JP4642709B2 - 顕微鏡とオートフォーカス装置およびオートフォーカス方法 - Google Patents

Description

本発明は、例えば細胞スクリーニング装置に用いられる顕微鏡とオートフォーカス装置およびオートフォーカス方法に関するものである。

従来の技術として特許文献１には、カバーガラスにより覆われた対象物の場合、使用するカバーグラスの厚さを予め記憶し、アクティブ方式によりカバーガラス上面を第１の焦点基準とした後、第１の焦点基準を記憶したカバーガラスの厚さだけ修正し、さらにそこからコントラスト方式によるパッシブ方式のオートフォーカスをかける方法が紹介されている。

このように、従来の技術では、アクティブ方式のオートフォーカスをかける構成と、パッシブ方式のオートフォーカスをかける構成の両方を用いている。これは、カバーガラスにより覆われた対象物の場合、アクティブ方式のみでは光点ないしマークを照射したときに、カバーガラス上面からの反射はあるものの、対象物表面は光点ないしマークを反射しないため対象物自体の焦点位置を検出することが出来ないからである。

特開平２−１１８６０９号公報

しかしながら、上述のような従来の技術では、装置構成が複雑となり、またコスト増大の原因にもなる。さらに、コントラスト方式のオートフォーカスでは、撮影された画像毎に画像処理によるコントラスト評価を行わなくてはならず、処理に多くの時間を要する。また、処理時間を早くするために高速処理が出来るプロセッサ等を用意すれば、さらにコスト増大につながる。

これは、マイクロタイタープレートを用いた対象物（例えば、細胞）にフォーカスを合わせる場合も同様で、マイクロタイタープレート底の上面、つまり底面の対象物と面している側にフォーカスを合わせる場合もアクティブ方式のオートフォーカスでは屈折率の関係で対象物からの反射は極めて少ないため、パッシブ方式を併用してオートフォーカスをかける必要がある。

本発明は、このような事情に鑑みてなされたものであって、簡易な構成により、精度よくオートフォーカスを高速処理することができる顕微鏡とオートフォーカス装置およびオートフォーカス方法を提供することを目的とする。

上記課題を解決するために、本発明は以下の手段を採用する。
本発明は、透明板部材上に載置された被検物体から発せられる光を集光する対物レンズを具備する顕微鏡に備えられ、前記対物レンズの焦点面を前記被検物体と前記透明板部材との境界面に一致させるオートフォーカス装置であって、光源と、該光源から発せられ前記対物レンズを介して前記透明板部材の表面および前記境界面において反射して戻る反射光を検出する検出器とを有する検出手段と、該検出手段の入力ゲインおよび／または出力ゲインを切り替えるゲイン調節手段と、前記対物レンズの焦点面と前記被検物体とを光軸方向に沿って相対移動させる焦点面移動手段と、前記検出器からの出力に基づいて、前記対物レンズの焦点面が前記表面または前記境界面に一致したか否かを判定し、前記対物レンズの焦点面と前記表面とが一致したと判定した場合に前記検出手段の入力ゲインおよび／または出力ゲインを切り替えるように前記ゲイン調節手段を制御し、前記焦点面移動手段により、前記対物レンズの焦点面を前記表面に一致させた後に前記境界面に近接させるように前記対物レンズの焦点面と前記被検物体とを相対移動させ、前記対物レンズの焦点面が前記境界面に一致したと判定した場合に前記対物レンズの焦点面と前記被検物体との相対移動を停止させるように前記焦点面移動手段を制御する制御手段とを備えるオートフォーカス装置を提供する。

本発明によれば、検出手段の光源から発せられた光は、対物レンズを介して、被検物体を載置した透明板部材に照射される。検出手段は、透明板部材の表面において反射して戻る反射光を対物レンズにより集光し、検出器により検出する。制御手段は、この検出結果に基づいて、対物レンズの焦点面が表面に一致したか否かを判定し、一致していない場合は、焦点面移動手段を作動させて対物レンズの焦点面と被検物体との相対位置を光軸方向に変化させつつ、判定作業を繰り返す。一致した場合には、同じ手段により被検物体と透明板部材との境界面の検出を行う。この場合において、ゲイン調整手段の作動により、表面の検出時と境界面の検出時とで、検出手段の入力ゲインおよび／または出力ゲインが調整される。

これにより、弱い光で検出可能な透明板部材の表面の検出時には、検出手段の入力ゲインおよび／または出力ゲインを下げて検出器における検出信号の飽和を防止し、より強い光で検出される境界面については、検出手段の入力ゲインおよび／または出力ゲインを上げて、微小な反射光を検出することが可能となる。
その結果、検出手段の入力ゲインおよび／または出力ゲインを切り替えるだけの簡易な構成により、コストを増加させることなく、対物レンズの焦点面を精度よく高速に被検物体と透明板部材との境界面に一致させることができる。

また、上記発明においては、前記ゲイン調節手段が、前記光源のパワーを切り替えることとしてもよい。
このように構成することで、反射率の高い透明板部材の表面は、光源から弱い光を出射して検出し、反射率の低い被検物体と透明板部材との境界面は、光源から強い光を出射することにより検出することができる。これにより、表面からの反射光によって境界面の検出が妨げられたり、被検物体にダメージを与えたりすることなく、境界面に精度よく対物レンズの焦点面を一致させることができる。

また、上記発明においては、前記ゲイン調節手段が、前記検出手段の出力ゲインの切替により前記検出器の受光感度を切り替えることとしてもよい。
このように構成することで、反射率の高い透明板部材の表面からの反射光は、検出器の受光感度を下げて検出し、反射率の低い被検物体と透明板部材との境界面からの反射光は、検出器の受光感度を上げることにより検出することができる。これにより、表面からの反射光によって境界面の検出が妨げられたり、被検物体にダメージを与えたりすることなく、境界面に精度よく対物レンズの焦点面を一致させることができる。

また、上記発明においては、前記透明板部材がマイクロタイタープレートであることとしてもよい。

また、上記発明においては、前記被検物体が細胞であることとしてもよい。

また、上記発明においては、顕微鏡が本発明に係るオートフォーカス装置を備えることとしてもよい。
このように構成することで、簡易な構成により、精度よくオートフォーカスを高速処理することができ、迅速かつ高精度な観察を行うことができる。

本発明は、透明板部材上に載置された被検物体から発せられる光を集光する対物レンズを具備する顕微鏡に備えられ、前記対物レンズの焦点面を前記被検物体と前記透明板部材との境界面に一致させるオートフォーカス装置であって、光源と、該光源から発せられ前記対物レンズを介して前記透明板部材の表面および前記境界面において反射して戻る反射光を検出する検出器とを有する検出手段と、前記対物レンズの焦点面と前記被検物体とを光軸方向に沿って相対移動させる焦点面移動手段と、前記検出器からの出力に基づいて、前記対物レンズの焦点面が前記表面または前記境界面に一致したか否かを判定し、前記対物レンズの焦点面と前記表面とが一致したと判定した場合に判定条件を変更し、前記焦点面移動手段により、前記対物レンズの焦点面を前記表面に一致させた後に前記境界面に近接させるように前記対物レンズの焦点面と前記被検物体とを相対移動させ、前記対物レンズの焦点面が前記境界面に一致したと判定した場合に前記対物レンズの焦点面と前記被検物体との相対移動を停止させるように前記焦点面移動手段を制御する制御手段とを備えるオートフォーカス装置を提供する。

本発明によれば、検出手段の光源から発せられた光は、対物レンズを介して、被検物体を載置した透明板部材に照射される。検出手段は、透明板部材の表面において反射して戻る反射光を対物レンズにより集光し、検出器により検出する。制御手段は、この検出結果に基づいて、対物レンズの焦点面が表面に一致したか否かを判定し、一致していない場合は、焦点面移動手段を作動させて対物レンズの焦点面と被検物体との相対位置を光軸方向に変化させつつ、判定作業を繰り返す。一致した場合には、同じ手段により被検物体と透明板部材との境界面の検出を行う。この場合において、判定条件変更手段の作動により、表面の検出時と境界面の検出時とで、検出手段の判定条件が調整される。

これにより、弱い光で検出可能な透明板部材の表面の検出時には、検出手段の判定条件を変更することにより、検出器における検出信号の飽和を防止し、微小な反射光を検出することが可能となる。
その結果、検出手段の判定条件を変更するだけの簡易な構成により、コストを増加させることなく、対物レンズの焦点面を精度よく高速に被検物体と透明板部材との境界面に一致させることができる。

また、上記発明においては、前記判定条件変更手段が、前記光源のパワーを変更することとしてもよい。
このように構成することで、反射率の高い透明板部材の表面は、光源から弱い光を出射して検出し、反射率の低い被検物体と透明板部材との境界面は、光源から強い光を出射することにより検出することができる。これにより、表面からの反射光によって境界面の検出が妨げられたり、被検物体にダメージを与えたりすることなく、境界面に精度よく対物レンズの焦点面を一致させることができる。

また、上記発明においては、前記判定条件変更手段が、前記検出手段の出力ゲインを変更することとしてもよい。
このように構成することで、反射率の高い透明板部材の表面からの反射光は、検出器の受光感度を下げて検出し、反射率の低い被検物体と透明板部材との境界面からの反射光は、検出器の受光感度を上げることにより検出することができる。これにより、表面からの反射光によって境界面の検出が妨げられたり、被検物体にダメージを与えたりすることなく、境界面に精度よく対物レンズの焦点面を一致させることができる。

本発明は、透明板部材上に載置された被検物体に光を照射し、前記透明板部材の表面および前記被検物体と前記透明板部材との境界面において反射して戻る反射光を検出する検出手段を備えた顕微鏡において、前記対物レンズの焦点面を前記被検物体と前記透明板部材との境界面に一致させるオートフォーカス方法であって、前記対物レンズの焦点面と前記透明板部材の表面とを近接させる第１の近接ステップと、前記対物レンズの焦点面が前記透明板部材の表面に一致したか否かを判定する第１の判定ステップと、該第１の判定ステップにより前記対物レンズの焦点面が前記表面に一致したと判定された場合に、前記検出手段の入力ゲインおよび／または出力ゲインを切り替えるゲイン切替ステップと、前記対物レンズの焦点面と前記境界面とを近接させる第２の近接ステップと、前記対物レンズの焦点面が前記境界面に一致したか否かを判定する第２の判定ステップと、該第２の判定ステップにより前記対物レンズの焦点面が前記境界面に一致したと判定された場合に、前記対物レンズの焦点面と前記境界面とが近接するのを停止させる停止ステップとを含むオートフォーカス方法を提供する。

本発明によれば、光源から発せられた光は、対物レンズを介して、被検物体を載置した透明板部材に照射される。検出ステップでは、透明板部材の表面に反射して戻る反射光が対物レンズにより集光されて検出される。制御ステップでは、この検出結果に基づいて、対物レンズの焦点面が表面に一致したか否かが判定される。一致していない場合は、焦点面移動ステップにおいて、対物レンズの焦点面と被検物体との相対位置が光軸方向に変化されつつ、判定作業が繰り返される。一致した場合には、同じステップにおいて被検物体と透明板部材との境界面の検出が行われる。この場合において、ゲイン調整ステップでは、表面の検出時と境界面の検出時とで、検出ステップにおける入力ゲインおよび／または出力ゲインが調整される。

これにより、弱い光で検出可能な透明板部材の表面の検出時には、検出ステップにおける入力ゲインおよび／または出力ゲインを下げて検出信号の飽和を防止し、より強い光で検出される境界面については、検出ステップにおける入力ゲインおよび／または出力ゲインを上げて、微小な反射光を検出することが可能となる。
その結果、検出ステップにおける入力ゲインおよび／または出力ゲインを切り替えるだけの簡易な方法により、コストを増加させることなく、対物レンズの焦点面を精度よく高速に被検物体と透明板部材との境界面に一致させることができる。

本発明によれば、簡易な構成により、精度よくオートフォーカスを高速処理することができるという効果を奏する。

〔第１の実施形態〕
以下、本発明の第１の実施形態に係る顕微鏡とオートフォーカス装置ついて、図１〜図１０を参照して説明する。
本実施形態に係る顕微鏡１は、図１に示されるように、観察光学系１Ａと、照明光学系１Ｂと、オートフォーカス装置１Ｃとを備えている。

観察光学系１Ａは、対物レンズ２と、反射ミラー３と中間光学系４，５および焦点面移動手段３３からなり、さらに中間光学系４，５の先には接眼レンズを含む不図示の結像光学系がある。対物レンズ２と反射ミラー３との間には平行光路３１が形成されており、この平行光路３１にはダイクロイックミラー６とハーフミラー７とが平行光路３１の光軸に対して４５°の角度で設置されている。

照明光学系１Ｂは、可視光線を出射する、例えば、メタルハライドランプである照明光源９と照明レンズ１０とを有し、照明光束はハーフミラー７によって反射されて平行光路３１に導かれ、ＸＹ電動ステージ11上のマイクロタイタープレート（透明板部材）１２内部の対象物、例えば、細胞であるサンプルを照明するようになっている。

オートフォーカス装置１Ｃは、検出手段２Ｃと、結像位置判定部（制御手段）１９とを主な構成要素としている。検出手段２Ｃは、７８５ｎｍの赤外光を出射するレーザーダイオード（光源）１３と、コリメーターレンズ１４と、遮光板１５と、ハーフミラー１６と、集光レンズ１７と、フォトディテクタ（検出器）１８とを備えている。尚、本実施の形態におけるフォトディテクタ１８は赤外光に感度を持つ二分割のものであり、該フォトディテクタ１８の２つの受光素子１８ａ，１８ｂ同士は２０μｍの間隔をあけて配置されている。

顕微鏡１は、ユーザがコンピュータ２０、モニタ２１、キーボード２２、マウス２３を操作することで、接続コネクタ２５で顕微鏡１と接続されているコントロールボックス２４を経由して制御されるようになっている。コンピュータ２０とコントロールボックス２４はＲＳ‐２３２Ｃで接続されており、コントロールボックス２４は、コンピュータ２０からのコマンドを受けて顕微鏡１の対物レンズ２、照明光源９、ＸＹ電動ステージ１１、結像位置判定部１９を駆動させると同時に、各ユニットの動作状況を把握してコンピュータ２０に送信する役割を担っている。

結像位置判定部１９は、図２に示されるように、演算部１９ａ、ＣＰＵ１９ｃ（ゲイン調整手段）、ＬＤドライバ１９ｂ、Ｚモータドライバ１９ｆ、ＰＣインターフェース１９ｄおよびＺアドレス管理部１９ｅを備えている。
演算部１９ａはフォトディテクタ１８の２つの受光素子１８ａ，１８ｂからの出力信号Ａ，Ｂを用いて（Ａ−Ｂ）／（Ａ＋Ｂ）の演算を行い、図３のフォーカス判定曲線に示されるようなデータを作成してＣＰＵ１９ｃへ送信する。図３において、横軸はＸＹ電動ステージ１１と対物レンズ２との距離を示し、縦軸は（Ａ−Ｂ）／（Ａ＋Ｂ）の演算値を示している。

ＬＤドライバ１９ｂはオートフォーカス用光源であるレーザーダイオード１３を制御するもので、ＯＮ、ＯＦＦおよびパワーをＣＰＵ１９ｃの指示に基づいて制御する。
Ｚモータドライバ１９ｆは対物レンズ２を光軸方向に沿って上下に動作させるべく、焦点面移動手段３３を作動させる。焦点面移動手段３３には、例えば、不図示のステッピングモータが採用される。
ＰＣインターフェース１９ｄは、接続コネクタ２５を経由してＣＰＵ１９ｃとコントロールボックス２４との通信のために信号レベルの変換やノイズ除去を行なうものである。

Ｚアドレス管理部１９ｅはＺモータドライバ１９ｆおよびＣＰＵ１９ｃと通信をしながら対物レンズ２の現在位置をアドレスで管理するものである。
本実施の形態では、アドレスは０−９０００００の範囲で管理される。アドレス０は対物レンズ２が下がりきった状態、つまり、マイクロタイタープレート１２から一番遠ざかった状態である。アドレス９０００００は対物レンズ２が上がりきった状態である。１アドレスは０．０１μｍに相当する。

次に、マイクロタイタープレート１２について説明する。
図４および図５に示されるように、マイクロタイタープレート１２はＸＹ電動ステージ１１上にセットされている。透明なプラスチックで出来ているマイクロタイタープレート１２の底面はプレート底下面（表面）１２ａ、プレート底上面（境界面）１２ｂを有し、プレート底上面１２ｂには培養液１２ｄ内で培養された細胞１２ｃが配置されている。尚、この底面の厚さは約８００μｍである。

図４において、対物レンズ２はプレート底下面１２ａにフォーカスが合っている状態を示している。対物レンズ２から出射されているフォーカスビーム２ａはプレート底下面１２ａに焦点を結んでいて、その反射光が対物レンズ２に再び戻り、フォトディテクタ１８の中心にスポットＳを結ぶ。図６にその様子を示す。

対物レンズ２の焦点面が、プレート底下面１２ａと一致すると、フォトディテクタ１８の受光素子１８ａ，１８ｂの分割線上にスポットＳが結ばれ、受光素子１８ａ，１８ｂのそれぞれが同じレベルを受光する。そして、演算部１９ａはフォトディテクタ１８からの２つの出力信号Ａ，Ｂを用いて（Ａ−Ｂ）／（Ａ＋Ｂ）の演算を行う。

このとき、受光素子１８ａ，１８ｂは同じレベルの光を受光しているので、演算結果が０となる（以下、０クロスポイントという。）そして、このとき、ＣＰＵ１９ｃは、対物レンズ２の焦点面がプレート底下面１２ａと一致したことを判定する。
本実施の形態ではこの状態を第一の焦点位置と定義する。

図３に示されるように、対物レンズ２の焦点面が被検物体と一致した点から対物レンズ２を遠ざけていくと、反射光は受光素子１８ａ側に移っていき出力信号Ａが大きくなっていく。一方、対物レンズ２の焦点面が被検物体と一致した点より対物レンズ２を近付けていくと、反射光は受光素子１８ｂ側に移っていき出力信号Ｂが大きくなっていく。尚、どちらの場合も、一定範囲を超えると、反射光は得られなくなり、出力信号は０に近づく。

図５において、対物レンズ２はプレート底上面１２ｂすなわち上記細胞１２ｃの最下層面にフォーカスが合っている状態を示している。対物レンズ２から出射されているフォーカスビーム２ａはプレート底上面１２ｂに焦点を結んでいる。
上述した第一の焦点位置の判定方法と同様に演算が行われ、０クロスポイントとなったとき、対物レンズ２の焦点面は、プレート底上面１２ｂと一致する。
本実施の形態ではこの状態を第二の焦点位置と定義する。

この位置は細胞１２ｃが配置されている面であり、ユーザはこの面にフォーカスを合わせることを希望する。しかし、図４と図５において、プレート底下面１２ａとプレート底上面１２ｂとでは、境界面物質の屈折率の違いからその反射率が著しく異なる。

具体的には、空気と接しているプレート底下面１２ａは屈折率の違いが大きいため、フォーカスビーム２ａを良く反射する。そのため、弱いフォーカスビーム２ａでもフォトディテクタ１８は良好に受光する。一方、細胞１２ｃの最下層面と接しているプレート底上面１２ｂは屈折率が近いため、フォーカスビーム２ａを僅かにしか反射しない。そのため、プレート底下面１２ａで良好だったフォーカスビーム２ａでは反射が弱すぎてフォトディテクタ１８では受光できない現象が発生する。図７にそれを具体的に示す。

図７のグラフは、横軸が対物レンズ２の位置を表し、縦軸がフォトディテクタ１８の受光素子１８ａ，１８ｂからの出力を不図示のＡ／Ｄコンバータで変換した１６ビットデータを表している。
図７に示されるように、アドレス５０００００位置をプレート底下面１２ａとし、対物レンズ２の焦点面がマイクロタイタープレート１２に近づくにつれて受光素子１８ａ，１８ｂからの出力が大きくなり、遠ざかるにつれて出力が小さくなる。

グラフ中の実線が受光素子１８ａの出力を表し、点線が受光素子１８ｂの出力を表している。この場合、フォーカスビーム２ａの強さは全範囲で一定である。
図７で分かるように、プレート底下面１２ａの位置付近では受光素子１８ａ，１８ｂは十分なフォーカスビーム２ａの反射により出力が出ているが、プレート底上面１２ｂ付近では反射が弱いため出力が殆ど見られない。
尚、本実施の形態における演算部１９ａはノイズによる誤動作を避けるため、フォーカスビーム２ａの反射が規定値以上なければ演算を開始しない様になっている。

このように構成された本実施の形態の具体的な動作を図９および図１０に示すフローチャートを用いて以下に示す。
ユーザが顕微鏡１、コントロールボックス２４、コンピュータ２０およびモニタ２１の電源を入れ、システムを起動させるとともに、不図示の制御プログラムをコンピュータ２０上で起動させる。制御プログラムは装置全体をイニシャライズする。

次にユーザはＸＹ電動ステージ１１にマイクロタイタープレート１２を設置し、コンピュータ２０を操作してＸＹ電動ステージ１１を動作させ、マイクロタイタープレート１２の所望のウエルを対物レンズ２の視野に入れる（ステップＳＡ１）。
マイクロタイタープレート１２の光学像は、不図示の接眼レンズもしくは不図示のカメラポートに接続されているＣＣＤカメラで観察することができるので、現在の焦点状態を目視で確認することができる。

続いてユーザは制御プログラムを操作してオートフォーカスをかける指示を出す（ステップＳＡ２）。上述した結像位置判定部１９のＣＰＵ１９ｃには、マイクロタイタープレート１２のプレート底下面１２ａが位置している平均的なアドレス（本実施の形態では５０００００アドレス）がメモリされている。結像位置判定部１９は、焦点面移動手段３３を作動させて、このアドレスより１０００００アドレス少ないアドレスに対物レンズ２を移動させる。この場合、アドレスは４０００００となるので、マイクロタイタープレート１２のプレート底下面１２ａよりも１ｍｍ下方に対物レンズ２が移動する。

続いてＣＰＵ１９ｃはＬＤドライバ１９ｂに対してパワー２５ｍＷで出力するコマンドを送信する。レーザーダイオード１３は指定された２５ｍＷの出力で７８５ｎｍの赤外線を出力する（ステップＳＡ３）。結像位置判定部１９は、焦点面移動手段３３を作動させて対物レンズ２を上方つまりアドレス５０００００方向に動作させ（ステップＳＡ４）、同時にフォトディテクタ１８の受光素子１８ａ，１８ｂの出力を検出する（ステップＳＡ５）。出力が規定の大きさ以上になったところで（ステップＳＡ６「ＹＥＳ」）、演算部１９ａが演算を開始する（ステップＳＡ７）。

ＣＰＵ１９ｃは演算部１９ａから送られてくる演算データおよびＺアドレス管理部１９ｅのアドレス値の両方を評価しながらマイクロタイタープレート１２のプレート底下面１２ａを検出する。具体的には、演算部１９ａにより図３で示される逆Ｓ字カーブの演算データが作成され、このデータに基づき、ＣＰＵ１９ｃは、０クロスポイントか判定する（ステップＳＡ８）。

一方、フォトディテクタ１８の受光素子１８ａ，１８ｂの出力が規定の大きさに満たない場合（ステップＳＡ６「ＮＯ」）、アドレスが５０００００に満たないときは（ステップＳＡ９「ＹＥＳ」）、ステップＳＡ４に戻る。そして、フォトディテクタ１８の受光素子１８ａ、１８ｂの出力が規定の大きさになるまで、ステップＳＡ４〜ステップＳＡ６およびステップＳＡ９を繰り返す。
なお、ステップＳＡ９において、アドレスが５０００００以上のときは（ステップＳＡ９「ＮＯ」）、オートフォーカスはエラーとなる（ステップＳＡ１０）。

ステップＳＡ８において、０クロスポイントのとき（ステップＳＡ８「ＹＥＳ」）、ＣＰＵ１９ｃは、対物レンズ２の焦点面がアドレス５０００００付近にあるかを判定する（ステップＳＡ１１）。
一方、０クロスポイントとならないときは（ステップＳＡ８「ＮＯ」）、結像位置判定部１９は、再度焦点面移動手段３３を作動させて対物レンズ２をアドレス５０００００方向に動作させ（ステップＳＡ１２）、フォトディテクタ１８の受光素子１８ａ、１８ｂの出力を検出する（ステップＳＡ１３）。そして、ステップＳＡ７に戻り、０クロスポイントになるまで、ステップＳＡ７、ステップＳＡ８、ステップＳＡ１２およびステップＳＡ１３を繰り返す。

ステップＳＡ１１において、この判定が成功すると（ステップＳＡ１１「ＹＥＳ」）、続いて結像位置判定部１９は、焦点面移動手段３３を作動させて対物レンズ２を４００００アドレス（４００μｍ）上方にそのまま移動させ（ステップＳＡ１５）、そこでＣＰＵ１９ｃはＬＤドライバ１９ｂに対してパワー８５ｍＷで出力するコマンドを送信する。レーザーダイオード１３は指定された８５ｍＷの出力で７８５ｎｍの赤外線を出力する（ステップＳＡ１６）。尚、本実施の形態で使用しているレーザーダイオード１３の最大出力は８５ｍＷである。

一方、ステップＳＡ１１において、０クロスポイントがアドレス５０００００付近にないときは（ステップＳＡ１１「ＮＯ」）、オートフォーカスはエラーとなる（ステップＳＡ１４）。
尚、マイクロタイタープレート１２のプレート底下面１２ａを検出するときにレーザーダイオード１３の出力を２５ｍＷに落としているのは、プレート底下面１２ａからの反射が強く、これ以上大きくするとフォトディテクタ１８の受光素子１８ａ，１８ｂの出力が飽和してしまうからである。

この状態で、結像位置判定部１９は、焦点面移動手段３３を作動させて対物レンズ２を上昇させ（ステップＳＡ1７）、同時にフォトディテクタ１８の受光素子１８ａ，１８ｂの出力を検出する（ステップＳＡ１８）。出力が規定の大きさ以上になったところで（ステップＳＡ１９「ＹＥＳ」）、演算部１９ａが演算を開始する（ステップＳＡ２０）。

ＣＰＵ１９ｃは演算部１９ａから送られてくる演算データおよびＺアドレス管理部１９ｅのアドレス値の両方を評価しながら、０クロスポイントか判定する（ステップＳＡ２１）。
一方、フォトディテクタ１８の受光素子１８ａ，１８ｂの出力が規定の大きさに満たない場合（ステップＳＡ１９「ＮＯ」）、ステップＳＡ１７に戻る。そして、フォトディテクタ１８の受光素子１８ａ，１８ｂの出力が規定の大きさになるまで、ステップＳＡ１７〜ステップＳＡ１９を繰り返す。

本実施の形態では、まずマイクロタイタープレート12のプレート底下面12ａを検出しているが、これは、フォーカスビーム２ａが確実かつ強力に反射するプレート底下面１２ａを検出することで、マイクロタイタープレート１２の存在を確実に把握するためである。ここで、フォーカスビーム２ａの反射が検出されなければ、マイクロタイタープレート１２がセットされていないことが明らかになり、オートフォーカス動作は強制終了される。

図８に上述の動作によるフォトディテクタ１８の受光素子１８ａ，１８ｂの出力を示す。図７と同様に横軸が対物レンズ２の位置を表す。図８では、アドレス５０００００位置がプレート底下面１２ａであり、対物レンズ２の焦点面がマイクロタイタープレート１２に近づくにつれて受光素子１８ａ，１８ｂの出力が大きくなり遠ざかるにつれて出力が小さくなる。縦軸はフォトディテクタ１８の受光素子１８ａ，１８ｂからの出力を不図示のＡ／Ｄコンバータで変換した１６ビットデータである。グラフ中の実線が受光素子１８ａの出力を表し、点線が受光素子１８ｂの出力を表している。

図８から判るように、マイクロタイタープレート１２のプレート底下面１２ａおよびマイクロタイタープレート１２のプレート底上面１２ｂともにフォトディテクタ１８の受光素子１８ａ，１８ｂから出力が出ている。
マイクロタイタープレート１２のプレート底上面１２ｂからの反射によるフォトディテクタ１８の出力はマイクロタイタープレート12のプレート底下面１２ａに比べるとまだ小さいが、演算には十分な出力であり、また、これ以上レーザーダイオード１３の出力を大きくすると細胞１２Ｃにダメージを与える可能性があるのでこれで十分である。

ステップＳＡ２１において、０クロスポイントのとき（ステップＳＡ２１「ＹＥＳ」）、対物レンズ２の焦点面がプレート底上面１２ｂと一致する。すなわち、マイクロタイタープレート１２のプレート底上面１２ｂ面に配置されている細胞にフォーカスが合わせられる。そして、オートフォーカスは、終了する（ステップＳＡ２４）。
一方、０クロスポイントとならないとき（ステップＳＡ２１「ＮＯ」）、結像位置判定部１９は、再度焦点面移動手段３３を作動させて対物レンズ２をアドレス５０００００方向に動作させ（ステップＳＡ２２）、フォトディテクタ１８の受光素子１８ａ、１８ｂの出力を検出する（ステップＳＡ２３）。そして、ステップＳＡ２０に戻り、０クロスポイントとなるまで、ステップＳＡ２０〜ステップＳＡ２３を繰り返す。

以上説明してきたように、本実施形態に係る顕微鏡１によれば、プレート底下面２ａからの反射光によってプレート底上面１２ｂの検出が妨げられたり、被検物体である細胞にダメージを与えたりすることなく、プレート底上面１２ｂに精度よく対物レンズ２の焦点面を一致させることができる。これにより、簡易な構成で、精度よくオートフォーカスを高速処理することができる。

〔第２の実施形態〕
以下、本発明の第２の実施形態に係る顕微鏡１´とオートフォーカス装置１Ｃ´について、図１１〜図１４を参照して説明する。但し、第１の実施形態と同じ構成、動作、原理についてはその説明を割愛する。
図１１に示されるように、本実施の形態に係る顕微鏡１´の構成は、第１の実施形態と結像位置判定部１９ｉが異なっている。結像位置判定部１９ｉは、図１２に示されるように、第１の実施形態の結像位置判定部１９の構成と演算部１９ｇ、ＣＰＵ１９ｊおよびＬＤドライバ１９ｈが異なっており、さらにゲインコントロール回路１９０を備えている。

ゲインコントロール回路１９０はフォトディテクタ１８の受光素子１８ａ，１８ｂからの出力をＣＰＵ１９ｊからの指示に基づきゲインを可変して取り込み、演算部１９ｇはこのゲインコントロール回路１９０からの出力を演算をする。

このように構成された本実施の形態の具体的な動作を図１３および図１４に示すフローチャートを用いて以下に示す。
プレート底下面１２ａの検出において、上記ゲインコントロール回路１９０は演算部１９ｇが判定できるだけの大きさにまで出力ゲインを増大させる。ＬＤドライバ１９ｈは、ＣＰＵ１９ｉからの指示でレーザーダイオード１３をＯＮ、ＯＦＦする。

フォトディテクタ１８の受光素子１８ａおよび１８ｂからの出力が規定の大きさ以上になったところで（ステップＳＢ６「ＹＥＳ」）、演算部１９ｇが演算を開始する（ステップＳＢ７）。
一方、フォトディテクタ１８の受光素子１８ａ，１８ｂからの出力が規定の大きさに満たない場合（ステップＳＢ６「ＮＯ」）、出力ゲインがＭＡＸ値以下のときは（ステップSB９「YES」）、ゲインコントロール回路１９０は演算部１９ｇが判定できるだけの大きさにまで出力ゲインを上昇させ（ステップＳＢ１０）、ステップＳＢ５に戻る。そして、フォトディテクタ１８の受光素子１８ａ，１８ｂからの出力が規定の大きさ以上になるまで、ステップＳＢ５，ステップＳＢ６、ステップＳＢ９およびステップＳＢ１０を繰り返す。なお、ステップＳＢ９において、出力ゲインがＭＡＸ値より大きいときは（ステップＳＢ９「NO」）、オートフォーカスはエラーとなる（ステップＳＢ１１）。

また、プレート底上面１２ｂの検出において、結像位置判定部１９ｉは、焦点面移動手段３３を作動させて対物レンズ２を４００００アドレス（４００μｍ）上方にそのまま移動させ（ステップＳＢ１６）、同時にフォトディテクタ１８の受光素子１８ａ，１８ｂからの出力を検出する（ステップＳＢ１７）。出力が規定の大きさ以上になったところで（ステップＳＢ１８「ＹＥＳ」）、演算部１９ｇが演算を開始する（ステップＳＢ１９）。

一方、フォトディテクタ１８の受光素子１８ａ，１８ｂからの出力が規定の大きさに満たない場合（ステップＳＢ１８「ＮＯ」）、ゲインコントロール回路１９０は演算部１９ｇが判定できるだけの大きさにまで出力ゲインを上昇させ（ステップＳＢ２１）、ステップＳＢ１７に戻る。そして、フォトディテクタ１８の受光素子１８ａ，１８ｂからの出力が規定の大きさになるまで、ステップＳＢ１７、ステップＳＢ１８およびステップＳＢ２１繰り返す。

このようにして、結像位置判定部１９ｉのＣＰＵ１９ｊは、マイクロタイタープレート１２のプレート底上面１２ｂに配置されている細胞１２ｃに最終的にフォーカスを合わせ、オートフォーカスは終了する（ステップＳＢ２４）。
上述においては、フォトディテクタ１８の受光素子１８ａ，１８ｂからの出力をＣＰＵ１９ｊからの指示に基づきゲインを可変して取り込みを行なっているが、勿論これと併用してレーザーダイオード１３のパワーを変更しても良い。

以上説明してきたように、本実施形態に係る顕微鏡１´によれば、プレート底下面２ａからの表面からの反射光によってプレート底上面１２ｂの検出が妨げられたり、被検物体にダメージを与えたりすることなく、プレート底上面１２ｂに精度よく対物レンズの焦点面を一致させることができる。
これにより、簡易な構成で、精度よくオートフォーカスを高速処理することができる。

〔第３の実施形態〕
本発明の第３の実施形態に係る顕微鏡１″とそのオートフォーカス装置１Ｃ″ついて、図１５〜図１８を参照して説明する。但し、第１の実施形態と同じ構成、動作、原理についてはその説明を割愛する。
図１５に示されるように、本実施の形態に係る顕微鏡１″の構成は、第１の実施形態と結像位置判定部１９ｎが異なっている。結像位置判定部１９ｎは、図１６に示されるように、第１の実施形態の結像位置判定部１９の構成と演算部１９ｋおよびＣＰＵ１９ｍが異なっている。演算部１９ｋでは、第１の実施形態の演算部１９ａにおいて行われる演算（Ａ−Ｂ）／（Ａ＋Ｂ）に加えて、Ａ＋Ｂの演算が行われるようになっている。

このように構成された本実施の形態の具体的な動作を図１７および図１８に示すフローチャートを用いて以下に示す。
本実施の形態は、図１７に示されるように、第１の実施形態と同様の動作でマイクロタイタープレート１２のプレート底下面１２ａを検出する。

続いて、ＣＰＵ１９ｍは、焦点面移動手段３３を作動させて対物レンズ２を８００μｍ上昇させる（ステップＳＣ１５）。この段階で対物レンズ２の焦点位置は、マイクロタイタープレート１２のプレート底上面１２ｂ付近に達する。

続いてＣＰＵ１９ｍは、フォトディテクタ１８の受光素子１８ａ，１８ｂからの出力を検出し（ステップＳＣ１６）、演算部１９ｋに対してこの出力を元にＡ＋Ｂの演算をさせ（ステップＳＣ１７）、そのデータを受信する。そしてそのデータの大きさが規定の大きさ（スレッシュホールド）を超えるように、すなわちＣＰＵ１９ｍが合焦判定を行わせるに足るだけの大きさになるようにＬＤドライバ１９ｂに対してレーザーダイオード１３の出力を上昇すべく指示を出す。

レーザーダイオード１３の出力が上昇し演算部１９ｋからのＡ＋Ｂ演算値がスレッシュホールドを超えたら（ステップＳＣ１８「ＹＥＳ」）、ＣＰＵ１９ｍは、焦点面移動手段３３を作動させてその位置を中心に±４００μｍ対物レンズ２を動作させる（ステップＳＣ１９）。そして、フォトディテクタ１８の受光素子１８ａ，１８ｂからの出力を検出し（ステップＳＣ２０）、かつ演算部１９ｋに（Ａ−Ｂ）／（Ａ＋Ｂ）の演算をさせ（ステップＳＣ２１）、０クロスポイントか判定する（ステップＳＣ２２）。

一方、レーザーダイオード１３の出力が上昇せず演算部１９ｋからのＡ＋Ｂ演算値がスレッシュホールドに満たない場合は（ステップＳＣ１８「ＮＯ」）、出力ゲインを上昇させ（ステップＳＣ２３）、ステップＳＣ１６に戻る。そして、演算部１９ｋからのＡ＋Ｂ演算値がスレッシュホールドを超えるまで、ステップＳＣ１６〜ステップＳＣ１８およびステップＳＣ２３を繰り返す。

ステップＳＣ２２において、０クロスポイントのとき（ステップＳＣ２２「ＹＥＳ」）、対物レンズ２の焦点面がプレート底上面１２ｂと一致する。
一方、０クロスポイントとならないとき（ステップＳＣ２２「ＮＯ」）、ステップＳＣ１９に戻る。そして、０クロスポイントとなるまで、ステップＳＣ１９〜ステップＳＣ２２を繰り返す。

このようにして、結像位置判定部１９ｎのＣＰＵ１９ｍは、マイクロタイタープレート１２のプレート底上面１２ｂ面に配置されている細胞に最終的にフォーカスを合わせ、オートフォーカスは終了する（ステップＳＣ２４）。

以上説明してきたように、本実施形態に係る顕微鏡１″によれば、対物レンズ２の焦点面の位置を調整し、対物レンズ２の焦点面をプレート底上面１２ｂ近傍に移動させることにより、プレート底下面２ａからの反射光によってプレート底上面１２ｂの検出が妨げられたり、被検物体にダメージを与えたりすることなく、プレート底上面１２ｂに精度よく対物レンズの焦点面を一致させることができる。
これにより、簡易な構成で、精度よくオートフォーカスを高速処理することができる。

以上、本発明の実施形態について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。例えば、焦点面移動手段３３は、対物レンズ２を移動させる代わりに、ＸＹ電動ステージ１１を光軸方向に沿って上下に移動させることとしてもよく、また対物レンズ２とＸＹ電動ステージ１１とを相互に移動させることとしてもよい。

第１の実施形態に係る顕微鏡を示す構成図である。 第１の実施形態に係る結像位置判定部の構成図である。 第１の実施形態に係る結像位置判定部のフォーカス判定曲線を示す図である。 第１の実施形態に係るマイクロタイタープレートの底下面に焦点位置を合わせた側面図である。 第１の実施形態に係るマイクロタイタープレートの底上面に焦点位置を合わせた側面図である。 第１の実施形態に係るフォトディテクタの中心にスポットが照射された様子を示す図である。 第１の実施形態に係るマイクロタイタープレートの底下面において、フォトディテクタによる反射光の受光状態を示す図である。 第１の実施形態に係るマイクロタイタープレートの底上面において、フォトディテクタによる反射光の受光状態を示す図である。 第１の実施形態に係る動作のフローチャート図である。 第１の実施形態に係る動作のフローチャート図である。 第２の実施形態に係る顕微鏡を示す構成図である。 第２の実施形態に係る結像位置判定部の構成図である。 第２の実施形態に係る動作のフローチャート図である。 第２の実施形態に係る動作のフローチャート図である。 第３の実施形態に係る顕微鏡を示す構成図である。 第３の実施形態に係る結像位置判定部の構成図である。 第３の実施形態に係る動作のフローチャート図である。 第３の実施形態に係る動作のフローチャート図である。

符号の説明

１Ｃ オートフォーカス装置
２ 対物レンズ
２Ｃ 検出手段
１２ マイクロタイタープレート（透明板部材）
１３ レーザーダイオード（光源）
１８ フォトディテクタ（検出器）
１９ 結像位置判定部（制御手段）
３３ 焦点面移動手段

Claims (10)

1. 透明板部材上に載置された被検物体から発せられる光を集光する対物レンズを具備する顕微鏡に備えられ、前記対物レンズの焦点面を前記被検物体と前記透明板部材との境界面に一致させるオートフォーカス装置であって、
   光源と、該光源から発せられ前記対物レンズを介して前記透明板部材の表面および前記境界面において反射して戻る反射光を検出する検出器とを有する検出手段と、
   該検出手段の入力ゲインおよび／または出力ゲインを切り替えるゲイン調節手段と、
   前記対物レンズの焦点面と前記被検物体とを光軸方向に沿って相対移動させる焦点面移動手段と、
   前記検出器からの出力に基づいて、前記対物レンズの焦点面が前記表面または前記境界面に一致したか否かを判定し、前記対物レンズの焦点面と前記表面とが一致したと判定した場合に前記検出手段の入力ゲインおよび／または出力ゲインを切り替えるように前記ゲイン調節手段を制御し、前記焦点面移動手段により、前記対物レンズの焦点面を前記表面に一致させた後に前記境界面に近接させるように前記対物レンズの焦点面と前記被検物体とを相対移動させ、前記対物レンズの焦点面が前記境界面に一致したと判定した場合に前記対物レンズの焦点面と前記被検物体との相対移動を停止させるように前記焦点面移動手段を制御する制御手段とを備えるオートフォーカス装置。
2. 前記ゲイン調節手段が、前記光源のパワーを切り替える請求項１に記載のオートフォーカス装置。
3. 前記ゲイン調節手段が、前記検出手段の出力ゲインの切替により前記検出器の受光感度を切り替える請求項１または請求項２に記載のオートフォーカス装置。
4. 前記透明板部材がマイクロタイタープレートである請求項１から請求項３のいずれかに記載のオートフォーカス装置。
5. 前記被検物体が細胞である請求項１から請求項４のいずれかに記載のオートフォーカス装置。
6. 請求項１から請求項５のいずれかに記載のオートフォーカス装置を備える顕微鏡。
7. 透明板部材上に載置された被検物体から発せられる光を集光する対物レンズを具備する顕微鏡に備えられ、前記対物レンズの焦点面を前記被検物体と前記透明板部材との境界面に一致させるオートフォーカス装置であって、
   光源と、該光源から発せられ前記対物レンズを介して前記透明板部材の表面および前記境界面において反射して戻る反射光を検出する検出器とを有する検出手段と、
   前記対物レンズの焦点面と前記被検物体とを光軸方向に沿って相対移動させる焦点面移動手段と、
   前記検出器からの出力に基づいて、前記対物レンズの焦点面が前記表面または前記境界面に一致したか否かを判定し、前記対物レンズの焦点面と前記表面とが一致したと判定した場合に判定条件を変更し、前記焦点面移動手段により、前記対物レンズの焦点面を前記表面に一致させた後に前記境界面に近接させるように前記対物レンズの焦点面と前記被検物体とを相対移動させ、前記対物レンズの焦点面が前記境界面に一致したと判定した場合に前記対物レンズの焦点面と前記被検物体との相対移動を停止させるように前記焦点面移動手段を制御する制御手段とを備えるオートフォーカス装置。
8. 前記判定条件変更手段が、前記光源のパワーを変更する請求項７に記載のオートフォーカス装置。
9. 前記判定条件変更手段が、前記検出手段の出力ゲインを変更する請求項７または請求項８に記載のオートフォーカス装置。
10. 透明板部材上に載置された被検物体に光を照射し、前記透明板部材の表面および前記被検物体と前記透明板部材との境界面において反射して戻る反射光を検出する検出手段を備えた顕微鏡において、前記対物レンズの焦点面を前記被検物体と前記透明板部材との境界面に一致させるオートフォーカス方法であって、
    前記対物レンズの焦点面と前記透明板部材の表面とを近接させる第１の近接ステップと、
    前記対物レンズの焦点面が前記透明板部材の表面に一致したか否かを判定する第１の判定ステップと、
    該第１の判定ステップにより前記対物レンズの焦点面が前記表面に一致したと判定された場合に、前記検出手段の入力ゲインおよび／または出力ゲインを切り替えるゲイン切替ステップと、
    前記対物レンズの焦点面と前記境界面とを近接させる第２の近接ステップと、
    前記対物レンズの焦点面が前記境界面に一致したか否かを判定する第２の判定ステップと、
    該第２の判定ステップにより前記対物レンズの焦点面が前記境界面に一致したと判定された場合に、前記対物レンズの焦点面と前記境界面とが近接するのを停止させる停止ステップとを含むオートフォーカス方法。

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