ES2245248B1 - Uso de la artemisinina y sus derivados en la fabricacion de medicamentos utiles como agentes antiviricos. - Google Patents
Uso de la artemisinina y sus derivados en la fabricacion de medicamentos utiles como agentes antiviricos. Download PDFInfo
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Abstract
Uso de la artemisinina y sus derivados en la fabricación de medicamentos útiles como agentes antivíricos. La invención muestra en sendos modelos de cultivos celulares in vitro, el efecto antivírico de la artemisinina, un compuesto obtenido de fuentes naturales y presente en preparados a base de plantas de la medicina tradicional china (MTC), así como de sus derivados, frente a los virus causantes de la hepatitis B (HBV), de la hepatitis C (HCV) así como frente al virus causante de la diarrea vírica bovina (BVDV). Los experimentos llevados a cabo demuestran el interés farmacológico de este principio activo en base al mencionado efecto antivírico, pero también, en base a su nula toxicidad para las células hospedadoras del virus y a su aceptable solubilidad.
Description
Uso de la artemisinina y sus derivados en la
fabricación de medicamentos útiles como agentes antivíricos.
La invención se adscribe al sector técnico de la
farmacia, en concreto, al tratamiento de enfermedades de origen
vírico, como son, en humanos, la hepatitis C y la hepatitis B y la
diarrea vírica bovina en medicina veterinaria, mediante fármacos de
origen natural, en concreto de plantas de uso en la medicina
tradicional china (MTC), como es el caso de la artemisinina y sus
derivados.
Gran parte de las infecciones víricas que
afectan al hombre o a los animales son un importante problema
sanitario a nivel mundial. En el caso de hepatitis B en humanos,
por ejemplo, existe una vacuna segura y eficaz frente al
hepadnavirus causante, el HBV, pero la infección sigue suponiendo
un serio problema, que afecta a 300 millones de personas en todo el
mundo, porque todavía no se ha desarrollado por completo ninguna
terapia antivírica efectiva para tratar a los pacientes infectados
por el virus.
En lo que se refiere a la hepatitis C, también
en humanos, la Organización Mundial de la Salud (OMS) ha estimado
que aproximadamente 3% de la población mundial ha sido infectada por
el agente que la causa, el HCV. Este hecho, unido en parte a la
ausencia de una vacuna eficaz contra el flavivirus causante y a la
severidad de la enfermedad hepática originada por el patógeno
humano, convierte al HCV en una de las causas principales de
enfermedades en el mundo. Además, el estudio de la biología del HCV
así como el análisis sistemático de nuevos fármacos
anti-HCV se ha visto obstaculizado hasta ahora por
la carencia de un sistema eficaz de cultivo celular en el que
propagar el virus. Por todo ello, existe una necesidad de encontrar
fármacos con efectos antivíricos útiles para luchar contra los
agentes causantes de estas dos infecciones hepáticas, la hepatitis
B y la hepatitis C.
Igualmente ocurre con la diarrea vírica bovina,
causada por un virus de la misma familia (Flaviviridae) que
el HCV de los humanos, que produce una enfermedad que causa enormes
pérdidas en las cabañas de ganado vacuno, que están obligando a los
diferentes países que sufren periódicamente estas epidemias en su
ganado, a poner en marcha costosos programas de erradicación de la
enfermedad.
La búsqueda de nuevos fármacos para la medicina
occidental llevó, hace ya varias décadas, a intentar hallarlos
entre los remedios utilizados en la medicina tradicional china
(MTC). La vasta experiencia de la MTC acumulada a lo largo de
milenios ha seleccionado varios métodos curativos, que incluyen
terapias basadas en el uso de plantas. Se han registrado
aproximadamente 100.000 tratamientos con múltiples especies
vegetales, pero la mayor parte de ellos están basados en mezclas de
varias de ellas, lo que hace muy difícil la identificación de las
sustancias activas responsables en realidad del efecto curativo. Aún
así, se ha realizado un esfuerzo importante por identificar nuevos
fármacos y aplicaciones a partir de productos naturales
potencialmente útiles empleados habitualmente en la MTC, con vistas
a desarrollar tratamientos normalizados para diferentes
enfermedades humanas (Seeff et al., 2001; Chang 1997; Chang
1998; Efferth et al., 2003a). Algunos de ellos tienen ya
usos terapéuticos conocidos en la medicina occidental. Es el caso
de la artemisinina.
La artemisinina es una sustancia que se extrae
de Artemisia annua, planta que ha sido utilizada durante
milenos en la MTC como remedio contra los resfriados y la fiebre, y
que es conocida en la medicina occidental por sus propiedades
antimalaria (Nosten y Price, 1995; Meshnick, 2002). Un derivado de
la artemisinina es el artesunato, para el que se ha descrito un
efecto virostático frente al citomegalovirus (Efferth et
al., 2002a) y citostático frente a células cancerosas (Efferth
et al., 2001; Efferth et al., 2002b; Efferth et
al., 2002c; Efferth et al., 2003b). El tratamiento
farmacológico frente a distintos virus presenta una amplia gama de
especificidades y solapamientos. Sorprendentemente, el hecho de que
un compuesto sea efectivo contra un virus no determina en absoluto
su eficacia frente a otro tipo de virus. De no ser así, el SIDA o
la hepatitis vírica podrían combatirse eficazmente con agentes
contra otros virus como el de la gripe. Por el contrario, tampoco
es extraño que virus muy diferentes como el HBV y el HCV presenten
sensibilidad cruzada a ciertos compuestos como la artemisinina,
aunque no para otros como los que actualmente se usan en clínica.
(De Clercq E. : 2004).
Sorprendentemente, se ha encontrado ahora que la
artemisinina y sus derivados presentan también propiedades
antíviricas frente a otros virus distintos a los citomegalovirus,
en concreto frente a virus de las familias de hepadnavirus y
flavivirus. La presente invención pone de manifiesto este efecto
antivírico en experimentos in vitro, entre otros, con células
hepáticas humanas. Concretamente, en el caso de la hepatitis B, se
emplearon células HepG2 2.2.15, una línea celular derivada de
células de hepatoblastoma humano (HepG2) infectadas de forma
estable por el HBV (Sells et al., 1987), como modelo in
vitro para evaluar la capacidad antivírica de la artemisinina y
de uno de sus derivados, el artesunato aumentando así su
hidrosolubilidad, manifestando ambos compuestos capacidad
antivírica, mientras que su toxicidad sobre las células
hospedadoras sólo aparece a concentraciones muy superiores a las que
llevan a cabo su efecto antivírico, junto con una aceptable
solubilidad en los medios utilizados. En cuanto a la hepatitis C,
las pruebas realizadas con la artemisinina demostraron un aumento
de la viabilidad (protección frente al efecto citotóxico vírico) de
células previamente infectadas con el virus de la diarrea vírica
bovina (BVDV, el modelo in vitro aceptado para realizar
estudios sobre el HCV), apoyando la idea de una posible futura
utilización de este compuesto en la terapia contra el HCV.
La presente invención pone de manifiesto el
efecto antivírico en experimentos in vitro, que incluyen
células hepáticas humanas, de uno de los integrantes de las
composiciones de plantas de la MTC, la artemisinina y de sus
derivados. El efecto virostático frente a HBV, HCV y BVDV, se
presenta a dosis a las que no existe toxicidad para las células
hospedadoras y para las que los compuestos tienen buena
hidrosolubilidad, en contraposición con la ausencia de dicho efecto
antivírico y/o presencia de toxicidad para las células hospedadoras
y/o mala solubilidad, presente en otros componentes de plantas
también utilizadas en la MTC.
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Los compuestos de la invención, artemisinina y
sus derivados, responden a la fórmula general (I)
Fórmula
I
en la que R puede representar: un
grupo cetónico (artemisinina), un grupo hidroxilo
(dihidroartemisinina), un grupo amino, hidroxiamino o amido, un
radical alquilo o hidroxialquilo, un grupo éster, particularmente un
éster del ácido butanodioico (artesunato); un grupo éter,
particularmente el éter metílico (artemeter), un halógeno, un
derivado de un ácido biliar unido directamente o mediante un
espaciador con objeto de modificar sus propiedades fisicoquímicas o
de aumentar la vectorización hepática del fármaco. Como tales
derivados se entienden los diferentes compuestos de la misma
familia, compartiendo todos ellos el puente de endoperóxido
O-C-O-C presente en
los heterociclos condensados, resultantes de las diferentes
posibilidades de sustitución que ofrece el grupo R. La artemisinina
reacciona con el hierro libre de las células infectadas por el
virus, y el puente endoperóxido se rompe, dando lugar a radicales
libres que causan una rápida y extensiva muerte
celular.
En la presente invención se han empleado células
HepG2 2.2.15 para probar experimentalmente el efecto antivírico de
la artemisinina y sus derivados, frente al virus de la hepatitis B.
Esta línea celular infectada por el HBV de forma estable se obtuvo
a partir de células HepG2 de hepatoblastoma humano (Sells et
al., 1987), y ha sido un modelo útil "in vitro" para
la evaluación de nuevos fármacos anti-HBV, así como
para investigar varias etapas de la biología del HBV (Schalm et
al. 1995). Las células HepG2 2.2.15 producen y secretan
viriones maduros del HBV, cuya cantidad se puede determinar por la
abundancia de DNA vírico o proteínas víricas inmunoreactivas (Sells
et al. 1987). En condiciones normales de cultivo, en los
cultivos de HepG2 2.2.15 están presentes varias formas de
HBV-DNA (Doong et al. 1991; Sells et
al. 1987). El perfil de ácidos nucleicos es esencialmente el
mismo que se encuentra en el tejido hepático de individuos
infectados por el HBV (Sells et al. 1988). Estas formas son:
doble hebra parcial (pdsDNA), circular covalentemente cerrado
(cccDNA), circular relajado (rcDNA), integrado en el genoma de la
célula hospedadora (iDNA), monocatenario (ssDNA) y fragmentado
(fDNA). Además, se ha demostrado que la cantidad de DNA vírico
extracelular varía proporcionalmente a los cambios en el nivel de
DNA vírico intracelular (Sells et al. 1988).
Se ha llevado a cabo una evaluación in
vitro del efecto anti-HBV de 20 compuestos
extraídos y altamente purificados de los remedios de la MTC.
Utilizando células HepG2 2.2.15, se determinó la producción de HBV
después de 21 días de cultivo con estos compuestos (0,01 a 100
\muM) midiendo la liberación de proteína de superficie (HBsAg)
mediante ELISA y de HBV-DNA mediante PCR
cuantitativa en tiempo real. La variedad de formas de DNA vírico
liberadas se estudió mediante análisis con transferencia tipo
Southern. La toxicidad frente a las células hospedadoras se evaluó
con el ensayo de retención de rojo neutro. Basándose en los
resultados obtenidos, los compuestos con interés farmacológico
ensayados se seleccionaron de acuerdo con los siguientes
criterios:
- i)
- inducen una inhibición pronunciada de la liberación de HBsAg y/o DNA vírico
- ii)
- a concentraciones a las que la viabilidad de las células hospedadoras no se veía afectada
- iii)
- y presentando una solubilidad aceptable (moderada-alta) en los medios de cultivo ensayados
La combinación de estos 3 criterios pone de
manifiesto el papel como antivírico de la artemisinina y sus
derivados, contra la infección por el HBV. Resulta sorprendente
dicho efecto antivírico ya que otro amplio número de componentes de
los preparados de la MTC, no presentaron dicho efecto de acuerdo a
los 3 criterios de selección expuestos.
A continuación se realizó una evaluación de la
artemisinina como agente protector en un modelo "in
vitro" de la infección de la hepatitis C. Ésta se llevo a
cabo infectando una línea de células epiteliales bovinas derivadas
de tráquea embrionaria (EBTr) con una cepa citopática (Oregon C24V,
genotipo I, subgenotipo b) del virus de la diarrea bovina (BVDV),
que, como el HCV, pertenece a la familia Flaviviridae
(Behrens et al., 1998).
La capacidad protectora frente al BVDV se evaluó
por medida de la viabilidad de la célula hospedadora mediante un
ensayo con sales de tetrazolio (MTT). Las células se expusieron a
un intervalo de diluciones de BVDV durante 18, 24 o 48 horas. El
medio se reemplazó por uno recién preparado libre de virus y las
células se cultivaron durante tiempos diferentes (72 o 96 horas)
para establecer la combinación deseada de dilución de BVDV para la
infección, tiempo de exposición y tiempo de incubación, con el fin
de obtener el efecto citolítico deseado (\approx40%), que permite
un ensayo adicional de protección de las células hospedadoras por
ribavirina (como control positivo) o artemisinina. Estos fármacos
se añadieron a células no infectadas e infectadas junto con el
medio de incubación. La ribavirina es un componente común de la
quimioterapia contra la infección por el HCV. Este fármaco no
indujo ningún efecto tóxico en las células no infectadas hasta 100
\muM, mientras que las células infectadas tratadas con ribavirina
mostraron un incremento significativo en la viabilidad (hasta
\approx30%) al compararlas con células infectadas no tratadas. De
forma similar, dentro del intervalo de concentraciones ensayado, la
artemisinina no mostró ninguna toxicidad en células no infectadas y
también fue capaz de proteger a las células infectadas de la
actividad citolítica del BDVD. A concentraciones bajas el efecto
protector fue más marcado para la artemisinina de lo que lo fue
para la ribavirina.
Los excipientes presentes en los medicamentos
antivíricos a base de artemisinina y/o alguno de sus derivados, así
como sus rangos de concentración, o el de los principios activos
presentes en los mismos, son bien conocidos en el estado de la
técnica, toda vez que la artemisinina y sus derivados han sido ya
usados en la fabricación de medicamentos para el tratamiento de la
malaria. Así la artemisinina y sus derivados pueden presentarse en
formulaciones hidrosolubles, particularmente en forma de
artemisinina, artesunato o dihidroartemisinina, pero también
presentan solubilidad en formulaciones liposolubles en aceite, como
sería el caso del artemeter. Ello permite obtener presentaciones de
artemisinina o sus derivados tanto para ingesta oral (sólida o
líquida), como inyectables, supositorios, etc. La dosis efectiva de
artemisinina o sus derivados con efectos antivíricos en humanos,
sin que se presente toxicidad, puede oscilar entre los
3-300 mg/Kg de masa corporal, para una dosis
terapéutica que oscila entre 200-1000 mg/día,
divididas en varias tomas, con un límite de concentración, para
ingesta por vía oral, < 0.4 \mug/ml.
Una realización también preferida de la
invención es la fabricación de medicamentos antivíricos a base de
artemisinina o sus derivados, combinados entre ellos o con otro
agente antivírico, particularmente con derivados de nucleósidos,
como lamivudina, ribavirina, adefovir dipivoxil o emtricitabina.
Otra realización preferida de la invención es el
uso de la artemisinina y sus derivados en el que el medicamento
fabricado se emplea también en el tratamiento de las patologías
asociadas a las hepatitis víricas, particularmente en el
tratamiento de la cirrosis, hepatocarcinoma y otras hepatopatías
asociadas.
Se sembraron células HepG2 2.2.15 en frascos
Roux con medio de cultivo DMEM suplementado con FCS al 10%,
L-glutamina 4 mM, NaHCO_{3} 26,2 mM, HEPES 25 mM,
20 mg/1 de gentamicina y 200 mg/100 ml de ciprofloxacino. Después
del primer pase, se reemplazó el ciprofloxacino por 150 mg/ml de
geneticina (G418). Las células se utilizaron al tercer pase cuando
se sembraron 3,5 x 10^{5} células en placas de plástico (3,5 cm
de diámetro), y se mantuvieron durante tres días antes de cualquier
tratamiento, para que alcanzaran condiciones aproximadas a las de
confluencia. Durante el período experimental (21 días) se reemplazó
el medio de cultivo por uno de reciente preparación, con o sin
(condiciones control) diferentes concentraciones de compuestos de la
MTC, cada 3 días. Para añadir los fármacos de la MTC se disolvieron
primero en DMSO y luego se diluyeron con medio de cultivo hasta
alcanzar una concentración final del fármaco igual a la más elevada
del intervalo deseado y \leq0,2% de DMSO (vol/vol). De esta
solución se prepararon diluciones seriadas con el fin de llevar a
cabo estudios de dosis-respuesta.
La moderada solubilidad en agua de algunos
compuestos (Tabla 1) da cuenta del hecho de que su solución inicial
en DMSO fue en la mayor parte de los casos clara pero se volvió
ligeramente turbia cuando se añadió medio de cultivo para preparar
una solución de partida altamente concentrada de
5-25 mM. En la mayor parte de los casos (fármacos
clasificados en la Tabla 1 como de solubilidad moderada en el medio
de cultivo), la adición de medio de cultivo para alcanzar la
concentración final de la solución concentrada
(200-600 \muM) dio como resultado una
solubilización aparentemente completa del compuesto. Si se observó
turbidez en la solución concentrada, los compuestos se clasificaron
como de baja solubilidad en el medio de cultivo. Esto implica que
los estudios de dosis-respuesta dieron como
resultado una subestimación parcial de los resultados porque la
concentración real de fármaco era menor que la nominal. Los
fármacos considerados como de alto interés farmacológico se
clasificaron como de solubilidad alta o moderada en el medio de
cultivo a 37ºC.
- \bullet
- Los datos se obtuvieron en, al menos, tres cultivos diferentes en los que cada condición se ensayó por triplicado. Los valores se dan como medias\pmSD. Para calcular la significación estadística de las diferencias dentro de o entre grupos, se utilizaron, según fuera apropiado, el ensayo t para valores apareados o el método de Bonferroni para el análisis de comparaciones múltiples.
La toxicidad celular inducida por los fármacos
se evaluó midiendo la cantidad de células vivas en el cultivo en el
día 21 de la exposición al fármaco utilizando el ensayo del rojo
neutro (RN) (Fautz et al. 1991), que está basado en la
capacidad de los lisosomas y el aparato de Golgi de las células
vivas para absorber este colorante. Para llevar a cabo este ensayo,
después de la separación del sobrenadante de las células y un doble
lavado de las células con solución salina estéril tamponada con
fosfato (PBS) a 37ºC, se añadió 1 ml de RN a 50 \mug/ml en PBS.
Los cultivos se incubaron a 37ºC en una atmósfera de CO_{2}
5%-aire 95% durante 90 minutos. Después de lavar las células de
nuevo dos veces con PBS, se eluyó el RN con una solución acuosa que
contenía etanol al 50% más ácido acético al 1% durante 10 minutos a
temperatura ambiente, y se determinó la cantidad de colorante
absorbido por las células midiendo la absorbancia a 540 nm. Después
de 21 días de tratamiento con diferentes cantidades de derivados de
la MTC, la viabilidad de las células HepG2 2.2.15 se vio afectada
de manera diferente según el compuesto estudiado. Para la
artemisinina no se encontró una reducción en este parámetro hasta
concentraciones superiores a 100 \muM (Figura 1). El artesunato,
la berberina y el ácido tánico indujeron toxicidad en las células
hospedadoras a \geq10 \muM, mientras que la citotoxicidad
inducida por la curcumina se encontró a 100 \muM (Tabla 1). Para
el resto de los compuestos no se encontró ninguna toxicidad en el
intervalo de concentraciones utilizado en este estudio.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
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Toxicidad en las células
hospedadoras, efecto antivírico frente a HBV e interés farmacológico
de los derivados de la MTC
ensayados
Se utilizó ELISA en fase sólida, utilizando el
"Sistema 3 del ensayo ELISA del Anticuerpo ORTHO frente al
HBsAg" (Ortho-Clinical Diagnostics, Madrid,
España) para cuantificar las cantidades de proteína de la envuelta
del HBV, antígeno de superficie (HBsAg), liberada de las células
infectadas al medio de cultivo. Los resultados se normalizaron
mediante los valores encontrados en las células sin tratar del
mismo cultivo, que se consideraron como 100%.
Se debería señalar que la medida del HBsAg
secretado por las células HepG2 2.2.15 del día 18 al día 21 de
exposición a compuestos de la MTC no fue una estimación precisa de
la abundancia de partículas víricas completas porque no todas las
proteínas inmunorreactivas presentes en el medio formaban parte de
viriones completos – es decir, no todas ellas se pueden incluir en
"partículas de Dane"-. En realidad, algunas de ellas se pueden
liberar al medio o pueden formar parte de partículas víricas libres
de genoma (Pugh y Bassendine 1990). Por ello, un incremento en el
HBsAg no implica necesariamente un incremento en la producción de
viriones. En contraste, una reducción marcada en la producción de
HBsAg estaría asociada con más probabilidad con una liberación de
viriones disminuida. Varios de los compuestos de la MTC ensayados
inhibieron la secreción de HBsAg (Tabla 1). Así, el artesunato fue
el inhibidor más fuerte, con CI50 <10 \muM, que el resto de
los compuestos (p<0,05). La berberina y el ácido tánico también
fueron inhibidores buenos, pero menos potentes, con CI50 entre 10 y
20 \muM (p<0,05 frente a compuestos con actividad menor),
mientras que la artemisinina y la curcumina tuvieron valores de
CI50 entre 50 y 100 \muM (p<0,05 frente a compuestos con
actividad menor). Los otros compuestos fueron inhibidores muy
pobres o su capacidad no se observó en absoluto en el intervalo de
concentraciones utilizado.
Para determinar la abundancia del
HBV-DNA en el medio de las células tratadas, se
utilizó PCR cuantitativa en tiempo real (Q-PCR). Se
recogió el sobrenadante de células HepG2 2.2.15 del cultivo y se
extrajo el DNA utilizando una adaptación del método de la digestión
alcalina (Kaneko et al. 1989), tal como se ha comunicado
previamente (Romero et al. 2002). La solución se neutralizó
con HCl 0,12 N y se diluyó, según fuera apropiado, antes de
utilizarla para la Q-PCR. Las secuencias de los
oligonucleótidos cebadores de la síntesis en ambos sentidos de la
doble cadena de DNA y de la sonda flourógena Tagman® han sido
publicadas previamente (Romero et al. 2002). En el análisis
del DNA-HBV no se confirmó ninguna interferencia de
los compuestos con la Q-PCR tal como se ha descrito
anteriormente (datos no mostrados). Las curvas patrón necesarias
para calcular la cantidad de copias de DNA en cada muestra se
obtuvieron utilizando una sonda del HBV de 904 pb con 100% de
similitud con el DNA del subtipo ayw del HBV, tal como se ha
descrito previamente (Romero et al., 2002). Esta sonda se
utilizó también para llevar a cabo análisis con transferencia tipo
Southern de la liberación del HBV-DNA, tal como se
ha informado previamente (Romero et al., 2002). Brevemente,
se aisló DNA vírico por precipitación con polietilenglicol, se
purificó mediante el tratamiento con proteinasa K, y se
desproteinizó mediante la extracción con fenol/cloroformo (Acs
et al. 1987). Alícuotas de DNA correspondientes a diferentes
condiciones experimentales se sometieron a electroforesis en gel de
agarosa al 1,5% y se transfirieron a continuación a una membrana de
nylon cargada positivamente (Biodine B plus, Pall Gelman, Madrid,
España) para llevar a cabo la hibridación con la sonda de DNA del
HBV de 904 pb marcada con ^{32}P-dCTP.
La determinación de la cantidad de
HBV-DNA liberado al medio de cultivo de HepG2
2.2.15 durante diferentes tratamientos comparada con la encontrada
en las condiciones control reveló varios patrones de respuesta. En
algunos casos (artesunato y berberina), ocurrió una reducción en
este parámetro, acompañada por una disminución de la liberación de
HBsAg (Tabla 1). En el caso de la baicaleína, el ácido
glicirricínico y la puerarina, se observó una inhibición moderada
de la liberación HBV-DNA en presencia de un efecto
débil o nulo sobre la secreción de HBsAg (Tabla 1). En las células
tratadas con artemisinina, ácido tánico o curcumina, la abundancia
de HBV-DNA en el medio se incrementó a pesar de la
reducción de la cantidad de HBsAg (Tabla 1). En los otros
compuestos, que no tuvieron ningún efecto sobre la liberación de
HBsAg, la cantidad de HBV-DNA en el medio no se
alteró sustancialmente (daidzina y nardosinón) o se incrementó en
un grado de moderado (baicalina, disulfuro de dialilo, daidzeína,
isonardosinón, nardofurano y quercetina) a alto (bufalina y
tetrahidronardosinón).
El análisis con transferencia tipo Southern
indicó que la mayoría del HBV-DNA presente en el
medio de las células HepG2 2.2.15 en las condiciones control (datos
no mostrados) estaba principalmente en forma de rcDNA, ssDNA y
pdsDNA, tal como ha sido previamente descrito por otros (Sells
et al. 1998) y confirmado por nosotros (Romero et
al., 2002). Sin embargo, también se vieron otras formas. Éstas
fueron: cccDNA e iDNA, liberados probablemente de células muertas
despegadas, y formas de bajo peso molecular, que probablemente
correspondían a copias incompletas del genoma de diferentes tamaños
y/o nucleosomas fragmentados que contenían parte del genoma del
HBV-DNA (fDNA). Todas estas formas de
HBV-DNA también se observaron en células tratadas
durante 21 días con artimisinina (inserto de la Figura 1). El
patrón de bandas era similar en la mayor parte de los casos,
exceptuando algunos de los compuestos capaces de intensificar la
liberación de HBV-DNA, en los cuales el análisis con
transferencia tipo Southern indicó que la mayor abundancia de
HBV-DNA no se veía justificada por un incremento en
la proporción de partículas completas que contenían pdsDNA, sino
más bien por un incremento en la liberación de rcDNA.
Se sembró una línea de células epiteliales
bovinas de tráquea embrionaria (EBTr) en frascos Roux con MEM
GLUTAMAX suplementado con FCS al 10%, 50 mg/l de gentamicina y una
mezcla antiobiótica/antimicótica para cultivos celulares
(Sigma-A7292). Las células se incubaron a 37ºC, en
una atmósfera de CO_{2} 5%: aire 95% con aproximadamente 80% de
humedad hasta que se alcanzó la confluencia después de tres a siete
días de cultivo. Una vez que las células se despegaron mediante un
tratamiento suave con tripsina, se contaron en una cámara Thoma y
luego se sembraron en placas de 96 pocillos (15 x 10^{3}
células/pocillo; 50 \mul/pocillo). Se dejó que las células se
adhirieran a los pocillos durante 2 horas antes de añadir 50 \mul
de medio de cultivo con la dilución deseada de virus de la diarrea
bovina (BVDV; cepa citopática Oregon C24V, genotipo I, subgenotipo
b). El medio que contenía BVDV se separó después de 18, 24 ó 48
horas del período de infección.
Los datos se obtuvieron en tres o cuatro
cultivos celulares en los que cada condición se ensayó en 8
pocillos diferentes. Los valores se dan como medias\pmSD. Para
calcular la significación estadística de las diferencias dentro de
o entre grupos, se utilizaron, según fuera apropiado, el ensayo t
para valores apareados o el método de Bonferroni para el análisis
de comparaciones múltiples.
La infección de células EBTr con la cepa
seleccionada de BVDV se ha utilizado como un modelo "in
vitro" aceptado para realizar el ensayo sistemático
colectivo de fármacos anti-HCV. Sin embargo, una
exposición continua a la presencia de cantidades muy elevadas de
BVDV en el medio de cultivo podría no reflejar la situación real en
la mayor parte de los casos de hepatitis C crónica e inducir un
efecto citolítico demasiado fuerte. Como tal, la producción de virus
se añade a la exposición impuesta y el efecto final es menos
reproducible. Por ello, se ha modificado el modelo simulando un
período de infección que iba seguido por un tiempo de incubación en
el que las células infectadas mostraban el efecto citopático del
BVDV. Se ensayaron varias combinaciones de duración tanto de la
infección con diferentes diluciones de una solución concentrada de
viriones, como del período de incubación una vez retirado el medio
con viriones. Intentamos obtener una reducción reproducible de la
viabilidad celular de -40% para asegurar una población celular
remanente suficientemente sana como para poder recuperarse de la
infección pero con una reducción de la viabilidad celular
suficientemente fuerte como para permitir la observación de
cualquier efecto protector inducido por el fármaco. Nuestros
resultados indicaron que un tiempo de infección de 48 horas seguido
de un tiempo de incubación de 72 horas era la mejor combinación
(Figura 2). Esto permitió calcular la dilución exacta de la
solución concentrada de partículas víricas para lograr una
supervivencia celular inicial del 60% de las células infectadas
antes de añadir los fármacos.
Las células infectadas y no infectadas se
lavaron dos veces con medio de cultivo libre de virus y se
incubaron de nuevo con 100 \mul de medio de cultivo libre de
virus que contenía la concentración deseada de artemisinina o
ribavirina disueltos previamente en DMSO (concentración final en el
medio de cultivo <0,2%) durante 72 ó 96 horas. La viabilidad
celular al final del período experimental se midió mediante el
ensayo de Promega (Innogenetics, Barcelona, España), basado en
sales de tetrazolio (CellTiter 96® AQueous). El efecto tóxico se
dedujo de la reducción de la viabilidad celular en las células
tratadas no infectadas, mientras que la protección antivírica se
reveló por el incremento en el número de células después del efecto
citopático inducido por el BVDV.
Cuando se investigó la toxicidad en células
hospedadoras no infectadas (Figura 3), se encontró que ni la
ribavirina ni la artemisinina tuvieron ningún efecto deletéreo
sobre las células hospedadoras no infectadas al menos hasta los más
altos niveles de concentración utilizados en el presente estudio
(100 \muM).
El estudio de la protección antivírica inducida
por estos fármacos (Figura 4) reveló que, como se esperaba, la
ribavirina llevó a cabo un efecto protector significativo de hasta
30% en las células hospedadoras infectadas. La artemisinina, de
forma similar, fue capaz de llevar a cabo un efecto protector
significativo frente al BVDV. Sin embargo, a concentraciones bajas
(<50 \muM) este efecto era significativamente más elevado que
el de la ribavirina, aunque a concentraciones altas (\geq50
\muM) el efecto de ambos fármacos no fue significativamente
diferente.
Estos hallazgos ponen de manifiesto el valor de
la artemisinina como nuevo agente antivírico frente a la infección
por el HCV. La artemisinina y sus derivados ya han sido utilizados
para tratar la malaria en gran número de pacientes. Por ello hay
una considerable experiencia en la práctica clínica con estos
fármacos a partir de la cual no se ha comunicado ninguna toxicidad
relevante (Batty, 1996). Además, debido al hecho de que los
mecanismos de acción de la ribavirina (Lau, 2002) y la artemisinina
(Yan, 1994) son probablemente diferentes, existe la posibilidad de
un efecto sinérgico de los fármacos en una terapia combinada.
Figura 1. Efecto sobre la viabilidad celular
(zona sombreada) y la liberación de HBsAg (círculos) y
HBV-DNA (barras) al medio de cultivo por parte de
las células HepG2 2.2.15 después de 21 días de cultivo en presencia
de la concentración indicada (que variaba de 0,01 a 200 \muM) de
artemisinina (A) o de su derivado el artesunato (B). Al final del
período experimental se recogió el medio para llevar a cabo medidas
de la abundancia de HBsAg y HBV-DNA, y se ensayó en
las células su viabilidad utilizando el ensayo del rojo neutro. Los
valores son medias\pmSD de tres cultivos diferentes en los que
cada punto de datos era el valor medio de tres placas diferentes.
Están expresados como porcentajes de determinaciones llevadas a
cabo en placas a las que no se había añadido ningún fármaco ( 0
\muM o control). *, p<0,05 comparando la abundancia de HBsAg en
los controles; \ddagger p<0,05 comparando la liberación de
HBV-DNA con los controles; \dagger, p<0,05
comparando la viabilidad celular con los controles. Una
significación estadística similar se obtuvo para valores situados a
la derecha de la flecha. El recuadro representa el análisis con
transferencia tipo Southern del HBV-DNA hallado en
el medio de cultivo de la concentración indicada de fármaco. Las
posiciones esperadas para las formas conocidas del
HBV-DNA, es decir, circular relajado (rcDNA),
circular parcialmente bicatenario (pdsDNA), circular cerrado
covalentemente (cccDNA), monocatenario (ssDNA), formas integradas
(iDNA) y formas fragmentadas (fDNA) están indicadas a la
derecha..
Figura 2. Efecto del tiempo de exposición e
incubación de la línea de células epiteliales bovinas derivadas de
tráquea embrionaria (EBTr) con el virus de la diarrea vírica bovina
(BVDV; cepa citopática Oregon C24V, genotipo I, subgenotipo b)
sobre la eficiencia de la infección medida mediante la viabilidad
celular al final del período experimental. Las flechas y las líneas
discontinuas se utilizan para indicar la dilución de BVDV
seleccionada para inducir una reducción de 40% en la población de
células, que se utilizó en experimentos subsiguientes sobre el
efecto antivírico de los fármacos. Los valores son medias\pmSD de
24 medidas llevadas a cabo en tres cultivos diferentes, *,
P<0,05 al comparar con células control no infectadas cultivadas
en condiciones similares, mediante el ensayo t para valores
apareados.
Figura 3. Efecto sobre la viabilidad de la línea
de células epiteliales bovinas derivadas de tráquea
embrionaria
(EBTr) de la incubación con las concentraciones indicadas de ribavirina (cuadrados sin relleno) y artemisinina (círculos sin relleno) durante 72 horas. Los valores son medias\pmSD de 32 medidas llevadas a cabo en cuatro cultivos diferentes. *, P<0,05 al comparar con células control no infectadas cultivadas en condiciones similares en ausencia de cualquiera de estos fármacos, mediante el ensayo t para valores apareados. \dagger, P<0,05, al compararlo con el efecto de la misma concentración de ribavirina mediante el método de Bonferroni para el análisis de comparaciones múltiples.
(EBTr) de la incubación con las concentraciones indicadas de ribavirina (cuadrados sin relleno) y artemisinina (círculos sin relleno) durante 72 horas. Los valores son medias\pmSD de 32 medidas llevadas a cabo en cuatro cultivos diferentes. *, P<0,05 al comparar con células control no infectadas cultivadas en condiciones similares en ausencia de cualquiera de estos fármacos, mediante el ensayo t para valores apareados. \dagger, P<0,05, al compararlo con el efecto de la misma concentración de ribavirina mediante el método de Bonferroni para el análisis de comparaciones múltiples.
Figura 4. Efecto de la incubación con las
concentraciones indicadas de ribavirina (cuadrados negros) y
artemisinina (círculos negros) durante 72 horas sobre la viabilidad
de la línea de células epiteliales bovinas derivadas de tráquea
embrionaria (EBTr) infectadas mediante la exposición al virus de la
diarrea vírica bovina (BVDV; cepa citopática Oregon C24V, genotipo
I, subgenotipo b) durante 48 horas antes de añadir el fármaco. Los
valores son medias\pmSD de 32 medidas llevadas a cabo en cuatro
cultivos diferentes. *, P<0,05 al comparar con células control
no infectadas cultivadas en condiciones similares en ausencia de
cualquiera de estos fármacos, mediante el ensayo t para valores
apareados. \dagger, P<0,05, al compararlo con el efecto de la
misma concentración de ribavirina mediante el método de Bonferroni
para el análisis de comparaciones múltiples.
Claims (10)
1. Uso de la artemisinina o de sus derivados
caracterizados por la fórmula I
en la que R puede representar: un
grupo cetónico (artemisinina), un grupo hidroxilo
(dihidroartemisinina), un grupo amino, hidroxiamino o amido, un
radical alquilo o hidroxialquilo, un grupo éster, particularmente
un éster del ácido butanodioico (artesunato); un grupo éter,
particularmente el éter metílico (artemeter), un halógeno, un
derivado de un ácido biliar unido directamente o mediante un
espaciador, así como los posibles esteroisómeros de estas variantes,
en la fabricación de medicamentos útiles como agentes antivíricos,
con excepción de su uso frente a
citomegalovirus.
2. Uso de la artemisinina o sus derivados según
la reivindicación 1, caracterizado porque el virus causante
de la infección pertenece a la familia de los hepadnavirus.
3. Uso de la artemisinina o sus derivados según
la reivindicación 1, caracterizado porque el virus causante
de la infección pertenece a la familia de los flavivirus.
4. Uso de la artemisinina o de sus derivados
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en que el
medicamento fabricado es útil en el tratamiento de infecciones
hepáticas en seres humanos causadas por virus.
5. Uso de la artemisinina o de sus derivados
según cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 y 4,
caracterizado porque el virus causante de la infección es el
virus de la hepatitis B (HBV).
6. Uso según la reivindicación 5 del artesunato
en la fabricación de medicamentos útiles en el tratamiento de
infecciones hepáticas en seres humanos causadas por el virus de la
hepatitis B (HBV).
7. Uso de la artemisinina o de sus derivados
según cualquiera de las reivindicaciones 1, 3 y 4,
caracterizado porque el virus causante de la infección es el
virus de la hepatitis C (HCV).
8. Uso de la artemisinina o de sus derivados
según cualquiera de las reivindicaciones 1, 3, caracterizado
porque el virus causante de la infección es el virus de la diarrea
bovina (BVDV).
9. Uso de la artemisinina según cualquiera de
las reivindicaciones 7 u 8, caracterizado porque el
medicamento fabricado contiene opcionalmente un derivado de
nucleósidos con actividad antivírica seleccionada entre la
lamivudina, la ribavirina, emcitracitabina o el adefovir
dipivoxil.
10. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
anteriores caracterizado porque el medicamento fabricado se
emplea también en el tratamiento de las patologías hepáticas
asociadas a las infecciones víricas, particularmente en el
tratamiento de la cirrosis y/o hepatocarcinoma.
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| ES200401396A ES2245248B1 (es) | 2004-06-09 | 2004-06-09 | Uso de la artemisinina y sus derivados en la fabricacion de medicamentos utiles como agentes antiviricos. |
Applications Claiming Priority (1)
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| ES2245248A1 ES2245248A1 (es) | 2005-12-16 |
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|---|---|---|---|
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| US5219880A (en) * | 1991-03-29 | 1993-06-15 | Dermatologic Research Corporation | Treatment of viral tumors and hemorrhoids with artemisinin and derivatives |
| ATE206618T1 (de) * | 1997-09-21 | 2001-10-15 | Schering Corp | Kombinationstherapie zur entfernung von nachweisbarer hcv-rns in patienten mit chronischer hepatitis c-infektion |
| DE19843383A1 (de) * | 1998-09-22 | 2000-03-30 | Hassan Jomaa | Phosphororganische Verbindungen und ihre Verwendung |
| US7842719B2 (en) * | 2002-10-31 | 2010-11-30 | Kemin Foods, L.C. | Use of endoperoxides for the treatment of infections caused by flaviviridae, including hepatitis C, bovine viral diarrhea and classical swine fever virus |
| EP3257509A1 (en) * | 2003-02-12 | 2017-12-20 | Georgetown University | Use of artemisinin and related compounds for treating anorectal squamous cell cancer induced by human papilloma virus |
-
2004
- 2004-06-09 ES ES200401396A patent/ES2245248B1/es not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| KHAN, M.M. Abid Ali et al. "Occurrence of some antiviral sterols in Artemisia annua". Plant Science. 1991. Vol. 75, nº 2, páginas 161-165. * |
| SCHALM, S.W. et al. "New nucleoside analogues for chronic hepatitis B". Journal of Hepatology. 1995. Vol. 22, supl. 1, páginas 52-56. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2245248A1 (es) | 2005-12-16 |
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| EC2A | Search report published |
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