JP4594734B2 - Ｃ型肝炎、牛ウイルス性下痢症及び豚コレラウイルスを含むフラビウイルス科ウイルスにより生起される感染症の治療のためのエンドペルオキシド類の使用 - Google Patents

Description

発明の背景
本発明は、概して、フラビウイルス科（Flaviviridae）ウイルスにより生起される感染症の治療におけるセスキテルペンラクトン類の使用、ならびにより詳細には、Ｃ型肝炎、黄熱病、デング熱、牛ウイルス性下痢症及び豚コレラの治療のためのセスキテルペンラクトンエンドペルオキシド類の使用に関する。

慢性Ｃ型肝炎は世界中で１億８千万人（人口の３％）に影響を及ぼす重大な公衆衛生上の問題であり、これには合衆国の４００万人を含み、慢性肝臓病の主要原因である。ＨＣＶ感染症は合衆国において増加し続け、２０１０年までには３倍の人々が感染するであろうと予測されている。Ｃ型肝炎ウイルスによる感染が、深刻な、またある場合には命に関わる慢性肝臓病（肝臓障害及び肝臓癌を含む）を進行させる可能性の増大に導きうる。

慢性肝臓疾患は、合衆国成人の死因の第１０位であり、年間およそ２５，０００人が死亡しており、これは全ての死亡のおよそ１％に相当する。人口を基準とした研究では、慢性肝臓疾患の４０％がＨＣＶ関連であり、これにより８，０００−１０，０００人が死亡していると見積もられることが示されている。ＨＣＶ関連の急性及び慢性肝臓疾患の医療コスト及び労働損失コストの最近の推計は年間６億ドル以上であり、ＨＣＶ−と連関する（associated）末期の肝臓疾患は、成人間肝臓移植の最もよくある兆候（the most frequent indication）である。なぜなら、大半のＨＣＶ感染者は３０〜４０歳であり、ＨＣＶ関連慢性肝臓疾患に寄与しうる死亡数は実質的に次の１０−２０年間、すなわち、感染者の群が、慢性肝臓疾患からの合併症が典型的に起こる年齢に達する間に増加しうるからである。

ＨＣＶは主として、大量のあるいは繰り返しの血液に対する直接経皮的な暴露により伝染する。合衆国ではＨＣＶ伝染に関連する最も一般的な暴露は２つあり、輸血と注射薬の使用である。Ｃ型肝炎の治療は臨床学的方法（practice）としては素早く変化する領域である。インターフェロンとリバビリン、ヌクレオチド類似体の併用療法は慢性Ｃ型肝炎の患者の単純な治療法として認められている。リバビリンとインターフェロンの併用により患者を治療する研究によると、インターフェロン単独の著効率１５％−２５％と比較して著効率の向上は著しく、４０％−５０％に達することが示されている。インターフェロン投与を受けた多くの患者が治療初期にインフルエンザ様の症状を経験しているが、かかる症状は治療の継続により低減する。後の副作用として、疲労、骨髄抑制及び神経精神病学的効果（例えば、無気力、認知変化、興奮性及びうつなど）が挙げられる。深刻な副作用のため、患者の１０％−４０％についてはインターフェロンの投薬量を減じなければならず、また５％−１５％で中断しなければならない。リバビリンは溶血性貧血を生起し、以前から貧血、骨髄抑制または腎不全を有する患者にとって問題となりうる。かかる患者には併用療法は避けるか、貧血を直す試みをすべきであろう。リバビリンにより生起される溶血性貧血は、虚血性心疾患又は脳血管疾患を伴う患者にとっては生命を脅かしうる。リバビリンは催奇性であり、治療中に妊娠の可能性のある女性患者には避けるべきである。コルチコステロイド、ウルソジオール及びチモシンなどの他の治療法は効果的ではない。肝臓中の高い鉄レベルがインターフェロンの効果を低減する。インターフェロンと鉄還元治療法（静脈切開またはキレート化）を併用することが研究されているが、結果は決定的でない（ HYPERLINK "http://www.cdc.gov" www.cdc.gov)。したがってＣ型肝炎の感染の治療に用いる新規な生物活性分子であって、現行で可能な治療法と比較してより少ないあるいはより低下した副作用とよりよい効果を有するものの発見及び開発に対して強い医学的ニーズが存在する。
発明の概要
一般式：

を有するセスキテルペンラクトン類が、フラビウイルス科ウイルス（Flaviviridae）、例えばＣ型肝炎ウイルス、牛ウイルス性下痢症ウイルス及び豚コレラウイルスにより生起される感染症に対し活性を有することが発見されている。当業者には他のセスキテルペンラクトン化合物がフラビウイルス科ウイルスにより生起される感染症の治療に有効であろうことは明らかではあるが、本明細書では代表的な、目下好適なセスキテルペンラクトン類について記載する。またかかる化合物の薬学的に許容可能な塩類も含む。

好適なセスキテルペンラクトン類はセスキテルペンラクトンエンドペルオキシド類であるアルテミシニン、ジヒドロアルテミシニン、アルテスネート（artesunate）及びアルテメーテルである。
好適な態様の詳細な説明
ここに、セスキテルペンラクトン類、及び好適にセスキテルペンラクトンエンドペルオキシド類、例えばアルテミシニン、ジヒドロアルテミシニン、アルテメーテル及びアルテスネート等、特定のフラビウイルス科ウイルス、例えばＣ型肝炎ウイルスに対して抗ウイルス性の物質を記載する。

本発明の好適なセスキテルペン化合物は、以下の式：

（ここで、Ｘ₁及びＸ₂はＯ、Ｓ、Ｓｅ及びＮからなる群から選択され；
ＹはＯ、Ｓ、Ｓｅ及びＮからなる群から選択され；
ＺはＯ、ＮＨ、Ｓ及びＳｅからなる群から選択され；そして
ＱはＣＯ、ＣＨＯＨ、ＣＨＯＣＨ₃、ＣＨＯＣ₂Ｈ₅、ＣＨＯＣ₃Ｈ₇及びＣＨＯＣＯＣＣＨ₂ＣＨ₂ＣＯＯＨからなる群から選択される）
の化合物及びそれらの薬学的に許容される塩を含む。

目下、本発明の特に好適なセスキテルペン化合物は、アルテミシニン（Ｘ₁及びＸ₂がＯであり、ＹがＯであり、ＺがＯであり、ＱがＣ＝Ｏである）；ジヒドロアルテミシニン（ＱがＣＨＯＨであるアルテミシニン）；アルテメーテル（ＱがＣＨＯＣＨ₃であるアルテミシニン）；アルテエーテル（ＱがＣＯＣ₂Ｈ₅であるアルテミシニン）；プロピル生成物（ＱがＣＨＯＣ₃Ｈ₇であるアルテミシニン）；及びアルテスネート（ＱがＣＨＯＣＯＣＨ₂ＣＨ₂ＣＯＯＨであるアルテミシニン）である。目下、本発明の最も好適なセスキテルペン化合物はジヒドロアルテミシニンである。

エンドペルオキシド類はペルオキソ結合（−Ｏ−Ｏ−）を有し、かかる化合物が有する抗マラリア活性に重要であるとされている。ペルオキソ結合を−Ｓ−Ｓ−（ジスルフィド）又は−Ｓｅ−Ｓｅ−（ジセレニド）あるいは−Ｎ−Ｏ−あるいは−ＮＨ−ＮＨ−（ヒドラジン）及びこれらの結合の種々の組合せによって置き換えると、活性を有する新規化合物を作ることもできるだろう。

フラビウイルス科ウイルス（Flaviviridae）は、ヒト及び動物ＲＮＡウイルス性病原体として重要な種である（Rice CM. 1996. Flaviviridae: the viruses and their replication. Fields BN, Knipe DM, Howley PM, eds. Fields virology. Philadelphia: Lippincott-Raven Publishers. Pp 931-960)。現在認識されている３つの属のフラビウイルス科ウイルスは、感染、宿主域及び病因において顕著な相違を示す。古典的なフラビウイルス科ウイルスの一員は、黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス及び牛ウイルス性下痢症（ＢＶＤＶ）及び豚コレラウイルス（ＣＳＦＶ）等のペストウイルスである。最も最近この種の一員として分類されたものは一般にもっぱらヒト病原体であるＣ型肝炎（ＨＣＶ）である。フラビウイルス科ウイルスは（＋）センスＲＮＡゲノム極性を有する単一ストランドＲＮＡウイルスである。（＋）センスＲＮＡを有する他のウイルス種としてピコルナウイルス科ウイルス、トガウイルス科ウイルス、カルシウイルス科ウイルス及びコロナウイルス科ウイルスが挙げられる。

本発明の化合物はその本来の形あるいは塩の形で用いることができる。化合物が充分に塩基性あるいは酸性で安定な無毒の酸性塩又は塩基性塩を形成することができる場合は、化合物を塩の形で投与することが適当である。薬学的に許容可能な塩の例は、生理学的に許容可能なアニオンを形成する酸により形成した有機酸付加塩、例えば酢酸塩アスコルビン酸塩、安息香酸塩、クエン酸塩、エトグルタール酸塩（etoglutarate）、グリセロリン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、コハク酸塩、及び酒石酸塩である。適切な無機塩を形成することもでき、重炭酸塩、炭酸塩、塩酸塩、硝酸塩及び硫酸塩が挙げられる。

本発明の化合物は、適当な賦形剤との組合せにおける化合物を含み、ウイルス性感染症に有効である薬学的組成物として、便利に投与することができる。処方薬が体内又は体外のウイルス性感染症の治療に使用されるかによって、本発明の化合物及び組成物は非経口、局所、膣内、経口又は直腸内に投与することができる。

非経口投与のために活性化合物またはその塩の溶液を水、場合により無毒の界面活性剤と混合して調製することができる。グリセロール、液体ポリエチレングリコール、トリアセチン及びこれらの混合物、及び油中での分散液も調製できる。

化合物の有用な投薬量は、in vitro活性と比較して決定することができる。ヒトに対する有効投与量の推定法は当業者に周知である。
化合物は単位投薬形態により便利に投与することができる：例えば単位投薬形態当たり０．１〜２０００ｍｇ、好適には１００〜１０００ｍｇ、最も好適には１００〜５００ｍｇの活性成分を含む。所望の一回量は、単一の投薬で提供されるか、あるいは適当な間隔をあけて投与される分割投薬、例えば１日当たり２回、３回、４回或いはさらなる副投薬により提供される。副投薬それ自体は、例えば、多数の別個の大まかに間隔をあけた投与にさらに分割することができる。例えば、吸入器からの複合吸引や複数滴の眼への適用などである。

体内感染には、遊離塩基として計算して哺乳動物の体重当たり約１〜３０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１〜１０ｍｇ／ｋｇの投薬量にて経口又は非経口で投与することができる。
化合物及び組成物の正しい投与方法は、治療される個々の患者の必要性、治療のタイプ及びもちろん参加する施術者の判断に必然的に依存するであろう。本発明の化合物は治療の必要な動物に投与することができる。大概の場合、これはヒトであるが家畜類及びペットの治療も特に意図しており、これらも本発明の範囲に入る。
方法及び材料
アルテミシニンはAldrich社より購入した。ワームウッド（ニガヨモギ）（Artemisia absinthum）の粗植物抽出物KE-4、スイートワームウッド（Artemisia annua）の粗植物抽出物KE-5、及びタラゴン（Artemisia dracunculus）の粗植物抽出物KE-6をKemin Industries Inc. （Des Moines, アメリカ合衆国）より入手した。KE-4,5および6のサンプルを調製するためにワームウッド、スイートワームウッド、あるいはタラゴンの乾燥粉砕物２ｇをヘキサン２００ｍＬと室温で８時間撹拌した。その後懸濁物をＧ３ガラスフィルターで濾過し、減圧下エバポレートした。残った暗褐色の残渣を生物学的スクリーニングに使用した。アルテメーテル、ジヒドロアルテミシニン及びアルテスネートはDafra Pharma.より購入した。これらの化合物を種々の病原性ウイルス、例えばヒト免疫不全ウイルス（HIV）、単純ヘルペスウイルス（HSV）、ワクシニアウイルス（VV）、水疱瘡ウイルス（VZV）及びヒトサイトメガロウイルス（CMV）についてスクリーニングした。CMV以外の全てのウイルスのＥＣ₅₀（ヒトＣＥＭ細胞培養中でHIV-誘発細胞変性性を５０％阻害するのに要求される有効化合物濃度、ヒト胚線維芽細胞Ｅ₆ＳＭ細胞培養中でHSV-及びVV-誘発細胞変性性を５０％阻害するのに要求される有効化合物濃度、及びヒト胎児肺（HEL）細胞培養中でVZV-誘発プラーク形成を５０％阻害するのに要求される有効化合物濃度）を測定した。抗ウイルス性の測定は、９６穴マイクロプレートで成長させたCMV、ヒト胎児肺線維芽細胞（HEL）を２０ＰＦＵウイルス／穴で感染させたものに対するＩＣ₅₀で表した。

３７℃で２時間インキュベートした後、感染細胞を試験化合物の希釈液１回分を含む媒体０．１ｍＬで満たした。７日目にGiemsa溶液で細胞を撹拌した後、顕微鏡観察によりプラークの数を数えた。最少抗ウイルス濃度は、ウイルス誘発プラークの形成を５０％阻害するのに要求される投薬量として表した。

化合物をフラビウイルス科ウイルスでもスクリーニングした。HCVに対するスクリーンのための適当なin vitro分析がないため、Ｃ型肝炎ウイルスと多くの類似性を有する牛ウイルス性下痢症（BVDV）に対するスクリーンをすることとした（Frolov I, McBride S and Rice CM. Cis-acting RNA elements required for replication of bovine. Viral diarrhea virus-hepatitis C 5' non-translated region chimeras. RNA 4, 1418-1435 (1998)）。さらにBVDVの異なる株に対するアルテメーテルのスクリーニングを行った。

これら化合物は、さらにマウス白血病細胞（L1210/0）、マウス乳ガン細胞（FM3A）、及びヒトＴ−リンパ球細胞（Molt4/C8,CEM/0）の増殖を通じて抗腫瘍活性をチェックした。CMV及びVZVに対して観察された最高の抗ウイルス活性はKE6からであった。それほどではないにせよ、アルテミシニンはHSV-2及びVVに対して抗ウイルス活性を示した。
結果と考察
第１スクリーニング（表１）では、アルテミシニン及び粗アルテミシア（Artemisia）抽出物（KE-4, KE-5及びKE-6）の抗ウイルス活性をHIV-1, HIV-2, HSV-1, HSV-2, VV, CMV及びVZVに対してチェックした。

牛腎臓細胞（MDBK）中のウイルス性下痢症（BVDV、Pe515株）に対する抗ウイルス活性をチェックするために第２のスクリーニング（表２）を行った。

抗ウイルス活性はMDBK細胞中のBVDBのPe515株を用いて評価した。いずれの実験も、抗ウイルス活性及び細胞毒性はMTS法にしたがって測定した。ＥＣ₅₀は、誘発された細胞変性性を５０％低減させるのに要求される濃度のことである。MTC（最少毒性濃度）は、細胞代謝作用において≧２０％の減少を引き起こす濃度と定義されている。

MDBKをアルテメーテル、アルテミシニン、KE4及びKE5で処理したときに、MTCが最高濃度（１００μｇ／ｍＬ）に達した。この試験ではBVDV（フラビウイルス科ウイルス）に対するエンドペルオキササイド（アルテミシニン、ジヒドロアルテミシニン、アルテメーテル、及びアルテンスネート）の強い活性が、細胞毒性が低いにも関わらず観測された。したがってかかる生成物はフラビウイルス科ウイルスにより生起される感染症の治療の可能性として位置づけられる。

アルテメーテルは、BDV（ボーダー病ウイルス）と同様、異なるBVDV株に対してスクリーニングした（表３）。

特にBVDVIcp、すなわちHCVに最も似ているBVDV株に対して、アルテメーテルの効果が明確に見て取れる。この生成物はＥＣ₅₀＝０．１６μｇ／ｍＬであった。この実験での毒性濃度はだいたい１００μｇ／ｍＬであるとわかった。さらにBDVに対して効果が観測された（ＥＣ９０＝０．８μｇ／ｍＬ）。

アルテミシニンと粗アルテミシア抽出物（KE-4, KE-5及びKE-6）は腫瘍細胞のラインL1210/0、Molt4/C8、及びCEM/0に対してスクリーニングされたが興味深い活性は見いだせなかった。
結論
DNAウイルス及びレトロウイルスに対する最初のスクリーニングでは、我々は顕著な抗ウイルス活性に気付くことができなかった。BVDV（RNAウイルス）に対する二番目のスクリーニングで、我々は、アルテミシニン、アルテスネート、アルテメーテル及びジヒドロアルテミシニンの強い抗ウイルス活性を明確に示した。かかる生成物は全てエンドペルオキシド類であり、試験した粗アルテミシア抽出物よりもBVDVに対して顕著なより良好な活性を示した。BVDV及びHCVは多くの類似性を有しているので、アルテミシニン、アルテメーテル、アルテスネート、ジヒドロアルテミシニン及びおそらく他のペルオキシド類もHCVに対して強い、選択的な抗ウイルス活性を有しているだろう。

本発明を好適な態様に鑑み説明したが、これに限定されるものと理解してはならず、特許請求の範囲に規定される本発明の意図する全範囲内において変更及び修正を行うことができる。

図１はアルテミシニン、ジヒドロアルテミシニン、アルテメーテル及びアルテスネートの化学構造を表す。

Claims (10)

1. フラビウイルス科ウイルス（Flaviviridae sp.）により生起される感染症の治療のための薬学的組成物であって、以下の式：
   

   

   （ここで、Ｘ_１及びＸ_２はＯであり；
   ＹはＯであり；
   ＺはＯであり；そして
   ＱはＣＯ、ＣＨＯＨ、ＣＨＯＣＨ_３、ＣＨＯＣ_２Ｈ_５、ＣＨＯＣ_３Ｈ_７及びＣＨＯＣＯＣＣＨ_２ＣＨ_２ＣＯＯＨからなる群から選択される）
   を有するセスキテルペン及びこれらの薬学的に許容可能な塩を有効量含む、前記組成物。
2. セスキテルペンがアルテミシニンおよびアルテミシニンの類似化合物からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
3. 感染症がＣ型肝炎である、請求項１又は２に記載の組成物。
4. 感染症が牛ウイルス性下痢症又は豚コレラである、請求項１又は２に記載の組成物。
5. フラビウイルス科ウイルスにより生起される感染症の治療のための請求項１記載の薬学的組成物であって、インターフェロン又はペグインターフェロンとの組合せにより有効量のエンドペルオキシドを含む、前記組成物。
6. エンドペルオキシドがアルテミシニン及びアルテミシニンの類似化合物からなる群から選択される、請求項５に記載の組成物。
7. 感染症がＣ型肝炎である、請求項５に記載の組成物。
8. （＋）センスＲＮＡウイルスにより生起される感染症の治療のための薬学的組成物であって、以下の式：
   

   

   （ここで、Ｘ _１ 及びＸ _２ はＯであり；
   ＹはＯであり；
   ＺはＯであり；そして
   ＱはＣＯ、ＣＨＯＨ、ＣＨＯＣＨ _３ 、ＣＨＯＣ _２ Ｈ _５ 、ＣＨＯＣ _３ Ｈ _７ 及びＣＨＯＣＯＣＣＨ _２ ＣＨ _２ ＣＯＯＨからなる群から選択される）
   を有するセスキテルペン及びこれらの薬学的に許容可能な塩を有効量含む、前記組成物。
9. エンドペルオキシドがアルテミシニン及びアルテミシニンの類似化合物からなる群から選択される、請求項８に記載の組成物。
10. （＋）センスＲＮＡウイルスにより生起される感染症の治療のための請求項８記載の薬学的組成物であって、インターフェロン又はペグインターフェロンとの組合せにより有効量のエンドペルオキシドを含む、前記組成物。

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