KR101755651B1 - 투명 또는 저 콘트라스트 검체의 분석을 위한 자동 현미경 초점 시스템 및 방법 - Google Patents

Abstract

현미경 시스템 및 방법은 대물 렌즈의 피사계 심도의 경계를 실험적으로 결정한다. 이 시스템 및 방법은 주로 프로세서 및 관련 기기에 의해 실행되는 촬상될 검체의 조작에 의해 자동화 된다. 실험적 피사계 심도의 계산도 마찬가지로 자동화 된다. 심도계 깊이의 경계를 실험적으로 결정할 때, 특히 투명 및 반투명 검체를 피사계 심도보다 작은 사용자 정의 깊이에서 정확하게 촬상할 수 있다.

Description

투명 또는 저 콘트라스트 검체의 분석을 위한 자동 현미경 초점 시스템 및 방법 {AUTOMATIC MICROSCOPIC FOCUS SYSTEM AND METHOD FOR ANALYSIS OF TRANSPARENT OR LOW CONTRAST SPECIMENS}

본 발명은 일반적으로 현미경에 관한 것이며, 보다 상세하게는, 투명 또는 저 콘트라스트의 검체에 초점을 맞춘 대물 렌즈의 초점의 작동 거리 및 깊이를 실험적으로 결정하기 위한 시스템 및 방법에 관한 것이다. 본 발명은 투명 또는 저 콘트라스트 검체의 규정된 깊이에 유리하게 초점을 맞출 수 있는 현미경 시스템 및 방법을 제공한다.

모든 광학 현미경은 검체를 명확하게 촬상하기 위해서 초점을 제공하는 기구를 필요로 한다. 많은 경우에, 시스템의 초점은 시각적으로 인식가능한 특징들을 갖는 검체에 의존한다. 이 특징들은 초점을 위해 필요한 콘트라스트를 제공한다. 다른 경우에는, 검체까지의 거리가 결정되고 초점은 대물 렌즈의 공지된 초점 거리에 의해 설정된다. 투명한 검체에는 적절한 초점을 확립하기 위한 고유의 과제를 나타내며, 적절한 초점 맞춤이 가능한 지점에 대한 콘트라스트를 향상시키기 위해서, 당해 기술 분야에서 고도로 숙련된 실무자들에게만 공지된 특수한 기술들이 필요하다.

통상적으로, 현미경 사용자에 대한 초점에서 이미지가 나타날 때까지 현미경의 대물 렌즈와 검체 사이의 거리를 증가 또는 감소시킴으로써, 현미경의 초점이 맞춰진다. 따라서, 현미경의 초점 맞춤은 일반적으로 다소 주관적이며, 현미경은 검체 표면의 특징들을 적절히 가시화하기 위해서 초점 조정 가능성을 가져야 한다. 대물 렌즈와 검체 사이의 상태 거리를 조정하기 위해서, 손잡이를 제공하여 대물 렌즈 또는 검체를 지지하는 물체 스테이지를 이동시키며, 현미경 사용자는 최적의 초점에 도달하였다고 주관적으로 판단할 때까지 이 손잡이를 조작한다. 따라서, 보다 미세한 정밀도의 필요에도 불구하고, 현미경 사용자는 본질적으로 초점을 주관적으로 결정하는 주관적 도구를 여전히 사용하고 있다.

기술은 두 가지 기본적인 방법으로 초점 결정에서 주관성을 취하고 있다. 첫 번째 방법은, 자동으로 초점을 제어하기 위한 피드백을 제공하기 위해서, 검체의 표면으로부터 반사된 근적외선과 같은 광을 감지하여 대물 렌즈와 검체 사이의 거리를 측정한다. 이 유형의 방법은 니콘 코포레이션(일본)에 의해서 제시되어 있다. 다른 방법으로는, 니콘 코포레이션은 거리를 측정하기 위한 반사음의 사용에 대해서 개시하고 있다. 모션 엑스 코포레이션(MotionX Corporation)(미국), 예컨대, 포커스 트랙 레이저 오토 포커스 시스템즈(FocusTrac Laser Auto Focus Systems) 및 프라이어 사이턴티픽(Prior Scientific)(미국)에 개시된 것과 같은 레이저 초점 제어 시스템은, 대물 렌즈와 검체 사이의 거리를 측정하고 초점 조정을 위한 피드백을 제공하는 것에 의해서, 초점 맞춤을 용이하게 한다. 미국 특허 제 7,345,814 호는 레이저 초점 시스템에 대해서 개시하고 있다. 어떤 경우에는, 이러 방법들은 검체의 반사율과 투명성 때문에, 투명한 검체에 초점을 맞추기가 어렵다. 이 거리 측정 방법들은 일반적으로 표준 현미경을 사용하여 초점 맞춤을 용이하게 하기 위해서 하드웨어 및 제어 소프트웨어의 추가를 필요로 한다. 미국 특허 제 5,594,235 호는 높이 또는 종래 기술에서 언급 된 바와 같이 Z 축 포인트를 최적으로 측정하기 위해서 공초점 센서(confocal sensor)를 사용한다. 소정 수의 z포인트들이 미리 결정되고, 그 후, 각각의 Z 포인트가 반사율에 대해서 평가된다. 다양한 반사율의 정도에 기인하여, 표면의 각 포인트에서의 높이를 결정할 수 있다. 이것은 지형 측정을 위한 도구로서 생각될 수도 있지만, 그것은 또한 초점 정밀도의 일정한 안정성을 보장한다.

현미경의 초점을 맞추는 제2의 공지의 방법은 현미경 대물 렌즈와 검체 사이의 거리가 증감함에 따라 이미지의 콘트라스트를 비교하는 것이다. 기본적으로, 이것은 전술한 바와 같이 검체의 초점이 맞처져 있는지를 시각적으로 결정하기 위해서 현미경 사용자가 사용하는 방법이다. 이 방법은 CCD 나 CMOS 센서(이것에 한정되는 것은 아니다) 등의 센서를 이용하여 검체의 이미지를 전자식으로 촬상하는 것에 의해서 용이하게 자동화된다. 이 방법은 그레온 및 영(Groen and Young) 등의 "자동초점 알고리즘에 사용하기 위한 상이한 초점 기능들의 비교(A Comparison of Different Focus Functions for Use in Autofocus Algorithms)" 혈구 계측법 6:81-91(1985)에 상세하게 기재되어 있다. 그러나 이러한 콘트라스트 비교 방법은 완전히 투명하거나 또는 이미지 내에 콘트라스트를 갖지 않는 검체에서는 사용할 수 없다.

현미경의 필드 조리개 F-스톱를 사용하는 방법이 검체에 초점을 맞추기 위해 이용되고 있다. 이 방법은 초우 및 리우(Chow and Liu)의 니콘 광학 현미경, 기본 조작 절차, http://nanomech.me.washington.edu/pdfs/nikon.pdf, 2009 년 1 월에 개시되어 있고, 또한 나노 메트릭스 사(Nanometrics Incorporated)의 나노 스펙(Nanospec^TM3000) 실험실 메뉴얼, 나노 스펙 두께 측정 시스템 8.33장에도 개시되어 있다. 이 방법에서, 검체 상에 F-스톱을 투영하기 위해서 F-스톱이 폐쇄되고, 콘트라스트가 증가 및/또는 감소되도록 초점을 조정한다(즉, 검체와 대물 렌즈를 상대적으로 시킨다. 최대의 콘트라스트의 지점에서, 검체는 초점이 맞춰진 것으로 간주되며, F-스톱을 개방하여 검체의 촬상을 가능하게 한다.

현미경 촬상에서, 검체는 대물 렌즈를 통해 주로 확대된다. 각 대물 렌즈는 때때로 초점 심도라 칭하는 관련 피사계 심도(depth of field)를 가지고 있다. 니콘 코포레이션은 초점의 가장 가까운 물체면으로부터 동시에 초점의 가장 먼 면까지의 거리로서 피사계 심도를 정의한다. 현미경 검사에서는, 피사계 심도가 약 0.2 내지 55 마이크로 미터(mm)의 범위로 매우 짧다. 이것은 투명한 검체를 촬상할 때 피사계 심도 내의 모든 물체가 촬상되는 것으로 이해된다. 예를 들면, Ref.6 데이터를 사용하는 경우, 4x대물 렌지는 55.5 mm 의 피사계 심도를 가지므로, 이것을 검체의 표면의 가장 가까운 초점 맞춤 물체면으로 투명 검체에 초점을 맞추면, 검체의 상부 55.5 ㎛의 모든 물체가 촬상될 것이다. 이것은, 예를 들면, 당해 영역이 단지 검체의 상부 5 ㎛ 인 경우에는 바람직하지 않다. 따라서, 소망하는 경우에 대물 렌즈의 피사계 심도의 나머지를 뮤효화하는 소망의 깊이에서 투명 또는 반투명의 검체에 현미경의 초점을 맞추는 것을 가능하게 하는 현미경 시스템이 당해 기술에서 필요하다. 소망하는 깊이에서 투명 또는 저 콘트라스트의 검체를 자동으로 쵤상하는 것을 가능하게 하는 현미경 시스템 및 방법이 당해 기술에서 필요하다.

본 발명의 제1구현예는, 현미경, F-스톱 및 하나 이상의 프로세서를 갖는 현미경 시스템의 대물 렌즈의 피사계 심도의 경계를 실험적으로 결정하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은

상기 대물 렌즈의 피사계 심도 외부의 제1위치에 검체의 초점 면을 배치하는 단계;

상기 제1위치에서 상기 초점 면 상에 상기 F-스톱을 투영시켜 F-스톱 투영도를 그 위에 형성하는 단계;

상기 검체와 대물 렌즈 사이의 증분 상대 이동을 실행하여 상기 대물 렌즈에 대해서 상이한 증분 위치들에 상기 검체의 초점 면을 배치하고, F-스톱을 투영시켜 상기 증분 위치들에서 초점 면 상에 F-스톱 투영도를 형성하는 단계로서, 상기 증분 상대 이동을 실행하는 단계는 피사계 심도의 경계의 위치로 상기 초점 면을 움직이는, 상기 증분 위치들에서 초점 면 상에 F-스톱 투영도를 형성하는 단계; 및

상기 제1위치와 상기 증분 위치들에서 상기 F-스톱 투영도의 이미지의 콘트라스트 분석을 수행하는 단계로서, 상기 콘트라스트 분석을 수행하는 단계는 상기 하나 이상의 프로세서에 의해서 실행되고 상기 초점 면이 상기 피사계 심도의 경계의 위치에 있을 때 확립된다.

본 발명의 제2구현예는, 상기 검체가 투명하고, 상기 초점 면은 대물 렌즈에 대해서 근위 초점 면으로부터 그리고 상기 대물 렌즈에 대해서 원위 초점 면으로부터 선택되는, 상기 제1구현예에 기재된 방법을 제공한다

본 발명의 제3구현예는, 피사계 심도가 제1 경계 WD 및 제2경계 WD1를 가지며, WD는 초점 면이 상기 대물 렌즈로부터 거기에 명확한 초점인 최단 거리이고, WD1은 초점 면이 상기 대물 렌즈로부터 거기에 명확한 초점인 최대 거리이며, 상기 제1위치는 WD의 99% 미만이거나 WD1의 101%보다 큰 거리가 되도록 선택되는, 상기 구현예들 중 어느 하나에 기재된 방법을 제공한다.

본 발명의 제4구현예는, 상기 콘트라스트 분석을 수행하는 단계는, 복수의 증분 위치들에서의 상기 F-스톱 투영도의 상대 초점의 표준 편차의 비교에 의해서 피사계 심도의 경계에서의 임의의 위치에 상기 초점 면이 위치할 때 확립되는, 상기 구현예들 중 어느 하나에 기재된 방법을 제공한다.

본 발명의 제5구현예는, 상기 F-스톱을 투영시키는 상기 단계는 상기 하나 이상의 프로세서에 의해서 자동화되는, 상기 구현예들 중 하나에 기재된 방법을 제공한다.

본 발명의 제6구현예는, 상기 증분과 관련된 이동을 실행하는 단계는 상기 하나 이상의 프로세서에 의해서 자동화되는, 상기 구현예들 중 어느 하나에 기재된 방법을 제공한다.

본 발명의 제7구현예는, 상기 배치시키는 단계는 상기 하나 이상의 프로세서에 의해서 자동화되는, 상기 구현예들 중 어느 하나에 기재된 방법을 제공한다.

본 발명의 제8구현예는, 상기 현미경 시스템의 사용자에 의해서 상기 제1위치가 입력되는, 상기 구현예들 중 어느 하나에 기재된 방법을 제공한다.

본 발명의 제9구현예는, 상기 대물 렌즈가 제조자 규정 작동 거리를 가지며, 상기 제1위치는 상기 현미경 시스템의 사용자가 입력하는 제조자 규정 작동 거리에 기초하여 선택되는, 상기 구현예들 중 어느 하나에 기재된 방법을 제공한다.

본 발명의 제10구현예는, 상기 현미경 시스템이 이미지 센서를 더 포함하고, 상기 방법은 상기 증분 위치들에서 상기 초점 면상에 상기 F-스톱 투영도를 상기 이미지 센서에 의해서 전자식으로 촬상하는 단계를 더 포함하며, 전자식으로 촬상하는 상기 단계는 상기 하나 이상의 프로세서에 의해서 자동화되는, 상기 구현예들 중 어느 하나에 기재된 방법을 제공한다.

본 발명의 제11구현예는, 상부 초점 면 아래의 규정된 깊이 또는 하부 초점 면 위의 규정된 높이에서 투명 검체를 촬상하는 방법을 제공하고, 상기 방법은:

현미경, F-스톱 및 하나 이상의 프로세서들을 갖는 현미경 시스템의 대물 렌즈의 피사계 심도의 경계를 실험적으로 결정하는 단계로서, 상기 경계들을 실험적으로 결정하는 단계는

상기 대물 렌즈의 피사계 심도 외부의 제1위치에 검체의 초점 면을 배치하는 단계;

상기 제1위치에서 상기 초점 면 상에 상기 F-스톱을 투영시켜 F-스톱 투영도를 그 위에 형성하는 단계;

상기 검체와 대물 렌즈 사이의 증분 상대 이동을 실행하여 상기 대물 렌즈에 대해서 상이한 증분 위치들에 상기 검체의 초점 면을 배치하고, 상기 F-스톱을 투영시켜 상기 초점 면 상에 F-스톱 투영도를 형성하고, 상기 증분 위치들에서 초점 면 상의 상기 F-스톱 투영도의 이미지를 촬상하는 단계로서, 상기 증분 상대 이동을 실행하는 상기 단계는 피사계 심도의 경계의 위치로 상기 초점 면을 움직이는, 상기 촬상하는 단계; 및

상기 제1위치와 상기 증분 위치들에서 상기 F-스톱 투영도의 이미지의 콘트라스트 분석을 수행하는 단계로서, 상기 콘트라스트 분석을 수행하는 단계는 상기 하나 이상의 프로세서에 의해서 실행되고 상기 초점 면이 상기 피사계 심도의 경계의 위치에 있을 때 확립되는, 상기 콘트라스트 분석을 수행하는 단계;및

상기 경계를 결정하는 단계에서 결정된 피사계 심도의 경계에 기초하여 피사계 심도 내에 투명한 검체의 초점 면을 배치하는 단계를 포함한다.

본 발명의 제12구현예는, 피사계 심도가 제1 경계(WD) 및 제2경계(WD1)를 가지며, WD는 초점 면이 상기 대물 렌즈로부터 거기에 명확한 초점인 최단 거리이고, WD1은 초점 면이 상기 대물 렌즈로부터 거기에 명확한 초점인 최대 거리이며, 상기 피사계 심도에 의해 투명한 검체의 초점 면을 배치하는 단계는, 상부 초점 면을 WD1보다 대물 렌즈 가까이에 배치하거나 또는 하부 초점 면을 WD보다 대물 렌즈로부터 더 멀리 배치하는 것을 더 포함하는, 상기 제11구현예에 기재된 방법을 제공한다.

본 발명의 제13구현예는, 피사계 심도가 제1 경계(WD) 및 제2경계 (WD1)를 가지며, WD는 초점 면이 상기 대물 렌즈로부터 떨어져 있지만 명확한 초점에 있을 수도 있는 최단 거리이고, WD1은 초점 면이 상기 대물 렌즈로부터 떨어져 있지만 명확한 초점에 있을 수도 있는 최대 거리이며, 상기 제1위치는 WD의 99% 미만이거나 WD1의 101%보다 큰 거리가 되도록 선택되는, 상기 제11구현예 내지 제12구현예 중 어느 하나에 기재된 방법을 제공한다.

본 발명의 제14구현예는, 상기 콘트라스트 분석을 수행하는 단계는, 복수의 증분 위치들에서의 상기 F-스톱 투영도의 상대 초점의 표준 편차의 비교에 의해서 피사계 심도의 경계 위치에 상기 초점 면이 위치할 때 확립되는, 상기 제11구현예 내지 제13구현예 중 어느 하나에 기재된 방법을 제공한다.

본 발명의 제15구현예는, 상기 F-스톱을 투영시키는 단계는 상기 하나 이상의 프로세서에 의해서 자동화되는, 상기 제11구현예 내지 제14구현예 중 하나에 기재된 방법을 제공한다.

본 발명의 제16구현예는, 상기 증분과 관련된 이동을 실행하는 단계는 상기 하나 이상의 프로세서에 의해서 자동화되는, 상기 제11구현예 내지 제15구현예 중 어느 하나에 기재된 방법을 제공한다.

본 발명의 제17구현예는, 상기 배치시키는 단계는 상기 하나 이상의 프로세서에 의해서 자동화되는, 상기 제11구현예 내지 제16구현예 중 어느 하나에 기재된 방법을 제공한다.

본 발명의 제18구현예는, 상기 현미경 시스템의 사용자에 의해서 상기 제1위치가 입력되는, 상기 제11구현예 내지 제17구현예 중 어느 하나에 기재된 방법을 제공한다.

본 발명의 제19구현예는, 상기 대물 렌즈가 제조자 규정 작동 거리를 가지며, 상기 제1위치는 상기 현미경 시스템의 사용자가 입력하는 제조자 규정 작동 거리에 기초하여 선택되는, 상기 제11구현예 내지 제18구현예 중 어느 하나에 기재된 방법을 제공한다.

본 발명의 제20구현예는, 상기 현미경 시스템이 이미지 센서를 더 포함하고, 상기 방법은 상기 증분 위치들에서 상기 초점 면상에 상기 F-스톱 투영도를 상기 이미지 센서에 의해서 전자식으로 촬상하는 단계를 더 포함하며, 상기 전자식으로 촬상하는 단계는 상기 하나 이상의 프로세서에 의해서 자동화되는, 상기 제11구현예 내지 제19구현예 중 어느 하나에 기재된 방법을 제공한다.

본 발명의 제21구현예는 현미경 시스템을 제공하며, 이 현미경 시스템은:

검체를유지하는 스테이지;

광원;

대물 렌즈;

전동 F-스톱;

상기 검체와 상기 대물 렌즈 사이의 상대위치를 변경하도록 작동 가능한 구동 메커니즘;

전자 이미지 센서;

상기 검체와 상기 대물 렌즈 사이의 소정의 상대 위치에서 상기 검체의 상대 초점을 결정하는 수단;

제1 실험적 작동 거리(WDE)를 결정하는 수단으로서, 상기 WDE는 상대 초점을 결정하는 상기 수단에 의해서 결정될 때 초점이 맞춰지면 상기 검체의 초점 면과 대물 렌즈 사이의 최단 거리인, 상기 제1 실험적 작동 거리(WDE)를 결정하는 수단;

제2 실험적 작동 거리(WDE1)를 결정하는 수단으로서, 상기 WDE1은 상대 초점을 결정하는 상기 수단에 의해서 결정되는 초점이 맞을 때 검체의 초점 면과 대물 렌즈 사이의 최대 거리인, 상기 제2 실험적 작동 거리(WDE1)를 결정하는 수단;

상기 스테이지, 상기 전동 F-스톱, 상기 구동 메커니즘 및 상기 이미지 센서를 제어하고, 상대 초점을 결정하는 상기 수단, WDE를 결정하는 상기 수단 및 WDE1를 결정하는 상기 수단을 작동시키는 하나 이상의 프로세서; 및

촬상될 초점 면 아래의 사용자 정의 깊이 또는 초점 면 위의 사용자 정의 높이를 입력하는 수단-상기 하나 이상의 프로세서는 상기 검체를 적절한 위치로 이동시켜 초점 면 아래의 상기 사용자 정의 깊이 또는 초점 면 위의 상기 사용자 정의 높이에서 촬상하도록 되어 있고, 상기 적절한 위치는WDE 또는 WDE1에 기초한다.

본 발명의 제22구현예는, 상기 대물 렌즈에 대한 상기 검체의 소정의 상대 위치를 저장하고, 그 상대 위치에서 상기 검체를 전자식으로 촬상하고, 그리고 그 상대 위치에서 상대 초점에 관한 정보를 저장하는 수단을 더 포함하는, 상기 제21구현예에 기재된 현미경 시스템을 제공한다.

본 발명의 제23구현예는, 또한 상기 WDE 및 WDE1를 결정하는 수단이 상대 초점을 결정하는 상기 수단에 의해서 결정되는 상대 초점의 표준 편차 분석을 이용하는, 상기 제21구현예 내지 제22구현예 중 어느 하나에 기재된 현미경 시스템을 제공한다.

본 발명의 제24구현예는, 또한 데이터의 사용자 입력을 가능하게 하기 위해서 상기 프로세서와 통신하는 입력 장치를 더 포함하는, 상기 제21구현예 내지 제23구현예 중 어느 하나에 기재된 현미경 시스템을 제공한다.

본 발명의 제25구현예는, 상기 스테이지상의 투명한 검체를 더 포함하는 상기 제21구현예 내지 제24구현예 중 어느 하나에 기재된 현미경 시스템을 제공한다.

도 1은 본 발명에 따른 현미경 시스템의 전체 구성도이다.
도 2는 작동 거리와, 대물 렌즈와 검체 사이의 피사계 심도 관계를 나타내는 측면 개략도이다.
도 3은 본 발명의 제1 방법에서 초기 위치설정에 도시된 대물 렌즈, 검체 및 검체 스테이지를 위한 구동 메커니즘의 측면 개략도이다.
도 4는 도 3의 초기 위치에서 대물 렌즈와 검체의 측면 개략도이다.
도 5는 도 4의 대물 렌즈와 검체의 측면 개략도이며, 검체가 실험적 작동 거리 WD_E1를 확립하는 위치로 이동한 것을 도시하고 있다.
도 6은 도 4 및 5와 같은 대물 렌즈와 검체의 측면 개략도이며, 검체가실험적작동 거리 WD_E를 확립하는 위치로 이동한 것을 도시하고 있다.
도 7은 본 발명의 제2 실시 형태에 있어서 초기 위치 결정에서의 대물 렌즈와 검체의 측면 개략도이다.
도 8은 도 7의 대물 렌즈와 검체의 측면 개략도이며, 검체가 실험적 작동 거리 WD_E를 확립하는 위치로 이동한 것을 도시하고 있다.
도 9는 도 7 및 8과 같은 대물 렌즈와 검체의 측면 개략도이며, 검체가실험적 작동 거리 WD_E1를 확립하는 위치로 이동한 것을 도시하고 있다.
도 10은 투명 검체에 투영된 폐쇄 F-스톱의 예시적 이미지로서, F-스톱의 초점이 어긋난 것을 도시하고 있다.
도 11은 투명 검체에 투영된 폐쇄 F-스톱의 예시적 이미지로서, F-스톱의 초점이 맞는 것을 도시하고 있다.
도 12은 도 3 내지 6의 방법에서 작동 거리를 결정하기 위해서 이미지의 표준 편차를 이용하는 방법을 나타낸 예시적인 그래프이다.
도 13은 도 7 내지 9의 방법에서 작동 거리를 결정하기 위해서 이미지의 표준 편차를 이용하는 방법을 나타낸 예시적인 그래프이다.
도 14는 실험적으로 결정된 작동 거리로부터의 오프셋이 투명 검체의 특정 깊이를 촬상하기 위해 적용될 수 있는 방법을 도시하는 측면 개략도이다.

본 발명은 작동 거리와 피사계 심도를 실험적으로 결정하는 현미경 시스템 및 방법을 제공하고, 촬상될 투명 또는 저 콘트라스트의 검체의 깊이를 자동으로 지정하는 것을 가능하게 한다. 용어 "투명"은 검체가 불투명한 것과는 대조적으로, 빛을 통과하는 것을 허용하는 것으로 이해되어야 한다. 본 명세서에서, 이 용어는 또한 이미지 때문에 반투명 특성 때문에 이미지를 자세히 볼 수는 없지만, 빛을 통과시키는 반투명한 반투명 검체를 포함하는 것으로 이해되어야한다. 투명한 검체에 의해서, 본 발명은 검체 내의 상이한 깊이에서 물체에 초점을 맞추는 장치 및 방법을 제공한다. 본 발명은 검체의 표면에서 또 상이한 깊이들(또는 층들) 내에서 검체의 촬상 대상과 결함의 정확성을 향상시킨다. 용어 "저 트라스트"는검체 내의 흑백의 범위가 매우 작은 것을 의미한다. 본 발명은 저 콘트라스트 검체에서 물체와 결함을 볼 수도 있는 정확도를 향상시킨다. 넓은 측면에서, 본 발명은 소정의 대물 렌즈의 작동 거리 및 피사계 심도를 실험적으로 결정하는 장치 및 방법을 제공한다. 일부 실시예에서, 이 방법은 현미경 시스템을 이용하는 사함으로부터의 입력이 거의 없이 자동화 된다.

전형적인 현미경 시스템이 도 1에 도시되어 있고 부호(10)으로 표시되어 있다. 이 현미경 시스템(10)은 검체를 촬상하는 광학 시스템(12)과, 피사계 심도를 자동으로 결정하는 초점 검출 시스템(14)을 포함한다. 이 특정 시스템(10)은 수정된 광학계(12)로서의 수정된 반사광 현미경을 이용하지만, 투과광 현미경이 유사하게 이용될 수도 있다는 것에 주의해야 한다. 광학 시스템(12)은 대물 렌즈(18) 아래에 검체(S)를 지지하는 검체 스테이지(16)를 포함한다. 광학 시스템(12)은 검체(S)를 조명하는 광원(20) 및 수직 조명(22)을 더 포함한다. 또한, 광학 시스템(12)은 조정 가능한 F-스톱(24)을 포함한다. 이미지 센서(26)는 대물 렌즈(18)를 투과한 이미지를 수신하고, 이미지 센서(26)는 초점 검출 시스템(14)의 일부로서 고려될 수도 있다. 초점 검출 시스템(14)은, 검체 스테이지(16) (및 그 위의 검체(S))를 대물 렌즈(18)를 향해서 또 그로부터 멀리 이동시키도록 작동하는 모터(28) 및 구동 메커니즘(30)을 포함한다. 구동 메커니즘(30)은, 모터(28)에 의해서 회전하여 검체 스테이지(16)를 전진시키는 스크류(31)로서 도시되어 있으며, 스크류(31)를 일방향 (예컨대, 시계 방향)으로 회전시킴으로써, 검체 스테이지가 상향향으로 이동하고, 그리고, 스크류(31)를 반대 방향 (예컨대, 반시계 방향)으로 회전시킴으로써, 검체 스테이지가 하방향으로 이동한다. 다른 구동 메커니즘들이 사용될 수도 있고, 또 구동 메커니즘가 현미경을 다른방식으로 또는 추가로 조작하여 현미경을 검체(S)에 대해서 이동시키도록, 대물 렌즈(18)와 검체(S) 의 상대 이동이 중요하다. 본 발명의 장치 및 방법을 통해 실험적으로 결정되는 피사계 심도는 통상적으로 매우 작기 때문에, 구동 메커니즘는, 스테이지 및 그 위의 검체가 미크론 또는 보다 바람직하게는 나노미터 정도의 매우 작은 증분으로 이동할 수 있도록 해야 한다. 모터(28)는 하나 이상의 프로세서(32)를 포함하고, 이 프로세서는 케이블(34) 또는 무선 통신 등의 다른 적절한 기구를 통해서 모터(28)와 통신한다. 초점 검출 시스템(14)은 또한 F-스톱(24)을 개폐하는 모터(36)를 포함하며, 이 모터(36)는 하나 이상의 프로세서(32)에 의해서 제어되고, 이 프로세서는 케이블(38) 또는 무선 통신 등의 다른 적절한 기구를 통해서 모터(36)와 통신한다. 마지막으로, 프로세서(들)(32) 및 이미지 센서(26)는 케이블(40) 또는 무선 통신 등의 다른 적절한 기구를 통해서 통신한다. 키보드, 터치 스크린 모니터 또는 다른 표준 수단 등의 조작자 입력부(42)는, 조작자가 소정의 제어 및 데이터를 입력하는 것을 가능하게 하기 위해서 이용 가능하다.

장치의 광학 부품은 시스템의 특징들, 특히, 배율, 작동 거리(WD) 및 피사계 심도(DOF)를 결정한다. 도 1의 예시적인 장치의 배율은 대물 렌즈(18)의 함수이다. 주지된 바와 같이, 모든 대물 렌즈들에는 개구 수(numerical aperture: NA) 뿐만 아니라 배율 정도가 지정되어 있다. 대물 렌즈의 이러한 사양들 및 그 구성은 본 발명의 2개의 중요한 구성요소, 즉 초점 심도(DOF) 및 작동 거리(WD)를 규정한다. 초점 심도(DOF) 및 작동 거리에 대한 그의 관계(WD, WD₁)가 도 2에 도시되어있다. DOF는 각각의 상이한 대물 렌즈마다 고유하며, 이미지가 양측 위치에서 명확이 초점이 맞춰지는 경우, 검체가 대물 렌즈로부터 떨어져 있는 최단 거리와 검체가 대물 렌즈에 가까이 있는 최대 거리 사이의 차이로서 규정된다. 본 발명의 개시 목적을 위해서, DOF를 작동 거리와 관련시키는 것이 유리하며, 그에 따라서, 도 2를 참조하여, 검체의 초점이 맞춰지는 경우, 작동 거리(WD)가 대물 렌즈(18)와 검체(S)의 상부면 사이의 최소 거리로 확립되어 있다는 것에 주의한다. 마찬가지로, 작동 거리(WD₁)은, 검체가 여전히 초점이 맞은 상태에서, 대물 렌즈(18)가 검체(S)의 상부면으로부터 떨어진 최대 거리로서 확립된다. 다음의 관계를 알 수있다.

DOF = WD₁ - WD 또는

DOF = |WD - WD₁|

DOF는 대물 렌즈의 특징이지만, 이것은 장치 내의 기계적 부품 및 추가 광학 부품들에 의해서 변경될 수도 있다. 대물 렌즈의 특징이기는 하지만, 실제의 작동 거리는 장치의 기계적 부품들 및 광학적 부품들에 의해서 변경될 수도 있다. 여기서, 목적을 위해서, DOF_M는 대물 렌즈 제조자에 의해 공급되는 전술한 초점 심도로 언급될 것이고, WD_M과 함께 WD_M 및 DOF_M의 합인 WD_M1 (즉, WD_M + DOF_M)는 대물 렌즈 제조자에 의해서 공급되는 전술한 작동 거리로 언급될 것이다. 따라서, 이들은 소정의 공지된 값이며, 본 발명은, F-스톱을 검체(S)상에 투영하는 것에 의해서 그리고 대물 렌즈(18)와 검체(S)사이의 상대 거리(ΔD)를 측정하면서 투영된 이미지를 분석하는 것에 의해서, WD 및 DOF를 실험적으로 결정하는 방법을 제공한다는 것에 주목한다. 본 명세서에서, 실험적으로 결정한 작동 거리 및 피사계 심도는 본 명세서에서 WD_E, WD_E1 및 DOF_E로 표시한다.

투명 검체의 WD_E, WD_E1 및 DOF_E를 실험적으로 결정하는 방법들이 도 3 내지 10에 도시되어 있다. 이 방법들은 검체의 상부면 및 하부면에 초점을 맞추는 것을 허용하지 않으므로, 이 방법들은 다소 저 콘트라스트 검체로 제한된다. 저 콘트라스트의 검체를 위한 방법은 투명 검체와 관련된 방법의 개시 후에 보다 구체적으로는 설명할 것이다. 특히, 일반적인 개념은 각 방법에 있어서 동일하고, 피사계 심도의 외부의 위치로부터 피사계 심도 내로 검체의 "초점 면" (본 명세서에서 하기에 규정함)을 이동시켜 전술한 바와 같이 실험적으로 결정된 작동 거리(WD_E, WD_E1)와 관련된 피사계 심도의 경계, 즉 DOF_E를 실험적으로 결정하는 것을 포함한다. 각각의 방법은 이 값들로부터 WD_E및 WD_E1 의 양자를 결정하도록 실행되며, DOF_E도 결정할 수 있지만, 그것은 본 명세서의 방법을 부분적으로 그리고 조합하여 실시하여 이들 소망의 값을 실험적으로 결정할 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 예를 들면, 하나의 방법을 이용하여 WD_E를 결정하고, 다른 방법을 이용하여 WD_E1를 결정할 수도 있고, 2가지 방법을 조합하여 모든 소망의 값들, 즉, WD_E, WD_E1 및 DOF_E를 얻는다. 이 방법들의 조합은 덜 효율적으로 수행되는 것으로 보일 가능성이 있으므로 아마 덜 바람직하지만, 그럼에도 불구하고, 그러한 조합은 본 발명의 이점을 여전히 제공하고 따라서 그 범위 내에 속한다.

본 방법을 설명하는데 있어서 용어 "초점 면"이 사용된다. 본 발명의 목적을 위해, 용어 "초점 면"은 그 위에 투영된 F-스톱의 초점이 맞춰지고 실험적 피사계 심도 내에 있을 때 결정하도록 분석되는 검체의 면을 암시하는 것이다. 투명한 검체에 대해서, 상부면 또는 하부면이 초점 면의 역할을 하도록 선택될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 실제로, 본 발명의 특정 방식은 투명 검체에서만 실행된다. 이것은 하기의 개시를 통해 보다 완전하게 이해될 것이다. 또한, 본 발명은 일반적으로는 이용되는 대물 렌즈의 피사계 심도보다 두꺼운 검체의 사용을 대상으로 하는 것에 유의해야 한다. DOF는 미크론의 범위로 일반적으로 매우 작기 때문에, 피사계 심도보다 두꺼운 검체가 항상 발생할 가능성이 있다는 것을 이해할 것이다.

용어 "ΔD"는 대물 렌즈(18)와 검체의 초점 면 사이의 거리로서 이해되어야 하고, 따라서, 초점 면의 특정 위치들을 나타내기 위해서 ΔD₁, ΔD₂ 등이 이용될 수도 있다.

제1 방법이 도 3 내지 6에 도시되어 있다. 이 방법은 일반적으로 대물 렌즈(18)에 가장 가까운 검체의 면을 "초점 면"으로 취급하는 것을 포함한다. 이 면은 "근위 초점 면"을 나타내는 도면들에서 문자 PPF로 표시되어 있다. 대물 렌즈(18)로부터 가장 먼 면은 "원위 초점 면"을 나타내는 문자 DFF로 표시되어 있다. 투명 검체만이 원위 초점 면(DFF)을 제공할 것이고, 원위 초점 면(DFF)의 사용은 하기에서 본 명세서에 포함될 것이다. 투명 검체 및 불투명 저 콘트라스트 검체의 양자가 적절한 근위 초점 면(PFF)을 제공할 것이라는 조건에서, 근위 초점 면(PFF)의 사용을 먼저 설명한다.

검체(S)의 초기 위치 설정이 도 3및 4에 도시되어 있는데, 검체(S)의 근위 초점 면(PFF)을 대물 렌즈(18)에 대해서 거리(ΔD₁)에 배치하되 ΔD₁가 DOF_E비의 외부에 위치하도록 모터(28) 및 구동 메커니즘(30)을 조작함으로써, 검체 스테이지(16)가 이동된다. 본 발명의 이 실시예를 실행하는데 있어서, 이것은 WD_M + DOF_M + 오프셋 보다 큰 거리 ΔD₁에 초점 면(PF)을 배치하는 것에 의해서 실행된다. 이와 같이, 근위 초점 면(PFF)은 대물 렌즈(18)의 DOF_E의 외부에 위치할 가능성이 높다. 일반적으로, 초점 심도 통상 매우 짧은 거리이기 때문에, 매우 미소한 오프셋이 적용될 수 있다. 그 의도는 근위 초점 면(PFF) 상에 투영된 F-스톱이 흐리게 보이도록 (즉, DOF_E의 외부) 초기에 검체(S)를 배치하기 위한 것이다. 정확한 거리는 중요하지 않지만, 특정 실시예에서는, 검체(S)의 초기 위치설정은 ΔD₁이 WD_M 의 101% 보다 크도록 하는 것이다. 다른 실시예에서는, ΔD₁이 WD_M 의 102%보다 크고, 다른 실시예에서는 103%보다 크며, 또 다른 실시예에서는 104%보다 크고, 또 다른 실시에에서는 105%보다 크다. 어떤 실시예에서는, ΔD₁이 WD_M의 105 내지 150%이다. DOF와 WD의 비율이 매우 작기 때문에, 오프셋은 근위 초점 면(PFF)가 DOF_E 의 외부에 위치하는 것을 보장한다. 물론, 근위 초점 면(PFF)상에 투영된 F-스톱의 이미지가 선명해 보이고 가능하면 DOF_E 내에 위치하면, 소망의 초기 위치에 도달할 때까지 (즉, 근위 초점 면(PFF) 이 DOF_E 의 외부에 위치할 때까지), 검체(S)가 단순히 더 멀리 재 위치설정될 수도 있다.

도 3 및 4에 도시된 바와 같이 이러한 초기 위치에 도달하면, F-스톱(24)이 모터(36)에 의해 자동 폐쇄되고, F-스톱의 이미지가 검체(S)상에 (그리고, 투명 검체의 경우에는 검체를 통하여) 투영된다. 투영된 F-스톱 이미지 (도 10 및 11, 부호 44)이 이미지 센서(26)에 기록되고, 프로세서(32)에 의해 분석된다. 도 10에 도시된 바와 같이, F-스톱(24)이 위치(ΔD₁) (즉, 대물 렌즈의 DOF_E의 외부)에서 폐쇄되면, 검체(S)의 근위 초점 면(PFF) 상의 투영된 F-스톱 이미지(44)이 46에서 초점이 어긋난 엣지로 나타난다. ΔD₁이 DOF_E의 외부에 있기 때문에 이 엣지(46)는 초점이 어긋난다. 근위 초점 면(PFF)을 DOF_E 및 투영된 F-스톱 이미지(44)의 외부에 배치하지 못한 조작자 또는 프로세서(32)가 초점이 맞는 것으로 결정하는 경우, 근위 초점 면(PFF)이 DOF_E의 외부에 위치하는 것을 보장하도록 추가의 오프셋이 적용될 수 있다.

F-스톱(24)을 폐쇄하는 즉시, 구동 메커니즘(30)이 대물 렌즈(18)와 근위 초점 면(PFF) 사이의 거리를 자동적으로 감소시키기 시작하고, 즉, 검체(S)를 도 4에 도시된 바와 같이 대물 렌즈에 가깝게 화살표(A) 방향으로 이동시킴으로써 ΔD를 감소시킨다. 투영된 F-스톱 이미지가 도 11에 도시된 바와 같이 초점이 맞을 때까지 검체가 이동하고, 여기서 검체(S)의 근위 초점 면(PFF)상의 투영된 F-스톱 이미지(44)이 명확하게 보이고 48에서와 같이 초점이 맞는 엣지로 보인다. ΔD2로 언급하는 이 위치는 도 5에 도시된 바와 같이 실험적 작동 거리(WD_E1)로 표시된다. 근위 초점 면(PFF) 또는 원위 초점 면(DFF)에 관계 없이, 초점 면이 각 방법에 대해 특별하게 규정되는 조건에서, 도 10 및 11은 본 명세서에서 각 방법을 참조한다.

초점이 맞는 이미지는 F-스톱 투명 이미지(44) 주위의 고도로 규정된 엣지 (초점 맞춤 엣지(48)에서와 같이)를 특징으로 한다. 이 엣지를 규정하는 방법은 당 업자에게 공지되어 있고, 통상적으로는 콘트라스트 분석을 특징으로 한다. 일례로서, 이미지 센서(26)상에 저장된 이미지의 표준 편차(SD)는 도 12에 도시된 바와 같이 변화될 것이다. 이 실시예에서, ΔD가 감소됨에 따라, 근위 초점 면(PFF)이 대물 렌즈(18)에 가까워지고, 최대 값이 발생할 때까지 SD가 증가한다. SD 곡선의 최대 값에서, 투영된 F-스톱 이미지(44)의 초점이 맞춰진다. 최대 값은 ΔD2에서 처음 발생하는데, 이것은 WD_E1으로 이해될 것이고, 그 위치는 도 5에 도시된 바와 같다. 모터(28) 및 구동 메커니즘(30)은 투영된 F-스톱 이미지(44)의 초점이 어긋날 때까지 ΔD를 계속 감소시킨다. 이것은 도 12의 ΔD3에서 발생하는 SD의 감소를 특징으로 하며, ΔD3는 도 6에 도시된 바와 같이 실험적 작동 거리(WD_E)의 지표이다. 이동, 촬상 및 분석의 전체는, 프로세서(32) 및 이미지 센서(26), 모터(36) 및 관련된 조정 가능한 F-스톱(24) 및 모터(28) 및 관련 구동 메커니즘(30) 과 같은 관련 소자들에 의해서 용이하게 자동으로 수행된다. ΔD₃(WD_E)를 결정할 때, F-스톱(24)이 자동으로 개방되고, ΔD₂(WD_E1) 및 ΔD₃(WD_E)의 스테이지 위치들이 저장된다. ΔD2 및 ΔD3는 실험적으로 결정된 작동 거리(WD_E1, WD_E)이므로, 초점(DOF_E)의 실험적 깊이는 다음과 같이 용이하게 계산된다.

DOF_E = (ΔD2 - ΔD3) = WD_E1 - WD_E.

도 3 내지 6의 실시예가 검체가 투명한 경우 검체의 원위 초점 면(DFF)으로서 초점 면을 취급하는 분석에 의해서 실행될 수 있다는 것을 이해해야 할 것이다. 본 발명은 이것을 의도하며, 당업자가 원위 초점 면(DFF)에 종래의 방법의 적용을 용이하게 하는데 필요한 추가의 개시가 없다는 것을 이해할 것이다. 초점 면은 원위 초점 면 (DFF) 으로서 취급되고, 동일한 이동 및 분석들이 수행된다. 당업자들은 DOF_E의 외부의 적절한 개시 위치에 원위 초점 면(DFF)을 배치하는 것이 가능할 것이고, 투명 검체의 근위 초점 면(PFF)이 초기 위치에서 DOF_E 내에 존재하는 상황을 방지하거나 또는 고려하는 대책을 세울 수 있다.

또 다른 방법이 도 7 내지 9에 도시되어 있는데, 검체(S)의 초점 면은 투명 검체의 원위 초점 면(DFF), 즉, 빛을 통과시켜 특히 빛이 원위 초점 면(DFF) 에 도달할 수 있게 하고 또 그의 촬상을 가능하게 하는 초점 면이다. 검체(S)의 초기 위치설정이 도 7에 도시되어 있는데, ΔD1이 DOF_E의 외부에 위치하도록 대물 렌즈(18)에 대해서 위치(ΔD1)에 검체(S)의 원위 초점 면(DFF)이 배치되도록 모터(미 도시) 및 구동 메커니즘(미 도시)를 작동시킴으로써 검체 스테이지(미 도시)가 이동된다. 본 발명의 이 실시예를 실행하는데 있어서, 이것은 WD_M - 오프셋(offset) 미만인 거리(ΔD1)에 원위 초점 면(DFF)을 배치하는 것에 의해서 일반적으로 달성된다. 이와 같이, 원위 초점 면(DFF)은 대물 렌즈(18)의 DOF_E의 외부에 위치할 가능성이 높다. 일반적으로, DOF는 통상 매우 작은 거리이므로, 매우 미소한 오프셋을 적용할 수 있다. 초기 위치설정의 의도는, 검체(S)의 초기 위치에서 원위 초점 면(DFF) 상에 투영된 F-스톱이 흐리게 보이게(즉, DOF_E의 외부) 하는 것이다. 정확한 거리는 중요하지 않지만, 특정 실시예에서는, 검체(S)의 초기 위치설정은 ΔD1이 WD_M 의 99% 미만이 되도록 하는 것이다. 다른 실시예에서는, ΔD₁이 WD_M 의 98% 미만이고, 다른 실시예에서는 97% 미만이며, 또 다른 실시예에서는 96% 미만이, 또 다른 실시에에서는 95% 미만이다. 어떤 실시예에서는, ΔD₁이 WD_M의 50 내지 95%이다. DOF와 WD의 비율이 매우 작기 때문에, 이 오프셋은 원위 초점 면(DFF)이 DOF_E 의 외부에 위치하는 것을 보장한다. 물론, 원위 초점 면(DFF)상에 투영된 F-스톱의 이미지가 선명해 보이고 가능하면 DOF_E 내에 위치하면, 소망의 초기 위치에 도달할 때까지 (즉, 원위 초점 면(DFF)이 DOF_E 의 외부에 위치할 때까지), 검체(S)가 대물 렌즈(18)에 보다 가깝게 재 위치설정될 수도 있다.

도 7에 도시된 바와 같이 이러한 초기 위치에 도달하면, F-스톱(24)이 모터(36)에 의해 자동 폐쇄되고, F-스톱의 이미지가 검체(S)상에 그리고 검체(S) 를 통하여 투영된다. 투영된 F-스톱 이미지(44)이 이미지 센서(26)에 기록되고, 프로세서(32)에 의해 분석된다. F-스톱(24)이 위치(ΔD1) 에서 폐쇄되면, 검체(S)의 근위 초점 면(PFF) 상의 투영된 F-스톱 이미지(44)이 46에서와 같이 초점이 어긋난 엣지로 나타나고, ΔD1이 DOF_E의 외부에 있기 때문에 이 엣지는 초점이 어긋난다. 전술한 바와 같이, 이것은 도 11에 도시되어 있고, 모든 실시예에 대해 대체로 적용 가능하다. 원위 초점 면(DFF)을 DOF_E 및 투영된 F-스톱 이미지(44)의 외부에 배치하지 못한 조작자 또는 프로세서(32)가 초점이 맞는 것으로 판정되는 경우, 원위 초점 면(DFF)이 DOF_E의 외부에 위치하는 것을 보장하도록 추가의 오프셋이 적용될 수 있다.

F-스톱(24)을 폐쇄하는 즉시, 구동 메커니즘(30)이 대물 렌즈(18)와 원위 초점 면(DFF) 사이의 거리를 자동적으로 감소시키기 시작하고, 즉, 검체(S)를 도 7에 도시된 바와 같이 대물 렌즈(18)로부터 도 멀어지는 화살표(B)의 방향으로 이동시킴으로써 ΔD를 증가시킨다. 투영된 F-스톱 이미지(44)이 도 12에 도시된 바와 같이 초점이 맞을 때까지 검체(S)가 이동하고, 여기서 검체(S)의 원위 초점 면(DFF)상의 투영된 F-스톱 이미지(44)이 명확하게 보이고 48에서와 같이 초점이 맞는 엣지로 보인다. 이 위치는 도 8에 도시된 바와 같이 실험적 작동 거리(WD_E)로 표시된다.

초점이 맞은 이미지를 결정하는 방법은 도 3 내지 6에 개시된 것과 동일하고, 표준 편차 분석에 의해서 자동적으로 수행된다. 이미지 센서(26)상에 저장된 이미지의 표준 편차(SD)는 도 13에 도시된 바와 같이 변화될 것이다. 이 실시예에서, ΔD가 감소됨에 따라, 원위 초점 면(DFF)이 대물 렌즈(18)에 가까워지고, 최대 값이 발생할 때까지 SD가 증가한다. SD 곡선의 최대 값에서, 투영된 F-스톱 이미지(44)의 초점이 맞춰진다. 최대 값은 ΔD2에서 처음 발생하는데, 이것은 WD_E로 이해될 것이고, 그 위치는 도 8에 도시된 바와 같다. 모터(28) 및 구동 메커니즘(30)은 투영된 F-스톱 이미지(44)이 초점이 어긋날 때까지 ΔD를 계속 증가시킨다. 이것은 도 9에 WD_E1으로 도시된 도 13의 ΔD3에서 발생하는 SD의 감소를 특징으로 한다. ΔD3 (WD_E1)를 결정할 때, F-스톱(24)이 자동으로 개방되고, ΔD2(WD_E) 및 ΔD3(WD_E1)에서 스테이지 위치들이 저장된다. ΔD2 및 ΔD3는 실험적으로 결정된 작동 거리(WD_E1, WD_E)이므로, 초점(DOF_E)의 실험적 깊이는 다음과 같이 용이하게 계산된다.

DOF_E = (ΔD3 - ΔD2) = WD_E1 - WD_E.

도 7 내지 9의 실시예가 투명 검체의 근위 초점 면(PFF)으로서 초점 면을 취급하는 분석에 의해서 실행될 수 있다는 것을 이해해야 할 것이다. 또한, 불투명 또는 저 콘트라스트 검체의 경우에, 근위 초점 면(PFF)은 도 7 내지 9의 방법을 수행하기 위해서 초점 면의 역할을 할 것이다. 본 발명은 이것을 의도하지만, 추가의 개시는 필요 없다. 초점 면은 단순히 근위 초점 면(PFF) 으로서 취급되고, 동일한 이동 및 분석들이 수행된다. 당업자들은 DOF_E의 외부의 적절한 개시 위치에 근위 초점 면(PFF)을 배치하는 것이 가능할 것이고, 투명 검체의 원위 초점 면(DFF)이 초기 위치에서 DOF_E 내에 존재하는 상황을 방지하거나 또는 고려하는 대책을 세울 수 있다.

상술한 개시에서, 투명 검체의 경우, 근위 초점 면(PFF) 또는 원위 초점 면(DFF)을 DOF_E의 외부에 배치할 수 있고, 그 후에, 그 위의 F-스톱 이미지의 선명도를 분석함으로써 DOF_E의 경계 - WD_E 또는 WD_E1 --중의 하나로 이어질 수 있다는 것을 용이하게 이해해야 한다. 또한, 그들은 상방향 또는 하방향으로부터 경계로 이를 수도 있다. 불투명한 저 콘트라스트 검체의 경우에, 근위 초점 면(PFF)만이 이용되지만, 이 면은 한 방향으로부터 DOF_E의 경계 - WD_E 또는 WD_E1 -로 이어질 수 있다. 전술한 바와 같이, 본 명세서에 개시된 방법들은 부분적으로 또 조합하여 실행되어 소망하는 WD_E, WD_E1 및 DOF_E 값들을 실험적으로 결정하는 것이 이해되어야 한다. 따라서, 근위 초점 면(PFF)을 사용하여 BOFE의 하나의 경계, 예컨대, WD_E 를 결정할 수도 있고, 그리고 그 후에, 원위 초점 면(DFF)을 사용하여 다른 경계 WD_E1를 결정할 수도 있다. BOFE의 경계가 소정의 초점 면에 도달하는 때를 결정하기 위해서 경험하는 표준 편차를 고려하는 이동 및 방법들의 많은 조합이 존재하며, 본 발명은 검체의 초기 위치 설정 및 이동에 대해 본 명세서에 개시하는 특정 방법에 한정되지 않는다. 이 방법들은 초기 위치를 제공하는 것과 같이 유효하게 도시되어 있고, 단일의 초점 면상의 투영 이미지를 분석하고, 일정 방향으로 이동하여 DOF_E 를 결정한다.

본 발명은 검체가 대물 렌즈의 피사계 심도보다 두꺼운 경우에 특히 적용 가능하다는 것을 규정하고 있다. 그러한 검체 및 공지된 WD_E 및 WD_E1의 값들에 의해서, 검체를 대물 렌즈(18)에 대해서 선택적으로 이동시키는 것에 의해서, 근위 초점 면(PFF) 아래의 사용자 지정 깊이에 또는 원위 초점 면(DFF) 위의 사용자 지정 높이에서, 검체를 촬상하는 것이 가능하다. 도 14에서, WD_E, WD_E1 및 DOF_E는 이미 전술한 바와 같이 결정되어 있다. 검체의 근위 초점 면(PFF)이 WD_E 이 되면, DOF_E와 동일한 검체의 깊이가 촬상될 것이지만, DOF_E 미만의 깊이를 촬상하기를 원하면, 이것은 실험적으로 결정된WD_E, WD_E1 및 DOF_E를 갖는 것을 고려하여 이제 정확히 달성될 수 있다. 근위 초점 면(PFF) 이하의 소망의 깊이(Z₁)를 촬상하기 위해서, 근위 초점 면(PFF)은 대물 렌즈(18)로부터 WD_E1 - Z₁과 동일한 거리에 배치된다. 마이크로 및 나노 포지셔너 등의 정확한 모터 및 구동 메커니즘에 의해서, 매우 작은 깊이에서 정확한 촬상을 행하는 것이 가능하다. 도 14에 도시된 개략도에서, 검체(S)는 투명하고, 결함(50)의 초점이 맞춰질 것이며, 그에 따라 확립된 소망의 깊이(Z₁) 내에서 명확하게 촬상되는 한편, 결함(52)은 초점이 어긋날 것이다. 원위 초점 면(DFF) 위의 사용자 정의 높이(Z₂)에서 촬상하기 위해서, 원위 초점 면(DFF)은 WD_E 아래의 거리(Z₂)에, 즉, WD_E + Z₂에 배치될 수 있다.

특히, 공정들의 일부 또는 전부는 프로세서(들)(32)에 의해 자동화될 수 있다. 특정 실시예에서, 초기 위치설정은 사용자의 데이터 입력에 의해 또는 그 입력이 없이 프로세서(들)(32)에 의해 자동적으로 수행될 수 있다. 예컨대, 사용자는 제조자 규정 작동 거리(WD_M)를 공급할 수 있고, 프로세서(들)(32)은 전술한 바와 같이, 초점 면이 적절한 위치(ΔD₁)에 배치되는 것을 보장하도록 검체를 이동시킬 수 있다. 그 후, 전체의 이동 및 분석은 프로세서(들)(32)에 의해서 자동적으로 수행될 수 있고, 이 프로세서(들)은 구동 메커니즘(30), F-스톱(24), 이미지 센서(26) 및 검체의 초점이 맞을 때 결정하는 이미지의 콘트라스트 분석을 제어한다. 일부 실시예에서는, 대물 렌즈(18)와 스테이지(16)의 상부면 사이의 거리가 구동 메커니즘(30)에 의한 스테이지(16)의 위치 설정에 기초한 시스템의 공지된 값일 수 있다. 따라서, 하나 이상의 실시예들에서, 사용자는 WD_M 및 검체(S)의 높이를 프로세서(32)에 입력하고, 현미경 시스템(10)은, 그 후에 (a) 검체(S)를 적절한 위치로 자동으로 이동시켜 근위 초점 면(PFF) 또는 원위 초점 면(DFF)을 피사계 심도의 외부의 필요한 오프셋에 배치하고, (b) F-스톱을 투영하고, 그리고 (c) 검체를 이동시키고 투영된 이미지의 표준 편차를 감시하여 실험적 자동 거리 값들을 결정할 수 있다. 프로세서(32)는 검체의 높이를 고려하여 근위 초점 면(PFF)의 위치를 결정할 수 있다. 사용자는 근위 초점 면(PFF) 아래의 소망의 사용자 정의 깊이 및 원위 초점 면(DFF) 위의 높이를 입력하여 촬상할 수 있고, 프로세서(32) 및 관련 기구들은 검체(S)를 적절한 위치로 이동시켜 깊이/높이를 정확하게 촬상할 수 있다. 따라서, 본 발명은 조작자가 입력하는 소망의 이미지 깊이에 의해서만 촬상될 당해 면적을 자동으로 그리고 고유하게 결정할 수 있다. 자동화된 과정은, 현미경 시스템(10)이 하나의 센서 이미지보다 큰 전체의 검체를 활상하기 위해서, 대물 렌즈에 대해서 검체를 측방향으로 (뿐만 아니라 상방향 및 하방향으로) 이동시킬 수 있다는 점에서도 유리하다. 이러한 넓은 영역에 걸친 촬상은 다른 비 자동화 수단에 의해 수행하기에는 부담스러운 시간 소모적일 것이다.

Claims (17)

1. 현미경, F-스톱(F-stop), 이미지 센서 및 하나 이상의 프로세서들을 갖는 현미경 시스템의 대물 렌즈의 피사계 심도(depth of field)의 경계를 투명한 검체를 이용하여 실험적으로(empirically) 결정하기 위한 방법에 있어서,
   상기 대물 렌즈의 상기 피사계 심도 외부의 제1위치에 투명한 검체의 초점 면을 배치시키는 단계로서, 상기 초점 면은 상기 대물 렌즈에 대해서 근위 초점 면으로부터 그리고 상기 대물 렌즈에 대해서 원위 초점 면으로부터 선택되는, 단계;
   상기 제1위치에서 상기 초점 면 상에 상기 F-스톱의 엣지(edge)를 투영시켜 F-스톱 투영도를 그 위에 형성하는 단계;
   상기 검체와 상기 대물 렌즈 사이의 증분의 상대적 이동을 실행하여 상기 대물 렌즈에 대해서 상이한 증분 위치들에 상기 검체의 상기 초점 면을 배치하고, 상기 F-스톱의 엣지를 투영시켜 상기 증분 위치들에서 상기 초점 면 상에 F-스톱 투영도를 형성하는 단계로서, 상기 증분의 상대적 이동을 실행하는 단계는 상기 피사계 심도의 경계의 위치로 상기 초점 면을 움직이는, 상기 증분 위치들에서 상기 초점 면 상에 F-스톱 투영도를 형성하는 단계;
   상기 제1위치와 상기 증분 위치들에서 상기 초점 면상에 상기 F-스톱 투영도를 상기 이미지 센서로 전자적으로 촬상하는 단계; 및
   상기 전자적 촬상 단계에서 상기 이미지 센서에 의해 제공되는, 상기 제1위치와 상기 증분 위치들에서 상기 초점 면상의 상기 F-스톱 투영도의 이미지들의 콘트라스트 분석을 수행하는 단계로서, 상기 콘트라스트 분석을 수행하는 단계는 상기 하나 이상의 프로세서에 의해서 실행되고 상기 초점 면이 상기 피사계 심도의 경계의 위치에 있을 때 확립되는, 상기 분석을 수행하는 단계를 포함하는, 방법.
2. 청구항 1에 있어서,
   상기 피사계 심도는 제1 경계(WD) 및 제2 경계(WD1)를 가지며, 상기 WD는 상기 초점 면이 상기 대물 렌즈로부터 거기에 명확한 초점(clear focus)인 최단 거리이고, 상기 WD1은 상기 초점 면이 상기 대물 렌즈로부터 거기에 명확한 초점인 최대 거리이며, 상기 제1위치는 상기 WD의 99% 미만이거나 상기 WD1의 101%보다 큰 거리가 되도록 선택되는, 방법.
3. 청구항 1에 있어서,
   상기 초점 면이 복수의 증분 위치들에서의 상기 F-스톱 투영도의 상대 초점의 표준 편차의 비교에 의해서 상기 피사계 심도의 경계에서의 임의의 위치에 위치할 때, 상기 콘트라스트 분석을 수행하는 단계가 확립되는, 방법.
4. 청구항 1에 있어서,
   상기 F-스톱 투영도를 형성하는 단계는 상기 하나 이상의 프로세서에 의해서 자동화되는, 방법.
5. 청구항 1에 있어서,
   상기 증분의 상대적 이동을 실행하는 단계는 상기 하나 이상의 프로세서에 의해서 자동화되는, 방법.
6. 청구항 1에 있어서,
   상기 배치시키는 단계는 상기 하나 이상의 프로세서에 의해서 자동화되는, 방법.
7. 청구항 1에 있어서,
   상기 현미경 시스템의 사용자에 의해서 상기 제1위치가 입력되는, 방법.
8. 청구항 1에 있어서,
   상기 대물 렌즈는 제조자 규정 작동 거리(manufacturer-stated working distance)를 가지며, 상기 제1위치는 상기 현미경 시스템의 사용자에 의해 입력될 때 상기 제조자 규정 작동 거리에 기초하여 선택되는, 방법.
9. 상부 초점 면 아래의 규정된 깊이 또는 하부 초점 면 위의 규정된 높이에서 투명한 검체를 촬상하는 방법에 있어서, 상기 방법은
   현미경, F-스톱, 이미지 센서 및 하나 이상의 프로세서들을 갖는 현미경 시스템의 대물 렌즈의 피사계 심도의 경계를 실험적으로 결정하는 단계로서, 상기 경계들을 실험적으로 결정하는 단계는
   상기 대물 렌즈의 상기 피사계 심도 외부의 제1위치에 검체의 초점 면을 배치하는 단계;
   상기 제1위치에서 상기 초점 면 상에 상기 F-스톱을 투영시켜 F-스톱 투영도(projection)를 그 위에 형성하는 단계;
   상기 검체와 상기 대물 렌즈 사이의 증분의 상대적 이동을 실행하여 상기 대물 렌즈에 대해서 상이한 증분 위치들에서 상기 검체의 초점 면을 배치하고, 상기 F-스톱을 투영시켜 상기 초점 면 상에 F-스톱 투영도를 형성하고, 상기 증분 위치들에서 상기 초점 면 상의 상기 F-스톱 투영도의 이미지를 촬상하는 단계로서, 상기 증분의 상대적 이동을 실행시키는 단계는 피사계 심도의 경계의 위치로 상기 초점 면을 움직이는, 상기 촬상하는 단계;
   상기 제1위치와 상기 증분 위치들에서 상기 초점 면상에 상기 F-스톱 투영도를 상기 이미지 센서로 전자적으로 촬상하는 단계; 및
   상기 전자적 촬상 단계에서 상기 이미지 센서에 의해 제공되는, 상기 제1위치와 상기 증분 위치들에서 상기 초점 면상의 상기 F-스톱 투영도의 이미지들의 콘트라스트 분석을 수행하는 단계로서, 상기 콘트라스트 분석을 수행하는 단계는 상기 하나 이상의 프로세서에 의해서 실행되고 상기 초점 면이 상기 피사계 심도의 경계의 위치에 있을 때 확립되는, 상기 콘트라스트 분석을 수행하는 단계; 및
   상기 경계를 결정하는 단계에서 결정된 상기 피사계 심도의 경계에 기초하여 상기 피사계 심도 내에 투명한 검체의 초점 면을 배치하는 단계를 포함하는, 방법.
10. 청구항 9에 있어서,
    상기 피사계 심도가 제1 경계(WD) 및 제2경계(WD1)를 가지며, 상기 WD는 초점 면이 상기 대물 렌즈로부터 거기에 명확한 초점인 최단 거리이고, 상기 WD1은 상기 초점 면이 상기 대물 렌즈로부터 거기에 명확한 초점인 최대 거리이며, 상기 피사계 심도로 투명한 검체의 초점 면을 배치하는 단계는, 상부 초점 면을 상기 WD1보다 상기 대물 렌즈 가까이에 배치하거나 또는 상기 하부 초점 면을 상기 WD보다 상기 대물 렌즈로부터 더 멀리 배치하는 단계를 포함하는, 방법.
11. 현미경 시스템에 있어서,
    투명한 검체를 유지하는 스테이지;
    광원(illumination source);
    대물 렌즈;
    전동 F-스톱;
    상기 검체와 상기 대물 렌즈 사이의 상대 위치를 변경하도록 작동 가능한 구동 메커니즘;
    전자 이미지 센서;
    상기 투명한 검체와 상기 대물 렌즈 사이의 소정의 상대 위치에서 상기 투명한 검체의 상대 초점을 결정하는 수단으로서, 상기 수단은 상기 전동 F-스톱을 포함하는 상기 수단;
    제1 실험적 작동 거리(WDE)를 결정하는 수단으로서, 상기 WDE는 상대 초점을 결정하는 상기 수단에 의해서 결정될 때 초점이 맞춰지면 상기 투명한 검체의 초점 면과 상기 대물 렌즈 사이의 최단 거리인, 상기 제1 실험적 작동 거리(WDE)를 결정하는 수단;
    제2 실험적 작동 거리(WDE1)를 결정하는 수단으로서, 상기 WDE1은 상대 초점을 결정하는 상기 수단에 의해서 결정될 때 초점이 맞춰지면 상기 투명한 검체의 초점 면과 상기 대물 렌즈 사이의 최대 거리인, 상기 제2 실험적 작동 거리(WDE1)를 결정하는 수단;
    상기 스테이지, 상기 전동 F-스톱, 상기 구동 메커니즘 및 상기 이미지 센서를 제어하고, 상대 초점을 결정하는 수단, 상기 WDE를 결정하는 수단 및 상기 WDE1를 결정하는 수단을 작동시키는 하나 이상의 프로세서로서, 상기 하나 이상의 프로세서는 상기 투명한 검체에 F-스톱의 엣지(edge)를 투영시키고 상기 전자 이미지 센서에 의해 촬상되도록 상기 전동 F-스톱을 제어하고, 상기 투명한 검체에 투영된 상기 F-스톱의 엣지의 이미지들의 콘트라스트 분석을 수행하는 상기 하나 이상의 프로세서; 및
    촬상될 초점 면 아래의 사용자 정의 깊이 또는 초점 면 위의 사용자 정의 높이를 입력하는 수단으로서, 상기 하나 이상의 프로세서는 투명한 검체를 적절한 위치로 이동시켜 상기 초점 면 아래의 상기 사용자 정의 깊이 또는 상기 초점 면 위의 상기 사용자 정의 높이에서 촬상하도록 되어 있고, 상기 적절한 위치는 WDE 또는 WDE1에 기초하는, 상기 입력하는 수단을 포함하는, 현미경 시스템.
12. 청구항 11에 있어서,
    상기 대물 렌즈에 대한 상기 검체의 소정의 상대 위치를 저장하고, 해당 상대 위치에서 상기 검체를 전자식으로 촬상하고, 그리고 해당 상대 위치에서 상기 상대 초점에 관한 정보를 저장하는 수단을 더 포함하는, 현미경 시스템.
13. 청구항 11에 있어서,
    상기 WDE 및 WDE1를 결정하는 수단이 상기 상대 초점을 결정하는 상기 수단에 의해서 결정되는 상기 상대 초점의 표준 편차 분석을 이용하는, 현미경 시스템.
14. 청구항 11에 있어서,
    데이터의 사용자 입력을 가능하게 하기 위해서 상기 프로세서와 통신하는 입력 장치를 더 포함하는, 현미경 시스템.
15. 삭제
16. 삭제
17. 삭제

Images