＩＡの好ましい化合物は下記の通りである。
（ｉ） 式Ｉａ
上式中、Ｒ、Ｒ１、ｍ及びｑは上記で定義した通りである。
好ましくは、Ｒ１は２位、３位、５位及び／又は７位に位置し、ハロ、置換されていても良いアリール、置換されていても良いヘテロシクリル、置換されていても良いアルキル及び（ＣＨ２）ｎＮＲ２Ｒ３から選択される。上式中、ｎ、Ｒ２及びＲ３は上記で定義した通りである。更に好ましくは、Ｒ１は塩素（chloro）、置換されていても良いフェニル、Ｃ ３−６シクロアルキル、ＣＨ２ＮＲ４Ｒ５（Ｒ４及びＲ５は独立してＨ及びＣ１−４アルキルから選択される）又は置換されていても良いピリジニルである。
特に好ましい例は下記に示す。
（ｉｉ） 式Ｉｂ
上式中、Ｒ、Ｒ１、ｍ及びｑは上記に定義した通りである。
好ましくは、Ｒ１は２位、４位、５位及び／又は７位に位置し、ハロ及び置換されていても良いヘテロシクリルから選択される。より好ましくは、Ｒ１はクロル及び／又はモルホリニルである。
好ましい例は下記に示す。
（ｉｉｉ） 式Ｉｃ
上式中、Ｒ、Ｒ１、ｍ及びｑは上記で定義した通りである。
好ましくは、Ｒ１は２位、５位及び／又は７位に位置し、ハロ及びＣＨ２ＮＲ４Ｒ５（Ｒ４及びＲ５はＨ及びＣ１−４アルキルから独立して選択される）から選択される。
好ましい例は下記に示す。
（ｉｖ） 式Ｉｄ
上式中、Ｒ、Ｒ１、ｍ及びｑは上記で定義した通りである。
好ましくは、Ｒ１は２位及び／又は７位に位置し、置換されていても良いヘテロシクリル、ＣＯ２Ｒ２、（ＣＨ２）ｎＮＲ２Ｒ３及びＣＯＮＲ２Ｒ３（ｎ、Ｒ２及びＲ３は上記で定義した通りである）から選択される。
好ましい例は下記に示す。
（ｖ） 式Ｉｅ
上式中、Ｒ、Ｒ１、ｍ及びｑは上記で定義した通りである。
好ましくは、Ｒ１は２位、３位、６位及び／又は７位に位置し、ハロ、置換されていても良いアリール及び（ＣＨ２）ｎＮＲ２Ｒ３（ｎ、Ｒ２及びＲ３は上記で定義した通りである）から選択される。
好ましい例は下記に示す。
（ｖｉ） 式Ｉｆ
上式中、Ｒ１及びｍは上記で定義した通りである。
好ましくは、Ｒ１は２位及び／又は７位に位置し、ハロ及び（ＣＨ２）ｎＮＲ２Ｒ３（ｎ、Ｒ２及びＲ３は上記で定義した通りである）から選択される。
好ましい例は下記に示す。
更なる側面において、本発明は薬学的に又は獣医学的に許容しうる担体とともに上記に定義した式Ｉの化合物を含む医薬用組成物又は獣医用組成物を提供する。
式Ｉの化合物の幾つかは、それ自体が新規なものである。
従って、本発明は、少なくとも一つのＲ１がＨ以外であるという条件の下で、式Ｉの化合物である式ＩＩの化合物を提供する。
式ＩＩの好ましい化合物は式ＩＡの化合物であり、より好ましくは上記に定義した式Ｉａ、Ｉｂ、Ｉｃ、Ｉｄ及びＩｅの化合物であり、最も好ましくは１０４５、１０６１、１０６６、１０５３、１０６３、１０６４、１０６５、１０６７、１０６９及び１０７０である。
上記に定義した式ＩＩの化合物は以下の本明細書で詳細に説明する工程を用いて調製されうる。
本出願の特許請求の範囲において及び本発明の記載において、言語又は必要な意味を表すために文脈が他の意味を要求しない限り、「含む（comprise）」という用語、又は「含む（comprises）」若しくは「含む（comprising）」などの変形は包括的な意味で用いられる。即ち、記載された特性の存在を明記するために用いられるが、本発明の種々の実施態様における更なる特性の存在又は付加を除外するために用いられるのではない。
「置換されていても良いアルキル」又は「アルキルアミノ」等の単独又は複合語のいずれかで用いられる「アルキル」という用語は、１〜１０個の炭素原子、好ましくは１〜６個の炭素原子、より好ましくは１〜４個の炭素原子を有する直鎖、分枝鎖又は環状炭化水素基を指す。このようなアルキル基の実例は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、第二級ブチル、第三級ブチル、ペンチル、ネオペンチル、へキシル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル又はシクロヘキシルである。好ましいアルキル基はメチル又はエチルなどのＣ１−４アルキル及びシクロプロピルなどのＣ２−６シクロアルキルである。
単独で又は「置換されていても良いアルケニル」等の複合語のいずれかで用いられる「アルケニル」という用語は、２〜２０個の炭素原子、好ましくは２〜１４個の炭素原子、より好ましくは２〜６個の炭素原子の少なくとも一つの炭素−炭素二重結合を有する直鎖状、分枝状又は単環式若しくは多環式のラジカルを意味する。アルケニル・ラジカルの例にはアリル、エテニル、プロペニル、ブテニル、イソブテニル、３−メチル−２−ブテニル、１−ペンテニル、シクロペンテニル、１−メチル−シクロペンテニル、１−ヘキセニル、３−ヘキセニル、シクロヘキセニル、１−ヘプテニル、３−ヘプテニル、１−オクテニル、シクロオクテニル、１−ノネニル、２−ノネニル、３−ノネニル、１−デセニル、３−デセニル、１，３−ブタジエニル、１，４−ペンタジエニル、１，３−シクロペンタジエニル、１，３−ヘキサジエニル、１，４−ヘキサジエニル、１，３−シクロヘキサジエニル、１，４−シクロヘキサジエニル、１，３−シクロヘプタジエニル、１，３，５−シクロヘプタトリエニル、１，３，５，７−シクロオクタ−テトラエニル等が含まれる。
単独で又は「置換されていても良いアルキニル」等の複合語のいずれかで用いられる「アルキニル」という用語は、２〜２０個の炭素原子、好ましくは２〜１４個の炭素原子、より好ましくは２〜６個の炭素原子の少なくとも一つの炭素−炭素三重結合を有する直鎖又は分枝鎖のラジカルを指す。例には、エチニル、１−プロピニル、１−及び２−ブチニル、２−メチル−２−プロピニル、２−ペンチニル、３−ペンチニル、４−ペンチニル、２−ヘキシニル、３−ヘキシニル、４−ヘキシニル、５−ヘキシニル、１０−ウンデシニル、４−エチル−１−オクチン−３−イル、７−ドデシニル、９−ドデシニル、１０−ドデシニル、３−メチル−１−ドデシン−３−イル、２−トリデシニル、１１−トリデシニル、３−テトラデシニル、７−ヘキサデシニル、３−オクタデシニル等が含まれる。
単独で又は「置換されていても良いヘテロシクリル」等の複合語のいずれかで用いられる「ヘテロシクリル基」という用語は、窒素、硫黄及び酸素から選択される少なくとも一つのヘテロ原子を含む単環式又は多環式の複素環基を指す。
適切な複素環基は、例えばピロリル、ピロリニル、イミダゾリル、ピラゾリル、ピリジル、ピリジニル、ピリミジニル、ピラジニル、ピリダジニル、トリアゾリル又はテトラゾリルなどの１〜４個の窒素原子を含む３員〜６員の不飽和ヘテロ単環基、
ピロリジニル、イミダゾリジニル、ピペリジノ又はピペラジニルなどの１〜４個の窒素原子を含む３員〜６員の飽和ヘテロ単環基、
インドリル、イソインドリル、インドリジニル、ベンゾイミダゾリル、キノリル、イソキノリル、インダゾリル、ベンゾトリアゾリル又はテトラゾロピリダジニルなどの１〜５個の窒素原子を含む不飽和縮合複素環基、
ピラニル又はフリルなどの酸素原子を含む３員〜６員の不飽和ヘテロ単環基、
チエニルなどの１〜２個の硫黄原子を含む３員〜６員の不飽和ヘテロ単環基、
オキサゾリル、イソオキサゾリル又はオキサジアゾリルなどの１〜２個の酸素原子及び１〜３個の窒素原子を含む３員〜６員の不飽和ヘテロ単環基、
モルホニリルなどの１〜２個の酸素原子及び１〜３個の窒素原子を含む３員〜６員の飽和ヘテロ単環基、
ベンゾオキサゾリル又はベンゾオキサジアゾリルなどの１〜２個の酸素原子及び１〜３個の窒素原子を含む不飽和縮合複素環基、
チアゾリル又はチアジアゾリルなどの１〜２個の硫黄原子及び１〜３個の窒素原子を含む３員〜６員の不飽和複素単環基、
チアゾリジニルなどの１〜２個の硫黄原子及び１〜３個の窒素原子を含む３員〜６員の飽和ヘテロ単環基、
並びにベンゾチアゾリル又はベンゾチアジアゾリルなどの１〜２個の硫黄原子及び１〜３個の窒素原子を含む不飽和縮合複素環基
などの窒素含有複素環基を含む。
ヘテロシクリルは、イミダゾリル若しくはピリジニルなどの１〜３個の窒素原子を含む５員若しくは６員の不飽和ヘテロ単環基、イミダゾリジニル若しくはピペラジニルなどの１〜４個の窒素原子を含む５員若しくは６員の飽和ヘテロ単環基、又はモルホニリルなどの１〜２個の酸素原子及び１〜３個の窒素原子を含む５員若しくは６員の飽和ヘテロ単環基が好ましい。
単独で又は「置換されていても良いアリール」等の複合語のいずれかで用いられる「アリール」という用語は、１、２又は３個の環を含む炭素環式芳香族系を意味し、該環はぶら下がり様式で共に結合しうる又は融合しうる。「アリール」という用語はフェニル、ナフチル、テトラヒドロナフチル、インダン及びビフェニルなどの芳香族ラジカルを包含する。アリールは、４−ハロフェニル、より好ましくは４−フルオロフェニル又は４−クロロフェニルなどの置換されていても良いフェニルであることが好ましい。
「ハロ」という用語は、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素を指し、フッ素、ヨウ素又は塩素が好ましい。
「アルコキシ」という用語は直鎖又は分枝状のオキシ含有ラジカルを指し、それぞれが１〜約６個の炭素原子のアルキル部分を有することが好ましい。アルコキシの例には、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ及び第三級ブトキシが含まれる。
「置換されていても良いチオ」という用語は、二価の硫黄原子と結合した１〜１０個の炭素原子、好ましくは１〜６個の炭素原子、より好ましくは１〜４個の炭素原子の直鎖状又は分枝状のアルキルを含むラジカルなどの任意の置換基を指す。アルキルチオ・ラジカルの例には、メチルチオ、エチルチオ、プロピルチオ、ブチルチオ及びヘキシルチオが含まれる。
「置換されていても良い」という用語は、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルデヒド、ハロ、ハロアルキル、ハロアルケニル、ハロアルキニル、ハロアリール、ヒドロキシ、アルコキシ、アルケニルオキシ、アリールオキシ、ベンジルオキシ、ハロアルコキシ、ハロアルケニルオキシ、ハロアリールオキシ、ニトロ、ニトロアルキル、ニトロアルケニル、ニトロアルキニル、ニトロアリール、ニトロヘテロシクリル、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルケニルアミノ、アルキニルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ベンジルアミノ、ジベンジルアミノ、アシル、アルケニルアシル、アルキニルアシル、アリールアシル、アシルアミノ、ジアシルアミノ、アシルオキシ、アルキルスルホニルオキシ、アリールスルフェニルオキシ、ヘテロシクリル、ヘテロシクルオキシ、ヘテロシクルアミノ、ハロヘテロシクリル、アルキルスルフェニル、アリールスルフェニル、カルボアルコキシ、カルボアリールオキシ、メルカプト、アルキルチオ、ベンジルチオ、アシルチオ、リン含有基等から選択される一つ以上の基でさらに置換されうる基又は置換されえない基を指す。任意の置換基は、Ｃ１−６アルキル、より好ましくはＣ１−４アルキル、ＣＦ３、フッ素、塩素、ヨウ素、シアン、Ｃ１−６アルコキシ、より好ましくはＣ１−４アルコキシ、アリール、ヘテロシクリル、アミノ、又はアルキルアミノであることが好ましい。
「抗酸化剤」という用語は、本明細書中その最も広い意味で用いられ、毒性のない産物を生成するようにヒドロキシル・ラジカル等の反応性酸素種と反応する能力を有する基を指す。例には、３，４，５−トリメトキシフェニル及び３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニルなどのフェノール類、メラトニンなどのインドール・アミン及びフラボノイドが含まれる。他の例は文献（ライト，2001、カルボウニック，2001、ギルガン−シェルキ，2001）に見出せる。
「標的化部分」という用語は、本明細書中その最も広い意味で用いられ、能動輸送機構により薬物の脳内送達を促進する基を指す。標的化部分は血液脳関門に組み込まれた特定の輸送酵素により認識された、次いでこれらの輸送酵素は薬物を脳内に取り込む機構を提供する。通常、このような輸送体はナトリウム依存性であり、それらの基質はアスコルビン酸及びＬ−グルタミン酸塩などのカルボン酸を含む。薬物に対する標的化部分の抱合はこの酸部分を保持するように定められる。例は文献（マンフレディニ、2002、サカエデュ、2001）に見出せる。
「金属キレート因子」という用語は、本明細書中その最も広い意味で用いられ、金属原子、好ましくはＣｕ、Ｚｎ又はＦｅに結合できる二つ以上の供与原子を有する化合物であって、該供与原子の少なくとも二つは金属原子に同時結合でき、得られる金属複合体は金属イオン：生体リガンド複合体の熱力学安定性より大きいか又はそれに等しい熱力学的安定性を有する化合物を指す。本発明における神経性疾患の治療としての金属キレート因子の使用は既に知られている「キレート療法」の概念と区別される。「キレート治療」は、ウィルソン病、β−地中海貧血（thallesemia）及び血色素症など、多量の金属の除去を伴う臨床に関連する用語である。これらの疾患における金属恒常性の崩壊は、ダムの崩壊に非常に似た壊滅的事象として記載され、抗し難い問題金属の氾濫をもたらし得る。該化合物の作用機構は、多量の金属がキレート物質により隔離され排出により除去されるというものである。比較として、本発明の神経状態に関連する金属恒常性の崩壊は、水漏れする蛇口からの絶え間ない滴により類似しており、十分に長く放置されると、最終的に長期間にわたって局部的な損傷を惹起するであろう。本発明の「金属キレート因子」の意図は、毒素の循環が一旦短絡されると内因性浄化過程がより効果的に蓄積アミロイド生成タンパク質に対処できることを目的として、異常な金属−タンパク質相互作用を妨害し、金属の微妙な再配分及びその後の金属分布の正常化を成し遂げることである。
式Ｉ又は式ＩＩの化合物の塩は好ましくは薬学的に許容しうるものであるが、薬学的に許容し得ない塩であっても薬学的に許容しうる塩の調製の中間体として有用であれば、これらも本発明の範囲内にあることが理解されよう。薬学的に許容しうる塩の例は、ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウム及びアルキルアンモニウムなどの薬学的に許容しうる陽イオンの塩、又は塩酸、オルト燐酸、硫酸、燐酸、硝酸、炭酸、ホウ酸、スルファミン酸及び臭化水素酸などの薬学的に許容しうる無機酸の酸付加塩、又は酢酸、プロピオン酸、酪酸、酒石酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フマル酸、クエン酸、乳酸、粘液酸、グルコン酸、安息香酸、コハク酸、シュウ酸、フェニル酢酸、メタンスルホン酸、トリハロメタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、サリチル酸、スルファニル酸（sulphanilic acid）、アスパラギン酸、グルタミン酸、エデト酸、ステアリン酸、パルミチン酸、オレイン酸、ラウリン酸、パントテン酸、タンニン酸、アスコルビン酸及びバレリアン酸などの薬学的に許容しうる有機酸の塩を含む。
更に、本発明の化合物の幾つかは水又は一般的な有機溶媒と溶媒和物を形成しうる。このような溶媒は本発明の範囲内に包含される。
「薬学的に許容しうる誘導体」とは、あらゆる薬学的に許容しうる塩、水和物、エステル、アミド、活性代謝産物、類似体、残基、又は生物学的に若しくは他の意味で望ましくないものでない任意の他の化合物であって、所望の薬理学的及び／又は生理学的な効果をひき起こす化合物を意味する。
「プロドラッグ」という用語は、本明細書中その最も広い意味で用いられ、式Ｉ又は式ＩＩの化合物にインビボで変換される化合物を含む。プロドラッグ戦略の使用は、その作用部位、例えば脳への薬物送達を最適化する。一側面において、該用語は、プロドラッグがＢＢＢを横断するまで、加水分解を抑えるよう設計されたＣ１−６アルキル部分又はアリールエステル部分の存在を指す。ＢＢＢの内面のエステラーゼは作用してエステルを加水分解し化学式Ｉ又は化学式ＩＩの化合物のＣ８ヒドロキシルを遊離させる。第二の側面において、該用語は、抗酸化基、とりわけ３,４,５−トリメトキシフェニル部分又はその誘導体の２位での結合を指す。脳を酸化促進（prooxidative）環境に曝すと、３,４,５−トリメトキシフェニル基がヒドロキシル化され、２−ヒドロキシ−３,４,５−トリメトキシフェニル置換基を得る。そのヒドロキシル基は化学式Ｉ又は化学式ＩＩの化合物のキレート特性を強化するために作用する。
「互変異性体」という用語は、本明細書中その最も広い意味で用いられ、二つの異性体型の平衡状態で存在できる式Ｉ又は式ＩＩの化合物を含む。このような化合物は二つの原子又は基を結びつける結合及び該化合物のこれらの原子又は基の位置が異なりうる。
「異性体」という用語は、本明細書中その最も広い意味で用いられ、構造異性体、幾何異性体及び立体異性体を含む。式Ｉ又は式ＩＩの化合物は一つ以上の不斉中心を有しうるため、鏡像型で存在できる。
本発明の組成物は、一つ以上の薬学的に許容しうる担体及び任意の他の治療剤とともに化学式Ｉ又は化学式ＩＩの少なくとも一つの化合物を含む。個々の担体、希釈剤、アジュバント及び／又は賦形剤は、組成物の他の成分と適合するという意味で薬学的に「許容しうる」ものであり且つ被験体に有害であってはならない。組成物には、経口、直腸、鼻、局所（頬及び舌下を含む）、膣又は非経口（皮下、筋内、静脈内及び皮内を含む）の投与に適したものが含まれる。該組成物は、便宜上、単位投与剤形で存在し製薬分野で周知の方法により調製されうる。このような方法は、一つ以上の副成分を構成する担体と活性成分を結びつける工程を含む。一般的に、該組成物は、液体の担体、希釈剤、アジュバント及び／若しくは賦形剤又は微細に分割された固体担体又は両者と活性成分を均一且つ密接に結びつけた後、必要ならば生成物を成形することにより調製される。
「神経状態」という用語は、本明細書中その最も広い意味で用いられ、神経系の多様な細胞型が神経変性疾患又は損傷又は暴露の結果として変性及び／又は損なわれた状態を指す。特に、式Ｉ又は式ＩＩの化合物は、外科的介入、感染、毒性物質への暴露、腫瘍、栄養不足又は代謝障害により神経系細胞への損傷が起きた結果として生じる状態の治療に使用できる。その上、式Ｉ又は式ＩＩの化合物は、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、癲癇、薬物乱用若しくは薬物中毒（アルコール、コカイン、ヘロイン、アンフェタミンなど）、脊髄の疾患及び／若しくは損傷、ジストロフィー又は神経網膜の変性（網膜症）などの神経変性疾患、並びに糖尿病性神経障害及び／又は毒素により誘発される末梢性神経障害などの末梢性神経障害の続発症の治療に使用できる。
本明細書で用いられる「神経変性疾患」という用語はニューロンの統合性が脅かされる異常を指す。ニューロンの統合性は、神経細胞が生存の減少を示す場合又はニューロンがもはやシグナルを伝播できない場合に脅かされ得る。
本発明の化合物で治療できる神経疾患は、急性間欠性ポルフィリン症、アドリアマイシン誘発性心筋症、ＡＩＤＳ痴呆及びＨＩＶ−１誘発性神経毒症、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、アテローム性動脈硬化症、白内障、脳虚血、脳性麻痺、脳腫瘍、化学療法誘発性臓器損傷、シスプラチン誘発性腎臓毒症、冠動脈バイパス手術、クロイツフェルト−ヤコブ病及び「狂牛」病と関連するその新規な変異形、糖尿病性ニューロパシー、ダウン症候群、溺水、癲癇及び外傷後癲癇、フリードリッヒ運動失調症、前頭側頭型痴呆、緑内障、糸球体腎症、血色素症、血液透析、溶血、溶血性尿毒症症候群（ワイル病）、脳出血、ハレルフォルデン−シュパッツ病、心臓発作及び再潅流傷害、ハンチントン病、レーヴィ小体病、間欠性跛行、虚血性脳卒中、炎症性腸疾患、黄斑変性症、マラリア、メタノール誘発性毒症、髄膜炎（無菌性及び結核性）、運動ニューロン疾患、多発性硬化症、多系統萎縮症、心筋虚血、新生組織形成症、パーキンソン病、周産期仮死、ピック病、進行性核上麻痺、放射線治療誘発性臓器損傷、血管形成術後の再狭窄、網膜症、老人性痴呆症、統合失調症、敗血症、敗血性ショック、海綿状脳症、くも膜下出血／脳血管けいれん、硬膜下血腫、神経外科を含む外科手術による外傷、地中海貧血症、一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、外傷性脊髄損傷、移植、血管性痴呆、ウイルス性髄膜炎、及びウイルス性脳炎を含む。
従って、本発明の化合物は、他の治療の効果を増強するために、例えば脳由来の神経増殖因子の神経保護効果を増強するためにも使用されうる。
本発明は、外傷性脳損傷、脊髄損傷、脳虚血、脳卒中（虚血性及び出血性）、くも膜下出血／脳血管けいれん、脳腫瘍、アルツハイマー病、クロイツフェルト−ヤコブ病及び「狂牛」病と関連するその新規な変異形、ハンチントン病、パーキンソン病、フリードリッヒ運動失調症、白内障、レーヴィ小体の形成を伴う痴呆、多系統萎縮症、ハレルフォルデン−シュパッツ病、瀰漫性レーヴィ小体病、筋萎縮性側索硬化症、運動ニューロン疾患、多発性硬化症、致死性家族性不眠症、ゲルストマン−シュトロイスラー・シェインカー病及びオランダ型遺伝性アミロイド性脳出血などの急性及び慢性の神経疾患を含む、特に中枢神経系の酸化的損傷を誘発する状態を対象にする。
より具体的には、本発明は神経変性アミロイド症の治療を対象にする。神経変性アミロイド症は神経損傷がアミロイドの沈着に起因するすべての状態でありうる。アミロイドは、Ａβ、シヌクレイン（synuclein）、ハンチンチン（huntingtin）、又はプリオン・タンパク質を含むが、これらに限定されない種々のタンパク質又はポリペプチド前駆体から形成されうる。
従って、該状態は、散発性又は家族性のアルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、運動ニューロン疾患、白内障、パーキンソン病、クロイツフェルト−ヤコブ病及び「狂牛」病と関連するその新規な変異形、ハンチントン病、レーヴィ小体型痴呆、多系統萎縮症、ハレルフォルデン−シュパッツ病、及び瀰漫性レーヴィ小体病より成る群から選択されるのが好ましい。
神経変性アミロイド症は、アルツハイマー病又はダウン症候群若しくは家族性アルツハイマー病の数型ある常染色体優性型の一つに関連する痴呆（セント・ジョージ−ヒスロップ、2000に概説されている）などのＡβ関連状態であることがより好ましい。Ａβ関連状態はアルツハイマー病であることが最も好ましい。
本発明のあらゆる側面の特に好ましい実施態様においては、被験体は、治療前に、アルツハイマー病評価スケール（ＡＤＡＳ）−ｃｏｇ試験により判断されたとき、例えば２５以上のＡＤＡＳ−ｃｏｇ値を示すような、中度又は重度に認知機能を損なっているものである。
被験体の認知衰退を遅くする又は阻むことに加えて、本発明の方法及び化合物は神経変性状態の治療若しくは予防での使用にも適しうる又は神経変性状態の症状緩和での使用に適しうる。該化合物は患者が経験する認知衰退の少なくとも部分的な好転を提供できうる。神経変性状態になりやすい性質の危険性が増していると同定された被験体、又は軽度認知障害若しくは最小進行性（minimal progressive）認知障害などの認知衰退の前臨床的徴候を示す被験体に投与された場合、これらの方法及び化合物は、認知衰退速度を遅くする又は低減する効果に加えて、臨床症状の発症を予防又は遅延できる場合がある。
現在、アルツハイマー病及び他の痴呆は通常一つ以上の警戒すべき症状が現れるまで診断されない。これらの症状は、最近アメリカン・アカデミー・オブ・ニューロロジーにより定義された軽度認知障害（ＭＣＩ）として知られる症候群を構成し、記憶障害を有するが他の点では十分に機能し痴呆の臨床基準（ピーターソンら、2001）を満たさない個体の臨床状態を指す。ＭＣＩの症状は、
（１） 職業技能に影響を及ぼす記憶喪失
（２） 慣れ親しんでいる仕事を行うのが困難
（３） 言語障害
（４） 時間及び場所に関する見当識障害
（５） 誤った判断又は判断力の低下
（６） 抽象的思考が困難
（７） 物の置き忘れ
（８） 気分又は行動の変化
（９） 人格の変化
（１０）自発性欠如
を含む。
ＭＣＩは、ミニメンタル・ステート試験（Mini Mental Status Exam）及び記憶障害検査（Memory Impairment Screen）などの従来の認知スクリーニング試験、及び神経心理スクリーニング電池（neuropsychological screening battery）を用いて検出できる。
本明細書で用いられる「被験体」という用語は薬学的に活性な物質を用いた治療を要する疾患又は状態を患う任意の動物を指す。該被験体は哺乳動物、好ましくはヒト又は家畜動物若しくは愛玩動物でありうる。本発明の化合物はヒトの医療での使用に適していることが特に意図される一方で、イヌ及びネコなどの愛玩動物、ウマ、ポニー、ロバ、ラバ、ラマ、アルパカ、ブタ、ウシ及びヒツジなどの家畜動物、又は霊長類、ネコ科、イヌ科、ウシ科及び有蹄動物などの動物園の動物の治療を含む獣医学の治療にも適用できる。
適切な哺乳動物には霊長目、げっ歯目、ウサギ目、クジラ目、食肉目、奇蹄目及び偶蹄目の構成員が含まれる。奇蹄目及び偶蹄目の構成員はその類似の生態及び経済的重要性から特に好ましい。
例えば、偶蹄目は９つの科を通じて分布する約１５０の生物種を含む。即ち、ブタ（イノシシ科）、ペッカリー（ペッカリー科）、カバ（カバ科）、ラクダ（ラクダ科）、マメジカ（トラグリダエ（Tragulidae））、キリン及びオカピ（キリン科）、シカ（シカ科）、プロングホーン（プロングホーン科）、並びにウシ、ヒツジ、ヤギ及びアンテロープ（ウシ科）である。これらの動物の多くは種々の国々で給餌動物として用いられる。より重要なことには、ヤギ、ヒツジ、ウシ、及びブタといった経済的に重要な動物の多くは非常に類似した生態を有し、高度のゲノム相同性を共有する。
奇蹄目はウマ及びロバを含み、両者とも経済的に重要であり近縁である。実際、ウマとロバが異種交配することはよく知られている。
本明細書で用いられるとき、「治療に有効な量」という用語は、所望の治療反応を得るために、例えば神経状態を治療、改善又は予防するのに有効な本発明の化合物量を意味する。
特定の「治療に有効な量」は、治療される具体的な状態、被験体の健康状態、治療される被験体の種類、治療の継続期間、併用療法（ある場合）の性質、及び使用する具体的な製剤及び化合物又はその誘導体の構造などの因子によって明らかに変化する。
本発明の化合物は更に他の医薬と組み合わせて有効な組み合わせを提供しうる。該組み合わせが化学式Ｉ又は化学式ＩＩの化合物の活性を消失させない限り、薬学的に活性な薬物の化学的に適合するあらゆる組み合わせを含むことを意図する。本発明の化合物と他の薬剤は、別個に、連続して又は同時に投与されうることが理解されよう。
該状態がβ−アミロイド関連状態、特にアルツハイマー病である場合、他の薬剤には、例えばフェンセリン、ガランタミン、若しくはタクリンなどのアセチルコリンエステラーゼの活性部位の阻害剤、ビタミンＥ若しくはビタミンＣなどの抗酸化剤、一酸化窒素を放出するようにさらに改変されたフルブリプロフェン若しくはイブプロフェン（例えばＮｉｃＯｘにより生成されるＮＣＸ−２２１６）などの抗炎症剤、又は１７−β−エストラジオールなどのエストロゲン様物質が含まれうる。
医薬組成物の調製のための方法及び医薬担体は、レミングトンの薬科学，第２０版，ウィリアムズとウィルキンズ，ペンシルバニア，米国などの教科書に詳しく説かれているように、当分野で周知である。
本明細書で用いられるとき、「医薬担体」は、式Ｉ又は式ＩＩの化合物を被験体に送達するための薬学的に許容しうる溶媒、懸濁剤又は賦形剤である。該担体は液体又は固体であって良く計画された投与方法を考慮して選択される。個々の担体は該組成物の他成分と適合し被験体に有害でないという意味で薬学的に「許容しうる」ものでなければならない。
式Ｉ又は式ＩＩの化合物は、従来の毒性のない薬学的に許容しうる担体、アジュバント、及び賦形剤を含む単位投与剤形で経口投与、局所投与、又は非経口投与されうる。本明細書で用いられる非経口という用語は、皮下注射、肺若しくは鼻腔への投与用のエアロゾル、静脈内、筋内、くも膜下腔、頭蓋内への注射又は注入の技術を含む。
本発明は本発明の新規な治療方法で使用するのに適した局所用、経口用及び非経口用の医薬製剤も提供する。本発明の化合物は錠剤、水性又は油性の懸濁液、薬用キャンディー、トローチ、粉末、顆粒、乳濁液、カプセル、シロップ又はエリキシルとして経口投与されてもよい。経口用途の組成物は、薬学的に上質で且つ口当たりのいい調製物を製造するために甘味剤、香料、着色料及び保存剤より成る群から選択される一つ以上の薬剤を含みうる。適切な甘味料はスクロース、ラクトース、グルコース、アスパルテーム又はサッカリンを含む。適切な崩壊剤はコーンスターチ、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、キサンタンガム、ベントナイト、アルギン酸又は寒天を含む。適切な香料はペパーミント油、冬緑油、サクランボ、オレンジ又はラズベリーの香料を含む。適切な保存剤は安息香酸ナトリウム、ビタミンＥ、アルファトコフェロール、アスコルビン酸、メチルパラベン、プロピルパラベン又は亜硫酸水素ナトリウムを含む。適切な潤滑剤は、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、オレイン酸ナトリウム、塩化ナトリウム又はタルクを含む。適切な時間遅延剤は、モノステアリン酸グリセリン又はジステアリン酸グリセリンを含む。錠剤は、錠剤の製造に適した毒性のない薬学的に許容しうる賦形剤と混合した状態で活性成分を含む。
これらの賦形剤は、例えば（１）炭酸カルシウム、乳糖、燐酸カルシウム又は燐酸ナトリウムなどの不活性希釈剤、（２）コーンスターチ又はアルギン酸などの顆粒剤及び崩壊剤、（３）でんぷん、ゼラチン又はアカシアなどの結合剤；並びに（４）ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸又はタルクなどの潤滑剤であって良い。これらの錠剤は、被覆されなくても良く又は胃腸管での分解及び吸収を遅延する既知の技術により被覆されることによってより長期間にわたる持続作用を提供しても良い。例えば、モノステアリン酸グリセリン又はジステアリン酸グリセリンなどの時間遅延物質が使用されうる。被覆は、米国特許第４，２５６，１０８号；第４，１６０，４５２号及び第４，２６５，８７４号に記載される技術を用いて実施し、制御放出用の浸透性治療錠剤を成形してもよい。
本発明の方法で有用な薬学的に活性な薬剤並びに式Ｉ又は式ＩＩの化合物は、インビボ適用のため、注射又は経時的に漸次潅流により非経口的に独立して又は一緒に投与できる。投与は、静脈内、動脈内、腹膜内、筋内、皮下、腔内、経皮又は例えば浸透圧ポンプによる注入であってもよい。インビボ研究用に、該薬剤は、生物学的に許容しうる適切な緩衝液に添加又は溶解してもよく、細胞又は組織に添加してもよい。
非経口投与用の調製物は滅菌した水溶液又は非水溶液、懸濁液及び乳濁液を含む。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、及びオレイン酸エチルなどの注射可能な有機酸エステルである。水性担体は、水、アルコール／水溶液、乳濁液又は懸濁液を含み、生理食塩水及び緩衝化媒体を含む。非経口賦形剤は、塩化ナトリウム溶液、リンガー・デキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウムを含み、乳酸加リンガー静脈内賦形剤は流動性のある栄養補給剤、電解質補充剤（リンガー・デキストロースに基づくもの等）などを含む。保存料及び他の添加物は、例えば、抗菌薬、抗酸化剤、キレート剤、増殖因子及び不活性ガスなどであっても良い。
一般的に、「治療する（treating）」、「治療（treatment）」などの用語は、所望の薬理効果及び／又は生理学的効果を得るために被験体、組織又は細胞に影響を与えることを意味するために本明細書で用いられる。該効果は完全に又は部分的に疾患又はその徴候若しくは症状を防ぐ点で予防的であり及び／又は部分的に若しくは完全な疾患治癒の点で治療的でありうる。本明細書で用いられる「治療する」は、脊髄動物、哺乳動物、特にヒトの疾患のあらゆる治療又は予防を含み、（ａ）該疾患に罹りやすいが未だ該疾患に罹患したと診断されていない被験体に疾患が起きることを予防すること、（ｂ）該疾患を阻害すること、即ち、その進行を停止すること、又は（ｃ）該疾患の影響を軽減又は改善すること、即ち、該疾患の影響を逆行させることを含む。
本発明は、疾患を改善するのに有用な種々の医薬組成物を含む。本発明の実施態様の一つに基づく医薬組成物は、式Ｉ又は式ＩＩの化合物、その類似体、誘導体若しくは塩、又は式Ｉ若しくは式ＩＩの化合物の組み合わせ及び一つ以上の薬学的に活性な薬剤を担体、賦形剤及び添加剤又は助剤を用いて被験体への投与に適した剤形にすることにより調製される。しばしば使用される担体又は助剤は、炭酸マグネシウム、二酸化チタン、乳糖、マンニトール及び他の糖類、タルク、乳タンパク質、ゼラチン、デンプン、ビタミン、セルロース及びその誘導体、動物油及び植物油、ポリエチレングリコール並びに滅菌水、アルコール、グリセロール及び多価アルコールなどの溶媒を含む。静脈内賦形剤は流動性のある栄養補給剤を含む。保存料は抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤及び不活性ガスを含む。他の薬学的に許容しうる担体は、例えばレミングトンの薬科学、第２０版、ウィリアムズ・アンド・ウィルキンズ（2000）及びブリティッシュ・ナショナル・フォーミュラリー，第４３版（ブリティッシュ・メディカル・アソシエーション及びブリティッシュ・ファーマシューティカル・ソサイアティ・オブ・グレート・ブリテン，2002、http://bnf.rhn.net）に記載されているように、水溶液、塩、保存料、緩衝液などを含む毒性のない賦形剤を含む。該文献の内容は参照により本明細書にインコーポレートされる。医薬組成物の種々の化合物のｐＨ及び正確な濃度は当分野の常套技術に従って調整される。グッドマンとギルマンの治療の薬理基礎（第７版、1985）を参照せよ。
該医薬組成物は、用量単位で調製され投与されることが好ましい。固体の用量単位は錠剤、カプセル及び坐剤であって良い。被験体の治療用に、化合物の活性、投与様式、疾患の性質及び重症度、被験体の年齢並びに体重に応じて、異なる日用量が使用できる。しかしながら、特定の状況下では、より高い又はより低い日用量が適しうる。日用量の投与は、個々の用量単位か又はそうでなければ幾つかの少用量単位の剤形で単回投与することにより、また細分化された用量を特定の間隔を置いて複数回投与することにより、共に実施できる。
本発明の医薬組成物は、治療に有効な用量で局所的に又は全身に投与されうる。この用途に有効な量は、言うまでもなく、疾患の重症度並びに被験体の体重及び全身状態に依存する。通常、インビトロで使用される用量は医薬組成物のインサイチュ投与に有用な量に役立つ指針を提供でき、動物モデルは細胞毒性副作用の治療に有効な用量を決定するために用いられうる。例えばランガー、Science、249:1527（1990）に様々な考察が記載されている。経口用途の製剤は、活性成分が例えば炭酸カルシウム、燐酸カルシウム又はカオリンなどの不活性な固体の希釈剤と混合されている硬ゼラチンカプセルの剤形であってよい。該製剤は、活性成分が水又はピーナッツ油、液体パラフィン若しくはオリーブ油などの油性媒体と混合されている軟ゼラチンカプセルの剤形であってもよい。
水性懸濁液は、通常水性懸濁液の製造に適した賦形剤と混合した活性物質を含む。このような賦形剤は、（１）カルボキシメチル・セルロース・ナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカント・ゴム及びアカシア・ゴムなどの懸濁剤、（２）（ａ）レシチンなどの天然に存在するリン脂質、（ｂ）例えばステアリン酸ポリオキシエチレンなど、脂肪酸とアルキレン・オキサイドとの縮合産物、（ｃ）例えばヘプタデカエチレンオキシセタノールなど、長鎖脂肪族アルコールとエチレン・オキサイドとの縮合産物、（ｄ）モノオレイン酸ポリオキシエチレン・ソルビトールなど、脂肪酸及びヘキシトール（hexitol）に由来する部分エステルとエチレン・オキサイドとの縮合産物、又は（ｅ）例えばモノオレイン酸ポリオキシエチレン・ソルビタンなど、脂肪酸及びヘキシトール無水物に由来する部分エステルとエチレン・オキサイドとの縮合産物でありうる分散剤又は湿潤剤であってもよい。
医薬組成物は滅菌済みの注射可能な水性又は油脂性の懸濁液の剤形でありうる。この懸濁液はそれらの適切な分散剤又は湿潤剤及び上述した懸濁剤を用いて既知の方法に従って製剤化されうる。注射用の滅菌調製物も非経口で許容しうる毒性のない希釈剤又は溶媒の滅菌注射用の溶液又は懸濁液、例えば１,３−ブタンジオール溶液などであってもよい。使用可能な許容しうる賦形剤及び溶媒の中には、水、リンガー溶液及び等張性塩化ナトリウム溶液がある。更に、滅菌した不揮発性油は従来通り溶媒又は懸濁媒体として使用される。この目的には、合成のモノグリセリド又はジグリセリドを含む任意の無刺激性の不揮発性油を使用してもよい。その上、オレイン酸などの脂肪酸が注射物質の調製に使用される。
式Ｉ又は式ＩＩの化合物は、小さな単層状小胞（unilamellar vesicle）、大きな単層状小胞、及び複層状小胞などのリポソーム送達系の剤形で投与されてもよい。リポソームは、コレステロール、ステアリルアミン、又はホスファチジルコリンなどの種々のリン脂質から形成できる。
式Ｉ又は式ＩＩの化合物は、例えば、当分野で常套的な方法により調製されうる獣医用組成物の剤形での使用にも提供されうる。このような獣医用組成物の例としては、
（ａ） 経口投与、外用、例えば飲薬（例えば水溶液又は非水溶液又は懸濁液）、錠剤若しくは丸薬、飼料と混合する粉末、顆粒若しくはペレット、舌に適用するペースト、
（ｂ） 例えば滅菌溶液若しくは滅菌懸濁液として、例えば皮下、筋内若しくは静脈内の注射による非経口投与、若しくは（適切ならば）懸濁液若しくは溶液が乳頭を介して乳房に導入される乳房内注射による非経口投与、
（ｃ） 例えば皮膚に適用されるクリーム、軟膏若しくはスプレーとして局所適用、又は
（ｄ） 例えばペッサリー、クリーム若しくは泡として、膣内
に適応されるものが含まれる。
本発明の式Ｉ又は式ＩＩの化合物の用量レベルは、体重１キログラム当たり約０．５ｍｇから約２０ｍｇのオーダーであり、好ましい用量範囲は一日当たり体重１キログラム当たり約０．５ｍｇから約１０ｍｇ（一日当たり１患者当たり約０．５ｇから約３ｇまで）である。単回用量を作製するために担体物質と組み合わせてもよい活性成分の量は、治療される宿主及び具体的な投与様式に応じて変化する。例えば、ヒトへの経口投与を対象とした製剤は、全組成物の約５パーセントから９５パーセントまでで変化しうる適切且つ便利な量の担体物質とともに、約５ｍｇから１ｇの活性化合物を含みうる。
或いは、本発明の化合物は、計画では合計で少なくとも二回の投与があるように、分割投与計画で投与しても良い。投与は少なくとも２時間毎から４時間毎又はそれ以上毎に施されるのが好ましく、例えば該化合物は１時間おきに又は３０分おきに投与しても良い。好ましい一実施態様において、分割投与計画は、血中の活性薬剤の有効含量を維持するように、活性化合物の血中レベルが第一回目の投与後に達した最大血漿レベルの約５％〜３０％まで低下するほど十分に長くその第一回目の投与から間隔を空けた後の、本発明の化合物の第二回目の投与工程を含む。或いは、一回以上の連続投与は、それぞれの先行投与から対応する間隔で、好ましくは血漿レベルが直前の最大値の約１０％〜５０％まで低下した際に施しても良い。
しかしながら、いずれの特定の患者の具体的な用量レベルは、使用される特定の化合物の活性、年齢、体重、全身の健康、性別、食事、投与時間、投与経路、排泄速度、薬物の組み合わせ及び治療中の特定疾患の重症度を含む種々の因子に依存することが理解されよう。
（実施例）
本発明は参照のためにのみ下記の非限定的な実施例により詳細に説明する。
（１） ８−ヒドロキシ−キノキサリン及び８−ヒドロキシ−３Ｈ−キナゾリン−４−オンの調製
８−ヒドロキシ−キノキサリン及び８−ヒドロキシ−３Ｈ−キナゾリン−４−オンは文献で知られる工程により調製できる。例えば、ピルビン酸アルデヒドなどの１，２−ジカルボニル化合物で適切に置換された１，２−フェニレンジアミンの縮合により一連の２−置換又は３−置換の８−ヒドロキシキノキサリンが得られる（例えば、アベと共同研究者ら，J. Med Chem., 1998, 41, 4062を参照）（スキーム１）。ビスマス（Ｏ）の存在下におけるエポキシドと１，２−フェニレンジアミンの縮合による該化合物の代替合成はスキーム２に示す（アントニオッティと共同研究者ら, Tetrahedron Letters, 2002, 4, 3971を参照）。２−位及び／又は３−位の更なる合成は既知の方法を用いて達成できる。
８−ヒドロキシ−３Ｈ−キナゾリン−４−オン自体は文献の手法（アイヤルとダール, J. Sci. Ind. Res., 1956, 15Ｃ, 1を参照）に従って調製した。８−ヒドロキシ−３Ｈ−キナゾリン−４−オンの誘導体は文献で知られる多数の方法により合成できる。３Ｈ−キナゾリン−４−オン誘導体に対する最も一般的なアプローチの一つは置換２−アミノベンズアミドによるものである。２−アミノベンズアミドは二つの異なるアプローチを通して利用されうる（スキーム３）。例えば、２−ニトロ安息香酸３Ａはまず対応するアントラニル酸３Ｂに変換される。アミン及びＣＤＩなどの活性化剤の存在下で、３Ｂは２−アミノベンズアミド３Ｃを得る（経路Ａ）。或いは、ＣＤＩの存在下で３Ａ及びアミンはまず２−ニトロベンズアミド３Ｄに変換できる。続いて３Ｄの還元により３Ｃを得る（経路Ｂ）。
４，６−ジクロロ−３−ヒドロキシ−２−ニトロ安息香酸（４Ｆ）（スキーム４）の化合物は一連の８−ヒドロキシ−３Ｈ−キナゾリン−４−オンの供給用及び特に５，７−ジクロロ置換された誘導体の合成用に用いられる重要な中間体である。従って、ゴルスタインとシャッフ（Helv. Chim. Acta, 1957、57(23), 132）に従って、市販の２，４−ジクロロ安息香酸（４Ａ）は硝化され２，４−ジクロロ−５−ニトロ安息香酸（４Ｂ）を得る。化合物４Ｂはアミン４Ｃ及びアセトアミド４Ｄを経て３−アセトアミド−４，６−ジクロロ−２−ニトロ安息香酸（４Ｅ）に変換される。続いて４Ｅの塩基加水分解により２−ニトロ安息香酸４Ｆを得る。全段階が高収率で進行する（約９０％）。
上記化学式４Ｅの中間体は新規であるため本発明の一部を成す。この新規な中間体の使用により、スキーム４の工程は高収率でありスケールアップを施せるという結果になる。
化合物４Ｆなどの２−ニトロ安息香酸から８−ヒドロキシ−３Ｈ−キナゾリン−４−オン（５Ｃ）への変換はスキーム５に示す。従って、ＣＤＩの存在下におけるアミンを用いた４Ｆの処理はＮ−（置換）ベンズアミド５Ａを生成する。ニトロ基の還元及び得られるアミン５Ｂとギ酸／ＣＤＩとのカップリングにより所望のＮ−アルキル化誘導体５Ｃを得る。
Ｎ−アルキル化キナゾリン−４−オンもスキーム６に示される経路を通して調製されうる。従って、４Ｆなどの適切に置換された２−ニトロ安息香酸はまずＣＤＩなどの活性化剤の存在下でアミンと処理される。これは対応するニトロベンズアミドを提供し、還元条件下でアミノベンズアミドを得る。続いて還流ホルムアミドを用いたアミノベンズアミドの処理は３Ｈ−キナゾリン−４−オンを生成する。３Ｈ−キナゾリン−４−オンは次いでＮａＨなどの塩基で脱プロトン化され、適切なハロゲン化アルキルで処理される。
スキーム７は２−置換８−ヒドロキシ−３Ｈ−キナゾリン−４−オンの合成までの経路を示す。従って、塩化チオニルを用いた２−アミノ−４，６−ジクロロ−３−ヒドロキシ安息香酸などのアントラニル酸の処理後、アンモニアと酸塩化物との反応により対応するベンズアミドを得る。これは順にクロロアセチル酢酸で処理して５，７−ジクロロ−２−クロロメチル−８−ヒドロキシ−３Ｈ−キナゾリン−４−オンを得る（例えば、タニと共同研究者ら, J. Med. Chem., 1979, 22, 95を参照せよ）。さらに２−クロロメチル誘導体から一連の２−置換メチル誘導体、例えば２−（メチルアミノ）メチル誘導体の合成は標準的な文献の方法を用いて達成できる。前述の条件を用いたこれらの誘導体のＮ−アルキル化により２，３−二置換誘導体が得られる。
２，３−二置換−８−ヒドロキシ−３Ｈ−キナゾリン−４−オンはスキーム８に示される経路を通して合成してもよい。従って、２−アミノ−３Ｎ−（置換）ベンズアミドをＢｏｃ保護グリシンなどの適切なカルボン酸で処理する。続いてナトリウム・メトキシドによる脱水（リーと共同研究者ら, J. Med. Chem., 1995, 38, 3547）により所望の類似体が得られる。
（２） ８−メトキシ−４（３Ｈ）−キナゾリノン、８−ヒドロキシ−シンノリン(cinnoline)、５,８−ジヒドロキシ−キノキサリン、４，５−ジヒドロキシ−フェナジン、４，８−ジヒドロキシ−フェナジン、４−ヒドロキシ−アクリジン及び５−ヒドロキシ−３−メチル−２（１Ｈ）−キノキサリノンの調製
一般論
下記の化合物は文献に記載されている方法により調製した。
８−メトキシ−４（３Ｈ）−キナゾリノン（３）５、８−ヒドロキシ−シンノリン(cinnoline)（Ｃ１）２、５，８−ジヒドロキシ−キノキサリン（Ｂ３９）１、４，５−ジヒドロキシ−フェナジン（Ｆ５）３、４，８−ジヒドロキシ−フェナジン（Ｆ２）３、４−ヒドロキシ−アクリジン（Ｅ１）４、及び５−ヒドロキシ−３−メチル−２（１Ｈ）−キノキサリノン（Ｂ１２）１９。
下記の化合物は市販品を調達した。
８−ヒドロキシ−キナゾリン（Ａ１）、４−ヒドロキシ−フェナジン（Ｆ１）、４，１０−フェナントロリン−５−オール（Ｄ２）、４，７−フェナントロリン−５，６−ジオール（Ｄ３）及び８−ヒドロキシ−２−メチル−４（３Ｈ）−キナゾリノン（１）。アミン類：エチルアミン、ヒスタミン、２−（２−アミノエチル）ピリジン、２−（２−メチルアミノエチル）ピリジン。アルデヒド類：４−イミダゾールカルボキシアルデヒド、２−チアゾールカルボキシアルデヒド及び２−ピリジンカルボキシアルデヒド。アゾール類：ピラゾール、イミダゾール、メチルイミダゾール及び１Ｈ−１，２，３−トリアゾール。ボロン酸：フェニルボロン酸、２−（トリフルオロメチル）フェニルボロン酸、２−メトキシフェニルボロン酸、ｏ−トリルボロン酸、２−フルオロフェニルボロン酸、３−メトキシフェニルボロン酸、４−メトキシフェニルボロン酸、ｍ−トリルボロン酸、３，５−ジフルオロフェニルボロン酸、２，４−ジフルオロフェニルボロン酸、３−チオフェンボロン酸、３−フルオロフェニルボロン酸及び４−フルオロフェニルボロン酸。並びに有機亜鉛試薬：臭化２−ピリジル亜鉛、ヨウ化２−（メチルチオ）フェニル亜鉛、ヨウ化２−（エトキシカルボニル）フェニル亜鉛及び臭化６−メチルピリジル亜鉛（０．５Ｍ ＴＨＦ溶液）は市販であった（アルドリッチ社）。３−ピリジルボロン酸はフロンティア・サイエンティフィック社から購入した。２−アミノメチルチアゾールは文献１３に従って調製した。溶媒は分析用等級であり、調達した状態のまま使用した。ＴＨＦはアルゴン下でナトリウム及びベンゾフェノンから蒸留した。１Ｈ ＮＭＲスペクトル（δ、ＴＭＳ内部標準）は特に断らない限りヴァリアン・ユニティ３００分光計で記録し、Ｊ値はヘルツで示す。質量スペクトルデータはマイクロマス・クアトロＩＩ質量分析計で記録した。
化合物の６クラスの誘導体、即ち８−ヒドロキシ−キナゾリン、８−ヒドロキシ−キノキサリン、８−ヒドロキシ−シンノリン、４，７（４，１０）−フェナントロリン−５−オール、４−ヒドロキシ−アクリジン及び６−ヒドロキシ−フェナジンの合成は、Ａ部、Ｂ部、Ｃ部、Ｄ部、Ｅ部及びＦ部にそれぞれ記載する。
Ａ部：８−ヒドロキシ−キナゾリン誘導体Ａ２−Ａ１３８の合成
一連の８−ヒドロキシ−キナゾリン誘導体の調製はチャートのＡ１からＡ５に要約する。
４−クロロ−８−ヒドロキシ−２−メチル−キナゾリン（Ａ２）の調製（スキームＡ１）
８−ヒドロキシ−２−メチル−４（３Ｈ）−キナゾリノン（０．０１モル）及びオキシ塩化リン（１０ｍＬ）は還流下で３０分間加熱した。過剰のオキシ塩化リンは減圧下で除去し、残留物は氷（５０ｇ）及び水（５０ｍＬ）の混合物に添加し、ｐＨは６に調整した（アンモニア水）。４−クロロ−８−ヒドロキシ−２−メチル−キナゾリン（Ａ２）は濾過により分離した。
８−ヒドロキシ−２−メチル−キナゾリン（Ａ３）（スキームＡ１）の調製
４−クロロ−８−ヒドロキシ−２−メチル−キナゾリン（０．０１モル）は文献に記載される方法６に従ってヨウ化水素酸（１００ｍＬ；赤燐から新たに蒸留された）で処理した。これにより固体の８−ヒドロキシ−２−メチル−キナゾリン（Ａ３）が得られた。
８−ヒドロキシ−キナゾリン−２−カルボキシアルデヒド（２）の調製（スキームＡ２）
８−ヒドロキシ−２−メチル−キナゾリン（Ａ３）（５ｍｍｏｌ）を含むジオキサン溶液（１０ｍＬ）を、ＳｅＯ２（８．８ｍｍｏｌ）を含むジオキサン（３０ｍＬ）の撹拌混合物に５０℃で３時間にわたって滴下した。次いで得られた混合物を８０℃で１６時間加熱し、冷却し、固体を濾別した。濾液は濃縮しシリカのカラム・クロマトグラフィー（ジクロロメタン／ＭｅＯＨ、４０：１）により精製した。これにより固体の８−ヒドロキシ−キナゾリン−２−カルボキシアルデヒド（２）が得られた。
２−[アルキルアミノ−メチル]−８−ヒドロキシ−キノキサリン（Ａ４〜Ａ７）の調製（スキームＡ２）
トリアセトキシホウ水素化ナトリウム（１ｍｍｏｌ）を８−ヒドロキシ−キノキサリン−２−カルボキシアルデヒド（１ｍｍｏｌ）及びエチルアミン（１ｍｍｏｌ）を含むジクロロメタン撹拌溶液（１０ｍＬ）に添加した。該混合物を室温で１６時間撹拌し、中和し（ＮａＨＣＯ３水）、濃縮した。残留物から、シリカのカラム・クロマトグラフィー後にＡ４が得られた。
同様な様式で、アミン類、即ちヒスタミンによる２の還元アミノ化によりＡ５を得た。２−（２−アミノエチル）ピリジンはＡ６を生じ、２−（２−メチルアミノエチル）ピリジンはＡ７を生じた。
８−ヒドロキシ−キナゾリン−２−カルボキシアルデヒド・オキシム（Ａ８〜Ａ９）の調製（スキームＡ３）
８−ヒドロキシ−キナゾリン−２−カルボキシアルデヒド（２）（１ｍｍｏｌ）、ＮａＯＡｃ（２ｍｍｏｌ）、ヒドロキシルアミン塩酸塩（１．５ｍｍｏｌ）及び水（１０ｍＬ）の混合物を１００℃で１５分間加熱した。沈殿物は濾過により単離した。これは固体の８−ヒドロキシ−キナゾリン−２−カルボキシアルデヒド・オキシム（Ａ８）であった。
塩酸メトキシアミンを含むピリジンとの反応を２を用いて繰り返すとＡ９が得られた。
８−ヒドロキシ−２−メチルアミノ−キナゾリン（Ａ１０）の調製（スキームＡ４）
２−カルボン酸・オキシム（１ｍｍｏｌ）を含むＭｅＯＨ（２０ｍＬ）溶液を水素添加分解条件（大気中のＨ２、１０％Ｐｄ／Ｃ）下で１６時間処理した。固体を濾別し、濾液を濃縮して８−ヒドロキシ−２−メチルアミノ−キナゾリンを得た（Ａ１０）。
４，８−ジメトキシ−キナゾリン−２−カルボン酸（Ａ１１）の調製（スキームＡ５）
８−メトキシ−４（３Ｈ）−キナゾリノン５（３）（０．０５ｍｏｌ）及びＴＨＦ（１００ｍＬ）の撹拌混合物にヨードメタン（０．１ｍｏｌ）、臭化テトラブチルアンモニウム（１００ｍｇ）及びＮａＯＨ水（７．５５ｇのＮａＯＨと２０ｍＬのＨ２Ｏから調製した）を添加した。４０℃で１６時間後、混合物は濃縮し、残る残留物はＨ２Ｏ及びジクロロメタン（１：１、２００ｍＬ）に分配した。有機層は塩水で洗浄し、乾燥し、濃縮した。カラム精製により４，８−ジメトキシ−キナゾリン（４）を得た。
０℃の４（４０ｍｍｏｌ）を含むＣＨＣｌ３（２００ｍＬ）の撹拌溶液に１０分間にわたってｍ−クロロ過安息香酸（４４ｍｍｏｌ）を徐々に添加した。０℃で更に３０分後、この混合物を３０分間にわたって室温まで温めた後、乾燥するまで濃縮した。残る残留物に酢酸エチル及び１ＮのＮａＨＣＯ３（１：１、２００ｍＬ）を添加し、層分離し、有機層は乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、濃縮した。これはＮ−オキシド５を生じた。
５（３０ｍｍｏｌ）、ベンゼン（８０ｍＬ）及び硫酸ジメチル（３５ｍｍｏｌ）の混合物は還流下で１６時間撹拌し、冷却し、真空濃縮した。残る残留物を含む０℃のＨ２Ｏ（１００ｍＬ）にＮａＣＮ（９０ｍｍｏｌ）を添加した。３時間後、反応混合物を中和し（ＨＯＡｃ）、ジクロロメタンで抽出し、抽出物を混合し乾燥した。溶媒の除去により、２−シアノ−化合物６を得た。
６（２０ｍｍｏｌ）及びＮａＯＨ（４０ｍｍｏｌ）の混合物を含むＨ２Ｏ（２０ｍＬ）を１００℃で４時間加熱し、冷却した。溶液のｐＨを４に調整し（氷ＨＯＡｃ）、混合物を酢酸エチルで抽出した（５０ｍＬ×４）。混合した抽出物を乾燥し、揮発物質は除去した。これにより、固体の４，８−ジメトキシ−キナゾリン−２−カルボン酸を得た。続いて、ＢＢｒ３を用いて脱−Ｏ−メチル化すると、４，８−ジヒドロキシ−キナゾリン−２−カルボン酸（Ａ１１）が得られた。
４，８−ジヒドロキシ−キナゾリン−２−カルボン酸アミド（Ａ１２〜Ａ１７）の調製（スキームＡ５）
１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（１ｍｍｏｌ）を１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（１ｍｍｏｌ）及び４，８−ジヒドロキシ−キナゾリン−２−カルボン酸（Ａ１１）（１ｍｍｏｌ）を含むＤＭＦ及びジクロロメタン（１：１、１０ｍＬ）の撹拌溶液に添加した。３０分後、ヒスタミン（１ｍｍｏｌ）を添加し、その混合物を室温で更に１６時間撹拌した。次いで、揮発物質を真空除去し、シリカのカラム・クロマトグラフィーによる精製（酢酸エチル／ｉ−ＰｒＯＨ／２ＮのＮＨ４ＯＨ、６：２：１）後、残る残留物から４，８−ジヒドロキシ−キナゾリン−２−カルボン酸［２−（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）−エチル−アミド］（Ａ１２）を得た。
上記の反応をＡ１１とアミンを用いて反復した。２−（２−アミノエチル）ピリジンはＡ１３を生じ、２−（アミノメチル）ピリジンはＡ１４を生じ、２−アミノチアゾールはＡ１５を生じ、２−アミノフェノールはＡ１６を生じ、１，２−フェニレンジアミンはＡ１７を生じた。
８−ヒドロキシ−キナゾリン−２−カルボン酸アミド（Ａ１８〜Ａ２３）の調製（スキーム５）
４−ヒドロキシ−化合物（Ａ１２）（１．２ｍｍｏｌ）及びオキシ塩化リン（４ｍＬ）を還流下で１５分間加熱し、冷却した。氷（５０ｇ）を加え、この混合物をアンモニア水で塩基性化した。混合物をジクロロメタンで抽出し（２０ｍＬ×３）、抽出物を混合し、乾燥し、濃縮した。これにより、対応する４−クロロ−化合物７が得られた。
５０℃のｐ−トルエンスルホンヒドラジド（アルドリッチ社、２ｍｍｏｌ）を含むＣＨＣｌ３（１０ｍＬ）の撹拌混合物に４−クロロ化合物７（１ｍｍｏｌ）を１０分間にわたって徐々に添加した。１６時間後、固体を過により単離し、Ｈ２Ｏで洗浄し、乾燥した。これにより、４−Ｎ’−（ｐ−トルエンスルホンヒドラジノ）−化合物２１を得た。
４−Ｎ’−（ｐ−トルエンスルホンヒドラジノ）−化合物２１（０．８ｍｍｏｌ）を９５℃のＮａ２ＣＯ３（１０ｍｍｏｌ）及びＨ２Ｏ（１０ｍＬ）に添加し、この混合物を還流下で１５分間加熱し、冷却し、ろ過し、濾液はＣＨＣｌ３で抽出した。抽出液を混合し乾燥した。続いて揮発性物質を除去することにより、８−ヒドロキシ−キナゾリン−２−カルボン酸アミド（Ａ１８）を得た。
同様な様式で、残りの４（３Ｈ）−キナゾリノンＡ１３〜Ａ１７を８−ヒドロキシ−キナゾリン−２−カルボン酸アミド（Ａ１９〜Ａ２３）に変換した。
４−アリール（又は複素環）−８−ヒドロキシ−２−メチル−キノキサリン（Ａ２４〜Ａ３７）の調製（スキームＡ６）
２−ブロモプロパン（９ｍｍｏｌ）を４−クロロ−８−ヒドロキシ−２−メチル−キナゾリン（Ａ２）（６ｍｍｏｌ）、Ｋ２ＣＯ３（２４ｍｍｏｌ）及びＤＭＳＯ（２０ｍＬ）の撹拌混合物に添加した。室温で１６時間後、飽和ＮＨ４Ｃｌ（２０ｍＬ）は添加し、混合物をジクロロメタン（２０ｍＬ×３）で抽出した。抽出物を混合し濃縮した。ジエチルエーテル（１００ｍＬ）を該残留物に添加し、得られた混合物を２ＮのＮａＯＨ、Ｈ２Ｏ及び食塩水で逐次洗浄し、乾燥した（Ｎａ２ＳＯ４）。溶媒の除去により、固体の４−クロロ−８−イソプロポキシ−２−メチル−キナゾリン（３５）が得られた。
４−クロロ−８−イソプロポキシ−２−メチル−キナゾリン（３５）（０．５８ｍｍｏｌ）の撹拌混合物に、アルゴンの被膜下で、Ｐｄ（ＰＰｈ３）４（２０ｍｇ）、フェニルボロン酸（０．６２ｍｍｏｌ）、２ＮのＮａ２ＣＯ３（７．２ｍＬ）、ＥｔＯＨ（１．２ｍＬ）及びベンゼン（６ｍＬ）を添加した。混合物は還流下で１６時間撹拌し、冷却し、濃縮した。続いて、カラム・クロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘキサン）により、固体の８−イソプロポキシ−２−メチル−４−フェニル−キナゾリン（３６）を得た。
−７８℃の８−イソプロポキシ−２−メチル−４−フェニル−キナゾリン（３６）（０．３４ｍｍｏｌ）を含むジクロロメタン（２ｍＬ）の撹拌溶液に、ＢＣｌ３（１．３６ｍＬの１Ｍジクロロメタン溶液、１．３６ｍｍｏｌ）を添加した。該反応混合物を（２時間にわたって）室温まで温め、さらに２時間撹拌した。ＭｅＯＨ（５ｍＬ）を添加し、この混合物を乾固するまで濃縮した。この工程を４回反復した。残る残留物をジエチルエーテル（２ｍＬ×３）で更に洗浄し、８−ヒドロキシ−２−メチル−４−フェニル−キナゾリン（Ａ２４）を得た。
同様な様式で、ボロン酸、即ち、２−（トリフルオロメチル）フェニルボロン酸、２−メトキシフェニルボロン酸、ｏ−トリボロン酸、２−フルオロフェニルボロン酸、３−メトキシフェニルボロン酸、４−メトキシフェニルボロン酸、ｍ−トリルボロン酸、３，５−ジフルオロフェニルボロン酸、２，４−ジフルオロフェニルボロン酸、３−チオフェンボロン酸、３−フルオロフェニルボロン酸、４−フルオロフェニルボロン酸及び３−ピリジルボロン酸による４−クロロ−８−イソプロポキシ−２−メチル−キナゾリン（３５）の処理、並びにＢＣｌ３によるイソプロポキシ切断により、４−アリール（又は複素環）−８−ヒドロキシ−２−メチル−キナゾリン（Ａ２５〜Ａ３７）を得た。
４−アリール（又は複素環）−８−ヒドロキシ−キナゾリン（Ａ３８〜Ａ５１）の調製（スキームＡ７）
実施例９で前述した手法を用いて、８−メトキシ−４（３Ｈ）−キナゾロン５（３）（１０ｍｍｏｌ）及びオキシ塩化リンから４−クロロ−８−メトキシ−キナゾリン５０が得られた。実施例９に記載するように、フェニルボロン酸による４−クロライド５０の処理により、ＢＢｒ３を用いた脱Ｏ−メチル化の後、４−フェニル誘導体Ａ３８が得られた。５０のカップリング反応は一連のボロン酸を用いて繰り返した。即ち、２−（トリフルオロメチル）フェニルボロン酸、２−メトキシフェニルボロン酸、ｏ−トリボロン酸、２−フルオロフェニルボロン酸、３−メトキシフェニルボロン酸、４−メトキシフェニルボロン酸、ｍ−トリルボロン酸、３，５−ジフルオロフェニルボロン酸、２，４−ジフルオロフェニルボロン酸、３−チオフェンボロン酸、３−フルオロフェニルボロン酸、４−フルオロフェニルボロン酸及び３−ピリジルボロン酸から５１〜６４を得た。続いて、ＢＢｒ３によるメチルエーテルの切断により４−アリール（又は複素環）−８−ヒドロキシ−キナゾリンのＡ３９〜Ａ５１を得た。
５−クロロ−８−ヒドロキシ−キナゾリン（Ａ５２）の調製（スキームＡ８）
既に公開された７手法に従って、塩素（１２ｍｍｏｌ）を８−ヒドロキシ−キナゾリン（Ａ１）（１０ｍｍｏｌ）を含む９３％Ｈ２ＳＯ４撹拌溶液に添加した。３時間後、氷（１００ｇ）及びＨ２Ｏ（１００ｍＬ）を添加し、この混合物をアンモニア水で塩基性化し、ジクロロメタンで抽出し、該抽出物を乾燥した。溶媒の除去により、５−クロロ化合物Ａ５２を得た。
５−クロロ−８−ヒドロキシ−７−ヨード−キナゾリン（Ａ５３）の調製（スキームＡ８）
５−クロロ−８−ヒドロキシ−キナゾリン（１０ｍｍｏｌ）をＩＣｌ（１２ｍｍｏｌ）を含む濃ＨＣｌ（１０ｍＬ）撹拌溶液に添加した８。５分後、沈殿物を濾過により単離し、Ｈ２Ｏ、飽和チオ硫酸ナトリウム及びＨ２Ｏで順に洗浄し、乾燥した。これにより、固体の５−クロロ−８−ヒドロキシ−７−ヨード−キナゾリン（Ａ５３）を得た。
７−アリール（又は複素環）−５−クロロ−８−ヒドロキシ−キナゾリン（Ａ５４〜Ａ６７）の調製（スキームＡ８）
８−ヒドロキシ−化合物Ａ５３を、実施例９に記載する方法に従って２−ブロモプロパンを用いて対応するイソプロピルエーテル６５に変換した。
実施例９に記載する方法に従って、一連のボロン酸、即ちフェニルボロン酸、２−（トリフルオロメチル）フェニルボロン酸、２−メトキシフェニルボロン酸、ｏ−トリボロン酸、２−フルオロフェニルボロン酸、３−メトキシフェニルボロン酸、４−メトキシフェニルボロン酸、ｍ−トリルボロン酸、３，５−ジフルオロフェニルボロン酸、２，４−ジフルオロフェニルボロン酸、３−チオフェンボロン酸、３−フルオロフェニルボロン酸、４−フルオロフェニルボロン酸及び３−ピリジルボロン酸を用いた５−クロロ−７−ヨード−８−イソプロポキシ−キナゾリン（６５）の処理により、６６〜７９を得た。続いて、ＢＣｌ３を用いた８−イソプロポキシ基の切断によりＡ５４〜Ａ７９を得た。
７−クロロ−８−ヒドロキシ−キナゾリン（Ａ６９）の調製（スキームＡ９）
８−ヒドロキシ−キナゾリン（Ａ１）（０．１ｍｏｌ）及び濃硫酸（５０ｍＬ）は１００℃で５時間加熱し冷却した。該溶液は次いで３００ｍＬの冷Ｈ２Ｏに慎重に添加した。その結果得られた沈殿物は、濾過により単離し、Ｈ２Ｏで洗浄し、乾燥した。これにより固体の５−スルホン酸Ａ６８を得た。
５−スルホン酸Ａ６８（０．０９ｍｏｌ）及びＨ２Ｏ（２２５ｍＬ）の撹拌混合物に、ＫＯＨ（０．２５ｍｏｌ）及びＮａＯＣｌ（１０〜１３％の市販の塩素を含む２３０ｍＬの溶液）９を添加した。室温で１．５時間後、溶液をアンバーライトＩＲ−１２０（Ｈ＋）樹脂のカラムを通過させた。溶出液は２０ｍＬに濃縮した。次にアセトン（２０ｍＬ）を添加し、沈殿物を濾過により単離した。続いて、アセトンで洗浄し、乾燥し、７−クロロ−８−ヒドロキシ−キナゾリン（Ａ６９）を得た。
７−クロロ−８−ヒドロキシ−５−ヨード−キナゾリン（Ａ７０）の調製（スキームＡ９）
７−クロロ−８−ヒドロキシ−キナゾリン（Ａ６９）（０．１ｍｏｌ）及び酢酸カリウム（０．１５ｍｏｌ）を含むＭｅＯＨ及びＨ２Ｏ（１９：１，２５０ｍＬ）の溶液に、ヨウ素（０．０９５ｍｏｌ）を含むＭｅＯＨ及びＨ２Ｏ（１９：１，３５０ｍＬ）の溶液を３０分間にわたって添加した。次いで、この混合物を還流下で１５分間加熱し、冷却し、Ｈ２Ｏ（４００ｍＬ）を添加した。沈殿物を濾過により単離し、飽和チオ硫酸ナトリウム及びＨ２Ｏで洗浄し、乾燥した。これにより、固体の７−クロロ−８−ヒドロキシ−５−ヨード−キナゾリン（Ａ７０）を得た。
４−アリール（又は複素環）−７−クロロ−８−ヒドロキシ−キナゾリン（Ａ７１〜Ａ８４）の調製（スキームＡ１０）
実施例９に記載の方法に従って、一連のボロン酸、即ち、フェニルボロン酸、２−（トリフルオロメチル）フェニルボロン酸、２−メトキシフェニルボロン酸、ｏ−トリボロン酸、２−フルオロフェニルボロン酸、３−メトキシフェニルボロン酸、４−メトキシフェニルボロン酸、ｍ−トリルボロン酸、３，５−ジフルオロフェニルボロン酸、２，４−ジフルオロフェニルボロン酸、３−チオフェンボロン酸、３−フルオロフェニルボロン酸、４−フルオロフェニルボロン酸及び３−ピリジルボロン酸による５−クロロ−７−ヨード−８−イソプロポキシ−キナゾリン（８０）の処理により、８１〜９４を得た。続いて、ＢＣｌ３による８−イソプロポキシ基の切断によりＡ７１〜Ａ８４を得た。
２−クロロ−４，８−ジメトキシ−キノキサリン（９６）の調製（スキームＡ１１）
Ａｃ２Ｏ（６ｍＬ）を、Ｎ−オキサイド５（１０ｍｍｏｌ）及びジクロロメタン（１０ｍＬ）の撹拌混合物に添加した。次に溶媒は真空で除去し、その結果得られた溶液を還流下で１時間加熱し、冷却し、濃縮した。残る残留物はジエチルエーテルで洗浄した（１０ｍＬ×２）。これにより、固体の４，８−ジメトキシ−２（１Ｈ）−キナゾリノン（９５）を得た。
オキシ塩化リン（２０ｍＬ）を用いた４，８−ジメトキシ−２（１Ｈ）−キナゾリノン（９５）（５ｍｍｏｌ）の処理、及び実施例８の標準仕上げにより２−クロライド９６を得た。
２−アリール（又は複素環）−４，８−ジヒドロキシ−キナゾリン（Ａ８５〜Ａ９８）の調製（スキームＡ１２）
実施例９で前述した手法に従って、ボロン酸、即ち、フェニルボロン酸、２−（トリフルオロメチル）フェニルボロン酸、２−メトキシフェニルボロン酸、ｏ−トリボロン酸、２−フルオロフェニルボロン酸、３−メトキシフェニルボロン酸、４−メトキシフェニルボロン酸、ｍ−トリルボロン酸、３，５−ジフルオロフェニルボロン酸、２，４−ジフルオロフェニルボロン酸、３−チオフェンボロン酸、３−フルオロフェニルボロン酸、４−フルオロフェニルボロン酸及び３−ピリジルボロン酸と２−クロライド９６（０．１ｍｍｏｌ）とのカップリングにより９７〜１１０を得た。続いて、ＢＢｒ３による８−Ｏ−メチルエーテルの切断によりＡ８５〜Ａ９８を得た。
２−アリール（又は複素環）−８−ヒドロキシ−キナゾリンの調製（スキームＡ１２）
実施例６で前述した方法に従って、オキシ塩化リン、ｐ−トルエンスルホンヒドラジド及びＮａ２ＣＯ３による４−ヒドロキシ化合物Ａ８５〜Ａ９８の連続処理により、２−アリール（又は複素環）−８−ヒドロキシ−キナゾリンＡ９９〜Ａ１１２を得た。
２−クロロ−８−メトキシ−キナゾリン（１１３）の調製（スキームＡ１３）
実施例６で前述した手法に従って、８−ヒドロキシ−キナゾリン（Ａ１）（２０ｍｍｏｌ）及びヨードメタンから８−メトキシ−キナゾリン（１１１）を得た。８−メトキシ−キナゾリン（１１１）（１０ｍｍｏｌ）は次いでｍ−クロロ過安息香酸で処理しＮ−オキサイド１１２を得た。実施例１４のＡｃ２Ｏ及びオキシ塩化リンによるＮ−オキサイド１１２の連続処理により２−クロロ−８−メトキシ−キナゾリン（１１３）を得た。
２−[（Ｎ’−メチル）−複素環式]−８−ヒドロキシ−キナゾリン（Ａ１１３〜Ａ１１６）の調製（スキームＡ１３）
２−クロロ−８−メトキシ−キナゾリン（１１３）（１０ｍｍｏｌ）を含むピリジン（１０ｍＬ）溶液を塩酸メチルアミン（アルドリッチ社、１５ｍｍｏｌ）に添加した。室温で１６時間後、該混合物を真空濃縮した。続いて、該残留物のカラム精製により２−（Ｎ’−メチル）−化合物１１４を得た。
文献に記載される方法１１に従って、［Ｐｄ２（ｄｂａ）３］及びＤＰＰＰの存在下、２−ブロモピリジン（１．２ｍｍｏｌ）による１１４（１ｍｍｏｌ）のアミノ化により８−メトキシ−２−［（Ｎ’−ピリジル）メチル］−キナゾリン（１１５）を得た。続いて、ＢＢｒ３による１１５の処理（実施例６）から８−ヒドロキシ−キナゾリン誘導体Ａ１１３を得た。
１１４のアミノ化は、一連の２−ブロモ置換複素環、即ち２−ブロモチアゾール、４−ブロモ−１Ｈ−イミダゾール及び４−ブロモ−１−メチルイミダゾールを用いて反復し、１１６〜１１８を得た。続いて、ＢＢｒ３によるＯ−メチルエーテルの切断からＡ１１４〜Ａ１１６を得た。
５,７−ジアミノ−８−ヒドロキシ−キナゾリン（Ａ１１７）の調製（スキームＡ１４）
８−ヒドロキシ−キナゾリン（Ａ１）（０．０５ｍｏｌ）を含む酢酸（１７５ｍＬ）溶液に硝酸（０．１６ｍｏｌ）を含む酢酸（２５ｍＬ）溶液を添加し、温度は３０℃未満に保った。２時間後、５，７−ジニトロ−化合物１１９は濾過により単離し、Ｈ２Ｏで洗浄し、乾燥した。
酸化白金の存在下での５，７−ジニトロ−化合物１１９（０．０４５ｍｏｌ）を含むＭｅＯＨ（２００ｍＬ）の水素添加分解により、固体を得るための濾過及び濃縮の後に、５，７−ジアミノ−８−ヒドロキシ−キナゾリン（Ａ１１７）を得た。
５,７−ジアシルアミノ−８−ヒドロキシ−キナゾリン（Ａ１１８〜Ａ１１９）の調製（スキームＡ１４）
酢酸（２ｍｍｏｌ）及びＣＤＩ（２．２ｍｍｏｌ）を還流しながら乾燥したＴＨＦ（１０ｍＬ）中で１時間加熱した。５，７−ジアミノ−８−ヒドロキシ−キナゾリン（Ａ１１７）（２ｍｍｏｌ）を添加し、該混合物を還流しながら１６時間加熱した。揮発物質を真空除去し、続いてその結果得られた残留物のカラム・クロマトグラフィーから５，７−デスアセトアミド−８−ヒドロキシ−キナゾリン（Ａ１１８）を得た。
同様な様式で、安息香酸による５，７−ジアミノ−８−ヒドロキシ−キナゾリン（Ａ１１７）の処理から５，７−ジベンゾイルアミド−８−ヒドロキシ−キナゾリン（Ａ１１９）を得た。
２−アセチル−４，８−ジヒドロキシ−キナゾリン（Ａ１２０）の調製（スキームＡ１５）
臭化メチルマグネシウム（３Ｍのジエチルエーテル溶液１．２ｍＬ、３．５ｍｍｏｌ）を−１５℃で６（０．６ｍｍｏｌ）を含むジエチルエーテル（１０Ｌ）撹拌溶液に一滴ずつ添加した。得られた溶液を２時間にわたって室温まで温め更に４時間室温で撹拌した。次いで、反応混合物を飽和ＮＨ４Ｃｌで急冷し、酢酸エチルで抽出し（１０ｍＬ×３）、抽出物を混合し、乾燥し、濃縮して１２０を得た。
ＢＢｒ３による１２０の処理（実施例６）からＡ１２０を得た。
２−アセチル−８−ヒドロキシ−キナゾリン（Ａ１２１）の調製（スキームＡ１５）
オキシ塩化リン、ｐ−トルエンスルホンヒドラジド及びＮａ２ＣＯ３によるＡ１２０の連続処理によりＡ１２１を得た。
２−Ｓ−アセチル−４，８−ジヒドロキシ−キナゾリン（Ａ１２２）の調製（スキームＡ１５）
１２０（１ｍｍｏｌ）及びラヴェソン試薬（０．７ｍｍｏｌ）を含むＴＨＦ（１０ｍＬ）溶液を還流しながら１６時間加熱し冷却した。濃縮次いでその残留物のカラム・クロマトグラフィーにより１２１を得た。ＢＢｒ３による１２１の処理（実施例６）からＡ１２２を得た。
２−Ｓ−アセチル−８−ヒドロキシ−キナゾリン（Ａ１２３）の調製（スキームＡ１５）
オキシ塩化リン、ｐ−トルエンスルホンヒドラジド及びＮａ２ＣＯ３によるＡ１２２の連続処理（実施例６）からＡ１２３を得た。
８−ヒドロキシ−キナゾリン−２−尿素（Ａ１２４）の調製（スキームＡ１６）
２−クロライド１１３を標準的なチチバビン反応条件に従ってアミン１２２に変換した。次に２−アミン１２２（１ｍｍｏｌ）及びイソシアネート（１ｍｍｏｌ）を含む乾燥ＣＨＣｌ３（１０ｍＬ）を還流しながら１６時間加熱した。これにより、濾過後、尿素誘導体１２３を得た。ＢＢｒ３による１２３の処理からＡ１２４を得た。
８−ヒドロキシ−キナゾリン−２−チオ尿素（Ａ１２５）の調製（スキームＡ１６）
２−尿素誘導体１２３（１ｍｍｏｌ）及びラヴェソン試薬（０．７ｍｍｏｌ）を含むＴＨＦ（１０ｍＬ）は還流しながら１６時間加熱し、冷却し、濃縮した。続いてシリカのカラム精製により１２４を得た。次に、実施例６に従って、ＢＢｒ３により１２４を処理してＡ１２５を得た。
２−アシルアミド−８−ヒドロキシ−キナゾリン（Ａ１２６〜Ａ１２７）の調製（スキームＡ１７）
２−アミン１２２は標準条件下でアシル化した。即ち、Ａｃ２Ｏから１２５を得、安息香酸無水物から１２６を得た。ＢＢｒ３による１２５及び１２６の処理（実施例６）により、それぞれＡ１２６及びＡ１２７を得た。
２−チオアシルアミド−８−ヒドロキシ−キナゾリン（Ａ１２８〜Ａ１２９）の調製（スキームＡ１７）
アシルアミド化合物の１２５及び１２６を、前述した条件（実施例２１）に従って、それぞれラヴェソン試薬で処理し、標準仕上げの後、１２７及び１２８を得た。続いて、ＢＢｒ３によるＯ−メチルエーテル切断後、それぞれＡ１２８及びＡ１２９を得た。
２−（アシルアミド）−メチル−８−ヒドロキシ−キナゾリン（Ａ１３０）の調製（スキームＡ１８）
一連の酸無水物を用いたアミンＡ１０の標準アシル化により、カラム精製の後、２−（アシルアミド）−メチル誘導体Ａ１３０を得た。
２−（アゾール）−８−ヒドロキシ−キナゾリン（Ａ１３１〜Ａ１３４）の調製（スキームＡ１９）
２−クロライド１１３（０．５ｍｍｏｌ）及びピラゾール（２．５ｍｍｏｌ）の混合物を鋼鉄オートクレーブで１７５℃で４８時間加熱した。粗産物は次に実施例６に記載の手法に従ってＢＢｒ３で処理した。カラム・クロマトグラフィーによる連続精製から２−ピラゾール−１−イル−キナゾリン−８−オール（Ａ１３１）を得た。
上記の手法は、イミダゾール、２−メチルイミダゾール及び１Ｈ−１,２,３−トリアゾールを用いて反復し、Ａ１３２〜Ａ１３４を得た。
２−アリール（又は複素環）−８−ヒドロキシ−キナゾリン（Ａ１３５〜Ａ１３８）の調製（スキームＡ２０）
文献１２の手法に従って、２−クロライド１１３（５ｍｍｏｌ）を塩化アセチル及びヨウ化ナトリウムを含むＡｃＣＮで処理した。標準的な仕上げの後、シリカのカラム・クロマトグラフィーにより２−ヨード−化合物１２９を得た。
１２９（０．１ｍｍｏｌ）及びＰｄＣｌ２（ＰＰｈ３）２（５ｍｇ）を含むＴＨＦ（２．５ｍＬ）撹拌溶液に、室温のアルゴン大気下で５分間にわたって、臭化２−ピリジル亜鉛（０．５ＭのＴＨＦ溶液０．３７ｍＬ、０．１８５ｍｍｏｌ）を添加した。２時間後、飽和ＮＨ４Ｃｌ（５ｍＬ）を添加し、該混合物はジクロロメタンで抽出した（１０ｍＬ×３）。抽出物を混合し、Ｈ２Ｏ及び食塩水で洗浄し、乾燥し、濃縮した。続いてシリカのカラム・クロマトグラフィーにより８−メトキシ−２−ピリド−２−イル−キナゾリンを得た。８−Ｏ−メチルエーテルは実施例６の手法に従って切断し２−（ピリド−２−イル）−８−ヒドロキシ−キナゾリン（Ａ１３５）を得た。
この反応はヨウ化２−（メチルチオ）フェニル亜鉛、ヨウ化２−（エトキシカルボニル）フェニル亜鉛及び臭化６−メチルピリジル亜鉛を用いて反復し、Ａ１３６〜Ａ１３８を得た。
５−ブロモ−８−ヒドロキシ−キナゾリン（Ａ１３９）の調製（スキームＡ２１）
ゲルソンとマクニール１５による前述の方法に従って、Ｎ−ブロモスクシンイミドによる８−ヒドロキシ−キナゾリン（Ａ１）の臭素化により、５−ブロモ−８−ヒドロキシ−キナゾリン（Ａ１３９）を得た。
８−ヒドロキシ−キナゾリン−２−スルホン酸（２−ピリジン−２−イル−エチル）−アミド（Ａ１４０及びＡ１４１）の調製（スキームＡ２２）
２−アルキル（又はアリール又は複素環）スルファニル−８−ヒドロキシ−キナゾリン（Ａ１４２及びＡ１４３）の調製（スキームＡ２３）
実施例３のアミン（Ａ４〜Ａ７）の還元的アミノ化によりＡ１４２〜Ａ１５３を得る（スキームＡ２４）
５−フルオロ−、７−フルオロ−、５,７−ジフルオロ、５−クロロ−７−フルオロ及び７−クロロ−５−フルオロ−キナゾリン（Ａ１５４〜Ａ１５８）の調製（スキームＡ２５）
フッ素化キナゾリン誘導体（Ａ１５４〜Ａ１５８）の合成は８−ヒドロキシ−キノリンの文献方法１８に従った。
８−ヒドロキシ−キナゾリン−７−カルボン酸アミド（Ａ１６０）の調製（スキームＡ２６）
８−ヒドロキシ−キナゾリン（Ａ１）を、８−ヒドロキシ−キノリンのカルボキシル化についての文献方法２０に従って８−ヒドロキシ−キナゾリン−２−カルボン酸（Ａ１５９）に変換した。Ａ１５９からアミドＡ１６０へのその後の変換は、実施例８に記載の手法に従った。
Ｂ部：８−ヒドロキシ−キノキサリン誘導体の合成
チャートＢ１〜Ｂ４は８−ヒドロキシ−キノキサリン誘導体への経路を示す。合成手法は、特に断らない限り、Ａ部で前述したものと同様であった。
Ｃ部：８−ヒドロキシ−シンノリン誘導体の合成
チャートＣ１及びチャートＣ２は８−ヒドロキシ−シンノリン誘導体への経路を示す。合成手法は、特に断らない限り、Ａ部で前述したものと同様であった。
Ｄ部：４,７（４,１０）−フェナントロリン−５−オール誘導体の合成
チャートＤ１〜Ｄ４は４，７（４，１０）−フェナントロリン−５−オール誘導体への経路を示す。合成手法は、特に断らない限り、Ａ部で前述したものと類似していた。チャートＤ１に示す反応も出発物質として４，７−フェナントロリン−５−オール（Ｄ１）の代わりに４，７−フェナントロリン−５，６−ジオール（Ｄ３）を用いて繰り返した。
４,７−フェナントロリン−５−オール（Ｄ１）のスクラウプ合成
３−ヒドロキシ−ｐ−フェニレンジアミン（０．１８５ｍｏｌ）、グリセロール（１．１７ｍｏｌ）、ヒ素溶液（１００ｍＬ、１２３ｇの五酸化ヒ素を含む１００ｍＬのＨ２Ｏから調製した）及び希硫酸（４００ｍＬ、２４０ｍＬの濃硫酸を２００ｍＬのＨ２Ｏに添加することにより調製した）の撹拌混合物を還流しながら４時間加熱し、冷却した後、濃アンモニアでアルカリ性にした。該混合物はベンゼンで抽出した。ベンゼンを除去し、４，７−フェナントロリン−５−オール（Ｄ１）を得た。
Ｅ部：４−ヒドロキシ−アクリジン誘導体の合成
４−ヒドロキシ−アクリジンはチャートＥ１に示すように置換２−ハロ安息香酸及び置換アニリンのウルマン縮合４、１４により調製した。従って、２−ブロモ−３−ニトロ−安息香酸を用いたアニリン自体の縮合により、４−ヒドロキシ−アクリジン（Ｅ１）を得た。類似の様式で、ｏ−アニシジンから４−アミノ−５−ヒドロキシ−アクリジン及び４，５−ジヒドロキシ−アクリジンを得た。これらのアクリジンの更なる誘導体（チャートＥ２）はＡ部〜Ｄ部の化合物合成で前述した類似の反応条件を用いて調製した。
Ｆ部：４，５（４，８）−ジヒドロキシ−フェナジン誘導体の合成
４，５−及び４，８−ジヒドロキシ−フェナジン（Ｆ１及びＦ２）の化合物は文献３の手法に従って調製した。チャートＦ１〜Ｆ３に要約されるように、これらの化合物の誘導体の合成は、特に断らない限り、Ａ部〜Ｅ部で前述したものと類似の反応条件に従った。
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（３） ８−ヒドロキシ−［１，６］ナフチリジンの調製
一連の７−置換−８−ヒドロキシ−［１，６］ナフチリジンはスキーム９に示す経路を用いて調製できる（例えばアンソニーと共同研究者ら、特許ＷＯ０２／３０９３１ Ａ２を参照のこと）。従って、２，３−ピリジンジカルボン酸は一連の反応を通して８−ヒドロキシ−［１，６］ナフチリジン−２−カルボン酸メチルエステルに容易に変換される。次いで７−メチルエステルは例えばクルチウス条件下で対応する７−アミノ化合物に変換できる。アミノ官能基は順に既知の方法を用いて更に合成できる。例えば、ＨＣｌの存在下でのジアゾ化は対応する塩化物を生成する。更なる塩化物の合成は既知の方法を用いて容易に達成できる。
５，７−二置換−８−ヒドロキシ−［１，６］ナフチリジンは、５，８−ジヒドロキシ−［１，６］ナフチリジン−７−カルボン酸メチルエステルなどの進んだ（advanced）中間体から入手できる（アルバートとハンプトン，J. Chem. Soc., 1952, 4985、ブランコと共同研究者ら，J. Heterocyclic Chem., 1996, 33, 361の手法に従って調製される）。ＰＯＣｌ３又はＳＯＣｌ２を用いた５，８−ジヒドロキシ−［１，６］ナフチリジン−７−カルボン酸メチルエステルの塩素化により、５−クロロ−８−ヒドロキシ−［１，６］ナフチリジン−７−カルボン酸メチルエステルを得る。この塩化物から一連の５−置換−８−ヒドロキシ−［１，６］ナフチリジンの合成は既知の方法を用いて達成できる。文献方法を用いた更なる合成により一連の５，７−二置換−８−ヒドロキシ−［１，６］ナフチリジンが得られる。
２位、３位及び／又は４位で置換された８−ヒドロキシ−［１，６］ナフチリジンの誘導体は適切に置換された２，３−ピリジンジカルボン酸を用いて合成できる。例えば、市販の６−メチル−２，３−ピリジンジカルボン酸は８−ヒドロキシ−２−メチル−［１，６］ナフチリジン−７−カルボン酸メチルエステルに変換できる（スキーム１０）。他の置換された２，３−ピリジンジカルボン酸は既知の方法を用いて容易に調製できる（例えば、ウェップロ、米国特許第４，４６０，７７６号を参照のこと）。８−ヒドロキシ−２−メチル−［１，６］ナフチリジンの更なる誘導体化は、２−（メチルアミノ）メチル誘導体及び２−（アルキルアミノ）メチル誘導体などの一連の類似体を生ずる。これらの化合物の様々な７−置換誘導体は既知の方法を用いて対応する７−メトキシカルボニル、７−クロロ又は７−アミノ化合物から調製できる。
（４） ピリド［３，２−ｄ］ピリミジン−４−オール、［１，７］ナフチリジン−８−オール、ピリド［２，３−ｄ］ピリダジン−８−オール、［１，６］ナフチリジン−８−オール、ピリド［３，４−ｂ］ピラジン−５−オール、ピリド［３，４−ｂ］ピラジン−８−オール、［１，５］ナフチリジン−４，８−ジオール、［１，５］ナフチリジン−８−オール及びピリド［４，３−ｄ］ピリミジン−８−オールの調製
一般論
下記の試薬は市場で調達した。
アミン類：エチルアミン、ヒスタミン、２−（２−アミノエチル）ピリジン、２−（２−メチルアミノエチル）ピリジン。
アルデヒド類：４−イミダゾールカルボキシアルデヒド、２−チアゾールカルボキシアルデヒド及び２−ピリジンカルボキシアルデヒド。
アゾール類：ピラゾール、イミダゾール、メチルイミダゾール及び１Ｈ−１，２，３−トリアゾール。
ボロン酸：フェニルボロン酸、２−（トリフルオロメチル）フェニルボロン酸、２−メトキシフェニルボロン酸、ｏ−トリルボロン酸、２−フルオロフェニルボロン酸、３−メトキシフェニルボロン酸、４−メトキシフェニルボロン酸、ｍ−トリルボロン酸、３，５−ジフルオロフェニルボロン酸、２，４−ジフルオロフェニルボロン酸、３−チオフェンボロン酸、３−フルオロフェニルボロン酸及び４−フルオロフェニルボロン酸。
有機亜鉛試薬：臭化２−ピリジル亜鉛、ヨウ化２−（メチルチオ）フェニル亜鉛、ヨウ化２−（エトキシカルボニル）フェニル亜鉛及び臭化６−メチルピリジル亜鉛（０．５Ｍ ＴＨＦ溶液）（アルドリッチ社）。
３−ピリジルボロン酸はフロンティア・サイエンティフィック社から購入し、ピリド［３，２−ｄ］ピリミジン−４−オールはフランスのアンビンター社から購入した。２−アミノメチルチアゾールは文献１に従って調製した。溶媒は分析用等級であり供給された状態のまま使用した。ＴＨＦはアルゴン下でナトリウム及びベンゾフェノンから蒸留した。１Ｈ ＮＭＲスペクトル（δ、ＴＭＳ内部標準）は特に断らない限りヴァリアン・ユニティ３００分光計で記録し、Ｊ値はヘルツで示す。質量スペクトルデータはマイクロマス・クアトロＩＩ質量分析計で記録した。
化合物の８クラスの誘導体、即ち、ピリド［３，２−ｄ］ピリミジン−４−オール（Ａ）、［１，７］ナフチリジン−８−オール（Ｂ）、ピリド［２，３−ｄ］ピリダジン−８−オール（Ｃ）、［１，６］ナフチリジン−８−オール（Ｄ）、ピリド［３，４−ｂ］ピラジン−５−オール（Ｅ）、ピリド［３，４−ｂ］ピラジン−８−オール（Ｆ）、及び［１，５］ナフチリジン−４，８−ジオール、［１，５］ナフチリジン−８−オール（Ｇ）及びピリド［４，３−ｄ］ピリミジン−８−オールの合成が記載される。
チャートＡ１〜Ａ３は一連のピリド［３，２−ｄ］ピリミジン−４−オール誘導体の合成で使用される経路を要約する。［１，７］ナフチリジン−８−オールの誘導体の調製はチャートＢ１〜Ｂ２に記載する。化合物Ｂ１は類似化合物の合成についての文献２方法に従って調製した。ピリド［２，３−ｄ］ピリダジン−８−オール自体並びに誘導体Ｃ１及びＣ２の合成はブルゼジンスキーと共同研究者らによる前述方法３に従った。この系の更なる誘導体はチャートＣ１〜Ｃ４に要約される経路に従って調製した。チャートＤ１〜Ｄ２は一連の［１，６］ナフチリジン−８−オール誘導体への経路を示す。化合物Ｄ１の合成はブランコと共同研究者らの方法４を用いた。この系の他の構成員はチャートＤ１〜Ｄ２に示す経路に従って調製した。チャートＥ１は一連のピリド［３，４−ｂ］ピラジン−５−オール誘導体への経路を記載する。２，３−ジヒドロキシ−１，４−ジオキサンと１，２，３−トリアミノピリジンの縮合により、この系の親化合物であるピリド［３，４−ｂ］ピラジン−５−オール（Ｅ１）を得た。出発物質として２，３，４−トリアミノピリジンを使用する同じ反応（チャートＦ１）によりピリド［３，４−ｂ］ピラジン−８−オール（Ｆ１）を得た。ピリド［３，４−ｂ］ピラジン−５−オール及びピリド［３，４−ｂ］ピラジン−８−オールのクラスの更なる誘導体はチャートＥ１及びＦ１に示す経路を用いて調製した。チャートＧ１〜Ｇ２は一連の［１，５］ナフチリジン−４，８−ジオール及び［１，５］ナフチリジン−８−オール誘導体の合成で用いる経路を示す。親化合物の前駆体であるＧ１化合物の［１，５］ナフチリジン−４，８−ジオールの合成はブラウン及びデヴァールにより記載される経路５に従った。ピリド［４，３−ｄ］ピリミジン−８−オール（Ｈ１）は、出発物質として４，５−ピリミジンジカルボン酸を用いてチャートＨ１に示す経路に従って調製した４。このクラスの更なる誘導体はチャートＨ１及びＨ２に示す経路を用いて調製した。
引用文献
１． （ａ）Ａ．ドンドニ，Ｇ．ファンティン，Ｍ．フォガグノロ，Ａ．メディチとＰ．ペドリーニ，Synthesis, 1987, 998-1001。（ｂ）Ａ．ドンドニ，Ｆ．Ｌ．メルシャン，Ｐ．メリノ，Ｉ．ロジョとＴ．テジェロ，Synthesis, 1996, 641-646。
２． Ａ．アルバートとＡ．ハンプトン，J. 1952, 4985-4993。
３． Ｊ．Ｚ．ブルゼジンスキー，Ｈ．Ｂ．ブゾウスキーとＪ．イプスタジン，Tetrahedron, 1996, 52, 3261-3272。
４． Ｍ．ブランコ，Ｍ．Ｇ．ロレンゾ，Ｉ．ペリロとＣ．Ｂ．シャピラ，J. Heterocyclic Chem., 1996, 33, 363-366。
５． Ｓ．Ｂ．ブラウンとＭ．Ｊ．Ｓ．デヴァール，J. Org. Chem., 1978, 43, 1331-1337。
（５） ８−ヒドロキシ−６Ｈ−［１，６］ナフチリジン−５−オン、４−ヒドロキシ−４ａ，８ａ−ジヒドロ−ピラノ［３，２−ｂ］ピリジン−２−オン、８−ヒドロキシ−６Ｈ−［１，６］ナフチリン−５−オン、ジベンゾ［ａ，ｇ］キノリジン−８−オン及び４−ヒドロキシ−１Ｈ−ピリド［３，２−ｄ］ピリミジン−２−オンの調製
一般論
下記の試薬は市販で調達した。
アミン類：エチルアミン、ヒスタミン、２−（２−アミノエチル）ピリジン、２−（２−メチルアミノエチル）ピリジン。
アルデヒド類：４−イミダゾールカルボキシアルデヒド、２−チアゾールカルボキシアルデヒド及び２−ピリジンカルボキシアルデヒド。
アゾール類：ピラゾール、イミダゾール、メチルイミダゾール及び１Ｈ−１，２，３−トリアゾール。
ボロン酸：フェニルボロン酸、２−（トリフルオロメチル）フェニルボロン酸、２−メトキシフェニルボロン酸、ｏ−トリルボロン酸、２−フルオロフェニルボロン酸、３−メトキシフェニルボロン酸、４−メトキシフェニルボロン酸、ｍ−トリルボロン酸、３，５−ジフルオロフェニルボロン酸、２，４−ジフルオロフェニルボロン酸、３−チオフェンボロン酸、３−フルオロフェニルボロン酸及び４−フルオロフェニルボロン酸。
有機亜鉛試薬：臭化２−ピリジル亜鉛、ヨウ化２−（メチルチオ）フェニル亜鉛、ヨウ化２−（エトキシカルボニル）フェニル亜鉛及び臭化６−メチルピリジル亜鉛（０．５Ｍ ＴＨＦ溶液）（アルドリッチ社）。
３−ピリジルボロン酸はフロンティア・サイエンティフィック社から購入した。２−アミノメチルチアゾールは文献４に従って調製した。溶媒は分析用等級であり供給された状態のまま使用した。ＴＨＦはアルゴン下でナトリウム及びベンゾフェノンから蒸留した。１Ｈ ＮＭＲスペクトル（δ、ＴＭＳ内部標準）は特に断らない限りヴァリアン・ユニティ３００分光計で記録し、Ｊ値はヘルツで示す。質量スペクトルデータはマイクロマス・クアトロＩＩ質量分析計で記録した。
化合物の５クラスの誘導体、即ち、８−ヒドロキシ−６Ｈ−［１，６］ナフチリジン−５−オン（Ａ）、４−ヒドロキシ−４ａ，８ａ−ジヒドロ−ピラノ［３，２−ｂ］ピリジン−２−オン（Ｂ）、８−ヒドロキシ−６Ｈ−［１，６］ナフチリジン−５−オン（Ｃ）、ジベンゾ［ａ，ｇ］キノリジン−８−オン（Ｄ）及び４−ヒドロキシ−１Ｈ−ピリド［３，２−ｄ］ピリミジン−２−オン（Ｅ）の合成が記載される。
チョウと共同研究者らの方法１に従って無水酢酸を用いたエチル３−アミノ−ピコリン−２−エイトの縮合により、８−ヒドロキシ−６Ｈ−［１，６］ナフチリジン−５−オン（Ａ１）を得た。エチル３−アミノ−ピコリン酸−２をエチル５−クロロ−３−アミノ−ピコリン酸−２及びエチル６−メチル−３−アミノ−ピコリン酸−２でそれぞれ置換することにより、対応する２−メチル−及び３−クロロ−８−ヒドロキシ−６Ｈ−［１，６］ナフチリジン−５−オン誘導体が得られた。チャートＡ１〜Ａ４に示すようなこれらの系の更なる誘導体化から一連の８−ヒドロキシ−６Ｈ−［１，６］ナフチリジン−５−オンを得た。一連の４−ヒドロキシ−４ａ，８ａ−ジヒドロピラノ［３，２−ｂ］ピリジン−２−オンの調製はチャートＢ１〜Ｂ２に記載する。Ｃ２の合成にブランコ及び共同研究者らの方法２を用い、続いて酸加水分解の後に８−ヒドロキシ−６Ｈ−［１，６］ナフチリン−５−オン（Ｃ１）を得た。この系の更なる誘導体はチャートＣ１〜Ｃ２に示す経路に従って調製した。チャートＤ１〜Ｄ２は一連のジベンゾ［ａ，ｇ］キノリジン−８−オンの調製を示す。環系の構築を含む重要段階はコリヤー及び共同研究者らによる前述方法３に従った。チャートＥ１は一連の４−ヒドロキシ−１（アルキル化）−ピリド［３，２−ｄ］ピリミジン−２−オン誘導体の調製で用いる経路を示す。
引用文献
１. Ｚ.-Ｌ.チョウ、Ｊ.Ｍ.ナブラチル、Ｓ.Ｘ. カイ、Ｅ.Ｒ.ホイッテモア、Ｓ.Ａ.エスピチア、Ｊ.Ｅ.ホーキンソン、Ｍ.トラン、Ｒ.Ｍ.ウッドワード、Ｅ.ウエーバーとＪ.Ｆ.Ｗ.キーナ, Bioorg. Med. Chem., 2001, 9, 2061-2071。
２. Ｍ.ブランコ、Ｍ.Ｇ.ロレンツォ、Ｉ.ペリッロとＣ.Ｂ.シャピラ, J. Heterocyclic Chem., 1996, 33, 363-366。
３. Ｊ.Ｄ.コリエ、Ｊ.Ｆ.チャリナー、Ｅ.Ｊ.ホース、とＧ.Ｌ.ニューポート, J. Chem. Res., M, 1985, 3748-3747。
４. (a) Ａ.ドンドニ、Ｇ.ファンチン、Ｍ.フォガノロ、Ａ.メジチとＰ.ペドリニ, Synthesis, 1987m 998-1001。 (b) Ａ. ドンドニ、Ｆ.Ｌ.メルシャン、Ｐ.メリノ、Ｉ.ロジョとＴ.テジェロ, Synthesis, 1996, 641-646。
（６） ９−ヒドロキシ−ピリド［１，２−ａ］ピリミジン−４−オンの調製
９−ヒドロキシピリド［１，２−ａ］ピリミジン−４−オン自体は、文献の手法（デニンと共同研究者ら，J. Heterocyclic Chem., 1991, 28, 1287）に従って合成した。９−ヒドロキシピリド［１，２−ａ］ピリミジン−４−オンの誘導体は、既知の方法（例えば、エール及び共同研究者ら、米国特許第４，０２２，８９７号を参照せよ）を用いて調製できる。例えば、適切な２−置換−３−オキソ−プロピオン酸エチルエステルを用いた市販の２−アミノ−３−ヒドロキシピリジンの縮合（調製方法については、例えば、マラブー及び共同研究者ら、特許ＦＲ２，７６５，５８２号を参照のこと）は、中間体のエナミンを生成し、脱水条件下で所望の３−置換−９−ヒドロキシピリド［１，２−ａ］ピリミジン−４−オン（スキーム１１）を得る。８位での更なる合成は既知の報告方法（例えば、スミルノフと共同研究者ら，Chemistry of Heterocyclic Compounds, 1992, 12, 1425を参照せよ）を用いて達成できる。
スキーム１２は、幾つかの官能化された９−ヒドロキシピリド［１，２−ａ］ピリミジン−４−オンへの代替経路を示す。ここで、適切に置換された２−アミノ−３−ヒドロキシピリジンは、２−置換−３−オキソ−プロピオン酸エチルエステルと縮合する。例えば、２−アミノ−３−クロロ−３−ヒドロキシピリジン（調製についてはグドムンソンと共同研究者ら，Synthetic Communications, 1997, 27(5), 861を参照のこと）及び２−（４−クロロフェニル）−３−オキソ−プロピオン酸エチルエステルから８−クロロ誘導体を得る。後者は既知の方法を用いて更なる誘導体を合成できる。
（７） ８−ヒドロキシ−４（３Ｈ）−キナゾリノン、９−ヒドロキシピリミド[１,６−ａ]ピリミジン−４−オン及び９−ヒドロキシピリド[１,２−ａ]ピリミジン−４−オンの調製
一般論
下記の化合物／試薬は市場で調達した。
アミン類：エチルアミン、ヒスタミン、２−（２−アミノエチル）ピリジン、２−（２−メチルアミノエチル）ピリジン。
アルデヒド類：４−イミダゾールカルボキシアルデヒド、２−チアゾールカルボキシアルデヒド及び２−ピリジンカルボキシアルデヒド。
アゾール類：ピラゾール、イミダゾール、メチルイミダゾール及び１Ｈ−１，２，３−トリアゾール。
ボロン酸：フェニルボロン酸、２−（トリフルオロメチル）フェニルボロン酸、２−メトキシフェニルボロン酸、ｏ−トリルボロン酸、２−フルオロフェニルボロン酸、３−メトキシフェニルボロン酸、４−メトキシフェニルボロン酸、ｍ−トリルボロン酸、３，５−ジフルオロフェニルボロン酸、２，４−ジフルオロフェニルボロン酸、３−チオフェンボロン酸、３−フルオロフェニルボロン酸及び４−フルオロフェニルボロン酸。
有機亜鉛試薬：臭化２−ピリジル亜鉛、ヨウ化２−（メチルチオ）フェニル亜鉛、ヨウ化２−（エトキシカルボニル）フェニル亜鉛及び臭化６−メチルピリジル亜鉛（０．５Ｍ ＴＨＦ溶液）（アルドリッチ社）。
３−ピリジルボロン酸はフロンティア・サイエンティフィック社から購入した。２−アミノメチルチアゾールは文献１に従って調製した。溶媒は分析用等級であり供給された状態のまま使用した。ＴＨＦはアルゴン下でナトリウム及びベンゾフェノンから蒸留した。１Ｈ ＮＭＲスペクトル（δ、ＴＭＳ内部標準）は特に断らない限りヴァリアン・ユニティ３００分光計で記録し、Ｊ値はヘルツで示す。質量スペクトルのデータはマイクロマス・クアトロＩＩ質量分析計で記録した。
３種類の化合物、即ち、８−ヒドロキシ−４（３Ｈ）−キナゾリノン（Ａ）、９−ヒドロキシピリミド［１，６−ａ］ピリミジン−４−オン（Ｂ）及び９−ヒドロキシピリド［１，２−ａ］ピリミジン−４−オン（Ｃ）の誘導体の合成が記載される。
アイヤルと共同研究者らの方法２を使用して化合物Ａ１及びＡ２を合成した。一連の８−ヒドロキシ−４（３Ｈ）−キナゾリノンを提供するためのこれらの化合物の更なる誘導体化はチャートＡ１〜Ａ２に示す経路を用いた。８−ヒドロキシ−４（３Ｈ）−キナゾリノン系における５位及び／又は７位のハロゲン化は８−ヒドロキシキノリンの反応についての文献に前述された方法３に従った。クラスＢ及びＣの化合物Ｂ１及びＣ１の親系の合成は、デニンと共同研究者らにより先に報告された手法４を用いた。Ｂ１及びＣ１の更なる誘導体化はチャートのＢ１〜Ｂ２及びＣ１〜Ｃ２にそれぞれ示す経路に従った。
引用文献
１． （ａ）Ａ．ドンドニ，Ｇ．ファンティン，Ｍ．フォガグノロ，Ａ．メディチとＰ．ペドリーニ，Synthesis, 1987, 998-1001。（ｂ）Ａ．ドンドニ，Ｆ．Ｌ．メルシャン，Ｐ．メリノ，Ｉ．ロジョとＴ．テジェロ，Synthesis, 1996, 641-646。
２． Ｒ．Ｎ．アイヤル，Ｎ．アナンドとＭ．Ｌ．ダール，J. Sci. Ind. Res. A, General, 1956, 15C, 1-7。
３． Ｈ．ゲルソン，Ｍ．Ｗ．マクニール，Ｒ．パルメギアーニとＰ．Ｋ．ゴッドフレイ，J. Med. Chem., 1972, 15, 987-989、及び本明細書で引用される引用文献。
４． Ｆ．デンニン，Ｄ．ブロンデュとＨ．スリワ，J. Heterocyclic Chem., 1991, 28, 1287-1291。
一般論
下記の化合物／試薬は市場で調達した。
２，４−ジクロロアニソール、２，４−ジクロロ安息香酸、２，３−ピリジンジカルボン酸、６−メチル−２，３−ピリジンジカルボン酸及び２−アミノ−３−ヒドロキシピリジン（アルドリッチ社）。
以下の化合物は文献の手法に従って調製した。
５，８−ジヒドロキシ−［１，６］ナフチリジン−７−カルボン酸メチルエステル（アルバートとハンプトン，J. Chem. Soc., 1952, 4985、ブランコと共同研究者ら，J. Heterocyclic Chem., 1996, 33, 361）から５−クロロ−８−ヒドロキシ−［１，６］ナフチリジン−７−カルボン酸メチルエステル（ＰＢ１０４５）。
９−ヒドロキシピリド［１，２―ａ］ピリミジン−４−オン（ＰＢ１０４８）（デンニンと共同研究者ら，J. Heterocyclic Chem., 1991, 28, 1287）；８−ヒドロキシ−３Ｈ−キナゾリン−４−オン（ＰＢ１０４９）（アイヤルとダール、J. Sci. Ind. Res., 1956, 15C, 1）。
溶媒は分析用等級であり供給された状態のまま使用した。ＴＨＦはアルゴン下でナトリウム及びベンゾフェノンから蒸留した。１Ｈ ＮＭＲスペクトル（δ、ＴＭＳ内部標準）は特に断らない限りヴァリアン・イノヴァ４００分光計で記録し、Ｊ値はヘルツで示す。多重度：ｓ＝一重、ｄ＝二重、ｍ＝多重、ｓｅｐ＝七重、ｔ＝三重、ｑ＝四重。エレクトロスプレー質量スペクトルのデータはマイクロマス・クアトロＩＩ質量分析計で記録した。
（Ａ） ６，８−ジクロロ−３−メチルキノキサリン−５−オール（１０６４）及び６，８−ジクロロ−２−メチルキノキサリン−５−オール（１０６５）
段階Ａ：６,８−ジクロロ−３−メチルキノキサリン−５−オール及び６,８−ジクロロ−２−メチルキノキサリン−５−オールの調製
２，３−ジアミノ−４，６−ジクロロアニソール（フィリップス・グロエイランペンファブリケン，Ｎ．Ｖ．（１９７３）、特許ＧＢ１３０３７１１により報告された条件に従って２，４−ジクロロアニソールから調製した）（１．４８ｇ、７．１５ｍｍｏｌ）、２ＭのＡｃＯＨ（１４．２ｍＬ）及び４ＭのＮａＯＡｃ溶液（８．８ｍＬ）の６０℃の撹拌懸濁液に４０％のピルビン酸アルデヒド水溶液（１．１５ｍＬ）を添加した。次いで、該混合物を更に４０分間同じ温度で撹拌した。沈殿物を濾過により単離しＨ２Ｏで洗浄した（５ｍＬ×２）。この固体（１．２１ｇ）は次に酢酸エチルに溶解し、溶液をＳｉＯ２−ゲル（酢酸エチル／ヘキサン、１：３）の短栓を通して濾過した。これにより、淡いピンク色の固体の６，８−ジクロロ−５−メトキシ−２−メチルキノキサリン及び６，８−ジクロロ−５−メトキシ−３−メチルキノキサリンの１：１混合物（１．１３ｇ）が得られた。
２−メチル−及び３−メチル−化合物（２．４８ｇ、０．０１ｍｏｌ）の混合物を含む氷冷のジクロロメタン（３０ｍＬ）溶液に、ＢＢｒ３（１Ｍのジクロロメタン溶液、２０．１ｍＬ）を添加した。冷却槽は１時間後に除去し、混合物は３０℃で１６時間撹拌した。ＭｅＯＨを添加し、溶液を濃縮した。後の工程は４回以上反復した。ジクロロメタン（２０ｍＬ）を残りの残留物に添加し、この混合物のｐＨを７に調整した（濃ＮＨ４ＯＨ）。有機層は乾燥し、濃縮し、ＳｉＯ２−ゲルの短栓を通して濾過し（ジクロロメタン／ＭｅＯＨ、１９：１）、淡黄色の固体として６，８−ジクロロ−２−メチルキノキサリン−５−オール及び６，８−ジクロロ−３−メチルキノキサリン−５−オールの１：１混合物（１．５１ｇ）を得た。この混合物の一部をジエチルエーテルで抽出した（３×）。エーテル抽出物を濃縮し、残留物をイソプロパノールから再結晶させ、黄色針状の６，８−ジクロロ−２−メチル−キノキサリン−５−オールを得た。ジエチルエーテルを用いた抽出後、残る固体をＭｅＯＨで洗浄し、淡いピンク色の固体として６，８−ジクロロ−３−メチル−キノキサリン−５−オールを得た。
６，８−ジクロロ−３−メチルキノキサリン−５−オール：1H NMR(CDCl3):δ 8.88(s, 1H), 8.01(br, 1 H), 7.79(s, 1 H), 2.83(s, 3 H)。
６，８−ジクロロ−２−メチルキノキサリン−５−オール：1H NMR(CDCl3):δ 8.68(s, 1H), 7.95(br, 1 H), 7.83(s, 1 H), 2.87(s, 3 H)。
段階Ｂ：８−ベンジルオキシ−５，７−ジクロロ−２−メチルキノキサリンの調製
６，８−ジクロロ−３−メチルキノキサリン−５−オール（１５０ｍｇ，０．６５５ｍｍｏｌ）、臭化ベンジル（０．２０ｍＬ，１．６８ｍｍｏｌ）、ＫＯＨ（０．０９ｇ）及びＥｔＯＨ（１０ｍＬ）の混合物を還流しながら１６時間加熱し濃縮した。ジクロロメタン（２０ｍＬ）を添加し、この混合物をＨ２Ｏで洗浄し（５ｍＬ×２）、乾燥し濃縮した。残留物をＳｉＯ２−ゲル・クロマトグラフィーを通して精製し（ジクロロメタン／ＭｅＯＨ、１：０〜１５０：１）、８−ベンジルオキシ−５，７−ジクロロ−２−メチルキノキサリン（９８ｍｇ，４７％）を得た。1H NMR(CDCl3):δ 8.82(s, 1 H), 7.81(s, 1 H), 7.58(m, 2 H), 7.38(m, 2 H), 5.45(s, 2 H), 2.85(s, 3 H)。
段階Ｃ：８−ベンジルオキシ−５，７−ジクロロキノキサリン−２−カルボキシアルデヒドの調製
段階Ｂから得られた２−メチル産物（９３ｍｇ、０．２９１ｍｍｏｌ）とＳｅＯ２（１００ｍｇ）を含むジオキサン（４ｍＬ）及びＨ２Ｏ（０．４ｍＬ）の懸濁液を還流しながら３時間加熱した。この混合物は冷却し、濾過し（セライト）、濃縮した。ジクロロメタンを添加し、不溶性物質を濾過で取り除いた。溶媒は蒸発させ、残留物をＳｉＯ２−ゲル・クロマトグラフィー（ジクロロメタン）により精製し、オフ・ホワイトの固体として所望のアルデヒド（5 7mg, 59%）を得た。
８−ベンジルオキシ−５，７−ジクロロキノキサリン−２−カルボキシアルデヒド：1H NMR(CDCl3):δ 10.31(s, 1 H), 9.48(s, 1 H), 8.06(s, 1 H), 7.58-7.35(m, 5 H), 5.55(s, 2 H)。
（Ｂ） 塩酸６，８−ジクロロ−３−（ジメチルアミノメチル）キノキサリン−５−オール（１０６６）
トリアセトキシホウ水素化ナトリウム（５０ｍｇ，０．２３６ｍｍｏｌ）を、段階Ｃから得たアルデヒド（５７ｍｇ，０．１７１ｍｍｏｌ）、塩酸ジメチルアミン（１５．１ｍｇ，０．１８５ｍｍｏｌ）及びＥｔ３Ｎ（０．０２３ｍＬ）を含む１，２−ジクロロエタン（２ｍＬ）の撹拌溶液に添加した。１時間後、ジクロロメタン（２０ｍＬ）を添加し、得られた溶液を飽和ＮａＨＣＯ３溶液（５ｍＬ×２）で洗浄し、乾燥し、濃縮した。残留物をＳｉＯ２−ゲル・クロマトグラフィー（ジクロロメタン／ＭｅＯＨ、１：０〜７５：１）により精製し、淡い黄色の固体として所望の（８−ベンジルオキシ−５，７−ジクロロ−キノキサリン−２−イルメチル）ジメチルアミン（３８ｍｇ，６１％）を得た。1H NMR(CDCl3):δ 9.11(s, 1 H), 7.84(s, 1 H), 7.58-7.35(m, 5 H), 5.47(s, 2 H)。
（８−ベンジルオキシ−５，７−ジクロロ−キノキサリン−２−イルメチル）ジメチルアミン（３８ｍｇ，０．１０５ｍｍｏｌ）を含む濃ＨＣｌ（２ｍＬ）溶液は室温で１６時間撹拌した。オレンジ色の溶液は乾燥するまで濃縮し、残りの残留物をジエチルエーテルで洗浄し（２ｍＬ×３）、淡黄色の固体として所望の産物（２７ｍｇ，８３％）を得た。
塩酸６，８−ジクロロ−３−（ジメチルアミノメチル）キノキサリン−５−オール：1H NMR(DMSO-d6):δ 8.75(s, 1 H), 7.78(s, 1 H), 4.40(br, 2 H), 2.13(s, 6 H)；質量スペクトル：m/z 272, 274, 276(M++1, 100%, 66%, 11%)。
（Ａ） ５，７−ジクロロ−３−（４−フルオロフェニル）−８−ヒドロキシ−３Ｈ−キナゾリン−４−オン（１０５５）
段階Ａ：４，６−ジクロロ−３−ヒドロキシ−２−ニトロ安息香酸の調製
塩化スズ（ＩＩ）水和物（５０ｇ，０．２９ｍｏｌ）を、２，４−ジクロロ−５−ニトロ安息香酸（報告（ゴルスタイン，Ｈ．とシャッフ，Ｅ．，Helv. Chim. Acta, 1957, 57(23), 132）の手順に従って調製された）（１０．０ｇ，０．０４５ｍｏｌ）を含むＥｔＯＨ溶液（２００ｍＬ）に添加した。この混合物を７０℃で０．５時間撹拌し、冷却し、氷上に注いだ。混合物のｐＨは８に調整した（飽和ＮａＨＣＯ３）。懸濁液を室温で５時間撹拌し、ｐＨ５まで再酸性化した（氷ＨＯＡｃ）。得られた白色懸濁液を酢酸エチルで連続抽出し、抽出物を混合し、食塩水で洗浄し、乾燥し、濃縮し、オフ・ホワイト色の固体として所望のアミン（８．８ｇ，９６％）を得た。
５−アミノ−２，４−ジクロロ安息香酸：1H NMR(CD3OD):δ 7.30(s, 1 H), 7.27(s, 1 H)。
無水酢酸（２７ｍＬ）は５−アミノ−２，４−ジクロロ安息香酸（８．０ｇ，０．０４１ｍｏｌ）を含む氷ＨＯＡｃ（１５０ｍＬ）に添加した。溶液は室温で０．５時間撹拌し、濃縮し、白色固体として所望のアセトアミド（９．６ｇ，９６％）を得た。
５−アセトアミド−２，４−ジクロロ安息香酸：1H NMR(CD3OD):δ 8.32(s, 1 H), 7.62(s, 1 H), 2.19(s, 3 H)。
５−アセトアミド−２，４−ジクロロ安息香酸（９．６ｇ，０．０３９ｍｏｌ）を、発煙硝酸（１．８ｍＬ，０．０４３ｍｏｌ）及び濃硫酸（１２０ｍＬ）の氷冷の撹拌溶液に３０分にわたって少しずつ添加した。添加が完了した後、更に発煙硝酸（１７ｍＬ）及び濃硫酸（８０ｍＬ）を３０分及び６０分の間隔で添加した。次いで、反応混合物を０℃で更に２．５時間撹拌し、１２〜１６℃まで温め、全ての出発物質が消費されるまで（約３時間）この温度で撹拌した。該溶液は氷上に注ぎ酢酸エチルで抽出した（３×）。有機抽出物を混合し、食塩水で洗浄し、乾燥し、濃縮し、オレンジ色の固体として３−アセトアミド−４，６−ジクロロ−２−ニトロ安息香酸（９．８ｇ，８６％）を得た。
３−アセトアミド−４，６−ジクロロ−２−ニトロ安息香酸：1H NMR(CD3OD):δ 8.01(s, 1 H), 2.13(s, 3 H)。
３−アセトアミド−４，６−ジクロロ−２−ニトロ安息香酸（９．７ｇ，０．０３３ｍｏｌ）を、ＫＯＨ（１８．７ｇ，０．０３４ｍｏｌ）を含むＨ２Ｏ（８５ｍＬ）溶液に添加した。この溶液を還流しながら１８時間加熱し室温まで冷却した。濃ＨＣｌを添加しｐＨを０に調整した。この混合物を酢酸エチル及びＨ２Ｏで希釈し室温で３０分間撹拌した。層分離し、水性層は酢酸エチルで抽出し（３×）、抽出物を元の有機層と混合し、食塩水で洗浄し、乾燥し、濃縮し、暗赤色の固体として４，６−ジクロロ−３−ヒドロキシ−２−ニトロ安息香酸（７．４ｇ，８９％）を得た。融点１８８〜１８９℃（文献の融点（リンダーベルグ，Ｍ．，ヘルベルグ，Ｓ．，ビョーク，Ｓ．ら，Eur. J. Med. Chem., 1999, 34, 729-744）：186℃(dec)）。
４，６−ジクロロ−３−ヒドロキシ−２−ニトロ安息香酸：1H NMR(CD3OD):δ 7.79(s, 1 H)；質量スペクトル：m/z 250, 252, 254(M+-1, 100%, 66%, 11%)。
段階Ｂ：２−アミノ−４，６−ジクロロ−Ｎ−（４−フルオロフェニル）−３−ヒドロキシベンズアミドの調製
ＣＤＩ（２．２ｇ，０．０１３ｍｏｌ）を、４，６−ジクロロ−３−ヒドロキシ−２−ニトロ安息香酸（３．０ｇ，０．０１２ｍｏｌ）を含む無水ＴＨＦ（３０ｍＬ）及びＤＭＦ（２０ｍＬ）の撹拌溶液に添加した。４０分後、４−フルオロアニリン（４ｍＬ，０．０４２ｍｏｌ）を添加した。この溶液を還流しながら一晩加熱し、冷却し、暗褐色の粘性油になるまで濃縮した。油はＳｉＯ２−ゲル・クロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール、１９：１−９：１）により精製し、淡褐色の油として４，６−ジクロロ−Ｎ−（４−フルオロフェニル）−３−ヒドロキシ−２−ニトロベンズアミド（２．７ｇ，６５％）を得た。
４，６−ジクロロ−Ｎ−（４−フルオロフェニル）−３−ヒドロキシ−２−ニトロベンズアミド：1H NMR(CD3OD):δ7.58(m, 2 H), 7.44(s, 1 H), 7.07(m, 2 H)。
塩化スズ（ＩＩ）水和物（８．８ｇ，０．０３９ｍｏｌ）、４，６−ジクロロ−Ｎ−（４−フルオロフェニル）−３−ヒドロキシ−２−ニトロベンズアミド（２．７ｇ，０．００８ｍｏｌ）及びＥｔＯＨ（７０ｍＬ）の懸濁液を７０℃で１時間加熱し室温まで冷却した。該混合物を氷上に注ぎ、ｐＨ８まで塩基性化し（飽和ＮａＨＣＯ３）、室温で１．５時間撹拌した後氷ＨＯＡｃでｐＨ６．５に再酸性化した。懸濁液を濾過し、濾液を濃縮し、ベージュ色の固体を得た。該ベージュ色固体を濾過ケーキと混合し、熱酢酸エチルで抽出した（５×）。抽出物を混合し、固体の２−アミノ−４，６−ジクロロ−Ｎ−（４−フルオロフェニル）−３−ヒドロキシベンズアミド（２．０ｇ，７９％）を得た。
２−アミノ−４，６−ジクロロ−Ｎ−（４−フルオロフェニル）−３−ヒドロキシベンズアミド：1H NMR(CD3OD):δ7.69(m, 2 H), 7.09(m, 2 H), 6.73(s, 1 H)。
段階Ｃ：５，７−ジクロロ−３−（４−フルオロフェニル）−８−ヒドロキシ−３Ｈ−キナゾリン−４−オンの調製（１０５５）
ＣＤＩ（０．６５ｇ，４．０ｍｍｏｌ）及びギ酸（０．１７ｍＬ，３．６ｍｍｏｌ）を含む無水ＴＨＦ（１８ｍＬ）及びＤＭＦ（２ｍＬ）の溶液を室温で４時間撹拌した。次に段階Ｂから得たアミン（１．０１ｇ，３．２ｍｍｏｌ）を含むＴＨＦ（１５ｍＬ）溶液を添加し、この溶液は還流しながら１５時間加熱し、濃縮した。得られた茶色の固体を酢酸エチルで洗浄し白色針状の表題化合物（０．４９ｇ，４７％）を得た。
５，７−ジクロロ−３−（４−フルオロフェニル）−８−ヒドロキシ−３Ｈ−キナゾリン−４−オン：1H NMR(CDCl3/CD3OD, 9:1):δ8.10(br, 1 H), 7.50(s, 1 H), 7.36(m, 2 H), 7.21(m, 2 H)；質量スペクトル：m/z 325, 327, 329(M++1, 100%, 66%, 11%)。
（Ｂ）５，７−ジクロロ−３−シクロプロピル−８−ヒドロキシ−３Ｈ−キナゾリン−４−オン（１０６１）
下記の化合物は実施例３に記載の方法を用いて調製した。従って、段階Ｂにおけるシクロプロピルアミンによる４−フルオロアニリンの置換により（反応は７０℃で密閉チューブで行った）、ＳｉＯ２−ゲル・クロマトグラフィー（ジクロロメタン／ＭｅＯＨ、９：１）後、４，６−ジクロロ−Ｎ−シクロプロピル−３−ヒドロキシ−２−ニトロベンズアミド（４３％）を得た。1H NMR(CD3OD):δ7.37(s, 1 H), 2.73(m, 1 H), 0.74(m, 2 H), 0.59(m, 2 H)；質量スペクトル：m/z 289, 291, 293(M+-1, 100%, 66%, 11%)。
段階Ｂに記載の条件を用いた塩化スズ（ＩＩ）水和物による４，６−ジクロロ−Ｎ−シクロプロピル−３−ヒドロキシ−２−ニトロベンズアミド還元は２−アミノ−４，６−ジクロロ−Ｎ−シクロプロピル−３−ヒドロキシベンズアミドを生じた（９３％）。1H NMR(CD3OD):δ6.67(s, 1 H), 2.86(m, 1 H), 0.79(m, 2 H), 0.62(m, 2 H)。
２−アミノ−４，６−ジクロロ−Ｎ−シクロプロピル−３−ヒドロキシベンズアミドとギ酸とのＣＤＩ媒介性カップリング（段階Ｃに記載するように）により、酢酸エチル及びＭｅＯＨで洗浄後に、白色固体の５，７−ジクロロ−３−シクロプロピル−８−ヒドロキシ−３Ｈ−キナゾリン−４−オン（４０％）を得た。1H NMR(CDCl3/CD3OD, 9:1):δ8.30(s, 1 H), 7.46(s, 1 H), 3.22(m, 1 H), 1.21(m, 2 H), 0.94(m, 2 H)；質量スペクトル：m/z 271, 273, 275(M++1, 100%, 66%, 11%)。
（ｃ）５，７−ジクロロ−８−ヒドロキシ−３Ｈ−キナゾリン−４−オン（１０６７）
２，４−ジクロロ−５−ヒドロキシ−６−ニトロ安息香酸（段階Ａ）（４．４０ｇ，１７．６ｍｍｏｌ）及び塩化チオニル（２ｍＬ，２７ｍｍｏｌ）を含むトルエン（６０ｍＬ）溶液を還流しながら１時間加熱し室温まで冷却した。この溶液を０℃の濃ＮＨ４ＯＨ（４０ｍＬ）に添加した。冷却槽を除去し、該混合物を室温で２時間撹拌した後、濃縮し、茶色の固体として粗４，６−ジクロロ−３−ヒドロキシ−２−ニトロベンズアミドを得た。1H NMR(CD3OD):δ7.33(s, 1 H)；質量スペクトル：m/z 249, 251, 253(M+-1, 100%, 66%, 11%)。
段階Ｂに記載の条件に従って４，６−ジクロロ−３−ヒドロキシ−２−ニトロベンズアミドを塩化スズ（ＩＩ）水和物で還元すると、ベージュ色の固体として２−アミノ−４，６−ジクロロ−３−ヒドロキシベンズアミドが得られた（２．５ｇ，６２％（２段階））。1H NMR(CD3OD):δ6.69(s, 1 H)。
段階Ｃに記載の手法に従って、ＣＤＩの存在下で、２−アミノ−４，６−ジクロロ−３−ヒドロキシベンズアミド及びギ酸から、ＭｅＯＨによる粗産物の洗浄後、５，７−ジクロロ−８−ヒドロキシ−３Ｈ−キナゾリン−４−オンが白色の固体として得られた（３６％）。1H NMR(DMSO-d6):δ8.12(s, 1 H), 7.55(s, 1 H)；質量スペクトル：m/z229, 231, 233(M+-1, 100%, 66%, 11%)。
（Ａ）７−モルホリン−４−イル−［１，６］ナフチリジン−８−オール（１０５３）
段階Ａ：７−アミノ−８−イソプロポキシ−[１,６]ナフチリジンの調製
２−ブロモプロパン（０．９ｍＬ）を、８−ヒドロキシ−［１，６］ナフチリジン−７−カルボン酸メチルエステル（アンソニー及び共同研究者ら、特許ＷＯ０２／３０９３１ Ａ２に従って調製）（１．００ｇ，４．９０ｍｍｏｌ）、Ｋ２ＣＯ３（２．７９ｇ）及びＤＭＳＯ（１５ｍＬ）の撹拌混合物に添加した。５０℃で４０時間後、飽和ＮＨ４Ｃｌ（２０ｍＬ）を添加し、この混合物をジクロロメタンで抽出した（１０ｍＬ×３）。抽出物は混合し濃縮した。ジエチルエーテル（４０ｍＬ）を残留物に添加し、得られた混合物をＨ２Ｏ（５ｍＬ×２）及び食塩水（１０ｍＬ）で順次洗浄し、乾燥した。溶媒の除去により、８−イソプロポキシ−［１，６］ナフチリジン−７−カルボン酸メチルエステル（１．０６ｇ，８８％）を得た。1H NMR(CDCl3):δ9.16(dd, J=1.9及び4.3, 1 H), 9.03(s, 1 H), 8.34(dd, J=1.9及び8.5, 1 H), 7.63(dd, J=4.3及び8.5, 1 H), 5.33(sep, J=6.2, 1 H), 4.04(s, 3 H), 1.42(d, J=6.2, 6 H)。
８−イソプロポキシ−［１，６］ナフチリジン−７−カルボン酸メチルエステル（１．０６ｇ，４．３０ｍｍｏｌ）を含むＭｅＯＨ（１０ｍＬ）溶液を５分間にわたって一滴ずつヒドラジン水和物（２．５ｍＬ）の撹拌溶液に添加し、更に１時間撹拌し、濃縮した。これにより金色シロップとして所望の粗７−アシルヒドラジド（１．０６ｇ）を得た。
８−イソプロポキシ−［１，６］ナフチリジン−７−カルボン酸ヒドラジド：1H NMR(CDCl3):δ9.16(dd, J=1.8及び4.0, 1 H), 9.08(br, 1 H), 9.07(s, 1 H), 8.35(dd, J=1.8及び8.2, 1 H), 7.64(dd, J=4.0及び8.2, 1 H), 6.02(br, 1 H), 5.39(sep, J=6.2, 1 H), 4.10(br, 2 H), 1.45(d, J=6.2, 6 H)。
７−アシルヒドラジド（１．０６ｇ，４．３０ｍｍｏｌ）を含む氷冷の１ＭＨＣｌ（６ｍＬ）撹拌溶液に、亜硝酸ナトリウム（３３４ｍｇ，４．８４ｍｍｏｌ）を含むＨ２Ｏ（１．５ｍＬ）溶液を温度が５℃より高くならないような速度で一滴ずつ添加した。この混合物を０℃で更に２０分間撹拌した後真空で濃縮した。ＨＯＡｃ（５ｍＬ）及びＨ２Ｏ（５ｍＬ）を添加し、得られたオレンジ色の溶液を９５℃で２４時間加熱し、冷却し、濃縮した。Ｈ２Ｏ（１０ｍＬ）を添加し、混合物のｐＨを８に調整し（濃ＮＨ４ＯＨ）、ジクロロメタンで抽出し（１０ｍＬ×３）、乾燥した。溶媒の除去により、オレンジ色固体の７−アミン（４６７ｍｇ，５３％）を得た。
７−アミノ−８−イソプロポキシ−［１，６］ナフチリジン：1H NMR(CDCl3):δ8.88(dd, J=1.5及び4.0, 1 H), 8.62(s, 1 H), 8.07(dd, J=1.5及び8.2, 1 H), 7.15(dd, J=4.0及び8.2, 1 H), 5.16(sep, J=6.2, 1 H), 4.83(br, 2 H), 1.39(d, J=6.2, 6 H)；質量スペクトル：m/z 204(M++1, 100%)。
段階Ｂ：７−クロロ−８−イソプロポキシ−[１,６]ナフチリジンの調製
亜硝酸ナトリウム（１．８ｇ，０．０２６ｍｏｌ）を０〜５℃のアミン（１．００ｇ，４．９２ｍｍｏｌ）を含む濃ＨＣｌ（２０ｍＬ）の撹拌溶液に少しずつ添加した。この混合物をこの温度で更に１時間撹拌した後、１時間かけて室温まで温めた。氷を加え、混合物のｐＨを８に調整した（濃ＮＨ４ＯＨ）。次いで、混合物をジクロロメタンで抽出し、抽出物を食塩水で洗浄し、乾燥し、濃縮した。ＳｉＯ２−ゲル・クロマトグラフィー（ジクロロメタン／ＭｅＯＨ、２００：３）の精製により、無色の固体として所望の７−クロライド（４００ｍｇ，３６％）を得た。
７−クロロ−８−イソプロポキシ−［１，６］ナフチリジン：1H NMR(CDCl3):δ9.04(dd, J=1.8及び4.2, 1 H), 8.76(s, 1 H), 8.23(dd, J=1.8及び8.4, 1 H), 7.46(dd, J=4.2及び8.4, 1 H), 5.14(sep, J=6.2, 1 H), 1.38(d, J=6.2, 6 H)；質量スペクトル：m/z 223, 225(M++1, 100%, 33%)。
段階Ｃ：７−モルホリン−４−イル−［１，６］ナフチリジン−８−オールの調製（１０５３）
段階Ｂから得た７−クロライド（１００ｍｇ，０．４４８ｍｍｏｌ）及びモルホリン（２ｍＬ）の混合物を１８０℃で２０時間加熱した後、室温まで冷却した。反応混合物をＭｅＯＨで抽出し、抽出物は濃縮した。その残留物をＳｉＯ２−ゲル・クロマトグラフィー（ジクロロメタン／ＭｅＯＨ、２０：１）を用いて精製し、黄色固体の所望産物（７８ｍｇ，６４％）を得た。
０℃の８−イソプロポキシ−７−モルホリン−４−イル−［１，６］ナフチリジン（１４９ｍｇ，０．５４５ｍｍｏｌ）を含むジクロロメタン（１０ｍＬ）撹拌溶液にＢＣｌ３（１Ｍのジクロロメタン溶液１．５ｍＬ）を添加した。濃オレンジ色の溶液を室温で２４時間攪拌した。ＭｅＯＨ（１０ｍＬ）を添加し、混合物を濃縮した。この工程は４回反復した。ジエチルエーテルで残りの残留物を更に洗浄し（５ｍＬ×２）、暗赤色固体の塩酸７−モルホリン−４−イル−［１，６］ナフチリジン−８−オール（定量的収量）を得た。1H NMR(CD3OD):δ9.09(dd, J=1.5及び5.1, 1 H), 9.02(s, 1 H), 8.99(dd, J=1.5及び8.2, 1 H), 7.79(dd, J=5.1及び8.2, 1 H), 3.95(m, 4 H), 3.80(m, 4 H)。
塩酸７−モルホリン−４−イル−［１，６］ナフチリジン−８−オールを含むジクロロメタン（２０ｍＬ）溶液を飽和ＮａＨＣＯ３溶液で洗浄し（２×）、乾燥し、濃縮した。溶媒の除去により、ＳｉＯ２−ゲル・クロマトグラフィー（ジクロロメタン／ＭｅＯＨ、９：１）後に、オレンジ色固体の７−モルホリン−４−イル−［１，６］ナフチリジン−８−オールを得た（９７ｍｇ，７７％）。1H NMR(CD3OD):δ8.91(dd, J=1.4及び4.0, 1 H), 8.60(s, 1 H), 8.32(dd, J=1.4及び8.2, 1 H), 7.41(dd, J=4.0及び8.2, 1 H), 3.89(m, 4 H), 3.47(m, 4 H)。
（Ｂ）８−ヒドロキシ−２−メチルアミノメチル−［１，６］ナフチリジン−７−カルボン酸（４−フルオロフェニル）アミド（１０７０）
段階Ａ：６−メチルピリジン−２，３−ジカルボン酸２−イソプロピルエステルの調製
６−メチル−２，３−ピリジンジカルボン酸（１０．０ｇ，０．０５５ｍｏｌ）及びＡｃ２Ｏ（５０ｍＬ）を１２０℃で４時間加熱し、冷却し、茶色の油になるまで濃縮した。イソプロパノールを茶色の油に添加し、その溶液を８０℃で一晩加熱した。揮発性物質を真空で除去し、残留物をジエチルエーテルで洗浄した後、淡黄色固体の６−メチルピリジン−２，３−ジカルボン酸２−イソプロピルエステル（８．８ｇ，７１％）を得た。1H NMR(CDCl3):δ8.24(d, J=8.2, 1 H), 7.34(d, J=8.2, 1 H), 5.34(sep, J=6.2, 1 H), 2.68(s, 3 H), 1.39(d, J=6.2, 6 H)。
段階Ｂ：３−ヒドロキシメチル−６−メチルピリジン−２−カルボン酸イソプロピルエステルの調製
６−メチルピリジン−２，３−ジカルボン酸２−イソプロピルエステル（７．３１ｇ，０．３３ｍｏｌ）及び塩化チオニル（６５ｍＬ）の混合物を還流しながら１時間加熱した。得られた溶液は真空で濃縮した。残留物を無水ＴＨＦで洗浄し（２×）、茶色の油の粗酸塩化物を得た。氷冷の酸塩化物を含むＴＨＦ（５０ｍＬ）の撹拌溶液にホウ水素化ナトリウム（１．２６ｇ，０．３３ｍｏｌ）を含むＴＨＦ（１５ｍＬ）を２０分にわたって滴下した。０℃で１時間後、反応混合物を氷上に注ぎ、ジクロロメタンで抽出した（３×）。抽出物を混合し、食塩水で洗浄し、乾燥し、濃縮した。残留物をＳｉＯ２−ゲル・クロマトグラフィー（ジクロロメタン／ＭｅＯＨ、１９：１）により精製した後、淡褐色固体の３−ヒドロキシメチル−６−メチルピリジン−２−カルボン酸イソプロピルエステル（３．４２ｇ，４８％）を得た。1H NMR(CDCl3):δ7.76(d, J=7.9, 1 H), 7.31(d, J=7.9, 1 H), 5.32(sep, J=6.2, 1 H), 4.74(s, 2 H), 1.45(d, J=6.2, 6 H)。
段階Ｃ：３−［（ベンゼンスルホニル（メトキシカルボニルメチル）アミノ）メチル］−６−メチルピリジン−２−カルボン酸イソプロピルエステルの調製
３−［（ベンゼンスルホニル（メトキシカルボニルメチル）アミノ）メチル］ピリジン−２−カルボン酸イソプロピルエステルの調製についてアンソニーら（ＷＯ０２／３０９３１ Ａ２）により報告された条件に従って、ジイソプロピル・アゾジカルボキシレート（１．０７ｇ，５．３０ｍｍｏｌ）を含むＴＨＦ（５ｍＬ）溶液を、４０分間にわたって３−ヒドロキシメチル−６−メチル−ピリジン−２−カルボン酸イソプロピルエステル（７３９ｍｇ，３．５３ｍｍｏｌ）、Ｎ−（フェニルスルホニル）グリシンメチルエステル（８１０ｍｇ，３．５３ｍｍｏｌ）及びトリフェニルホスフィン（１．３９ｇ，５．３０ｍｏｌ）を含むＴＨＦ（１５ｍＬ）撹拌溶液に滴下した。得られた溶液を次いで室温で一晩撹拌した。反応混合物を濃縮して、粗３−［（ベンゼンスルホニル（メトキシカルボニルメチル）アミノ）メチル］−６−メチルピリジン−２−カルボン酸イソプロピルエステルを金色のシロップとして得た。これは更なる精製なしに次の段階で使用した。選択1H NMR(CDCl3):δ4.73(s, 2 H), 4.00(s, 2 H), 3.54(s, 3 H), 2.70(s, 3 H)。
段階Ｄ：８−ヒドロキシ−２−メチル−［１，６］ナフチリジン−７−カルボン酸メチルエステルの調製
粗３−［（ベンゼンスルホニル（メトキシカルボニルメチル）アミノ）メチル］−６−メチルピリジン−２−カルボン酸イソプロピルエステル（段階Ｃから得た）を含む０℃のＭｅＯＨ（２０ｍＬ）撹拌溶液に、ＮａＯＭｅを含むＭｅＯＨ溶液（Ｎａ（２００ｍｇ）をＭｅＯＨ（４ｍＬ）に溶解して調製）を２０分間にわたって滴下した。得られた溶液をさらに１時間０℃で撹拌し濃縮した。酢酸エチル（５０ｍＬ）及び氷−Ｈ２Ｏ（５０ｍＬ）を添加した。層分離し、水性層は酢酸エチルで抽出し（×２）、ｐＨを６に調整し（５ＭＨＣｌ）、ジクロロメタンで抽出した（２０ｍＬ×３）。抽出物を混合し、乾燥し、濃縮して、純粋な８−ヒドロキシ−２−メチル−［１，６］ナフチリジン−７−カルボン酸メチルエステルをクリーム色の固体として得た（７０８ｍｇ，９８％（２段階））。1H NMR(CDCl3):δ8.87(s, 1 H), 8.26(d, J=8.5, 1 H), 7.62(d, J=8.5, 1 H), 5.40(br, 1 H), 4.13(s, 3 H), 2.91(s, 3 H)。
段階Ｅ：塩酸８−ヒドロキシ−２−メチル−［１，６］ナフチリジン−７−カルボン酸（４−フルオロフェニル）アミドの調製
８−ヒドロキシ−２−メチル−［１，６］ナフチリジン−７−カルボン酸メチルエステル（０．３４ｇ，１．５６ｍｍｏｌ）及び４−フルオロベンジルアミン（０．５ｍＬ）を含むトルエン（４ｍＬ）溶液を還流しながら１６時間加熱し、室温まで冷却した。続いて溶媒を除去し、クリーム色の固体を得て、ジエチルエーテルで洗浄した後、オフ・ホワイト色の固体として８−ヒドロキシ−２−メチル−［１，６］ナフチリジン−７−カルボン酸（４−フルオロフェニル）アミド（０．４０ｇ，８７％）を得た。1H NMR(CDCl3):δ8.57(s, 1 H), 8.44(br, 1 H), 8.15(d, J=8.4, 1 H), 7.52(d, J=8.4, 1 H), 7.37(m, 2 H), 7.07(m, 2 H), 4.67(d, J=6.2, 2 H), 2.87(s, 3 H)。
段階Ｆ：塩酸８−ヒドロキシ−２−（メチルアミノ）メチル−［１，６］ナフチリジン−７−カルボン酸（４−フルオロフェニル）アミド（１０７０）の調製
ＳｅＯ２（１００ｍｇ，０．９０１ｍｍｏｌ）を８−ヒドロキシ−２−メチル−［１，６］ナフチリジン−７−カルボン酸（４−フルオロフェニル）アミド（１５０ｍｇ，０．４８２ｍｍｏｌ）を含む１，４−ジオキサン（８ｍＬ）及びＨ２Ｏ（０．１ｍＬ）の溶液に添加し、この混合物を５５℃で３時間加熱した。混合物を室温まで冷却し、濾過した（セライト）。濾液は濃縮し、淡いオレンジ色の固体として粗２−アルデヒドを得た。1H NMR(CDCl3):δ10.37(s, 1 H), 8.75(s, 1 H), 8.46(d, J=8.4, 1 H), 8.45(br, 1 H), 8.26(d, J=8.6, 1 H), 7.40(m, 2 H), 7.30(br, 1 H), 7.08(m, 2 H), 4.70(d, J=6.0, 2 H)。
粗２−アルデヒド及び塩酸メチルアミン（５０ｍｇ，０．７４１ｍｍｏｌ）を含む１，２−ジクロロエタン（５ｍＬ）撹拌溶液に、Ｅｔ３Ｎ（０．０７ｍＬ）を添加した。次にトリアセトキシホウ水素化ナトリウム（１０２ｍｇ，０．４８２ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温で一晩撹拌した。ＭｅＯＨを添加し、得られた溶液を濃縮した。飽和ＮａＨＣＯ３溶液を添加し、得られた淡いオレンジ色の固体を濾過により単離し、Ｈ２Ｏで洗浄し、真空乾燥した。ＭｅＯＨ（１０ｍＬ）を固体に添加し、残る不溶性物質を濾過で取り除いた。濾液を濃縮し、濃ＨＣｌを添加し、溶液を蒸発させ、乾燥し、淡黄色の固体として塩酸８−ヒドロキシ−２−（メチルアミノ）メチル−［１，６］ナフチリジン−７−カルボン酸（４−フルオロフェニル）アミド（ＰＢ１０７０）（４５ｍｇ，３０％）を得た。1H NMR(CD3OD):δ8.92(s, 1 H), 8.64(d, J=8.4, 1 H), 7.82(d, J=8.4, 1 H), 7.43(m, 2 H), 7.06(m, 2 H), 4.69(s, 2 H), 4.68(br, 1 H), 4.65(s, 2 H), 2.91(s, 3 H)。
（Ａ）３−（４−クロロフェニル）−９−ヒドロキシピリド［１，２−ａ］ピリミジン−４−オン（１０６９）
段階Ａ：２−（４−クロロフェニル）−３−オキソ−プロパン酸エチルエステルの調製
（４−クロロフェニル）酢酸（２０．０ｇ，０．１２ｍｏｌ）及び濃硫酸（２ｇ）を含むＥｔＯＨ（１５０ｍＬ）溶液を還流しながら１９時間加熱し、冷却した後、濃縮した。ジエチルエーテル（１００ｍＬ）を添加し、この溶液を飽和ＮａＨＣＯ３溶液で洗浄し（４０ｍＬ×２）、乾燥し、揮発性物質を除去した。これにより、油状の（４−クロロフェニル）酢酸エチルエステル（２２．３ｇ，９６％）を得た。
ギ酸エチル（７．４６ｇ，０．１０１ｍｏｌ）を、（４−クロロフェニル）酢酸エチルエステル（２０．０ｇ，０．１０１ｍｏｌ）及びＮａＨ（０．１３１ｍｏｌ）を含む氷冷のジエチルエーテル（１００ｍＬ）撹拌懸濁液に滴下した。次いで、この混合物を室温まで一晩温めた。混合物を中和し（１Ｍ ＨＣｌ）、有機層は単離し、乾燥し、溶媒を除去し、無色の固体として２−（４−クロロフェニル）−３−オキソ−プロパン酸エチルエステル（１９．８ｇ，８７％）を得た。1H NMR(CDCl3):δ12.14(d, J=12.8, 1 H), 7.31-7.18(m, 4 H), 4.29(q, J=7.2, 2 H), 1.57(br, 1 H), 1.29(t, J=7.2, 3 H)。
段階Ｂ：３−（４−クロロフェニル）−９−ヒドロキシピリド［１，２−ａ］ピリミジン−４−オン（１０６９）の調製
２−アミノ−３−ヒドロキシピリジン（５．５１ｇ，０．０５ｍｏｌ）及び２−（４−クロロフェニル）−３−オキソ−プロパン酸エチルエステル（１３．６ｇ，０．０６ｍｏｌ）を含むＥｔＯＨ（１００ｍＬ）を還流しながら１５時間加熱した後、冷却した。沈殿物は濾過により単離し、エナミン及び環状産物の９：１混合物（１１．１ｇ）を得た。
エナミン：1H NMR(DMSO-d6):δ10.67(d, J=12.4, 1 H), 8.10(d, J=12.4, 1 H), 7.72(d, J=4.8, 1 H), 7.37(m, 4 H), 7.16(m, 1 H), 6.86(dd, J=4.8及び8.0, 1 H), 4.16(q, J=7.2, 2 H), 1.18(t, J=7.2, 3 H)。
エナミン及び環状産物（１１．１ｇ）を含むジエチルベンゼン（１００ｍＬ）の混合溶液を１６０℃で８時間加熱し冷却した。沈殿物を濾過により単離し、ヘキサン及びＥｔＯＨで順次洗浄し、乾燥した。これにより、淡黄色固体の３−（４−クロロフェニル）−９−ヒドロキシピリド［１，２−ａ］ピリミジン−４−オン（７．０３ｇ，７４％）を得た。
３−（４−クロロフェニル）−９−ヒドロキシピリド［１，２−ａ］ピリミジン−４−オン：1H NMR(DMSO-d6):δ8.64(dd, J=2.0及び6.0, 1 H), 8.61(s, 1 H), 7.89(m, 2 H), 7.51(m, 2 H), 7.30(m, 2 H)；質量スペクトル：m/z 273, 275(M++1, 100%, 33%)。
（Ｂ）３−（４−クロロフェニル）−９−ヒドロキシ−８−ヨードピリド［１，２−ａ］ピリミジン−４−オン（１０６３）
３−（４−クロロフェニル）−９−ヒドロキシピリド［１，２−ａ］ピリミジン−４−オン（２．７３ｇ，０．０１ｍｏｌ）及びヨウ素（２．５４ｇ，０．０１ｍｏｌ）を含むＥｔＯＨ（１００ｍＬ）撹拌懸濁液に、過酸化水素（３０％ ｗ／ｖ水溶液の１．９４ｇ）を添加した。この混合物を室温で６日間撹拌した。固体を濾過により単離し、ＥｔＯＨで洗浄し（２０ｍＬ×３）、乾燥し、深緑色の粉末（３．５６ｇ）を得た。続いて、ＤＭＦから再結晶し、橙褐色の固体として３−（４−クロロフェニル）−９−ヒドロキシ−８−ヨードピリド［１，２−ａ］ピリミジン−４−オン（１．８０ｇ）を得た。
３−（４−クロロフェニル）−９−ヒドロキシ−８−ヨードピリド［１，２−ａ］ピリミジン−４−オン：1H NMR(DMSO-d6):δ8.57(s, 1 H), 8.35(d, J=7.2, 1 H), 7.88(m, 2 H), 7.64(d, J=7.2, 1 H), 7.51(m, 2 H)。質量スペクトル：m/z 399, 401(M++1, 100%, 33%)。
下記の検定は、本発明の方法で使用する適性について本発明の新規化合物を評価する際に使用する。
式Ｉ又は式ＩＩの化合物の評価
下記の検定は本発明の方法で使用する適性について式Ｉ又は式ＩＩの化合物を評価する際に使用した。
検定１． 蛍光Ｈ ２ Ｏ ２ 検定
蛍光検定はジクロロフルオレセイン・ジアセテート（ＤＣＦ；モレキュラー・プローブス、ユージーン社、オレゴン州）に基づいて銅の存在下でＡβによる過酸化水素の生成を阻害する試験化合物の能力を試験するために用いた。ＤＣＦ（５ｍＭ）を含む１００％ジメチル・スルホキシド（２０℃で１時間アルゴンで予め洗浄した）溶液は０．０２５ＭのＮａＯＨの存在下で３０分間脱アセチル化し、ｐＨ７．４で中和し、最終濃度を１ｍＭにした。ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）保存溶液はｐＨ７．４で１μＭに調製した。反応は９６穴プレートにおいてｐＨ７．４のＰＢＳ中で実施した（全容積＝２５０μＬ／穴）。５０ｎＭから１μＭの銅−グリシン・キレート（Ｃｕ−Ｇｌｙ）の範囲濃度でＡβ１〜４２を含む反応溶液は、１：６の比でグリシンにＣｕＣｌ２を添加することにより調製し、２Ｃｕ−Ｇｌｙ：１Ａβの割合で該Ａβ、ドーパミン（５μＭ）又はアスコルビン酸を含む還元剤、脱アセチル化ＤＣＦ１００μＭ、及びＨＲＰ０．１μＭに添加した。１−１０μＭのＥＤＴＡ又はキレート剤は、遊離銅の対照として存在しても良いが、該検定の機能には必要でなかった。反応混合物は３７℃で６０分間インキュベートした。カタラーゼ（４０００単位／ｍＬ）及びＨ２Ｏ２（１−２．５μＭ）の基準を含むｐＨ７．４のＰＢＳを正の対照として含めても良い。蛍光はそれぞれ４８５ｎＭ及び５３０ｎＭの励起フィルター及び発光フィルターを備えたプレート・リーダーを用いて記録した。Ｈ２Ｏ２濃度は蛍光をＨ２Ｏ２基準と比較することにより決定しうる。ＡβのＨ２Ｏ２生成の阻害は試験ウェルに既定濃度の試験化合物を含むことにより検定した。
検定２． 神経毒性検定
初代皮質ニューロン培養
皮質培養は前述のように調製した（ホワイトら、1998）。１４胚日のＢＬ６Ｊｘ１２９ｓｖマウスの皮質を切除し、髄膜なしに解剖し、０．０２５％（ｗｔ／ｖｏｌ）トリプシン中で解離した。解離した細胞は、２５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ＦＣＳ及び５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ＨＳを含むＭＥＭに２×１０６細胞／ｍＬの密度で４８穴培養プレートに播種し、３７℃で２時間インキュベートした。次いで培地はニューロベーサル培地（インビトロゲン・ライフ・テクノロジーズ社）及びＢ２７補足剤（インビトロゲン・ライフ・テクノロジーズ社）と置換した。培養は３７℃、５％ＣＯ２で維持した。実験前に、培養培地は抗酸化剤（インビトロゲン・ライフ・テクノロジーズ社）を含まないニューロベーサル培地及びＢ２７と置換した。
初代小脳顆粒ニューロン培養
生後５〜６日（Ｐ５−６）のマウスから小脳を切除し、切開して髄膜を除き、０．０２５％トリプシン中で解離した。小脳顆粒ニューロン（ＣＧＮ）は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、２ｍＭグルタミン及び２５ｍＭのＫＣｌを補足したＢＭＥ（インビトロゲン・ライフ・テクノロジーズ社）に３５００００細胞／ｃｍ２で２４穴培養プレートに播種した。硫酸ゲンタマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を全てのプレート培地に添加し、培養は３７℃、５％ＣＯ２で維持した。
検定３． 細胞生死判別の検定
（ａ）細胞生死判別のＭＴＳ検定
細胞の生死判別はＭＴＳ検定を用いて決定する。培養培地は抗酸化剤を含まず且つＢ２７補足剤を添加した新鮮なニューロベーサル培地で置換する。１／１０容積のＭＴＳ溶液（セル・タイトレ９６アクエアス・ワン、プロメガ社）を３７℃で２時間インキュベートする。２００マイクロリットルの部分標本を５６０ｎｍの分光光度計で測定する。
（ｂ）細胞生死判別のＬＤＨ検定
細胞死は、製造業者の取扱説明書に従って、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）細胞毒性検出キット（ベーリンガー・インゲルハイム社）を用いて血清及び細胞残屑を含まない培養上清から測定する。
（ｃ）Ａβの神経毒性及びＡβの神経保護の検定
ニューロン皮質細胞は、検定２のように５日間培養した。６日目にニューロベーサル（ＮＢ）培地（インビトロゲン・ライフ・テクノロジーズ社）及びＢ２７補足剤（インビトロゲン・ライフ・テクノロジーズ社）をＮＢ培地及びＢ２７補足剤（抗酸化剤なし）と置換した。６日目に、試験化合物を個別にニューロン細胞培養に添加した。
試験化合物を１００％ＤＭＳＯに溶解し、２．５ｍＭの濃度にした（１バイアル当たり過剰の化合物が検量される場合、１０ｍＭ、その後２．５ｍＭに希釈した）。２．５ｍＭの保存溶液は１０分の１に連続希釈し、２５０μＭ、２５μＭ、２．５μＭの希釈標準溶液を得た。
Ａβの調製：
Ａβを最初に２０ｍＭのＮａＯＨに溶解し、１ｍＭの濃度にし、５分間超音波破砕した。該ペプチドは次いでＨ２Ｏ及び１０ＸＰＢＳで希釈し、最終濃度２００ｕＭのＡβを含む１ＸＰＢＳにした。該ペプチドを再び５分間超音波破砕した後、１４０００ｒｐｍで５分間回転させ、新しいチューブに移した。
試験化合物を１００％ＤＭＳＯに溶解し、２．５ｍＭの濃度にした（１バイアル当たり過剰の化合物が検量される場合、１０ｍＭ、その後２．５ｍＭに希釈した）。２．５ｍＭの保存溶液は１０分の１に連続希釈して［ＮＢ培地及びＢ２７（抗酸化剤なし）で］２５０μＭ、２５μＭ、２．５μＭの希釈標準溶液を得た。試験化合物は直接細胞に添加せずに、下記を含む４８穴「ドラッグ・プレート」に添加した。
「ドラッグ・プレート」の調製：
４８穴プレートに添加：
ウェル１：５１５μＬのＮＢ＋Ｂ２７（抗酸化剤なし）＊＋２４μＬの２５μＭ試験化合物＋６０μＬのＡβ希釈液＊＊
ウェル２：５１５μＬのＮＢ＋Ｂ２７（抗酸化剤なし）＋２４μＬの２５０μＭ試験化合物＋６０μＬのＡβ希釈液
ウェル３：５１５μＬのＮＢ＋Ｂ２７（抗酸化剤なし）＋２４μＬ試験化合物の希釈液＊＊＊＋６０μＬのＡβ１−４２
ウェル４：５１５μＬのＮＢ＋Ｂ２７（抗酸化剤なし）＋２４μＬの２．５μＭ試験化合物＋６０μＬのＡβ１−４２
ウェル５：５１５μＬのＮＢ＋Ｂ２７（抗酸化剤なし）＋２４μＬの２５μＭ試験化合物＋６０μＬのＡβ１−４２
ウェル６：５１５μＬ ＮＢ＋Ｂ２７（抗酸化剤なし）＋２４μＬ ２５０μＭ試験化合物＋６０μＬ Ａβ１−４２希釈液
ウェル７：５１５μＬのＮＢ＋Ｂ２７（抗酸化剤なし）＋２４μＬ試験化合物希釈液＋６０μＬのＡβ１−４２希釈液
ウェル８：６００μＬ ＮＢ＋Ｂ２７（抗酸化剤なし）
Ｎ．Ｂ．６０μＬのＡβ１−４２＝２０μＬのＡβ１−４２／ウェル＝２０μＭのＡβ１−４２
ドラッグ・プレートは３７℃で１５分間インキュベートした。各ウェルの２００μＬを対応する細胞プレートに３連で添加した。細胞プレートは３７℃で４日間インキュベートした。
＊ＮＢ培地＋Ｂ２７（抗酸化剤なし）
＊＊Ａβ希釈液 ２ｍＭのＮａＯＨ、１ＸＰＢＳ
＊＊＊ＰＢＴ希釈液 １０％ＤＭＳＯを含むＮＢ＋Ｂ２７（抗酸化剤なし）
検定の終了：
細胞の処理後４日目に、検定は細胞にＭＴＳを添加することにより終了する。
（ｄ）試験化合物の細胞毒性についての検定
ニューロン皮質細胞はＮＢ培地及びＢ２７補足剤中で検定２のように５日間培養した。
６日目に、試験化合物を抗酸化剤を含まないＮＢ培地及びＢ２７補足剤中のニューロン細胞培養に添加した。
試験化合物は１００％ＤＭＳＯに溶解し、２．５ｍＭの濃度にした（１バイアル当たり過剰の化合物が検量される場合、１０ｍＭ、その後２．５ｍＭに希釈した）。２．５ｍＭの保存溶液は１０分の１に連続希釈し、２５０μＭ、２５μＭ、２．５μＭの希釈標準溶液を得た。試験化合物は直接細胞に添加せずに、下記を含む４８穴「ドラッグ・プレート」に添加した。
「ドラッグ・プレート」の調製：
４８穴プレートに添加：
ウェル１：５７６μＬのＮＢ＋Ｂ２７（抗酸化剤なし）＊＋２４μＬの２．５μＭ試験化合物
ウェル２：５７６μＬのＮＢ＋Ｂ２７（抗酸化剤なし）＋２４μＬの２５μＭ試験化合物
ウェル３：５７６μＬのＮＢ＋Ｂ２７（抗酸化剤なし）＋２４μＬの２５０μＭ試験化合物
ウェル４：５７６μＬ ＮＢ＋Ｂ２７（抗酸化剤なし）＋２４μＬ ２．５μＭ試験化合物
ウェル５：５７６μＬのＮＢ＋Ｂ２７（抗酸化剤なし）＋２４μＬの２５μＭ試験化合物
ウェル６：５７６μＬのＮＢ＋Ｂ２７（抗酸化剤なし）＋２４μＬの２５０μＭ試験化合物
ウェル７：５７６μＬのＮＢ＋Ｂ２７（抗酸化剤なし）＋２４μＬ試験化合物希釈液＊＊
ウェル８：６００μＬのＮＢ＋Ｂ２７（抗酸化剤なし）
ドラッグ・プレートは３７℃で１５分間インキュベートした。各ウェルの２００μＬを対応する細胞プレートに３連で添加した。細胞プレートは３７℃で４日間インキュベートした（２化合物は各プレートの細胞について試験される）。
*ＮＢ培地及びＢ２７（抗酸化剤なし）
＊＊ＰＢＴ希釈液 １０％ＤＭＳＯを含むＮＢ＋Ｂ２７（抗酸化剤なし）
検定の終了時に、１／１０容積のＭＴＳをプレートの１ウェル毎に添加した（即ち２５μＬ／２５０μＬ）。プレートは３７℃で２時間インキュベートした後、吸光度を５６０ｎｍで読み取った。
検定４． カスパーゼの検定
ニューロン培養のカスパーゼ活性を測定するために、成長培地を除去し、細胞は対照の塩溶液（ｐＨ７．４）で２回洗浄し、氷冷の細胞抽出緩衝液を該培養に直接添加する。抽出緩衝液は２０ｍＭトリス（ｐＨ７．４）、１ｍＭスクロース、０．２５ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）、０．５ｍＭのＰＭＳＦ、１％トリトンＸ−１００（Ｔｘ−１００）及び１μｇ／ｍＬのペプスタチン及びアプロチニンから成る。氷上で１５分間インキュベートした後、抽出緩衝液を除去し、微小遠心分離機で４℃で５分間遠心分離し、そして１００μＬの上清を９６穴プレートの各ウェルに添加する。１００μＬの２００μＭ基質（カスパーゼ３、６及び８に対してそれぞれＤＥＶＤ−ｐＮＡ、ＶＥＩＤ−ｐＮＡ又はＩＥＴＤ−ｐＮＡのいずれか）を各ウェルに添加し、最終濃度１００μＭの基質とする。プレートは３７℃で２時間、４時間、６時間又は２４時間インキュベートし、吸光度は４１５ｎｍ（Ａｂｓ４１５）の波長で測定する。吸光度の読み取りはｐＮＡ単独の既知標準と比較する。
検定５． アネキシンＶの検定
アネキシンＶの細胞への結合レベルを測定するため、培養は対照の塩溶液（ｐＨ７．４）で２回洗浄した後、約０．５μｇ／ｍＬの濃度でアネキシンＶ−ＦＩＴＣを含む対照の塩溶液（ｐＨ７．４）を添加する。ヨウ化プロピジウム（１０μｇ／ｍＬ）も同時に該培養に添加する。細胞は常温の暗闇で３０分間インキュベートし、続いて新しい対照塩溶液で３回洗浄する。ＦＩＴＣ蛍光の分析（励起４８８ｎｍ、発光５１０ｎｍ）はライカＤＭＩＲＢ顕微鏡を用いて測定する。ＡＳＡ４００カラー・フィルムを用いてライカＭＰＳ６０カメラ付属品で写真撮影し、ネガフィルムはアドビー・フォトショップ，バージョン２．０．１にスキャンする。
検定６． リポタンパク質酸化の検定
金属により媒介される脂質過酸化の二つの異なる検定が利用できる。第一の検定は金属化タンパク質の酸化活性を測定する工程を含む。これは透析された金属化タンパク質又は天然タンパク質（指定濃度で）と０．５ｍｇ／ｍＬのＬＤＬとを２４時（３７℃）間混合することにより測定する。脂質の過酸化反応（ＬＰＯ）は脂質過酸化検定キット（ＬＰＯ４８６、オキシス・インターナショナル社、ポートランド、オレゴン州）をキットの取扱説明書の通りに用いて測定する。ＬＰＯのレベルはＬＤＬ単独（１００％ＬＰＯ）と吸光度（４８６ｎｍ）を比較することにより測定する。第二の検定はタンパク質と結合していない遊離のＣｕの存在下で天然タンパク質のＬＰＯ活性を測定するために用いる。これは２０μＭのＣｕ−ｇｌｙとともに０．５ｍｇ／ｍＬのＬＤＬに非金属化ペプチド（１４０μＭ）を添加する工程及び金属化タンパク質のＬＰＯについて検定する工程を含む。ＬＰＯのレベルは吸光度（４８６ｎｍ）をＬＤＬ＋Ｃｕ−ｇｌｙ（１００％ＬＰＯ）と比較することにより測定する。負の対照として、ＬＤＬも該タンパク質をＣｕ−金属化するために用いるものと比較できるＣｕ−ｇｌｙ透析溶液に曝す。
検定７． Ｃｕ−金属化タンパク質により誘導される細胞毒性
タンパク質又は合成ペプチドを、タンパク質濃度に対して等モル又は２倍の金属で金属−グリシン溶液と混合する。この金属−タンパク質混合物を、３７℃で一晩インキュベートした後、３，５００キロダルトン・カットオフを備えたミニ透析カップ（ピアース社、ロックフォード、イリノイ州）を用いて十分に透析する（室温でｄＨ２Ｏ（３Ｌ／交換）を２回交換して２４時間）。ｐＨ７．４のＰＢＳでタンパク質を透析し、ｄＨ２Ｏ透析と同一の活性をもつ金属化タンパク質を得た。
これらの神経毒作用を測定するために、金属化タンパク質、天然のタンパク質又はペプチドを２日齢の初代皮質ニューロン培養に添加する。この培養もＣｕ−ｇｌｙ（５μＭ又は１０μＭ）又はＬＤＬに曝す。正の対照の培養はＣｕ−ｇｌｙ＋ＬＤＬ又はＬＰＯ産物の４−ヒドロキシ−ノネノール(nonenol)（ＨＮＥ、シグマ・ケミカルズ社）で処理する。培養は製造業者の取扱説明書に従って乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）検定キット（ロッシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ社、ヌナヴァディング、オーストラリア）を用いて細胞死について検定する。
検定８． Ａβが媒介するリソソーム酸性化の喪失についてのアクリジン・オレンジ検定
培養したマウスの皮質ニューロンをＡβ１−４２（２０μＭ）で１６時間処理した後、５ｍｇ／ｍｌのアクリジン・オレンジ（ＡＯ）を用いて３７℃で５分間染色する。３７℃で１５分間３７℃で５分間ＡＯが誘起する蛍光は蛍光顕微鏡の赤色フィルターで測定する。ＡＯは、エンドソーム／リソソーム画分に蓄積し且つインキュベーション中オレンジ色の蛍光を示す親リソソーム性の弱塩基である。ＡＯは、リソソーム膜に十分なプロトン勾配が存在する限り、リソソームの内部に隔離される。Ａβ１−４２による細胞の処理は、１６〜２４時間以内にオレンジ色の蛍光が消失することにより示されるように、リソソーム膜のプロトン勾配を崩壊させＡＯを細胞質ゾルに再局在化させる。
検定９． ヒト脳アミロイドの可溶化の検定
この検定は、ヒトの死後のＡＤ脳から得た組織抽出物のＡβを不溶性相から可溶性相へ移動させる試験化合物の能力を評価するために実施した。
プラークを生成する髄膜を含まない皮質０．５ｇ以下を、ＤＩＡＸ９００ホモジナイザー（ヒュドルフ社、ケルハイム、ドイツ）又は他の適切な装置を用いて、２ｍＬ以下の氷冷のリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）中でフルスピードで３０秒間三回ホモジナイズした。リン酸緩衝食塩水で抽出できる画分を得るために、ホモジネートを１００，０００×ｇで３０分間遠心分離し、上清を得た。或いは、該組織を凍結乾燥した後、粉砕し、粉末とした。次いで、粉末を上記のように抽出用のアリコートに検量した。遠心分離後に、１０μＬの上清のアリコートを得、８％のＳＤＳ、１０％の２−メルカプトエタノールを含む等容積の２Ｘトリス−ティセンＳＤＳ試料緩衝液（ｐＨ８．３）と混合した。試料は次に９０℃で１０分間加熱し、ゲル電気泳動により分離した。皮質試料の不溶性画分は１ｍＬのリン酸緩衝食塩水に最初のペレット試料を再懸濁することにより得た。この懸濁液の５０μＬ部分を次に上記のように２００ｍＬの試料緩衝液中で煮沸した。
トリス−トリシン・ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動は適切に希釈された試料を１０％から２０％の勾配ゲル（ノベックス社、サンディエゴ、カリフオールニア州）にローディングすることにより実施し、その後０．２μｍのニトロセルロース膜（バイオ−ラッド、ヘルクレス、カリフオールニア州）に移した。Ａβは、モノクローナル抗体Ｗ０２を用いることにより検出され、増強された化学発光（例えばＥＣＬ；アマーシャム・ライフ・サイエンス社、バッキンガムシャー州、英国）を用いることにより可視化された。Ｗ０２はホースラディッシュ・ペルオキシダーゼと結合したウサギ抗マウスＩｇＧ（ダコ社、デンマーク）と共に残基５から８、１７（又は他の適切な抗体）を検出する。各ゲルには対照標準として０．５ｎｇ、１ｎｇ及び２ｎｇの合成Ａβ４０（ケック・ラボラトリー、エール大学、ニューヘーブン、コネチカット州）を含む３レーンを包含させた。
ブロット・フィルムはＵＶＰゲル・ドキュメンテーション・システムなどの適切な画像化システムを用いることによりスキャンし、デンシトメトリーは例えばＵＶＰラブワークス等の適切なソフトウェアを用いて実施した。フィルム／スキャナーのダイナミック・レンジはステップ・タブレット（９１１ＳＴ６００番、コダック社、ロチェスター、ニューヨーク州）を用いることにより測定し、目盛り付きフィルムは製造業者によって感光され、既知の増加強度の段階を提示した。単量体及び二量体のＡβバンドを密度分析するためシグナル強度を定量化できる範囲は、ステップ・タブレットのスキャニング及びデンシトメトリーにより得られる曲線との比較に基づいた。予備検定後のシグナル強度が低い試料は低濃度又は高濃度の合成標準を用いることにより再検定してもよい。
全試料は数回分析し、ゲル負荷量及び希釈が標準曲線の定量できる範囲内に納まるよう調整した。この不溶性Ａβは上記の皮質試料から得る不溶性アミロイドプラークに由来するペレット化できる画分を含み、可溶性画分は単量体及び／又はオリゴマーの可溶性Ａβを含む。
１試験化合物ごとに数個のゲルを泳動し、それぞれのゲルにＰＢＳの対照を含めた。各ゲルには種々の濃度の試験化合物を含めた。スチューデント「ｔ試験」は任意濃度の各ゲルの試験化合物により得られる最高値の平均と複数のゲルから得たＰＢＳ値の平均とを比較するために用いた。従って、任意の試験化合物により得られる可溶化の平均増加がＰＢＳ単独と比べて有意であるか否かについての測定が可能である。（＋）点の試験化合物はプラークの可溶化においてＰＢＳ単独の値より統計学的に有意な増加に達した化合物である。（−）点の試験化合物はプラークの可溶化においてＰＢＳ単独の値より統計学的に有意な増加に達しない化合物である。
検定１０． 金属の分配
試験化合物の存在下で脳組織を抽出した後の、亜鉛及び銅を含む種々の金属の分配に及ぼす効果を検定するために、ヒトの脳組織の抽出物から得る可溶性画分及び不溶性画分をアミロイド可溶化検定のために調製する。二つの画分中の金属は、必要な場合、硝酸及び／又は過酸化水素を用いた適切な前処理の後に、誘導結合プラズマ質量分析により分析する。
検定１１． トランスジェニック動物のＡβ沈着に及ぼす試験化合物の投与の影響
トランスジェニック・マウス・モデルは、アルツハイマー病（ゲームスら，1995、シャオら，1996）、パーキンソン病（マスリアら，2000）、家族性筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）（グルニーら，1994）、ハンチントン病（レディら，1998）、及びクロイツフェルト−ヤコブ病（ＣＪＤ）（テリングら，1994）を含む幾つかの神経疾患に利用できる。本発明者らは、アルツハイマー病のトランスジェニック・モデルの一つであるＡＰＰ２５７６トランスジェニック・マウス（シャオら，1996）も白内障発症率が高いことを見出した。これらの動物モデルは本発明の方法を試験するのに適している。
トランスジェニック・マウスのＡＰＰ２５７６株（シャオら，1996）を使用する。８から９月齢の雌マウスを選別し、処理のため複数の群に分ける。
マウスを間隔をおいて屠殺し、試験化合物による処理が脳のアミロイド形成を減らすか否かを測定し、最も効果的な投与プロトコルを同定するために脳を調べる。脳及び血清における可溶性及び不溶性のＡβのレベルは検定９について記載した方法の通り較正ウェスタン・ブロットを用いて測定する。
各群の他のマウスは標準的方法であるモリス水迷路を用いて認知機能について８ヶ月までの期間にわたって試験する。動物の全般的健康も、自発運動、敏捷性及び全般的健康の徴候を含む特性の組み合わせを主観的に評価する５点の整数尺度を用いて、予備知識のないオペレーターにより毎日測定する。
検定１２． 生理化学的特性
極性表面積（ＰＳＡ）の計算
極性表面積値は、分子特性の計算用のパッケージである「モリンスピレーション（Molinspiration）」を通して利用できるウェブベースのプログラムを用いて計算した。
濁度溶解度測定
溶解度の見積もりはｐＨ２．０及びｐＨ６．５の両方で測定した。これはヒトの近位胃腸管に沿って予測できる範囲内のｐＨである。
該化合物はＤＭＳＯに適切な濃度で溶解した後、０．０１ＭのＨＣｌ（約ｐＨ＝２．０）又はｐＨ６．５の等張リン酸緩衝液のいずれかに加え、最終のＤＭＳＯ濃度を１％にした。次いで、これらの試料を比濁法により分析し、溶解度の範囲を測定した［Ｄ．ベヴァンとＲ．Ｓ．ロイド，Anal. Chem. 2000, 72, 1781-1787による］。
ｃＬｏｇＰ値
理論的なＬｏｇＰ値はＡＣＤ ＬｏｇＰソフトウェアを用いて決定した。引用する値は未熟練のデータベースから計算し、イオン化されていない種を表す。
検定１３． 血液脳関門の透過
試験化合物をＤＭＳＯに溶解し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を添加して５０μＭの濃度で１．２５％〜２．５％のＤＭＳＯを含むＰＢＳ溶液を得た。個々の潅流中のＢＢＢの完全性を評価し且つ脳組織試料の残留血管腔（ＲＶＳ）の容積（即ち、各潅流の終わりに血管の内腔内に残る流体の容積）を見積もるために血液脳関門（ＢＢＢ）−非透過性マーカーとして作用する微量の１４Ｃ−スクロースを各保存輸液に添加した（約０．０１μＣｉ／ｍＬ）。
成熟雄のスパーギュ・ドーリー・ラット（１８０−１９０ｇ）を、１．０ｍＬ／１００ｇ体重の用量のウレタン（２５％ｗ／ｖ）の腹腔内注射で麻酔した。右総頸動脈を外科的に露出し脳循環の潅流用にカニューレを挿入した。次に、右外頸動脈（頭蓋骨の外側の組織に血液を供給する）を、全注入溶液が残留右内頸動脈を介して脳に入るように、右総頚動脈からその分岐部より遠位で連結した。次いで、心臓を露出し、注入の開始直前に離断した。注入速度はポンプ・セットにより３．２ｍＬ／分で送達するように制御した（約８５％の正常血液がラットの大きさの脳に供給される）。注入カニューレは最初に０．５ｍＬのヘパリン添加ＰＢＳ（１０ＩＵ／ｍＬ）の予洗工程を行った。このＰＢＳは血管を洗い流し且つ血液が小血管を凝固し遮断するのを妨ぐように作用する。
１．５分後に、注入ポンプは自動停止し、カニューレを頸動脈から外した後、注入溶液の試料（１〜１．５ｍＬ）を注入カニューレの先端から回収した。次いで、脳を切り離し、右中脳を含む右半球、左中脳を含む左半球及び後脳（小脳、脳橋及び脳幹）の３部分に分けた。右内頸動脈を介した潅流は右半球及び右中脳に優先的に供給する（左半球及び後脳は可変の側副潅流を受け入れる）ため、脳の右部分だけを次の測定に用いた。各動物からの脳組織試料を−３０℃で凍結し、ホモジナイズし、検量した部分標本をＬＣ−ＭＳにより分析し、総脳濃度を得た。分析はマイクロマス・トリプル・クアッド・インスツルメントを用いて行った。移動相はアセトニトリル／水勾配（０．０５％ギ酸を含む）から成り、カラムはフェノメネックス・ルナＣＮであった。
各脳組織試料からの小部分標本及び対応する注入溶液を液体シンチレーション計数により分析し、１４Ｃ−スクロースのレベルを測定した。各脳組織試料の残留血管腔（ＲＶＳ）は、脳組織中のスクロースの測定濃度（ｄｐｍ／ｍｇ）を対応する注入溶液のスクロース濃度（ｄｐｍ／μＬ）で割ることにより計算した。これは各潅流の終わりに血管内に残留する流体の容積である。このＲＶＳに注入溶液の試験化合物の濃度を乗じることにより、各脳組織試料の血管内に存在する試験化合物の総残留量（即ち、ＢＢＢを横断しなかった量）が得られる。総脳濃度からこれを差し引くと、血管外にある各脳組織試料中の薬物量（即ち、ＢＢＢを横断した量）が得られる。このＲＶＳ−補正脳濃度の割り算により、脳の取り込み率が得られる（方程式１）。
合計５〜６回の脳潅流実験が各試験化合物について実施され、平均脳摂取率が計算された。
５０％を上回る率は極めて急速に脳に入る化合物を意味し、１０％から５０％の率は健全に脳に入る化合物を意味し、１０％未満の率（観察されない）は非常に遅く脳に入る化合物を意味し且つ治療投与に適さないであろう。１％未満の率（観察されない）は脳から効率的に排除される化合物を意味する。
検定１４． トランスジェニック・マウスの脳の免疫組織化学
検定１１で言及したＡＰＰ２５７６トランスジェニック・マウス（シャオら，1996）がこの検定で利用される。ホルマリンで固定されたマウスの対側脳組織を冠状に切断する。切片（１０μｍ）を対応する部位から採取し、抗原の検索用に８０％ギ酸で処理する。用いる一次抗体は、Ａβの残基１８から２２のエピトープを認識するモノクローナル抗体１Ｅ８である（スミスクライン・ビーチャム社、英国）。免疫反応性はホースラディッシュペルオキシダーゼ（３，３９−ジアミノベンジジンクロマゲンを用いる）（ダコ社）及びアルカリ・ホスファターゼ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル・ホスフェート及びニトロブルー・テトラゾリウム・クロライド・クロマゲンを用いる）（ダコ社）と連結した二次抗体を用いて発色させる。１切片当たりのプラークの存在度は、下記の尺度に従って、予備知識のない二人の技師により評価される。
０＝プラークは見えない
１＝プラークは存在するが非常にまばらである
２＝幾つかのプラークが存在する
３＝多数のプラークが限られた範囲に見える
４＝プラークは豊富であり特定の範囲に限定されない
適用できる場合は、例えば２．５等の中間値を割り当てる。
スチューデント「ｔ」試験は群間の比較に用いる。
検定１５． 薬物動態的側面
・試験化合物の静脈内注射：２ｍｇ／ｋｇを含む適切な賦形剤を２匹のラットに投与し、動脈血を２４時間以内にサンプリングする。
・試験化合物の経口投与：３０ｍｇ／ｋｇを含む適切な担体を２匹のラットに経口強制飼養により投与し、動脈血は２４時間以内にサンプリングする。
・試験化合物の血漿濃度は適切な分析方法により測定する。
検定１６． 試験化合物のマウス血漿レベルの測定
ＰＢＴ１０６１
ＰＢＴ１０６１はＮａ−カルボキシメチル・セルロース（ＣＭＣ）の懸濁液として３０ｍｇ／ｋｇで４匹のマウスに経口強制飼養により経口投与した。２匹のマウスは投与３０分後に屠殺され、２匹のマウスは投与６０分後に屠殺された。血液は心臓の穿刺により得た。血漿は遠心分離により分離した。
ＰＢＴ１０６１の濃度はＺＱインスツルメントを用いてＬＣ／ＭＳにより測定した。移動相はアセトニトリル（ＡＣＮ）／水勾配（０．０５％ギ酸を含む）から成り、カラムはフェノメネックス・ポーラー−ＲＰ４μＭ８０Ａ（５０×２ｍｍ）カラムであった。
マウスの血漿試料はＡＣＮによるタンパク質沈殿後に直接注入した。血漿の分析方法は１２５〜１０，０００ｎｇ／ｍｌの範囲で直線状であった（Ｒ２＝０．９９９２）。ジアゼパムは内部標準として用いた。血漿からＰＢＴ１０６１の回収率は約１００％であった。
３０ｍｇ／ｋｇで経口投与した後のマウスのＰＢＴ１０６１の血漿濃度は表１に示す。
ＰＢＴ１０６３
ＰＢＴ１０６３はＮａ−カルボキシメチル・セルロース（ＣＭＣ）の懸濁液として３０ｍｇ／ｋｇで４匹のマウスに経口強制飼養により経口投与した。２匹のマウスは投与３０分後に屠殺され、２匹のマウスは投与６０分後に屠殺された。血液は心臓の穿刺により得た。血漿は遠心分離により分離した。
ＰＢＴ１０６３の濃度はシングル四重極インスツルメントを用いてＬＣ／ＭＳにより測定した。移動相はアセトニトリル（ＡＣＮ）／水勾配（０．０５％ギ酸を含む）から成り、カラムはフェノメネックスＣ８の４μｍ８０Ａ（５０×２ｍｍ）カラムであった。
供給された急性毒性のマウス血漿試料（送達０２．０９．０３）をＡＣＮによるタンパク質沈殿後に直接注入した。濃度はラットの血漿で作成された較正曲線との比較により決定した。血漿の分析方法は３１２〜１０，０００ｎｇ／ｍｌの範囲で直線であった（Ｒ２＝０．９９７６）。ジアゼパムは内部標準として用いた。血漿からＰＢＴ１０６３の回収率は約４２．９％であった。
マウスの血漿試料のＰＢＴ１０６３濃度は表２に示す。
アルツハイマー病の治療についての式Ｉ又は式ＩＩの化合物の臨床試験
ＡＤの治療についての式Ｉ又は式ＩＩの化合物の第ＩＩ相臨床試験は、中等症のＡＤ患者の無作為二重盲検プラセボ比較試験第２相臨床試験において、経口ＰＢＴ−１処理の効果を研究するために実施した。３６人の被験者が無作為化され［１８人がプラセボであり１８人がＰＢＴ−１で、３２人が終了した］、重症度の高い罹患群及び低い罹患群に階層化した。治療効果は、重症度の高い罹患者において３６週にわたる認知低下の予防に統計学的に有意であった（基線ＡＤＡＳ−ｃｏｇ≧２５）。重症度の低い罹患群（ＡＤＡＳ−ｃｏｇ＜２５）の機能はこの間隔にわたって殆ど低下しなかった。従って、認知の変化はこの階層で識別できなかった。血漿Ａβ４２はＰＢＴ−１群で減少したが、プラセボ群で増加した（ｐ＜０．００１）。血漿のＺｎレベルはＰＢＴ−１群で有意に上昇した（約３０％）。
用量
幾つかの検討材料から用量を選択した。トランスジェニック・マウスについての先の研究において、１週間のうち５日間毎日投与する２０−３０ｍｇ／ｋｇのＰＢＴ−１の経口用量は、治療の２〜３ヵ月後にＡβの蓄積を阻害するのに著しく効果的であった。ヒトの等用量である１５００−２２５０ｍｇ／日は、処方されたＰＢＴ−１の抗菌性用量（６００ｍｇを一日４回経口投与）に近い。しかしながら、数ヶ月間投与される、この用量の規模はＳＭＯＮ毒性についての懸念をもたらす。
７５ｋｇの平均体重と仮定すれば、３．３ｍｇ／ｋｇ／日の開始用量はトランスジェニック・マウス・モデルの有効量の規模と同じオーダー内であるが、抗菌性用量の約１０分の１に過ぎない。
２０ｍｇ／ｋｇ／日未満の用量の有効性についてのトランスジェニック・マウスの研究から得られるデータはないため、本発明者らは、有益な効果が上記のマウスの研究の９〜１２週の継続期間（チャーニーら、2001）より長い治療期間を要すると判断した。従って、トランスジェニック・マウスで有効な量の約３分の１である平均用量で３６週の試験期間が選ばれる。１０ｍｇ／ｋｇ／日の最終用量はマウスの有効量の半分である。
３．３ｍｇ／ｋｇ／日の開始用量はトランスジェニック・マウス・モデルの有効量の規模と同じオーダー内であったが、抗感染用量の約１０分の１に過ぎない。本研究はトランスジェニック研究で見られるものと同じ規模にある金属及びＡβのレベルに及ぼす生化学的効果を検出することに努力した。
実験の手順
倫理的問題：情報に基づく判断又は決断ができない程度まで認知機能が損なわれている個人から得る承諾に関するオーストラリアの法律に従って、自身に代わって承諾できない各関係者についてビクトリア州民事及び行政裁判所により処理される「特別手続きの承諾」が得られた。その上、第三者の承諾が全介護人から得られた。全被験者は研究の開始前にドネペジルで安定させた。本研究はロイヤル・メルボルン病院研究財団の臨床研究及び倫理委員会により承認された。
研究の母集団：研究は、ビクトリア精神衛生研究機関のＡＤ臨床試験部門及びロイヤル・メルボルン病院で行った。研究の試験対象患者基準は、インフォームド・コンセント、ＮＩＮＣＤＳ−ＡＤＲＤＡ基準による推定ＡＤの診断（マッカーンら，198４）、１８〜４５のＡＤ評価スケール−認知（ＡＤＡＳ−ｃｏｇ）点（ローゼンら，1984）、１０〜２４のミニメンタル・ステート試験（ＭＭＳＥ）点（フオールシュタインら，1975）、少なくとも６ヶ月間５ｍｇ又は１０ｍｇのドネペジル、試験を支持することを厭わない又は支持できる親戚又は介護人、模擬試験を完了できる、一次感覚機能が損なわれていない、であった。
患者が末梢神経障害若しくは視神経障害の病歴若しくは臨床所見を有する場合又は共存する病気又は認知機能、神経伝導若しくは有害事象プロファイルと混同されうる病気に罹患した既往歴を有する場合は除外した。
下記の因子は効果指標と相関するか否かを決定するために基線で得られた。即ち、年齢、性別、発病前ＩＱ［国の成人読解試験（ＮＡＲＴ）から推定される］、教育年数、及びアポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）のアロタイプである。
研究計画：本研究は二重盲検プラセボ対照平行群の無作為化設計であった。３６人の患者及び彼らの介護人は募集されて参加し、患者は１：１の割合で無作為に選ばれＰＢＴ−１又はプラセボのいずれかを服用した。研究の継続期間は３６週間であった。ＰＢＴ−１の経口用量は０〜１２週では１２５ｍｇの指値であり、１３〜２４週では２５０ｍｇの指値に増加し、最終的に２５〜３６週では３７５ｍｇの指値であった。
研究手順：スクリーニング手順は完全な病歴、健康診断、神経学的検査及び眼科検診、血液検査及び尿検査並びに心理試験（ＡＤＡＳ−ｃｏｇ、ＭＭＳＥ）から成る。神経伝達試験及び視覚誘発応答はスクリーニングと基線の視察（ｖｉｓｉｔ）の間に行い基線の測定値を得た。血液はＡｐｏＥのアロタイプ決定、基線の無作為化前の金属及びＡβの血漿レベル決定用に収集した。全患者は研究開始時のドネペジルの用量を継続し、全患者は４週ごとに１００ｍｇのビタミンＢ１２を筋内内に投与された。
血液試料は留置カテーテルにより回収される１２、２４及び３６週を除いて肘前静脈穿刺（ve nepuncture）により回収した。手順の変更は、一貫して約１０％減少する（おそらく血小板活性化の差異の結果として）ことが見出されたＺｎのレベルを除いて生化学的読み取りに影響を及ぼさなかった。従って、これらの間隔から得られるＺｎのデータは分析から削除された。
効果指標：一次の臨床効果変数は、基線並びに４、１２、２４及び３６週で行われたＡＤＡＳ−ｃｏｇの基線点からの変化であった。この測定はドネペジルなどの現行治療と治療効果を比較可能にするために選ばれ、一次効果指標として有効性試験もＡＤＡＳ−ｃｏｇを用いた（ロジャーズら，1998）。多数の神経心理試験が二次指標として考えられたが、再検査で被験者を疲労させないことが必要であった。従って、唯一の他の認知試験はミニメンタル・ステート試験（ＭＭＳＥ）であった。ＣＩＢＩＣ＋（介護者の情報を取り入れながら臨床医との面接に基づく変化の所感）という主観的な観察指標も行った。血漿Ａβ、並びに血漿の亜鉛及び銅は全て４週ごとに採取した。
Ａβ検出のための二重抗体捕獲酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）：ポリスチレン・プレートは、ｍＡｂであるＧ２１０（Ａβ４０用）又はｍＡｂであるＧ２１１（Ａβ４２用）で被覆した。これらのプレートを洗浄し、ビオチン化ｍＡｂであるＷＯ２を添加した。結合抗体はストレプトアビジン標識ユーロピウム（パーキン・エルマー社、ビクトリア州、オーストラリア）で検出した。３連のウェルから得られた値は各プレートについて作成された標準曲線に基づいて計算した。合成のＡβ１−４０及びＡβ１−４２を補足した血漿試料も検定し目的の濃度範囲にわたる指標信頼性を確認した。
金属レベル：金属は前述したように誘導結合プラズマ質量分析法により測定した（チャーニーら，2001）。
治療薬剤のモニタリング：１２、２４及び３６週目に、ＰＢＴ−１の血中レベルは適切な確認研究とともにＨＰＬＣにより検定した（南オーストラリア大学、薬学研究センター）。
安全対策：標準的な有害事象の報告を行い、生化学試験、腎臓及び肝臓の機能、完全な血液検査、ビタミンＢ１２及び葉酸の血清レベルは個々の訪問で記録した。末梢性神経障害及び視神経障害について評価するために、神経学的検査を個々の訪問で実施し、視覚誘発反応、神経状態の研究及び眼科検査はスクリーニング時、１６週及び最終試行の訪問前に行った。ＥＣＧはスクリーニング時並びに１２、２４及び３６週目に行った。
データ作成及び統計分析：データのモニタリング及び管理は請負業者（ケンドル・インターナショナル・アンド・ヘルス・リサーチ・ソリューションズ社、メルボルン）が請け負った。有効性についての証拠は治療群間の基線からの変化の有意差により示された。分散分析は一次設計因子である基線での治療群疾患重症度を用いて統計的有意性を評価する主要な方法であった。潜在的に有意な共変量は必要に応じて導入した。範疇測定に基づく群間の差異は検出力を最大にするために正確な統計方法を用いて分析した。測定時間における０．６０という相関関係の仮定に基づいて、基線から３６週までの群間の変化における一つの標準偏差の差異の効果を検出する力は、１５人の被験者が１群ごとに募集される場合、約８０％であった。１５％の減少率が同様な母集団で観察されたので、１８人の患者が各治療群に補充された。
結果
被験者の募集及び人口統計：３６人の被験者が２０００年４月から１２ヶ月の期間にわたって募集された（図１）。これらのうち、３２人からプロトコル分析を通じて有意なデータを得た。２人の被験者は各治療群から除かれた。
基線の疾患重症度因子は、基線の中央値ＡＤＡＳ−ｃｏｇ点で試料を二群（値＜２５，≧２５）に分配することにより、計画通りに作成し、重症度の低い及び重症度の高い罹患群を得た（それぞれ治療群のｎ＝８及び８並びにプラセボ群のｎ＝７及び９）。
これらの群は基線で人口統計学的、生物学的及び臨床学的なパラメータにわたって差異はなかった（表４）。治療群以外は、ＮＡＲＴを用いて推定されるように、プラセボ群より高い平均発病前ＩＱ（１０４．９と比べて１１１．４；ｔ（３０）＝２．２７，ｐ＝０．０３１）及びより低い甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）レベル（２．００ｍＵ／Ｌと比べて１．１４；ｔ（３０）＝４．４００，ｐ＜０．００１）を有した。ＮＡＲＴ及びＴＳＨは続いて共変量としての分析に条件つきで参入したが、いずれの分析においても有意でないことが見出された。
臨床効果：基線から４、１２、２４及び３６週目のＡＤＡＳ−ｃｏｇ点の変化は治療群の因子及び基線の疾患重症度を用いて相互分散分析にかけられた。ＡＤＡＳ−ｃｏｇ点の変化の平均値はＰＢＴ−１処理群と比べて各試験間隔のプラセボ処理群でより大きな低下を示した（図２Ａ）。この傾向は４週目［Ｆ（１，２８）＝３．５５，ｐ＝０．０７０］及び２４週目［Ｆ（１，２８）＝３．３１，ｐ＝０．０８０］で統計的有意性に近づいた。プロトコルの計画通りに、試料を重症度の低い又は高い（基線ＡＤＡＳ−ｃｏｇ値＜２５、≧２５）罹患被験者に階層化することにより、疾患の重症度の効果を調べた。重症度レベル内の簡単な効果試験は、全週で重症度の低い階層における有意でない結果と４週目［Ｆ（１，２８）＝７．７３，ｐ＝０．０１０］及び２４週目［Ｆ（１，２８）＝６．６３，ｐ＝０．０１６］の重症度の高い階層における有意差とに総合群が分けられるという傾向を示した（図２Ｂ）。この傾向は３６週目に維持していたが、統計的有意性から僅かに外れた［Ｆ（１，２８）＝３．６２，ｐ＝０．０６８］。重症度の高い罹患群において、２４週目及び３６週目のプラセボを上回るＰＢＴ−１の基線ＡＤＡＳ−ｃｏｇ点から得た平均変化の差異はそれぞれ７．３７（９５％ＣＩ：１．５１−１３．２４）及び６．３６（９５％ＣＩ：−０．５０−１３．２３）であった（図２Ｂ）。
血漿Ａβ、Ｚｎ及びＣｕに及ぼす効果：基線で、治療群又は重症度の階層に血漿Ａβ４２レベルで有意な差異はなかった。血漿Ａβ４０／４２の基線での個々のレベルの分散は大きく、群間の平均変化のあらゆる有意差を検出するための研究の検出力を低下させた。しかしながら、基線参照レベルと個々のＡβレベルとの参照は著しく分散を減少させ、有意な治療効果を明らかにした。血漿Ａβ４２は２０週を超えるＰＢＴ−１治療群の基線から有意な減少を示したが、同期間にプラセボ群の血漿Ａβ４２は増加した（図３Ａ）。上で記載したと同様に、疾患の重症度による階層化はこれらの変化が重症度の低い罹患者でのみ明らかであることを証明した（図３Ｂ）。
ＰＢＴ−１の投与は全血漿Ｚｎの有意な上昇（約３０％）と関連した（図４Ａ）が、血漿Ｃｕには効果を及ぼさなかった（図４Ｂ）。プールされたＡＤ群のＺｎの平均基線レベル（９．４μＭ）は加齢に伴う規範値を下回った（ウッドとチェング，1997）。ＰＢＴ−１治療により誘発された血漿Ｚｎの増加は従ってレベルの正常化を意味した。対照的に、Ｃｕの平均基線レベル（１３．１μＭ）は加齢に伴う規範範囲内であった（ラヒル−ハーゼンら，2000）。同時又は後に検定した血漿Ａβ４２／４０レベルとＺｎ／Ｃｕレベルとの相関関係は有意な関係を示さなかった。
ＰＢＴ−１によるＡＤ被験者の重要な治療結果は、矛盾した血漿Ｚｎの上昇であり（図４Ａ）、これは血液とシナプス亜鉛のＺｎＴ３媒介性連絡の回復と一致している。これは、デスフェリオキサミンなどの典型的な金属キレート剤と対照的に、この用量のＰＢＴ−１の作用機構が全組織キレート剤の作用機構ではないことも意味している。金属に対するＰＢＴ−１の比較的弱い親和性は金属恒常性の再構築された平衡の存在下で著しい全身性の金属減少を惹起するには不十分であるらしい。
ＰＢＴ−１の血中レベル：２５０ｍｇ、５００ｍｇ及び７５０ｍｇの１日当たりの総用量でＰＢＴ−１の定常状態の投薬前レベルはそれぞれ４．０３±２．１０μｇ／ｍＬ、６．７４±３．７０μｇ／ｍＬ、７．６０±２．１５μｇ／ｍＬであり、同時又は後に検定したＡＤＡＳ−ｃｏｇ、金属又はＡβのレベルと有意な相関関係を示さなかった。
本記載及び本実施例で引用された引用文献は下記の頁に列挙し、参照により本明細書にインコーポレートされる。
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本発明が明瞭性及び理解の目的で詳細に記載される一方、本明細書に開示される発明概念の範囲から逸脱することなく、本明細書に記載される実施態様及び方法への種々の変更及び改変が為されうることは当業者には明らかであろう。
図１は、研究対象のフローチャートである。 図２は、（Ａ）ＣＱ対プラセボという二つの選択肢、及び（Ｂ）治療選択肢［重症度が低い方（ＡＤＡＳ−ｃｏｇ＜２５）、重症度が高い方（ＡＤＡＳ−ｃｏｇ≧２５）］内で重症度別に層別化したものにおける認知能力（ＡＤＡＳ−ｃｏｇで評価）の基線からの平均経時変化（±ＳＥ）を示すグラフである（＊ｐ≦０．０５；＊＊ｐ≦０．０１）。 図３は、（Ａ）ＣＱ対プラセボという二つの選択肢、及び（Ｂ）図８のような重症度別に層別化したものにおける血漿Ａβ４２レベルの基線からの平均経時変化（±ＳＥ）を示すグラフである。（＊＊＊ｐ≦０．００１） 図４は、ＣＱ対プラセボという二つの選択肢における（Ａ）血漿Ｚｎ（Ｂ）血漿Ｃｕの基線からの平均経時変化（±ＳＥ）を示すグラフである。 図５は、ＡＤの経過に伴う行動（ＡＤＡＳ−ｃｏｇ）レベル及び生化学的（血漿／ＣＳＦ Ａβ）レベルの相対変化を示すグラフである。

Claims (17)

  1. 神経変性障害の治療、改善及び／又は予防用の医薬組成物であって、式Ｉａの化合物
    （上式中、
    ＲはＯ又はＳであり；
    Ｒ１はＨ、置換されていても良いアルキル、置換されていても良いアルケニル、置換されていても良いアルキニル、置換されていても良いアリール、置換されていても良いヘテロシクリル、ＣＮ、ハロ、ＣＦ３、ＳＯ３Ｈ、及びＯＲ２、ＳＲ２、ＳＯＲ２、ＳＯ２Ｒ２、ＮＲ２Ｒ３、（ＣＨ２）ｎＮＲ２Ｒ３、ＨＣＮＯＲ２、ＨＣＮＮＲ２Ｒ３、ＣＯＮＲ２Ｒ３、ＣＳＮＲ２Ｒ３、ＮＣＯＲ２、ＮＣＳＲ２、ＣＯＲ２、ＣＯ２Ｒ２、ＣＳＲ２又はＳＯ２ＮＲ２Ｒ３から独立して選択され、Ｒ２及びＲ３はＨ、置換されていても良いアルキル、置換されていても良いアルケニル、置換されていても良いアルキニル、置換されていても良いアリール、置換されていても良いヘテロシクリルから独立して選択され、ｎは１〜１０の整数であり、
    ｍは１から３の整数であり、並びに
    ｑは１または２の整数である）、
    その塩、水和物、溶媒和物、互変異性体及び／又は異性体を含む、医薬組成物。
  2. 式Ｉａの化合物のＲがＯである、請求項１記載の医薬組成物。
  3. 式Ｉａの化合物のＲ１がハロ、置換されていても良いアリール、置換されていても良いヘテロシクリル、置換されていても良いアルキル、ＯＲ２、ＳＲ２、（ＣＨ２）ｎＮＲ２Ｒ３、ＣＯＮＲ２Ｒ３及びＮＣＯＲ２であり、ｎ、Ｒ２及びＲ３が請求項１で定義した通りである、請求項１又は２記載の医薬組成物。
  4. 式Ｉａの化合物のＲ１がフッ素、ヨウ素、塩素、置換されていても良いフェニル、１〜４個の窒素原子を含む置換されていても良い３〜６員の不飽和へテロ単環式基、１〜４個の窒素原子を含む置換されていても良い３〜６員の飽和へテロ単環式基、１〜２個の酸素原子及び１〜３個の窒素原子を含む置換されていても良い３〜６員の飽和へテロ単環式基、置換されていても良いＣ１−４アルキル、置換されていても良いＣ２−６シクロアルキル、置換されていても良いＣ１−６アルコキシ、置換されていても良いチオ、ＣＨ２ＮＲ４Ｒ５（Ｒ４及びＲ５は独立してＨ及びＣ１−４アルキルから選択される）又はＣＯＮＨ（ＣＨ２）２Ｒ６（Ｒ６は置換されていても良いヘテロシクリルである）である、請求項１〜３のいずれか１項記載の医薬組成物。
  5. 式Ｉａの化合物が下記：
    の通りである、請求項１〜４のいずれか１項記載の医薬組成物。
  6. 神経変性障害が神経変性アミロイド症である、請求項１〜５のいずれか１項記載の医薬組成物。
  7. 神経変性障害がパーキンソン病である、請求項１〜５のいずれか１項記載の医薬組成物。
  8. 神経変性障害がＡβ関連状態である、請求項６又は７記載の医薬組成物。
  9. 該Ａβ関連状態がアルツハイマー病又はダウン症候群を伴う痴呆又は家族性アルツハイマー病における常染色体優性遺伝型の幾つかの中の一つである、請求項８記載の医薬組成物。
  10. 認知の衰えを遅延、減少、又は抑制する、請求項１〜９のいずれか１項記載の医薬組成物。
  11. アセチルコリンエステラーゼ活性部位の阻害薬、抗酸化剤、抗炎症剤及びエストロゲン剤より選択される他の医薬を更に含む、請求項１〜１０のいずれか１項記載の医薬組成物。
  12. 式Ｉａの化合物が経口投与、局所投与又は非経口投与されるものである、請求項１〜１１のいずれか１項記載の医薬組成物。
  13. 神経変性障害の治療、回復及び／又は予防のための医薬の製造における、請求項１〜５のいずれか１項で定義した式Ｉａの化合物の使用。
  14. 請求項１〜５のいずれか１項で定義した式Ｉａの化合物及び薬学的に許容されうる担体を含む、神経変性障害の治療、回復及び／又は予防用の医薬組成物。
  15. アセチルコリンエステラーゼ活性部位の阻害薬、抗酸化剤、抗炎症剤及びエストロゲン剤より選択される他の医薬を更に含む、請求項１４記載の医薬組成物。
  16. 少なくとも一つのＲ１がハロであり、且つＲ１が５位もしくは７位に、又は５位と７位の両方に位置する、請求項１〜５のいずれか１項で定義した式Ｉａの化合物。
  17. ｍ及びｑが２であり、Ｒ１が２位、３位、５位及び７位に位置し、且つＲがＯである、請求項１６で定義した式Ｉａの化合物の調製方法であって、下記式
    （式中、Ｒ１は請求項１６に記載のＲ１と同意義である）で表される化合物を、保護されていても良いＲ１ＣＯ２Ｈ（Ｒ１は請求項１６に記載のＲ１と同意義である）と反応させた後、環化させる工程を含む調製方法。
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