FR2989588A1 - Composes pour la prevention ou le traitement des infections par des virus de la famille des flaviviridae - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne un composé de formule (I) suivante : ou un sel pharmaceutiquement acceptable de celui-ci, pour son utilisation dans la prévention ou le traitement d'une infection par un virus de la famille des Flaviviridae, notamment par le virus de l'hépatite C (VHC) chez un individu.

Description

COMPOSES POUR LA PREVENTION OU LE TRAITEMENT DES INFECTIONS PAR DES VIRUS DE LA FAMILLE DES FLAVIVIRIDAE Domaine de l'invention La présente invention concerne des composés utiles pour la prévention ou le traitement des infections par des virus de la famille des Flavivirdae, notamment des infections au virus de l'hépatite C. Arrière-plan technique Les virus de la famille des Flaviviridae comptent de nombreuses espèces pathogènes. Parmis elles, le virus de l'hépatite C (VHC) est une cause majeure de maladie chronique du foie. En effet, on estime qu'environ 170 millions de personnes sont infectées à travers le monde, ce qui représente environ 3 % de la population mondiale. Or, il n'existe pas de vaccin et les traitements actuels, à base d'interféron-a pégylé (PEGASYS®, PEG-Intron®, ou encore Viraferon-PEG®) et de ribavirine, sont non spécifiques. De plus, ils sont mal tolérés par les patients et ne sont efficaces que dans environ 50% des cas. Ainsi, faute de traitements curatifs ou prophylactiques efficaces, les patients infectés ont un risque élevé de développer une cirrhose ou un carcinome hépatocellulaire ce qui nécessite un recours de plus en plus important à la greffe de foie.

Toutefois, de nouvelles molécules ciblant spécifiquement la réplication du VHC commencent à arriver sur le marché, ce qui devrait conduire à une amélioration de l'efficacité du traitement dans les années qui viennent. L'agence du médicament des Etats-Unis (Federal Drug Agency, FDA) a ainsi approuvé en mai 2011 deux inhibiteurs de la protéase du VHC, le bocéprévir (Victrelis®, Merck) et le télaprévir (Incivek®, Vertex) pour le traitement de l'infection par le virus de l'hépatite C. Ces molécules semblent toutefois spécifiques du génotype 1 du VHC. De plus, ces traitements seraient à l'origine d'effets secondaires importants, tels que des rashs, une anémie et un prurit (Alkhouri & Zein (2012) Cleve Clin J Med 79:213-222). Par ailleurs, d'autres molécules antivirales, bloquant l'entrée du VHC dans les cellules cibles en interagissant avec les protéines d'enveloppe sont en cours de développement. La molécule ITX 5061 (iTherX Pharmaceuticals) vient ainsi d'entrer en essai clinique de phase I (Zhu et al. (2012) J. Infect. Dis. 205:656). Une autre molécule bloquant l'entrée du VHC a récemment été décrite par le laboratoire Bristol-Myers Squibb (Baldick et al. (2010) PLoS Pathog 6:e1001086). Cependant, cette molécule semble spécifique du génotype 1. Une molécule extraite du thé vert, la (-)-épigallocatéchine-3-gallate a également été décrite comme ayant une activité inhibitrice sur l'entrée du VHC (Galland et al. (2012) Hepatology 55:720). Toutefois, ces molécules n'ont pas encore démontré leur efficacité cliniquement.

En outre, le VHC mute rapidement et développe des résistances aux traitements. Il reste donc essentiel de continuer à identifier de nouvelles molécules anti-VHC La ferroquine est un dérivé ferrocène de la chloroquine qui présente une activité antipaludéenne in vitro et in vivo. La ferroquine est actuellement en phase d'essais cliniques pour le traitement du paludisme et est bien tolérée jusqu'à des doses de 1600 mg en dose unique ou 800 mg en doses répétées (Mombo-Ngoma et al. (2011) Malaria Journal 10:53). Plusieurs, dérivés, notamment déméthylés ou hydroxylés, de la ferroquine présentent également une activité anti-paludéenne in vitro (Biot et al. (2006) J Med. Chem. 49:2845). CH3 H3C CI Ferroquine Résumé de l'invention La présente invention découle de la mise en évidence inattendue, par les inventeurs, que la ferroquine présentait un effet d'inhibition de plusieurs virus de la famille des Flaviviridae et notamment du virus de l'hépatite C. En outre, les inventeurs ont montré que cet effet est notamment sous-tendu par une inhibition de l'entrée du VHC dans ses cellules cibles, par une inhibition de la réplication du VHC, ainsi que par une inhibition de la transmission du VHC de cellule à cellule. Par ailleurs, les inventeurs ont montré que l'association de la ferroquine avec l'interféron-a ou le bocéprévir avait un effet anti-VHC additif. En outre, les inventeurs ont montré que l'effet antiviral de ferroquine n'était pas limité à un génotype particulier du VHC Ainsi, la présente invention concerne un composé de formule (I) suivante : CI R1 R2 HN (I) dans laquelle : R1 et R2, identiques ou différents, sont sélectionnés dans le groupe constitué d'un atome hydrogène, d'un groupement alkyle, notamment de 1 à 10 atomes de carbone, de préférence méthyle ou éthyle, d'un groupement alkoxy, notamment de 1 à 10 atomes de carbone, d'un groupement acyle, notamment de 1 à 10 atomes de carbone, d'un groupement hydroxyalkyle, notamment de 1 à 10 atomes de carbone, d'un groupement acyloxyalkyle, notamment de 2 à 10 atomes de carbone, d'un groupement acétylalkyle, notamment de 2 à 10 atomes de carbone, et d'un groupement : R4 R3 où R3 représente C-H ou un hétéroatome, notamment sélectionné dans le groupe constitué de N et P, et R4 représente un atome d'hydrogène, un groupement alkyle, notamment de 1 à 10 atomes de carbone, de préférence méthyle ou éthyle, un groupement alkoxy, notamment de 1 à 10 atomes de carbone, un groupement acyle, notamment de 1 à 10 atomes de carbone, un groupe hydroxyalkyle, notamment de 1 à 10 atomes de carbone, un groupement acyloxyalkyle, notamment de 2 à 10 atome de carbone, ou un groupement acétylalkyle, notamment de 2 à 10 atomes de carbone, ou un sel pharmaceutiquement acceptable de celui-ci, pour son utilisation dans la prévention ou le traitement d'une infection à un virus de la famille des Flaviviridae, notamment au virus de l'hépatite C (VHC), chez un individu. La présente invention concerne également l'utilisation d'un composé de formule (I) tel que défini ci-dessus, ou d'un sel pharmaceutiquement acceptable de celui-ci, pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement d'une infection à un virus de la famille des Flaviviridae, notamment au virus de l'hépatite C (VHC), chez un individu. La présente invention concerne également une méthode de traitement d'une infection à un virus de la famille des Flaviviridae, notamment au virus de l'hépatite C (VHC), chez un individu, dans laquelle on administre à l'individu une quantité prophylactiquement ou thérapeutiquement efficace d'au moins un composé de formule (I) tel que défini ci-dessus, ou d'au moins un sel pharmaceutiquement acceptable de celui-ci. Dans un mode de réalisation préféré du composé pour son utilisation telle que définie ci-dessus, de l'utilisation telle que définie ci-dessus, ou de la méthode telle que définie ci- dessus, le composé, ou le sel pharmaceutiquement acceptable de celui-ci, est associé à au moins un composé additionnel destiné à la prévention ou au traitement d'une infection à un virus de la famille des Flaviviridae, notamment au virus de l'hépatite C (VHC). La présente invention concerne également une composition pharmaceutique, comprenant à titre de substances actives, au moins un composé de formule (I) tel que défini ci-dessus, ou un sel pharmaceutiquement acceptable de celui-ci, et au moins un composé additionnel destiné à la prévention ou au traitement d'une infection à un virus de la famille des Flaviviridae, notamment au virus de l'hépatite C (VHC), éventuellement en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.

La présente invention concerne également des produits contenant : - au moins un composé de formule (I) tel que défini ci-dessus, ou un sel pharmaceutiquement acceptable de celui-ci, et - au moins un composé additionnel destiné à la prévention ou au traitement d'une infection à un virus de la famille des Flaviviridae, notamment au virus de l'hépatite C (VHC), comme produit de combinaison pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps pour la prévention ou le traitement d'une infection à un virus de la famille des Flaviviridae, notamment au virus de l'hépatite C (VHC).

Description détaillée de l'invention Prévention ou traitement des infections à un virus de la famille des Flaviviridae La famille des Flaviviridae est bien connue de l'homme du métier. De préférence, le virus de la famille des Flaviviridae selon l'invention est un Flavivirus, tel que le virus de la fièvre jaune, le virus du Nil occidental, ou le virus de la dengue, un Hepacivirus, tel que le virus de l'hépatite C (VHC), ou un Pestivirus, tel que le virus de la diarrhée virale bovine ou le virus de la peste porcine classique. De manière tout particulièrement préférée, le virus de la famille des Flaviviridae selon l'invention est le virus de l'hépatite C. Comme on l'entend ici, la prévention ou le traitement des infections au virus de 30 l'hépatite C est synonyme de prévention ou traitement de l'hépatite C. L'expression « virus de l'hépatite C » ou « VHC » désigne une espèce virale responsable de l'hépatite C, anciennement connue sous le nom d'hépatite non A, non B. Le VHC selon l'invention peut notamment être de l'un des 6 génotypes majeurs, 1 à 6, actuellement référencé. Ces génotypes sont eux-même divisés en différents sous-types incluant notamment les sous-types la, lb, 2a, 2b, 2c, ou 3a.

La prévention ou le traitement des infections au virus de l'hépatite C vise notamment à empêcher l'apparition d'une charge virale en VHC ou de symptômes de l'hépatite C chez un individu non infecté ou asymptomatique, ou à diminuer ou supprimer la charge virale en VHC ou les symptômes de l'hépatite C chez l'individu infecté ou présentant les symptômes de l'hépatite C. La charge virale en VHC désigne en particulier la charge virale sanguine ou hépatique. Les symptômes de l'hépatite C correspondent notamment à une fibrose et/ou une nécrose du foie notamment chez un individu présentant une charge virale détectable en VHC. Dans le cadre de la prévention, l'individu selon l'invention peut ne présenter aucune charge virale en VHC, et ni nécrose, ni fibrose du foie ; il peut alors être à risque de contracter l'hépatite C ou être susceptible d'avoir été infecté par le VHC. Dans le cadre du traitement, l'individu peut souffrir d'une hépatite C aigüe ou chronique. En particulier, l'individu peut présenter une activité, c'est-à-dire une nécrose, supérieure à AO selon la classification Métavir bien connue de l'homme du métier (voir par exemple Bedossa (1993) Ann. Pathol. 13:260) et/ou une fibrose supérieure à FO selon la classification Métavir. De manière préférée, l'individu à traiter selon l'invention présente une activité supérieure ou égale à Al et une fibrose supérieure ou égale à F2, selon la classification Métavir. L'individu selon l'invention est de préférence un mammifère, de manière davantage préférée un porcin, un bovin ou un humain, et de manière particulièrement préférée un humain. Par ailleurs, dans un mode de réalisation préféré de l'invention, l'individu selon l'invention est à la fois porteur du paludisme et d'une infection par un virus de la famille des Flaviviridae, notamment par le VHC. En outre, dans un autre mode de réalisation préféré de l'invention l'individu doit subir ou a subi une greffe du foie. De préférence, le composé de formule (I) selon l'invention exerce son effet thérapeutique anti-virus de la famille des Flaviviridae en inhibant l'entrée du virus dans ses cellules cibles et/ou en inhibant la réplication du génome du virus et/ou en inhibant la transmission du virus de cellule à cellule. Composé de formule (I) Comme l'homme du métier le sait bien, le cycle cyclopentadiényle du composé de formule (I) est libre de rotation, aussi comme on l'entend ici la représentation décalée des cycles adoptée pour les formules (I) à (VII) selon l'invention ne doit pas être interprétée comme limitant l'invention à cette conformation mais au contraire comme couvrant également les formes éclipsées. De préférence, le groupement : R4 R3 représente un groupement sélectionné dans le groupe constitué des groupements : H pipérazino pipéridino morpholino De préférence également, l'un de R1 et R2 représente -H, -CH3 ou -CH2-CH3, et l'autre représente -CH3, -CH2-CH3 ou -CH2-CH2-OH De préférence, le composé de formule (I) selon l'invention est la ferroquine de formule (II) suivante : CI CH3 De préférence également, le composé de formule (I) selon l'invention, est une hydroxyferroquine sélectionnée dans le groupe constitué des composés de formules (III), (IV) et (V) suivantes : OH NH CI CI 7 (IV) CI OH N CH3 (V) De préférence également, le composé de formule (I) selon l'invention est un métabolite actif de ferroquine ou d'hydroxyferroquine sélectionné dans le groupe constitué 10 des composés de formules (VI) et (VII) suivantes : HN Ni..iCH3 (VI) HN NHC H3 15 CI CI (VII) Ainsi, selon l'invention, le composé de formule (I) est préférentiellement sélectionné dans le groupe constitué des composés de formules (II), (III), (IV), (V), (VI) et (VII). Comme on l'entend ici, un sel pharmaceutiquement acceptable désigne tout sel d'un composé de formule (I) pouvant servir à la fabrication d'un médicament, c'est-à-dire ayant un rapport bénéfice/risque acceptable pour l'individu concerné. Composé additionnel Le composé additionnel selon l'invention est de tout type permettant de prévenir ou de traiter une infection par un virus de la famille des Flaviviridae, notamment par le VHC. Il peut notamment s'agir d'interféron-a, de ribavirine, d'un inhibiteur de la réplication du VHC, d'un inhibiteur de protéase du VHC, ou d'un inhibiteur de l'entrée cellulaire du VHC. De préférence, le composé additionnel destiné à la prévention ou au traitement d'une infection à un virus de la famille des Flaviviridae, notamment au virus de l'hépatite C (VHC), est sélectionné dans le groupe constitué de l'interféron-a, notamment pégylé, de la ribavirine, du bocéprévir, et du télaprévir. Administration Le composé de formule (I) selon l'invention, ou son sel ou ester pharmaceutiquement acceptable, peut notamment être administré par la voie orale ou intraveineuse.

De préférence, lorsque le composé de formule (I) selon l'invention est la ferroquine, elle est administrée à une dose de 10 mg/j à 2000 mg/j, en particulier de 200 mg/j à 1600 mg/j. Le composé de formule (I) selon l'invention peut être associé à un véhicule pharmaceutiquement acceptable, c'est-à-dire tout véhicule, diluant, excipient ou adjuvant, 25 susceptible d'être administré à un individu en accompagnement d'un principe actif pharmaceutique. Description des figures 30 Figures 1 et 2 Des cellules Huh-7 prétraitées pendant 1 heure par les composés ont été infectées par JFH1- Luc (Figure 1) or JFH1 (Figure 2) en présence ou en absence de composés. 48 heures après l'infection, les cellules infectées ont été lysées pour quantifier l'activité luciférase (Figure 1) ou traitées par immunofluorescence pour compter les cellules (Figure 2). Les résultats sont exprimés en pourcentage d'infection par rapport à une infection témoin en l'absence de composé (axe des ordonnées) en fonction de la concentration de composé (axe des abscisses, en p.M). Les barres d'erreur représentent l'écart-type d'au moins trois expériences. Les concentrations cytotoxiques de chloroquine (CQ), d'hydroxychloroquine (HCQ), de ferroquine (FQ) et d'hydroxyferroquine de formule (IV) (HFQ) nécessaires pour réduire la viabilité des cellules de 50% (CC50) sont respectivement de 19,58 p.M, >20 p,M, 5,34 p.IVI et 10,36 Figures 3, 4, 5 et 6 La Figure 3 représente les temps auxquels la FQ a été ajoutée ou retirée. Les cellules Huh-7 ont été infectées par JFH1-Luc et traitées sur des périodes de temps différentes par la FQ (Figure 4 et 5). 48 heures après l'infection, les cellules ont été lysées pour quantifier l'activité luciférase. Les résultats sont exprimés en pourcentage d'infection par rapport à une infection témoin en absence de composé (axe des ordonnées) à différents temps d'exposition I, II, Ma et Mb (axe des abscisses). Les colonnes sombres représentent les résultats pour l'infection témoin et les colonnes claires les résultats obtenus en présence de FQ à 1 ii.M. Les barres d'erreur représentent l'écart-type d'au moins trois expériences. La figure 6 représente l'effet antiviral de la FQ sur des pseudoparticules de VHC (VHCpp) contenant les glycoprotéines d'enveloppe de l'isolat JFH1. Les cellules Huh-7 ont été infectées par des VHCpp (points) ou des pseudoparticules contenant la glycoprotéine d'enveloppe du rétrovirus endogène félin RD114 (carrés). Les cellules ont été traitées pendant 1 heure avant d'ajouter la FQ et pendant toute la durée de l'infection. 48 heures après l'infection, les cellules ont été lysées pour quantifier l'activité luciférase. Les résultats sont exprimés en pourcentage d'infection par rapport à une infection témoin en absence du composé (solvant seul) (axe des ordonnées) en fonction de la concentration en composé (axe des abscisses, en liM). Les barres d'erreur représentent l'écart-type d'au moins trois expériences. Figures 7 et 8 Figure 7 : de l'ARN JFH1-AE1E2-Luc a été introduit par électroporation dans des cellules Huh-7 et 4 heures après l'infection, les cellules ont été traitées ou non avec de la FQ. Les cellules ont été lysées 48 heures plus tard. Les résultats sont exprimés en pourcentage de réplication par rapport à une réplication témoins en l'absence de composé (axe des ordonnées) en fonction de la concentration en composé (axe des abscisses).

Figure 8 : des cellules Huh-7 ont été inoculées par du VHCcc pendant 2h puis cultivées en présence (colonnes claires) ou en absence (colonnes sombres témoins) de FQ pendant 70h. Les surnageants ont été récupérés, les cellules ont été lysées et la quantité (axe des ordonnées, en fmol/L) intracellulaire (lysats) et extracellulaire (surnageant) de la protéine core du VHC a été déterminée. Les données présentées sont représentatives de trois expériences indépendantes. Les barres d'erreur représentent l'écart-type d'au moins trois expériences. Le test de comparaison multiple de Turkey a été utilisé pour l'analyse statistique. ns : différences non significatives.

Figure 9 La Figure 9 représente la quantité d'ARN du VHC (axe des ordonnées, en Logl 0 de la quantité d'ARN du VHC (p.g) rapportée à la quantité totale d'ARN (iig)) de cellules Huh-7 non infectées ou inoculées par du VHCcc sans ajout ou en en présence de solvant, de FQ à 1 ou 2 .iM ou d'héparine. Les valeurs moyennes +/- l'écart-type (barres d'erreur) de trois expériences différentes sont présentées. Le test de comparaison multiple de Turkey a été utilisé pour l'analyse statistique. Aucune différence significative n'a été mise en évidence entre les cellules traitées et non traitées. Figure 10 La figure 10 représente le nombre de cellules infectées par foyer d'infection (axe des ordonnées) de cellules Huh-7 inoculées du virus JFH1 pendant 2h puis recouvertes par l'anticorps monoclonal anti-E2 3/11 (nAb) en présence ou en absence de FQ. 48h après l'infection, les cellules ont été fixées puis traitées par immunofluorescence pour détecter les cellules positives au VHC. Le nombre de cellules par foyer a été déterminé pour au moins 46 foyers dans chaque condition. Les barres représentent les valeurs moyennes. Les tests d'ANOVA à deux facteurs et de Bonferroni ont été utilisés pour comparer les conditions en présence et en absence de FQ (p<0.0001). *** indique une différence significative. Figures 11 et 12 Les figures 11 et 12 représentent les courbes isobolographiques obtenues respectivement pour les mélanges FQ/IFN-a (IFN) et FQ/bocéprévir (BCP). L'axe des ordonnées représente le pourcentage de l'IC50 obtenu en présence d'IFN-a ou de bocéprévir seul et l'axe des abscisses le pourcentage de l'IC50 obtenu en présence de la FQ seule. La diagonale en pointillée représente la ligne d'additivité et les valeurs d'IC50 mélangés dans des proportions différentes de FQ/IFN-a (IFN) et FQ/bocéprévir (BCP).

EXEMPLES Matériels et méthodes Produits chimiques. La ferroquine (FQ) et l'hydroxyferroquine de formule IV (HFQ dans la suite) ont été synthétisées comme décrit précédemment (Biot et al. (1997) J Med Chem 40:3715-3718, Biot et al. (2006) J Med Chem 49:2845-2849). La chloroquine (CQ) (référence : C6628), 1 ' hydroxychloroquine (HCQ) (référence : H0915) et l' interféron-a (IFNa) (référence : 14784) ont été obtenus auprès de Sigma-Aldrich. Les composés FQ, HFQ, CQ et HCQ ont été préparés sous la forme de solutions stock à 1mM dans du dimethylsulfoxide (DMSO). Cultures cellulaires. Les cellules Huh-7 (14), HEK-293T (ATCC CRL-11268) et HeLa (ATCC CCL-2) ont été cultivées en Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) supplementé par 10% de sérum de veau foetal (SVF) inactivé par la chaleur. Les cellules bovines de rein Madin-Darby (MDBK; ATCC CCL-22) ont été cultivées en DMEM supplémenté par du glutamax-I et 10% de sérum de cheval. La toxicité des composés a été évaluée sur les cellules Huh-7 à l'aide d'un test MTS commercial (Cell titer 96, référence : G5421) selon les instructions du fabricant (Promega).

Anticorps. Les anticorps monoclonaux anti-glycoprotéine El du VHC (A4) (Dubuisson et al. (1994) J Virol 68:6147-6160), anti-glycoprotéine E2 du VHC (3/11) (Flint et al. (1999) J Virol 73:6235-6244), anti-protéine d'enveloppe du virus de la fièvre jaune (2D12)(ATCC CRL-1689) et anti-protéine NS3 du virus de la diarrhée virale bovine (Osc-23) (Boulanger et al. (1991) J Gen. Virol. 72:1195-1198) ont été utilisés. Les anticorps secondaires conjugués aux fluorophores Cy3 (référence 115-165-062) et Alexa488 (référence : A1101) ont été respectivement obtenus de Jackson ImmunoResearch et Invitrogen. Virus. Une version modifiée du plasmide codant le génome de la souche JFH1 (génotype 2a; référence GenBank AB237837) (Wakita (2005) Nat Med 11:791-796) a été utilisée pour produire du VHC de culture cellulaire (VHCcc). Brièvement, le VHCcc a été produit en cellules Huh-7 après électroporation par de l'ARN transcrit in vitro à partir du plasmide JFH1 contenant (JFH1-Luc) ou non le gène rapporteur de la luciférase de Renilla et modifié pour exprimer l'épitope A4 (Goueslain et al. (2010) J Virol 84:773-787) et des mutations permettant d'augmenter le titre viral (Delgrange et al. (2007) J Gen Virol 88:2495-2503). Les stocks du plasmide JFH1 ont été produits par une amplification en cellules Huh-7. Dans la construction JFH1-Luc, le gène de la luciférase de Renilla est fusionné avec la phase de lecture ouverte virale dans une configuration monocistronique. Il a été vérifié que les données de luciférase de ce virus étaient dans les limites linéaires du dosage. Le plasmide JFH1- 4E1E2-Luc, contenant une délétion en phase dans la région, et le mutant incapable de se répliquer JFH1-GND-Luc, ont été décrits précédemment (Goueslain et al. (2010) J Virol 84:773-787, Rocha-Perugini et al. (2008) PLoS ONE 3:e1866). L'effet inhibiteur des composés a été déterminé en mesurant l'activité luciférase dans des lysats cellulaires ou en quantifiant l'infectiosité par fluorescence indirecte avec l'anticorps monoclonal anti-El. Pour les expériences de liaison quantitatives, du virus sous forme purifiée a été obtenu par précipitation du surnageant de cellules Huh-7 infectées par du VHCcc à l'aide de polyéthylène glycol 6000 à 8%. Le virus précipité a ensuite été chargé sur un gradient continu 10-40% d'iodixanol. Des fractions de 1 ml ont été collectées et les fractions les plus infectieuses ont été réunies. Le titre du stock était de 5.106 unités formant foyers (ffu)/ml. Des particules rétrovirales pseudotypées VHC (VHCpp) exprimant le gène rapporteur de la luciférase de luciole ont été produites en cellules HEK-293T comme décrit précédemment (Op De Beeck et al. (2004) J Virol 78:2994-3002). Dans certaines expériences, les souches NADL du virus de la diarrhée virale bovine et 17D du virus de la fièvre jaune ont également été utilisées pour tester l'effet des composés sur d'autres virus. Détermination de l'inhibition de la transmission de cellule à cellule. Des cellules Huh-7 déposées sur des lamelles de verre dans des plaques à 24-puits ont été infectées par des VHCcc pendant 2h (multiplicité d'infection (MOI) 0,01). L'inoculat a été retiré et replacé dans du milieu de culture contenant l'anticorps monoclonal neutralisant 3/11 anti-E2 (50p.g/m1). Deux jours après l'infection, les foyers ont été détectés par immunofluorescence indirecte.

Immunofluorescence indirecte. Les cellules infectées cultivées sur des lamelles de verre ont été traitées pour détecter les protéines virales par immunofluorescence indirecte comme décrit précédemment (Rouille et al. (2006) J Virol 80:2832-2841). Les noyaux ont été colorés par du 4',6'-diamidino-2-phénylindole (DAPI) à 1 µg/ml. Les lamelles ont été observées à l'aide d'un microscope Zeiss Axiophot, et les signaux fluorescents ont été enregistrés à l'aide d'une caméra Coolsnap ES (Photometrix, Kew, Australia). Pour la quantification des cellules positives pour les antigènes, des images de zones des lamelles choisies aléatoirement ont été enregistrées.

Quantification de la protéine core du VHC. Des cellules Huh-7 ont été inoculées pendant 2h avec des VHCcc dans des plaques à 6-puits. L'antigène core du VHC exprimé à l'intérieur des cellules ou secrété dans le surnageant a été quantifié à l'aide des microparticules chimioluminescentes (Architect HCV Ag Test, Abbott, France) comme décrit (Alsaleh et al. (2010) J Virol 84:12515-12528).

Test de liaison quantitatif. La quantité de virus liée aux cellules Huh-7 a été déterminée par RT-PCR quantitative en temps réel comme décrit précédemment (Castelain et al. (2004) J Clin Virol 31:227-234).

Détection de l'expression de récepteur au VHC par cytométrie en flux et marquage de Western. Des cellules Huh-7 ont été traitées par de la FQ pendant 48 heures. Après incubation avec la FQ, les cellules ont été colorées avec des anticorps pour mettre en oeuvre la cytométrie en flux et le marquage de Western comme décrit précédemment (Ciesek et al. (2010) Gastroenterology 138:1875-1884).

Isobologrammes. Pour déterminer les interactions possibles de la FQ avec d'autres molécules anti-VHC, les activités antivirales de combinaisons entre la FQ et l'IFN-a ou le bocéprévir ont été déterminées. Les valeurs d'IC50 ont été déterminées pour chaque composé seul ainsi que pour les composés dans des rapports de concentrations fixes. Les valeurs d'IC50 ont alors été utilisées pour calculer les concentrations inhibitrices fractionnelles à 50% qui ont été utilisées pour construire les isobologrammes comme indiqué dans Ohrt et al. (2002) Antimicrob Agents Chemother 46:2518-2524, ce qui permet de déterminer si les combinaisons ont un effet synergique, antagoniste ou additif.

Graphes et statistiques. Le logiciel Prism v5.0c (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA) a été utilisé pour préparer les graphes, calculer les valeurs d'IC50 et pour déterminer la significativité statistique des différences entre les groupes de données.

Exemple 1- La ferroquine inhibe l'infection par le VHC Les structures chimiques de la ferroquine (FQ), de l'hydroxyferroquine de formule (IV) (HFQ), de la chloroquine (CQ) et de l'hydroxychloroquine (HCQ) sont représentées dans le schéma ci-dessous : Cl CH3 (CH3 N ,CH3 CH3 Cl CQ , CH3 cH, r N ,CH3 HN N OH FQ Cl Cl HFQ HCQ Afin de tester l'effet de la ferroquine (FQ) sur le cycle de reproduction du VHC, le composé a été ajouté à des cellules cibles Huh-7 avant et pendant l'infection avec un virus contenant le gène rapporteur de la luciférase. Comme on peut le voir dans la Figure 1, la FQ 10 provoque une inhibition dose-dépendante de l'expression de luciférase. De manière importante, une inhibition dose-dépendante similaire de l'expression du VHC a également été observé avec un virus dépourvu de gène rapporteur (Figure 2), ce qui indique que la FQ affecte spécifiquement le cycle de reproduction du VHC avec un 1050 estimé de 0,8pM (± 0,26) et un IC90 de 1,92 p,M. 15 Des résultats similaires ont été obtenus sur des cellules HepG2 exprimant CD81. Les inventeurs ont également analysé l'activité potentielle d'une hydroxyferroquine (HFQ). Comme on peut le voir dans les Figures 1 et 2, la HFQ présente un effet antiviral sur le VHC d'une intensité similaire à celle de la FQ. En revanche, d'autres composés du type aminoquioline, comme la CQ et la HCQ sont moins efficaces contre le VHC (Figures 1 et 2). 20 Pour déterminer si le VHC est le seul membre de la famille des Flaviviridae à être affecté par la FQ, les inventeurs ont testé ce composé sur deux autres membres de cette famille de virus, le virus de la diarrhée virale bovine et le virus de la fièvre jaune. La FQ présente également une action antivirale, mais à des concentrations plus élevées que pour le VHC, avec des valeurs d'IC50 de 6.74 p.IVI et de 3.63 µM pour le virus de la diarrhée virale bovine et le virus de la fièvre jaune. L'ensemble de ces résultats indique que la FQ et la HFQ ont un effet antiviral contre les virus de la famille des Flaviviridae et particulièrement contre le virus de l'hépatite C.

Exemple 2 : la ferroquine inhibe l'entrée du VHC Pour déterminer si elle a un effet sur l'entrée du VHC, la FQ a été ajoutée ou retirée à différents temps, pendant et après l'inoculation de cellules Huh-7 par JFH1-Luc (Figure 3). Comme on le voit dans les Figures 4 et 5, la diminution la plus importante de l'infection par le VHCcc est observée lorsque la FQ est présente pendant l'infection virale, et seul un faible effet antiviral a été détecté lorsque la FQ a été ajoutée après l'infection. Ces résultats suggèrent que la FQ inhibe une étape précoce du cycle de reproduction du VHC, qui est selon toute vraisemblance l'étape d'entrée. Afin de préciser l'effet de la FQ sur l'entrée du VHC, les inventeurs ont utilisé un système mettant en oeuvre des pseudoparticules du VHC (VHCpp). Il s'agit de nucléocapsides rétrovirales qui portent des glycoprotéines du VHC dans leur enveloppe. Dans un tel contexte, seules les étapes précoces du cycle de reproduction du virus, à savoir l'interaction du virus avec ses récepteurs cellulaires, sa fixation et la fusion, sont spécifiques du VHC, tandis que les étapes ultérieures sont dépendantes des éléments de la nucléocapside rétrovirale. A l'aide de cette approche, la FQ inhibe l'entrée des pseudoparticules VHCpp de manière dose-dépendante (Figure 6). De plus, cet effet est spécifique des glycoprotéines d'enveloppe du VHC, car la FQ n'a pas d'influence sur l'entrée de pseudoparticules contenant la glycoprotéine d'enveloppe du rétrovirus endogène félin RD114. Ceci confirme que la FQ est bien un inhibiteur de l'entrée du VHC.

Comme la FQ affecte spécifiquement l'entrée du VHC, ceci a conduit les inventeurs à tester son effet antiviral sur différents génotypes/sous-types de VHC dans le contexte du système de pseudoparticules du VHC (VHCpp). Comme on le voit dans le Tableau 1, la FQ inhibe l'infection par des VHCpp des différents génotypes/sous-types testés, ce qui indique que la FQ inhibe l'entrée du VHC de façon indépendante du génotype.30 Genotype IC50 (.1M) la 0.85 ±0.11 1 b 0.49 ± 0.09 2a 0.26 ± 0.06 2b 0.28 ± 0.06 3 non déterminé 4 0.66 ± 0.09 0.69 ± 0.42 6 0.74 0.58 .± RD114 pas d'inhibition Tableau 1: la FQ inhibe l'entrée du VHC de manière indépendante du génotype Des VHCpp exprimant les glycoprotéines E1E2 de différents génotypes ont été testées pour leur sensibilité à la FQ et les IC50, correspondantes sont indiquées. Les séquences des isolats suivants ont été utilisées pour générer les VHCpp : H77 (gtla; Genbank AAB67037), UKN1B-5.23 (gtlb; 5 AY734976), JFH1 (gt2a; AB047639), UKN2B-1.1 (gt2b; AY734982), UKN3A-1.28 (gt3a; AY734984), UKN4-11.1 (gt4; AY734986), et UKN6-5.340 (gt6; AY736194). Exemple 3 : effet de la ferroquine sur la réplication et l'assemblage du VHC Bien que les données ci-dessus indiquent que la FQ inhibe puissamment l'entrée du VHC, il ne peut être exclu qu'elle ait également des effets additionnels sur d'autres étapes du cycle de reproduction du VHC. Ainsi, pour analyser l'effet de la FQ sur la réplication du génome du VHC, des cellules Huh-7 ont été soumises à une électroporation en présence d'ARN de JFH1-AE1E2- Luc inactif pour l'assemblage ayant été transcrit in vitro, afin de court-circuiter l'étape d'entrée et éviter toute interférence avec les étapes tardives du cycle de reproduction du VHC. Comme on le voit dans la Figure 7, la FQ présente également un effet sur la réplication du VHC, mais à des concentrations plus importantes (comparer les Figure 1 et 7). Cette observation permet d'interpréter le faible effet antiviral détecté lorsque la FQ est ajouté après infection dans l'Exemple 2.

Par ailleurs, afin de déterminer si la FQ pouvait avoir un effet sur l'assemblage et la sécrétion de virion du VHC, la quantité intracellulaire et extracellulaire de protéine core du VHC a été déterminée pour des cellules infectées traitées, après infection, par 1 ial\4 de FQ pendant 70h. La quantité de protéine core dans le surnageant de culture reflète la quantité de particules virales secrétées.

Comme on le voit dans la Figure 8, les quantités de protéine core relarguée dans le surnageant de cellules infectées sont similaires en présence ou en absence de traitement par la FQ. Ces données indiquent que la FQ n'inhibe pas l'assemblage et la sortie des virions de VHC.

Exemple 4 : la ferroquine inhibe une étape postérieure à la liaison lors de l'entrée virale Comme la FQ présente une activité antivirale sur une étape précoce du cycle de reproduction du VHC, les inventeurs ont exploré plus en détail son mode d'action sur l'entrée du VHC.

Pour déterminer si la FQ affecte directement la liaison des particules virales à la surface cellulaire ou une étape ultérieure de l'entrée du virus, les inventeurs ont analysé la liaison du virus en présence de FQ. Les cellules ont été inoculées par des VHCcc purifiées à 4°C en présence de FQ ou d'héparine, et la quantité de virus lié a été déterminée en quantifiant l'ARN génomique du VHC. Comme attendu, l'héparine a fortement réduit la liaison du VHC à la surface cellulaire (Figure 9). En revanche, en présence de FQ, aucun effet sur la liaison du virus n'a été observée (Figure 9), ce qui indique que la FQ n'inhibe pas l'entrée du VHC en empêchant la liaison du virus à la surface des cellules. Par ailleurs, l'effet de la FQ sur l'expression de facteurs d'entrée essentiels du VHC, CD81, SRB1, CLDN-1 et OCLN a été examiné. Des cellules Huh-7 ont été traitées par de la FQ à 1 µg/ml pendant 48 heures, puis l'expression de CD81, SRB1, CLDN-1 et OCLN a été déterminée par marquage de Western ou cytométrie en flux. Les niveaux d'expression des quatre facteurs sont inchangés, ce qui indique que la FQ n'agit pas en les régulant négativement.

Exemple 5 : la ferroquine inhibe la transmission virale de cellule à cellule Suite à l'infection de cellules Huh-7 par des VHCcc, les virus produits sont transmis aux cellules adjacentes, ce qui produit des foyers de progression de l'infection. Ce mode d'infection est insensible à une neutralisation par des anticorps anti-E2 (Timpe et al. (2008) Hepatology 47:17-24). Afin de déterminer si la FQ peut bloquer la transmission de cellule à cellule, des cellules Huh-7 infectées à une faible multiplicité d'infection ont été incubées avec l'anticorps monoclonal neutralisant 3/11 (Brimacombe et al. (2011) J Virol 85:596-605), en présence ou en absence de 1 1.1.M de FQ. Trois jours après l'infection, les foyers ont été visualisés par immunofluorescence et leur taille a été mesurée en comptant le nombre de cellules par foyer. Comme on le voit dans la Figure 10, le traitement à la FQ conduit à une forte diminution de la taille moyenne des foyers. En effet, dans la condition témoin les foyers contiennent en moyenne 40 cellules, alors que pour les cellules traitées par la FQ le nombre est réduit à 16 cellules. Ceci indique clairement que la FQ bloque la transmission de cellule à cellule du VHC.

Exemple 6 : effet antiviral de la FQ en combinaison avec l'IFN-a ou le bocéprévir Les inventeurs ont testé si la FQ pouvait être combinée à d'autres composés antiHCV actuellement utilisés dans le traitement de l'hépatite C Ainsi, les inventeurs ont utilisé le boceprevir, un composé qui cible directement la protéase NS3/4A du VHC, et l'IFN-a, qui est utilisé depuis plusieurs décennies dans le traitement anti-VHC. Ces combinaisons ont été analysées à l'aide d'isobologrammes pour déterminer leurs interactions pharmacochimiques (Tallarida (2006) J Pharmacol Exp Ther 319:1-7). Chaque composé a été combiné avec la FQ en différentes fractions de leur IC50. Pour chaque fraction d'IC50 de la FQ, le pourcentage d'IC50 du deuxième composé nécessaire pour obtenir 100% de l'IC50 totale a été estimé puis reporté sur un graphe. Dans les analyses d'isobologrammes, une diagonale droite indique que les deux composés sont dans une relation additive, alors que des diagonales concaves et convexes indiquent respectivement des effets synergiques et antagonistes. Les combinaisons de la FQ avec l'IFN-a ou le bocéprevir présentent clairement des effets additifs (Figures 11 et 12), ce qui indique que la FQ serait efficace dans les traitements par combinaison.

Discussion L'entrée du VHC représente une cible intéressante dans le cadre de la lute antivirale, offrant l'opportunité de prévenir de multiples interactions virus-récepteur et d'empêcher la fusion du virus de la membrane plasmique. Les inventeurs ont montré que la FQ présente une activité antivirale indépendante du génotype contre le VHC en inhibant une étape de l'entrée du virus dans la cellule postérieure à sa liaison avec la membrane plasmique et en bloquant la transmission de cellule à cellule entre cellules voisines. Bien que la ferroquine (FQ) soit un analogue de la chloroquine (CQ), son mécanisme d'action est potentiellement différent (Dubar et al. (2012) Chem Commun (Camb) 48:910- 912). La FQ présente en effet des propriétés de base plus faibles que celles de la CQ (Biot et al. (2005) Mol Pharm 2:185-193). Cette différence pourrait expliquer pourquoi la FQ ne présente pas d'activité antivirale contre des virus tels que le VSV, le virus de la grippe influenza ou le virus de Sindbis (Biot et al. (2006) J Med Chem 49:2845-2849), alors que la CQ bloque l'entrée dans la cellule de ces virus ainsi que celle d'autres virus dépendants du pH (Picard-Maureau et al. (2003) J Virol 77:4722-4730 ; Cassell et al. (1984) J Virol 52:857- 864 ; Yoshimura et al. (1982) J Virol 43:284-293). La FQ inhibe une étape de l'entrée du VHC dans la cellule postérieure à l'étape de liaison. Par ailleurs, l'effet de la FQ sur les pseudoparticules de VHC suggère que la FQ affecte les fonctions d'entrée des protéines d'enveloppe du VHC et non la partie lipoprotéique associée au virion. Il a été montré récemment que les protéines d'enveloppe du VHC forment de grands complexes moléculaires stabilisés par des ponts disulfures intramoléculaires (Vieyres et al. (2010) J Virol 84:10159-10168). Cette observation suggère que le processus d'entrée nécessite un réarrangement de ces ponts disulfures afin que le processus de fusion puisse avoir lieu. Il est donc possible que les propriétés oxydantes de la FQ en conditions acides pourraient inhiber le processus de fusion en affectant la réorganisation des ponts disulfures à l'intérieur des endosomes. Alternativement, il ne peut être exclu que la FQ modifie certains lipides spécifiques nécessaires pour la fusion de l'enveloppe du VHC avec une membrane endosomale précoce. Dans des études cliniques sur des individus humains sains, il a pu être montré que la FQ était sure et bien tolérée avec des doses orales d'au moins 1600 mg et que l'estimation moyenne pour la demi-vie terminale apparente dans le sang était de 16 jours. De plus, une concentration sanguine de 487 ng/mL (soit 1,1iiM) a été observée pour la plus grande dose de FQ testée, ce qui est légèrement supérieure à l'IC50 calculée pour le VHC en culture cellulaire, ce qui est donc indicatif d'une activité anti-VHC in vivo, seule ou en combinaison avec d'autres composés anti-VHC. La ferroquine pourrait fournir une nouvelle approche pour prévenir les infections par le VHC, en particulier dans le cadre de la greffe du foie de patients infectés de manière chronique par le VHC. En effet, un des principaux problèmes lors des greffes de foie est la réinfection du greffon qui est toujours observée concomitamment à une accélération de la progression de l'atteinte hépatique (Brown (2005) Nature 436:973-978). Ainsi, la capacité de la FQ d'inhiber la transmission du VHC de cellule à cellule est un atout majeur pour un inhibiteur d'entrée du VHC. De plus, la FQ présente une activité antivirale contre tous les génotypes du VHC qui ont été testés, ce qui augmente son intérêt, en tant qu'agent anti-VHC à large spectre. La combinaison d'inhibiteurs d'entrée, de réplication et de protéase dans un contexte de traitement par plusieurs composés pourrait être un moyen de réduire le risque d'émergence de virus résistants. La FQ pourrait ainsi être une option intéressante à tester pour la fabrication de combinaison anti-VHC à faible coût. Enfin, ces résultats soulignent l'intérêt d'utiliser la FQ chez des individus ayant à la fois le paludisme et une l'hépatite C.

Claims (13)

1. REVENDICATIONS1. Composé de formule (I) suivante : CI R1 (I) dans laquelle : R1 et R2, identiques ou différents, sont sélectionnés dans le groupe constitué d'un atome hydrogène, d'un groupement alkyle de 1 à 10 atomes de carbone, d'un groupement alkoxy de 10 1 à 10 atomes de carbone, d'un groupement acyle de 1 à 10 atomes de carbone, d'un groupement hydroxyalkyle de 1 à 10 atomes de carbone, d'un groupement acyloxyalkyle de 2 à 10 atomes de carbone, d'un groupement acétylalkyle de 2 à 10 atomes de carbone, et d'un groupement : R4 R3 où 15 R3 représente C-H ou un hétéroatome sélectionné dans le groupe constitué de N et P, et R4 représente un atome d'hydrogène, un groupement alkyle de 1 à 10 atomes de carbone, un groupement alkoxy de 1 à 10 atomes de carbone, un groupement acyle de 1 à 10 atomes de carbone, un groupement hydroxyalkyle de 1 à 10 atomes de carbone, un groupement acyloxyalkyle de 2 à 10 atome de carbone ou un groupement acétylalkyl de 2 à 10 atomes 20 de carbone, ou un sel pharmaceutiquement acceptable de celui-ci, pour son utilisation dans la prévention ou le traitement d'une infection par un virus de la famille des Flaviviridae chez un individu.
2. 2. Composé ou sel pharmaceutiquement acceptable de celui-ci pour son utilisation selon la revendication 1, de formule (II) suivante : CH3
3. 3. Composé ou sel pharmaceutiquement acceptable de celui-ci pour son utilisation selon la revendication 1, sélectionné dans le groupe constitué des composés de formules (III), (IV) et (V) suivantes : .'.........'.......,____,OH NH CI CI (IV) CI N.OH C H3 (V)
4. 4. Composé ou sel pharmaceutiquement acceptable de celui-ci pour son utilisation selon la revendication 1, sélectionné dans le groupe constitué des composés de formules (VI) et (VII) suivantes :15(VI) HN NHCH3 HN CI 23 CI (VII)
5. 5. Composé ou sel pharmaceutiquement acceptable de celui-ci pour son utilisation selon l'une des revendications 1 à 4, dans la prévention ou le traitement d'une infection par le virus de l'hépatite C (VHC) chez un individu.
6. 6. Composé ou sel pharmaceutiquement acceptable de celui-ci pour son utilisation selon l'une des revendications 1 à 5, associé à au moins un composé additionnel destiné à la prévention ou au traitement d'une infection par un virus de la famille des Flaviviridae.
7. 7. Composé ou sel pharmaceutiquement acceptable de celui-ci selon la revendication 6, dans lequel le composé additionnel destiné à la prévention ou au traitement d'une infection par un virus de la famille des Flaviviridae est sélectionné dans le groupe constitué de l'interféron-a, de la ribavirine, du bocéprévir, et du télaprévir.
8. 8. Composition pharmaceutique, comprenant à titre de substances actives, au moins un composé de formule (I) tel que défini dans l'une des revendications 1 à 4, ou un sel pharmaceutiquement acceptable de celui-ci, et au moins un composé additionnel destiné à la prévention ou au traitement d'une infection par un virus de la famille des Flaviviridae, éventuellement en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.25
9. 9. Composition pharmaceutique selon la revendication 8, dans laquelle le composé de formule (I) est sélectionné dans le groupe constitué des composés de formules (II), (III), (IV), (V), (VI) et (VII).
10. 10. Composition pharmaceutique selon la revendication 8 ou 9, dans laquelle le composé additionnel destiné à la prévention ou au traitement d'une infection par un virus de la famille des Flaviviridae est sélectionné dans le groupe constitué de l'interféron-a, de la ribavirine, du bocéprévir, et du télaprévir.
11. 11. Produits contenant : au moins un composé de formule (I) tel que défini dans l'une des revendications 1 à 4, ou un sel pharmaceutiquement acceptable de celui-ci, et - au moins un composé additionnel destiné à la prévention ou au traitement d'une infection par un virus de la famille des Flaviviridae, comme produit de combinaison pour une utilisation pour la prévention ou le traitement d'une infection par un virus de la famille des Flaviviridae.
12. 12. Produits selon la revendication 11, dans lesquels le composé de formule (I) est sélectionné dans le groupe constitué des composés de formules (II), (III), (IV), (V), (VI) et (VII).
13. 13. Produits selon la revendication 11 ou 12, dans lesquels le composé additionnel destiné à la 20 prévention ou au traitement d'une infection par un virus de la famille des Flaviviridae est sélectionné dans le groupe constitué de l'interféron-a, de la ribavirine, du bocéprévir, et du télaprévir.