JP4648382B2 - 抗cea、抗cd3及び抗cd28の遺伝子組み換えによる糸状な単鎖の三重特異性抗体 - Google Patents
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Description
51 ACCGGGCGCGAGCGTGAAAATCAGCTGCAAAGCGACCGGCTATACCTTCA
101 GCGATTATTGGATCGAATGGGTGAAACAGCGTCCGGGTCACGGCCTGGAA
151 TGGATCGGTGAAATCCTGCCGGGCAGCGGCCGTACCGACTACAACGAACG
201 TTTCAAAGGCAAAGCGACCTTCACCGGCGACGTTTCTAGCAACACCGCGT
251 ATATGAAACTGTCTAGCCTGACCAGCGAAGATAGCGCGGTGTATTACTGC
301 GCGACCGGCACCACCCCGTTCGGTTACTGGGGTCAGGGCACCCTGGTTAC
351 CGTTTCCGCGACTAGTACCCCGAGCCATAACAGCCATCAGGTGCCGAGCG
401 CGGGCGGCCCGACCGCGAACAGCGGCTCTAGAGACATCGTGCTGACCCAG
451 AGCCCGGCGAGCCTGGCGGTGTCTCTGGGTCAGCGTGCGACCATCTCCTG
501 CCGTGCTTCCCAGTCCGTTTCCACCTCCTCCTACACCTACATGCACTGGT
551 ATCAGCAGAAACCGGGTCAGCCGCCGAAACTGCTGATCAAATATGCGAGC
601 AACCTGGAATCTGGTGTGCCGGCGCGTTTCAGCGGTTCTGGCAGCGGCAC
651 CGACTTCACCCTGAACATCCACCCGGTGGAAGAAGAAGATACCGCGTATT
701 ACTATTGCCAGCACTCTTGGGAAATCCCGCGTACCTTCGGTGGCGGCACC
751 AAACTGGAAATCAAAGAATTCAACAGCACGTACCGGGTTGTAAGCGTCCT
801 CACCGTACTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAATACAAATGCAAGA
851 GTACTGAGGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGA
901 GCTTCAATGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCACTGGCTA
951 CACCATGAACTGGGTGAAGCAGAGTCATGGAAAGAACCTTGAGTGGATGG
1001 GACTTATTAATCCTTACAAAGGTGTTAGTACCTACAACCAGAAGTTCAAG
1051 GACAAGGCCACATTAACTGTAGACAAGTCATCCAGCACAGCCTACATGGA
1101 ACTCCTCAGTCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGAT
1151 CGGGGTACTACGGTGATAGTGACTGGTACTTCGATGTCTGGGGCGCAGGA
1201 ACCTCAGTCACTGTCTCCTCAACTAGTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGG
1251 TGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTTCTAGAGACATCCAGATGACCCAGACCA
1301 CATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGG
1351 GCAAGTCAGGACATTAGAAATTATTTAAACTGGTATCAACAGAAACCAGA
1401 TGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACTACACATCAAGATTACACTCAGGAG
1451 TCCCATCAAAGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACC
1501 ATTAGCAACCTGGAGCAAGAGGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGG
1551 TAATACGCTTCCGTGGACGTTCGCTGGAGGCACCAAACTGGAACTGAAGC
1601 GCGCTGTCGACTTCCAGAATGCGCTGCTGGTTCGTTACACCAAGAAAGTA
1651 CCCCAAGTGTCAACTCCAACTCCTGTAGAGGTCTCACATATGCAGGTACA
1701 GCTACAGGAATCTGGTCCGGGTCTGGTAAAACCGTCTCAGACCCTGTCTC
1751 TGACCTGTACCGTATCTGGTTTCTCTCTGTCTGACTATGGTGTTCATTGG
1801 GTACGTCAGCCGCCAGGTAAAGGTCTGGAATGTCTGGGTGTAATATGGGC
1851 TGGTGGAGGCACGAATTATAATTCGGCTCTCATGTCCAGACGTGTAACCT
1901 CTTCCGACGATACCTCTAAAAATCAGTTCTCTCTGAAACTGTCTCTGTCT
1951 TCCGTAGACACCGCTGTATACTATTGTGCTCGTGACAAAGGTTACTCCTA
2001 TTACTATTCTATGGACTACTGGGGTCAGGGCACCCTGGTAACCGTATCTT
2051 CCGGTACCGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGAATGGGGCCGCA
2101 CATCATCATCACCATCACGAGCAA
Overlap−PCRのスケジュールは、図1の記載に基づいて行われる。Overlap−PCRに使用された核酸断片は、以下のようにした。
2. 5’−TATACCATGGGTCTCGAGATGTACCCGCGCGGTAACACTAGTGAATTCAACAGCACGTA−3’(SEQ ID NO:6)
3. 5’−AGCCAGTCCTGGTGCAGTACGGTGAGGACGCTTACAACCCGGTACGTGCTGTTGAATTC−3’(SEQ ID NO:7)
4. 5’−CTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAATACAAATGCAAGAGTACTTCTAGAATGTA−3’(SEQ ID NO:8)
5. 5’−CGAACCAGCAGCGCATTCTGGAAGTCGACGTTACCGCGCGGGTACATTCTAGAAGTACT−3’(SEQIDNO:9)
6. 5’−AATGCGCTGCTGGTTCGTTACACCAAGAAAGTACCCCAAGTGTCAACTCCAACTCCTGT−3’(SEQ ID NO:10)
7. 5’−GCGGTACCGTTACCGCGCGGGTACATCATATGTGAGACCTCTACAGGAGTTGGAGTTGA−3’(SEQ ID NO:11)
8. 5’−CGCGGTAACGGTACCGCGCTGGAAGTTGACGAAACCTACGTTCCGAAAGAATTTAACGC−3’(SEQ ID NO:12)
9. 5’−TCGCTAGCCCCATCCGCGGGATGTCAGCGTGGAAGGTGAAGGTTTCCGCGTTAAATTCTTTCGG−3’(SEQ ID NO:13)
10. 5’−ATCGAGCTCATGTACCCGCGCGGTAACGCTAGCGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGA−3’(SEQ ID NO:14)
11. 5’−TATTGCTCGTGATGGTGATGATGATGTGCGGCCCCATTCAGATCCTCTTCTGAGATGAG−3’(SEQ ID NO:15)
12. 5’−CTCGACGGATCCTTATTGCTCGTGATGGTG−3’(SEQ ID NO:16)
具体的な構築工程を、図4に示す。また、この構築工程において用いられる各種類ベタターの概略を図5に示す。以下、具体的な構築工程を説明する。
ポリクローニングsiteのDNA断片及びpTMF空ベクター(Zhang et al.,2002)について、同時に、NcoI/BamHIダブル制限酵素による切断反応を行い、ポリクローニングsiteのDNA断片の酵素による切断産物及びpTMFの酵素による切断断片を回収し、TOP10株へ形質転換し、陽性に形質転換されたクローニングのプラスミドを抽出し、PCRにより連接したプラスミドをpTRIと名付け、次の操作に使用した。
PCR法でプラスミドCD28VH/pTMF(Cheng et al.,2002)により、抗CD28VHのDNA断片を増幅し、使用された上流側プライマー(P1: 5’−TCACATATGCAGGTACAGCTACAG−3’)(SEQ ID NO:19)及び下流側プライマー(P2; 5’−TTCGCTAGCGGAAGATACGGTACCA−3’)(SEQ ID NO:20)の5’末端には、夫々に制限酵素の切断位点であるNdeIとNheIがあるので、PCR産物の両末端も、これら2つの新しい制限酵素の切断位点を持つようになった。
PCR法でプラスミドCD3scFv/pTMF(▲喜富,粛颯,▼征,等.抗ヒトCD3、単▲抗体与改型単域抗体的表迭.中国科学(C▼),1996,26(5):428〜435))により、抗CD3scFvのDNA断片を増幅し、上流側プライマー(P1; 5’−AAGAGTACTGAGGTGAAGCTGGTGG−3’)(SEQ ID NO:21)及び下流側プライマー(P2: 5’−GAAGTCGACAGCGCGCTTCAGTTCCAG−3’)(SEQ ID NO:22)の5’末端には、夫々制限酵素による切断位点であるScaIとSalIがあるので、PCR産物の両末端にも、2つの新しい制限酵素による切断位点を持つようになった。
Overlap−PCRにより抗CEA単鎖抗体を構築した。抗CEAモノクローン抗体の重鎖と軽鎖の可変区のアミノ酸配列(Koga et al.,1990)とをポリペプチド配列(GGGGSGGGGSGGGGS)(SEQ ID NO:23)で連接し、抗CEA単鎖抗体として設計した。その後、大腸菌の偏好なコドン表(Nakamura et al.,2,000)に基づいて、DNA配列をトランスレーションし、相補的な核酸塩基配列に分けて(以下の配列番号1−22に示される)、Overlap−PCRにより、抗CEA単鎖抗体DNA断片の全長をつなぎ合わせた。以下、抗CEA単鎖抗体の全遺伝子断片の核酸断片である。
2. 5’−TCGCGCCCGGTTTCATCAGTTCCGCACCGCTCTGCTGCAGCTGAACCTGCTCGAGGAA−3’(SEQ ID NO:25)
3. 5’−ACTGATGAAACCGGGCGCGAGCGTGAAAATCAGCTGCAAAGCGACCGGCTATACCTTC−3’(SEQ ID NO:26)
4. 5’−CACCCATTCGATCCAATAATCGCTGAAGGTATAGCCGGTCGCTT−3’(SEQ ID NO:27)
5. 5’−ATTATTGGATCGAATGGGTGAAACAGCGTCCGGGTCACGGCCTGGAATGGATCGGTGAA−3’(SEQ ID NO:28)
6. 5’−ACGTTCGTTGTAGTCGGTACGGCCGCTGCCCGGCAGGATTTCACCGATCCATTCCAGG−3’(SEQ ID NO:29)
7. 5’−CGTACCGACTACAACGAACGTTTCAAAGGCAAAGCGACCTTCACCGGCGACGTTTCTAGC−3’(SEQ ID NO:30)
8. 5’−TTCGCTGGTCAGGCTAGACAGTTTCATATACGCGGTGTTGCTAGAAACGTCGCCGGTGAA−3’(SEQ ID NO:31)
9. 5’−TGTCTAGCCTGACCAGCGAAGATAGCGCGGTGTATTACTGCGCGACCGGCACCACCCCG−3’(SEQ ID NO:32)
10. 5’−GCTCACGGTCACCAGGGTGCCCTGACCCCAGTAACCGAACGGGGTGGTGCCGGTCPCGCA−3’(SEQ ID NO:33)
11. 5’−GCACCCTGGTGACCGTGAGCGCGACTAGTACCCCGAGCCATAACAGCCATCAGGTGCCG−3’(SEQ ID NO:34)
12. 5’−GTCTCTAGAGCCGCTGTTCGCGGTCGGGCCGCCCGCGCTCGGCACCTGATGGCTGTTAAT−3’(SEQ ID NO:35)
13. 5’−CGAACAGCGGCTCTAGAGACATCGTGCTGACCCAGAGCCCGGCGAGCCTGGCGGTGTC−3’(SEQ ID NO:36)
14. 5’−CTGGGAAGCACGGCAGGAGATGGTCGCACGCTGACCCAGAGACACCGCCAGGCTCGCCGG−3’(SEQ ID NO:37)
15. 5’−TCTCCTGCCGTGCTTCCCAGTCCGTTTCCACCTCCTCCTACACCTACATGCACTGGTAT−3’(SEQ ID NO:38)
16. 5’−GATCAGCAGTTTCGGCGGCTGACCCGGTTTCTGCTGAIACCAGTGCATGTAGGTGT−3’(SEQ ID NO:39)
17. 5’−AGCCGCCGAAACTGCTGATCAAATATGCGAGCAACCTGGAATCTGGTGTGCCGGCGCGT−3’(SEQ ID NO:40)
18. 5’−GTTCAGGGTGAAGTCGGTGCCGCTGCCAGAACCGCTGAAACGCGCCGGCACACCAGATT−3’(SEQ ID NO:41)
19. 5’−GCACCGACTTCACCCTGAACATCCACCCGGTGGAAGAAGAAGATACCGCGTATTACTAT−3’(SEQ ID NO:42)
20. 5’−GCCACCGAAGGTACGCGGGATTTCCCAAGAGTGCTGGCAATAGTAATACGCGGTATCTT−3’(SEQ ID NO:43)
21. 5’−TCCCGCGTACCTTCGGTGGCGGCACCAAACTGGAAATCAAAGAATTCGCC−3’(SEQ ID NO:44)
22. 5’−GGCGAATTCTTTGATTTCCAG−3’(SEQ ID NO:45)
s1) 5’−GGCGAATTCTTTGATTTCCAG−3’(SEQ ID NO:46)
s17) 5’−AGCCGCCGAAACTGCTGATC−3’(SEQ ID NO:47)
s16) 5’−GATCAGCAGTTTCGGCGGCT−3’(SEQ ID NO:48)
s13) 5’−CGAACAGCGGCTCTAGAGAC−3’(SEQ ID NO:49)
s12) 5’−GTCTCTAGAGCCGCTGTTCG−3’(SEQ ID NO:50)
s7) 5’−GTACCGACTACAACGAACGT−3’(SEQ ID NO:51)
s6) 5’−ACGTTCGTTGTAGTCGGTAC−3’(SEQ ID NO:52)
(1)CEA−TsAb/pTRIの大腸菌BL21(DE3)(Novagen会社製)への形質転換
実施例2のコンピテントセルの作製方法に従って、大腸菌BL21(DE3)コンピテントセル細胞を作製した。プラスミド抽出キット(上海華舜会社製)の説明書に基づき、プラスミドCEA−TsAb/pTRIを抽出し、実施例2の工程(1)に準じて形質転換実験を行い、実施例2の通りに判定を進めた。
CEA−TsAb/pTRIを有するBL21(DE3)を含む細菌を、LB−K培地を用いて37℃で一晩培養した後、モノクローンをとり、これを5mlのLB−K液体培地に移植して、大きいチューブを用いて37℃で振とうし、一晩培養(200rpm/分)した。翌日、一晩培養したものを1/100の割合に基づいて、250mlのLB−K液体の培地へ移植し、37℃で振とう培養(200rpm/分)を続けて、A600が0.6に達したとき、IPTG(大連宝生物会社製)を添加して、最終濃度を0.4mmol/mlとし、30℃で4時間培養を継続し、低温による発現を誘導した。その後、室温、12,000rpmで10分間の遠心分離を行い、菌体を採取し、1/5培養体積のPBS緩衝液中に懸濁し、菌体の超音波破砕を行った。更に、室温、12,000rpmで10分間の遠心分離を行った。遠心分離した上清成分は、胞内に可溶性発現のCEA−TsAbを含み、遠心分離した沈殿成分は、封入体として発現したCEA−TsAbを含む。遠心分離した沈殿成分を1/5培養体積のPBSで懸濁した。「分子クローン実験指南(金冬雁、黎孟楓逢、1996、科学出版社)」の記載に基づき、未還元性SDS−PAGE電気泳動及びWestern blotにより、上記の超音波処理産物の上清成分及び沈殿成分について、CEA−TsAbの発現状況を検出し、数字図像分析器(アメリカ Alpha Innotech会社、AlphaImage 2200 Documentation & analysis system)により、胞内の可溶性発現と封入体の発現との相対割合を確定した。SDS−PAGE電気泳動(図9に示す)及びWestern blot(図10に示す)の結果は、上記の胞内の可溶性発現の方法により、胞内可溶性発現の割合が、70%程度に達したことを示す。超音波処理産物の上清成分は、そのまま精製することで、次に説明する体外の活性実験に使用することができるので、変性及び複製の工程を少なくし、生産効率を向上させ、生産時間を低下させることができる。
上記の250mlの低温誘導された胞内可溶性の発現産物について、室温、12,000rpmで10分間遠心分離を行い、菌体を採集し、1/5体積(50ml)のDEAEアニオン交換樹脂(ファマシア会社製)、平衡緩衝液(20mmol/ml NaCl、50mmol/ml Tris−HCl(pH8.0))を加えて懸濁し、超音波破砕した。その後、室温、12,000rpmで10分間遠心分離し、遠心分離した上清成分をそのまま精製に使用した。
Jurkat細胞膜の抗原の作製:Jurkat細胞(ヒト急性T細胞性白血病細胞株)(米国典型培養物保蔵中心(American Type Culture Collection,ATCC)から購入、番号はTIB−152)を約5×106個採集し、1,000gで10分間、遠心分離した後、細胞の沈殿成分を0.5mlのPBSで懸濁し、超音波処理により破砕した。超音波処理した破砕液を、室温、12,000rpmで10分間、遠心分離した後、超音波処理した上清成分を保留し、Bradford法により、蛋白濃度の定量を行った。その後、防腐剤として、NaN3を最終濃度が0.05%(W/V)となるよう添加し、安定剤として、プレスリリース(中国科学院微生物研究所から購入)を最終濃度が0.15mol/lとなるよう添加した。その後、100μlごとに分注し、−80℃で冷凍保存して備用した。
(1)コート:抗原濃度は、CEAを1μg/ml(Fitzerald会社製,ドイツ)とし、CD28−FCchimeraを1μg/ml(R&D会社製)とし、Jurkat細胞膜抗原を10μg/mlとした。コート体積としては、10μl/孔でコートした。コートの緩衝液の構成は、1.36gのNa2CO3、7.35gのNaHCO3、950mlの水、1mol/lのHCl又は1mol/lのNaOHで、pH9.2に調整し、水を補加して1lとした。PBSにより37℃で2時間のコート又は4℃で一晩のコートを行った。
間接FACS法を用いて、CEA−TsAbの各種腫瘍細胞に対する結合特異性を検出した。下記の表1は、使用された各種腫瘍細胞の腫瘍相関性及び由来を示す。
(1)上記の4種類の細胞を培養、採集し、SW1116細胞を除き、他の3種類の細胞は、RPMI−1640液体培地(GIBCO会社製)で、10%ウシ胎児血清(黒尤江江海生物工程技木会社製)を添加して、5%CO2、37℃の培養室で培養した。SW1116細胞の培養は、L15液体培地(GIBCO会社製)で、10%新生仔ウシ血清血清(黒尤江江海生物工程技木会社製)を添加し、5%CO2、37℃の培養室で培養した培養した。細胞が対数期になるまで増殖させた後、種類毎の細胞を5×105個採集した。
直接的FACS法により、CEA−TsAbの末梢血単核細胞(PBMC)(北京市血液センターから購入)とJurkat細胞との結合活性を検出した。具体的な実験操作は、以下のようにした。
CEA−TsAbと特異的に結合する大腸癌細胞SW1116を標的細胞(Target cells)とし、PBMCを効果細胞(Effect cells)とし、invitroで、一定の標的細胞と効果細胞の比率となるように(標的細胞/効果細胞、E/T)混合し、同時に、一定濃度のCEA−TsAbを添加し、その後37℃で48時間、培養し、更にMTT法により腫瘍細胞の存活の状況を測定した。これにより、CEA−TsAbのT細胞を介した大腸癌細胞SW1116の殺傷活性を測定した。具体的な操作は以下のようにした。
特異性殺傷率(%)=[A600(E/T)−A600(E/T/A)]/[A600(E/T)−A600(M)]×100%
CEA−TsAbと特異的に結合する大腸癌細胞SW1116を標的細胞(Target cells)として、PBMCを効果細胞(Effect cells)とし、これらをin vitroで効果細胞と標的細胞との比率(E/T)が5となるよう混合し、一定濃度(750ng/ml)のCEA−TsAbを添加し、37℃で20−40時間培養し、更にOLYMPUS IMT−2 倒立型顕微鏡により、効果細胞による腫瘍細胞の殺傷状況を観察し、顕微鏡写真を撮影した。40倍レンズで20時間、観察及び記録した。その結果(図18に示す)、CEA−TsAbの効果細胞を介した腫瘍細胞の殺傷過程は、以下の4つの工程に分けることができた。まず、標的細胞を順序的に、付着細胞を剥離(図18B)し、その後、効果細胞が腫瘍細胞の表面に集まる(図18C)。集まっている効果細胞の数の増加に連れて、腫瘍細胞の表面には、突起が発生する(図18D)。最後に、細胞の縁がファジーになって、細胞は完全に破砕し、死滅した(図18E、F、G)。
MTT法によるT細胞の増加を検出し、これによりCEA−TsAbがT細胞を介してSW1116細胞を殺傷する過程を判断し、T細胞の活性化の状況を観察した。具体的な操作は、以下のようにした。
SI=[A600(E/T/A)/A600(E/T)]
上記のA600(E/T)は、抗体無添加のコントロール孔のA600測定値であり、A600(E/T/A)は抗体を添加したサンプル孔のA600測定値である。
活性化されたCTL細胞は、3つの経路により腫瘍細胞を殺傷することができる。そのうち、一つの経路は、perforinを分泌し、このperforinは、腫瘍細胞の表面に微小孔を造成して細胞を破砕させ、更に、細胞をネクローシスさせる。他の活性化されたCTL細胞から分泌されたGranzymeが、上記の微小孔から腫瘍細胞内に侵入し、腫瘍細胞のアポトーシスを誘導し、また、活性化きれたCTL細胞の表面に誘導されて発現したFASLと腫瘍細胞の表面のFASとが相互的に作用して、腫瘍細胞のアポトーシスを誘導する。CEA−TsAbがT細胞を介して行う腫瘍細胞の殺傷メカニズムを詳しく分析するため、PI(Propidium Iodide)及びFITC−conjugated−Annexin−V(BD会社から購入)を使用し、殺傷された腫瘍細胞を標識し、その後、蛍光顕微鏡とFACS法により、腫瘍細胞のネクローシス及びアポトーシスの状況、その割合を観察、検出した。具体的な操作は、以下のようにした。
Claims (9)
- 単鎖の三重特異性抗体であって、抗癌胎児性抗原の抗体、ペプチドリンカー、抗ヒトCD3抗体、ペプチドリンカー及び抗ヒトCD28抗体の重鎖の断片を順序的に連接し、糸状な単鎖の融合蛋白質を形成した単鎖の三重特異性抗体であって、
前記抗癌胎児性抗原の抗体及び抗ヒトCD3抗体は、単鎖抗体の断片、抗体のFab断片又は抗体の単区域(single domain)断片とし、
前記糸状な単鎖の三重特異性抗体は、抗癌胎児性抗原の単鎖抗体、FCペプチドリンカー、抗ヒトCD3単鎖抗体、HSAペプチドリンカー及び抗CD28抗体の重鎖の断片を順序的に連接し、SEQ ID NO:4で表されるアミノ酸配列を有するCEA−TsAbであることを特徴とする単鎖の三重特異性抗体。 - 前記抗癌胎児性抗原の単鎖抗体は、SEQ ID NO:1で表されるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項1に記載の単鎖の三重特異性抗体。
- 前記抗ヒトCD3単鎖抗体は、SEQ ID NO:2で表されるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項1に記載の単鎖の三重特異性抗体。
- 請求頂1に記載の単鎖の三重特異性抗体をコードするDNAであって、SEQ ID NO:3で表される核酸配列を有することを特徴とするDNA。
- 請求項4に記載のDNA配列を含むことを特徴とする発現ベクター。
- 発現ベクターであって、請求項1に記載の単鎖抗体であるCEA−TsAbをベクターpTRIにクローニングして構築されることを特徴とする請求項5に記載の発現ベクター。
- 請求項5に記載の発現ベクターを含むことを特徴とする宿主細胞。
- 単鎖の三重特異性抗体が発現される菌体を1/5培養体積の超音波緩衝液で懸濁し、超音波による破砕処理を行った後、室温、12,000rpmで10分間の遠心分離を行い、前記超音波緩衝液は、20mmol/mlのNaClと50mmol/mlのTris−HClとから成り、この混合液のpHを8.0とする工程と、
前記遠心分離した上清成分を、5倍カラム体積の平衡緩衝液により平衡化したDEAEアニオン交換カラムに置いて、流出した級分を採集し、初歩的な精製を行って単鎖の三重特異性抗体を得る工程と、を含むことを特徴とする請求項1に記載の単鎖の三重特異性抗体の精製方法。 - 請求項1に記載の単鎖の三重特異性抗体及び薬理学的に容許されるキャリアーを含むことを特徴とする抗癌胎児性抗原を発現する腫瘍の治療用又は予防用薬品。
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