JP4631069B2 - β−アミロイド毒性緩和剤。 - Google Patents

Description

本発明は、β−アミロイド（以降「βＡ」と記す。）毒性緩和剤に関し、特にアクトミオシン分解物を活性成分として含むβＡ毒性緩和剤に関するものである。

高齢化社会を迎え、老齢性痴呆症は大きな社会問題になってきた。老齢性痴呆症の代表的な疾患であるアルツハイマー病は、現在まで多くの研究者により精力的な研究が行われてきたが、その発症原因は依然充分解明されるに至らず、満足できる予防方法や治療方法が確立されていないのが実情である。これまでのところでは、老人斑が沈着しそれにより神経細胞が脱落し脳の萎縮が起きる、とする説が有力となっている。老人斑は、その主成分がβＡであり、細胞毒性作用を有し、アルツハイマー病における神経細胞死を引き起こしていると考えられている。βＡは、３９〜４３個のアミノ酸からなる凝集しやすいペプチドであり、大脳皮質あるいは海馬由来の初代培養神経細胞に加えると細胞に障害を与え、アポトーシスによる細胞死が引き起こされる。特に、β−アミロイド細胞毒性の発現には、アミノ酸配列中の２５〜３５フラグメント（βＡ_{２５〜３５}）が最も重要である、との報告がある。〔非特許文献１参照〕。

このような見地から、神経細胞に対するβＡの毒性を緩和することでアルツハイマー病を予防できると考えられ、これまでにもβＡ毒性緩和作用のある化合物が報告されている。例えば、２−（８−ジメチルアミノオクチルチオ）−３−（２−テノイル）−６−イソプロピルピリジン・クエン酸塩〔特許文献１参照〕、Ｎ−（アリール／ヘテロアリール）アミノ酸誘導体〔特許文献２参照〕などがある。また、安全性の立場から３アミノ酸残基からなるペプチド〔特許文献３参照〕、天然物由来の茶ポリフェノール類〔特許文献４参照〕、カテキンおよび緑茶抽出物〔特許文献５参照〕をなどが報告されている。

ヤンクナー（Ｙａｎｋｎｅｒ，Β．Ａ．）他著、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２５０巻、２７９〜２８２頁、１９９０年 特開平７−２４７２１４号公報 特開２００３−５２６６０３号公報 特開２００２−１７３４４８号公報 特開平１０−２４５３４２号公報 特表２００３−５１９１９２号公報

かかる状況に鑑み、本発明の目的は、アルツハイマー病の進行を抑える効果が大きく、かつ安全性に問題がないβＡ毒性緩和剤を提供することにある。

上記目的を達成すべく、本発明請求項１に係るβＡ毒性緩和剤は、アクトミオシンを、パパイン及びフィチンから選ばれたプロテアーゼの存在下において酵素分解し、その酵素分解物から分子量１０，０００以下を分画して得られたアクトミオシン分解物を活性成分として含むものである。

請求項２に係るβＡ毒性緩和剤は、請求項１におけるアクトミオシンとして、動物の筋肉からの抽出物を用いている。

請求項３に係るβＡ毒性緩和剤は、請求項２における動物の筋肉として、豚骨格筋を用いている。

本発明の効果として、アルツハイマー病の予防、およびアルツハイマー病の進行を抑える効果が大きく、かつ多量に摂取しても副作用が少ないβＡ毒性緩和剤が提供される。

本発明のβＡ毒性緩和剤は、アクトミオシン分解物を活性成分として含んでいる。アクトミオシンは、動物の筋肉、特に動物の骨格筋に多く存在しており、本発明ではこれらから抽出して得ることができる。このうち、豚骨格筋が、原材料として量的に入手し易い上、アクトミオシンを多く含んでいる点から特に好ましい。動物の筋肉は、生肉でもよく、あるいは乾燥肉でもよい。

動物の筋肉からアクトミオシンの抽出方法は、特に限定するものではないが、例えば、非特許文献２〔ブリスキー、フカザワ（Ｂｒｉｓｋｅｙ．Ｅ．Ｊ．，Ｆｕｋａｚａｗａ Ｔ．）著、アドバンスセス・イン・フード・リサーチ（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｆｏｏｄ Ｒｅｓｅａｃｈ）、１９卷、２７９−３６０頁、１９７１年〕に記載された、筋肉をミンチしてバッファー液（０．６Ｍ−ＫＣｌ／０．０４Ｍ−ＮａＨＣＯ_３／０．０１Ｍ−Ｎａ_２ＣＯ_３水溶液）に懸濁させ、遠心分離を繰り返し、透析チューブにて透析した後に凍結乾燥する方法がある。

アクトミオシン分解物は、アクトミオシンを水中で化学的、あるいは微生物により分解しても得られるが、本発明のアクトミオシン分解物は、アクトミオシンをパパイン及びフィチンから選ばれたプロテアーゼの存在下で分解して得られた酵素分解物であり、この方法により低い温度でアクトミオシンの分解が進行し、かつ選択的に本発明の活性成分を多く含むようになる。このうち、パパインを用いての加水分解が、本発明の目的とするβＡ毒性緩和作用が優れており特に好ましい。これらは、市販されている製品を用いることができる。

プロテアーゼを用いての酵素分解を行う条件は、プロテアーゼの種類やその力価に依り異なるが、代表的には２０〜５０℃、特に３５〜４０℃で、２０〜３０時間程度である。ｐＨは、用いるプロテアーゼの至適ｐＨ範囲が異なり、例えばパパインではｐＨ３〜１２、フィチン、トリプシン、α−キモトリプシン、サーモリシン、プロナーゼ、ブロメラインなどではｐＨ４〜１０であり、ペプシンはｐＨ２〜４である。ｐＨを調整するときのアルカリあるいは酸は、好適には食品に許容されるものが選ばれ、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、塩酸などである。

プロテアーゼの使用量は、アクトミオシン濃度、プロテアーゼの力価、温度、処理時間などにより大きく異なるが、一般的にはアクトミオシンを抽出するに用いた動物の筋肉量に対し０．５〜２重量％程度である。

プロテアーゼを用いてアクトミオシンを分解したときには、この工程が終了した後で、分解混合液の温度を８０〜１００℃に上げてプロテアーゼを失活させる。

このようにして得られたアクトミオシンをパパイン及びフィチンから選ばれたプロテアーゼの存在下で分解して得られた分解物中に、本発明のβＡ毒性緩和剤の活性成分である分子量１０，０００以下の成分が含まれている。このアクトミオシン分解物中には、その他成分も含んでいるが、この場合のその他成分は、βＡ毒性緩和作用に対しなんら悪い影響を及ぼさない。しかし、薬や補助食品として使用するとき、活性成分を出来るだけ濃縮することが望ましいことがあり、例えば液体クロマトグラフィーで本発明の活性成分を分取することができる。後述の実施例において分取操作の例を説明する。

また、分取した成分のうち分子量が１０，０００以下の部分に特に顕著な効果がみられた。従って、本発明のβＡ毒性緩和剤は、分子量１０，０００以下を分画して得られたアクトミオシン分解物を活性成分としている。しかし、この分画は必須のものではなく、本発明のβＡ毒性緩和剤は、分解物混合物から活性成分を分離することなく分解混合物をそのまま用いてもよい。分子量による分画は、例えば限外ろ過など公知の方法で実施できる。

以上述べた活性成分、あるいは活性成分を含む混合物は、必要により酸などを加えて製薬組成物、補助食品用構成物とにして使用し、通常経口でヒトの体内に取り入れられる。アルツハイマー病の予防、治療における本活性成分の量は、ヒトに対して投与する場合活性成分として１０〜２００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ程度である。

経口投与剤とするとき、例えば結合剤（シロップ、ゼラチン、ソルビット、ヒドロキシプロピルセルロース等）、賦形剤（ラクトース、シュガー、コーンスターチ、リン酸カルシウム、ソルビット等）、滑沢剤（ステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール、シリカ等）、崩壊剤（ポテトスターチ、カルボキシメチルセルロース等）、湿潤剤（ラウリル硫酸ナトリウム等）を包含することがあるが、本発明の効果が損なわれない限りこれらの成分と一緒にすることはなんら差し支えない。また、本活性成分は多量に摂取しても生体に悪影響を与えない利点を有することから、そのまま、または種々の栄養分等とともに補助食品などに加えることもできる。

以下、本発明を実施例で説明する。以下の実施例は、本発明を説明するために挙げた例であり、これにより本発明を限定するものではない。以下の実施例では、神経成長因子により交感神経細胞用に分化するため神経細胞モデルに広く用いられているラット副腎髄質褐色細胞腫由来ＰＣ１２細胞で検討した。

〔アクトミオシン分解物の調製〕
アクトミオシンは、上記した非特許文献２の方法により、豚骨格筋肉をミンチしてバッファー（０．６Ｍ−ＫＣｌ／０．０４Ｍ−ＮａＨＣＯ_３／０．０１Ｍ−Ｎａ_２ＣＯ_３水溶液）に懸濁後、遠心分離を繰り返し、透析チューブにて透析した後に凍結乾燥して得た。

蒸留水１ｍｌに豚骨格筋アクトミオシン凍結乾燥品１ｍｇを加えて懸濁させ、これにプロテアーゼ１０μｇを添加して３７℃にて２４時間反応させた。反応後直ちに１０分間沸騰させてプロテアーゼを失活させた。この反応混合液の一部について、遠心分離（１０，０００×ｇ、１０分間）してその上済み液を限外ろ過〔アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）社製、「ミクロン（Ｍｉｃｒｏｎ）１０」（商品名）、分画分子量＝１０，０００〕して、低分子量（分子量１０，０００以下）部分と高分子量（分子量１０，０００より大きい）部分に分画した。

なお、本実施例では、プロテアーゼとして、パパイン〔東京化成工業（株）製品〕、フィチン〔東京化成工業（株）製品〕、ペプシン〔和光純薬工業（株）製品〕、トリプシン〔和光純薬工業（株）製品〕、α−キモトリプシン〔和光純薬工業（株）製品〕、サーモリシン〔シグマ（Ｓｉｇｍａ）社製品〕、プロナーゼＥ〔メルク（Ｍｅｒｃｋ）社製品〕、ブロメラインＦ〔天野エンザイム（株）製品〕のそれぞれを用いた。

〔細胞培養〕
細胞培養フラスコ〔グライナー（Ｇｒｅｉｎｅｒ）社製品〕を用い、ダルベッコ改変イーグル培地〔シグマ（Ｓｉｇｍａ）社製品〕に、５％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清〔インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社製品〕、１０％（ｖ／ｖ）ウマ血清〔インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社製品〕を添加し、ラット副腎褐色細胞腫由来ＰＣ１２細胞〔独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター、セル番号：ＲＣＢ０００９、セル名称：ＰＣ１２〕を１×１０^５／ｍＬ撒種し、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで培養した。

〔細胞生存能力の測定〕
細胞生存能力の測定には、生細胞中のミトコンドリア脱水酵素のテトラゾリウム塩（ＷＳＴ−１）還元作用を指標とする方法が広く用いられており、本実施例ではこの方法に依って、ＰＣ１２細胞のＷＳＴ−１還元能力を指標とした。βＡは、βＡ_{２５〜３５}〔アメリカンペプタイド社（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｏｍｐａｎｙ）製品〕を用い蒸留水に溶解して使用した。

〔実施例１〕
ＰＣ１２細胞に対するβＡ_{２５〜３５}毒性緩和作用は、ヘオらの方法〔ヘオ（Ｈｅｏ，Ｈ．Ｊ．）他８名著、モレキュラ セル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ）、１０卷、２５３−２６２頁、２０００年〕に基いて、一部を変えた方法により測定した。０．５％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清および１％（ｖ／ｖ）ウマ血清添加ダルベッコ改変イーグル培地を用いて、９６穴プレート〔ベクトンディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）社製品〕に上記の細胞溶液８０μＬを入れ、ＰＣ１２細胞を１×１０^４／穴になるように播種し、５％ＣＯ_２インキュベーター中で培養した。培養２２時間後に各穴に豚骨格筋アクトミオシン分解混合物１０μＬを加え、続いてその２時間後にβＡ_{２５〜３５}の４００μＭ水溶液を１０μｌ（βＡ_{２５〜３５}の最終濃度：４０μＭ）を添加し、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーター中で４８時間培養した。次いで、各穴にミトコンドリア脱水素酵素の基質であるテトラゾリウム塩〔タカラバイオ（株）製、「プレミックス（Ｐｒｅｍｉｘ）ＷＳＴ−１」（商品名）〕１０μＬを加えて、３７℃で４時間反応させた。各穴の反応液について、マイクロプレートリーダー〔バイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）社製、「モデル−５５０」（製品名）〕を用い、波長４１５ｎｍ（対象波長；６５５ｎｍ）での吸光度を測定した。尚、コントロールとしてβＡ_{２５〜３５}を含まない蒸留水を添加した。

図１にβＡ_{２５〜３５}を含まない系（コントロール区）のＰＣ１２細胞生存率を１００として、それぞれのＰＣ１２細胞生存率を示した。βＡ_{２５〜３５}を添加することによりＰＣ１２細胞生存率が低下しており、βＡ_{２５〜３５}がＰＣ１２細胞を死滅させていることがわかる。同時に、アクトミオシン分解物を添加するとβＡ_{２５〜３５}のＰＣ１２細胞死滅作用を緩和して、ＰＣ１２細胞生存率が高くなった。このうち、パパインを用いてのアクトミオシン分解物が特にＰＣ１２細胞生存率が高くなった。

〔実施例２〕
豚骨格筋アクトミオシン分解混合液物を限外ろ過して、分子量１０，０００以下と１０，０００より大きい部分に分画し、βＡ_{２５〜３５}の最終濃度を２０μＭとした以外実施例と同様にしてβＡ_{２５〜３５}のＰＣ１２細胞死滅作用を評価した。結果を図２に示す。
分子量１０，０００以下の成分は、１０，０００より大きい成分よりＰＣ１２細胞生存率が高く、βＡ_{２５〜３５}のＰＣ１２細胞死滅作用が大きく緩和されていることを示している。

アルツハイマー病を予防するための補助食品として、さらにアルツハイマー病の進行を抑える治療薬として有効であり、補助食品、医薬品に配合して実用できる。

βＡ_{２５〜３５}を添加し、アクトミオシン分解物を加えたときのＰＣ１２細胞生存率を比較したグラフである。 βＡ_{２５〜３５}を添加し、アクトミオシン分解物の分子量１０，０００以下の成分と１０，０００より大きい成分について、ＰＣ１２細胞生存率を比較したグラフである。

Claims (3)

1. アクトミオシンを、パパイン及びフィチンから選ばれたプロテアーゼの存在下において酵素分解し、その酵素分解物から分子量１０，０００以下を分画して得られたアクトミオシン分解物を活性成分として含むことを特徴とするβ−アミロイド毒性緩和剤。
2. 前記アクトミオシンは、動物の筋肉からの抽出物であることを特徴とする請求項１に記載のβ−アミロイド毒性緩和剤。
3. 前記動物の筋肉は、豚骨格筋肉であることを特徴とする請求項２に記載のβ−アミロイド毒性緩和剤。

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