JP4586622B2 - 精子選択採取用シャーレ - Google Patents

Description

本発明は、生殖補助技術（ＡＲＴ）での体外受精において、運動性の高い精子（運動精子）を選択的に採取するために使用される精子選択採取用シャーレに関する。

体外受精とは、卵管閉塞等の女性側因子、良好な精子の数が少ない等の男性側因子、あるいはその両方の因子に起因する不妊症例に対し行われるものであり、患者から採取した卵子と精子を体外で受精させ、ある程度培養した後に体内に戻す施術である。ＡＲＴにおいては、精液より取り出された形態的に正常な運動精子を受精に用いることが重要とされている。

運動精子は、密度勾配体を用いた遠心分離により精漿を除去して精液を濃縮した後、該精液を培養液の下部に注入して一定時間放置し、自身の運動性により培養液中を上昇（swim up）した精子を回収する方法（swim up法）によって得られる。このswim up法は、図１０に示されるように、一般的な試験管９１内で行われることが多く、培養液９２の上部に存在する精子９３をswim upしてきた運動精子としてピペット９４にて採取する。しかし、このようにswim up法を試験管内で行うことは、運動精子の回収率が悪く、また必ずしも運動精子のみを採取できるとは限らなかった。

前記試験管に代えて、swim up法による運動精子の回収を目的としたシャーレが公知となっている（例えば、特許文献１参照）。このシャーレは、シャーレ底面に設けられた凹部に精液を注入して上部に培養液を満たし、該凹部からシャーレ底面にswim upしてきた運動精子のみを選択的に採取するためのものである。
しかし、このようなシャーレは、少量の運動精子を選択的に採取する顕微受精において使用される場合には、顕微鏡下で採取作業が行える点等で優れているが、精子の量が多い通常の体外受精において使用される場合には運動精子の採取効率が悪い。
また、最近では、一定時間放置後に培養液上部に存在する精子のみが運動精子ではないとする説もある。すなわち、運動性が高く、一度培養液上部にswim upした精子が、再度培養液下部に移動している可能性もある。

一方、周壁で囲まれた培養物の収容区画が複数個設けられた培養容器が公知である（例えば、特許文献２参照）。この容器は、培養物を各収容区画の底面に固定し、培養液を全収容区画を覆うように満たして培養物の培養を行うためのものである。該容器は、最初に精液を注入する区画を選び、そこから培養液中を他の区画へと移動した精子を運動精子として採取する使用方法で用いれば、前述のシャーレと比較して、運動精子を採取する作業の効率はよい。
しかし、該培養容器は運動精子の選択的採取を目的とした容器ではないため、swim up法による運動精子の選択採取に使用する場合には不具合が生じる。すなわち、格子状に収容区画が配置される場合は、一つの区画から他の区画までの距離が様々であるため、どの区画に移動した精子を運動精子とするかにより、採取作業に時間がかかったり、採取する運動精子の量が減少したりするおそれがある。また、円形に収容区画が配置される場合は、中心の区画と他の区画を仕切る壁部の幅が一定でない。したがって、幅が薄い部分から移動する運動精子と、幅が厚い部分から移動する運動精子とで運動性の高さが異なるため、幅によっては採取可能な運動性を有する精子が中心の区画に残り、運動精子の採取量が減少する可能性がある。

特開２００３−２８９８５０号公報 実開平４−１２８９８号公報

そこで本発明は、通常の体外受精においてswim up法による運動精子の回収を目的としたシャーレであって、運動精子のみを採取作業および採取量の面で効率よく採取できる精子選択採取用シャーレを提供することを目的とする。

本発明者らは、鋭意検討を行った結果、精液を注入する区画と、精子の移動先となる区画を、上端が一定の幅を有する壁部を介して隣接させて配置することで、一定レベル以上の運動性を有する精子を確実に、かつ、効率よく採取することができるシャーレを提供することができることを見出し、本発明に到達した。

すなわち、本発明は、
（１） 底部と側壁とを有し、内部に複数の収容区画が設けられてなる精子選択採取用シャーレであって、各収容区画は、前記側壁よりも低く、かつ、上端が一定の幅を有する壁部により区画されてなり、前記収容区画は、精液が注入される一つの精液注入区画と、該精液注入区画と前記壁部を介して隣接し、該精液注入区画に注入された精液中の精子が移動しうる一つまたは二つ以上の精子移動区画とからなることを特徴とする精子選択採取用シャーレ、
（２） 前記収容区画の容量は、０．１〜３．０ｍＬである（１）記載の精子選択採取用シャーレ、
（３） 前記収容区画の壁部は、高さが１〜５ｍｍであり、上端の幅が０．０１〜２０ｍｍである（１）または（２）記載の精子選択採取用シャーレ、
（４） 前記収容区画の壁部の上部端面には、精液注入区画側から精子移動区画側へ向かって高くなる傾斜が形成されてなる（１）〜（３）のいずれかに記載の精子選択採取用シャーレ、
（５） 前記精子選択採取用シャーレは、前記収容区画そのものの形状であり、該収容区画は該精子選択採取用シャーレの内部を前記壁部を用いて区画することにより形成される（１）〜（４）のいずれかに記載の精子選択採取用シャーレ、
（６） 前記精子選択採取用シャーレは、前記収容区画が中央部に設けられてなり、該収容区画は該精子選択採取用シャーレの内部を前記壁部と該精子選択採取用シャーレの底部上に設けられた外壁を用いて区画することにより形成される（１）〜（４）のいずれかに記載の精子選択採取用シャーレ、
（７） 前記精子選択採取用シャーレは、底部が円形であり、前記収容区画は該底部の直径方向に延びる底面が長方形の区画である（６）記載の精子選択採取用シャーレ、
（８） 前記精子選択採取用シャーレは、底部が円形であり、前記収容区画は、該底部の中央に配置された底面が円形の精液注入区画と、該精液注入区画の周囲に配置される該精液注入区画の底面と同心円の底面を有する精子移動区画とからなる（６）記載の精子選択採取用シャーレ
に関する。

本発明の精子選択採取用シャーレは、精液を注入する区画（精液注入区画）と、精子の移動先となる区画（精子移動区画）を隣接させて配置し、精液を注入してから一定時間経過後に精子移動区画に存在する精子を運動精子として採取することにより、運動性の高い精子だけを容易に採取することができる。また、本発明の精子選択採取用シャーレは、精液注入区画と精子移動区画が上端が一定の幅を有する壁部を介して隣接しているため、一定レベル以上の運動性を有する精子を確実に採取することが可能である。採取可能な精子の運動性のレベルは、収容区画を区画する壁部の高さや幅、あるいは壁部の上部端面に設けられた傾斜の角度に応じて、適宜設定することができる。
さらに、本発明の精子選択採取用シャーレは、精子移動区画の数により、作業効率および精子採取効率のバランスを取ることができ、精液注入区画に注入される精液の状態に応じて好適な形状に設定されたシャーレを用いることができる。すなわち、運動精子の数が少ない精液を用いる場合は、精子移動区画の数が多い精子選択採取用シャーレを用いることで、貴重な運動精子をできるだけ多量に採取することができる。また、運動精子の数が多い精液を用いる場合は、精子移動区画の数が少ない精子選択採取用シャーレを用いることで、採取作業にかかる時間をできるだけ短くすることができる。

以下に、本発明の精子選択採取用シャーレを添付図面に示す好適な実施例に基づいて詳細に説明するが、本発明はこれらの説明に限定されるものではない。
図１は本発明の精子選択採取用シャーレの一実施例を示す上面図であり、図２は図１に示される精子選択採取用シャーレの断面図である。図３および図４は、本発明の精子選択採取用シャーレの他の実施例を示す断面図である。図５、図８および図９は、本発明の精子選択採取用シャーレのさらに他の実施例を示す上面図である。また、図６は、本発明の精子選択採取用シャーレのさらに他の実施例を示す上面図であり、図７は図６に示される精子選択採取用シャーレの断面図である。また、図１０は従来の運動精子の選択採取方法を示す説明図である。

図１および図２に示されるように、本発明の精子選択採取用シャーレ１は、底部２と側壁３とを有してなる。該精子選択採取用シャーレ１を構成する材料としては、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリアミドなど、電子線滅菌が可能であり、かつ、透明性の高いものが好ましく採用される。
該精子選択採取用シャーレ１は、後述する収容区画を完全に満たし、かつ、該収容区画の上面よりも上方に液面がくるように、内部に培養液を満たした状態で使用される。前記培養液とは、セファロチン等の抗生物質や緩衝液としてのＨｅｐｅｓ等を含む培養液などがあげられる。

前記精子選択採取用シャーレ１の内部には、前記側壁３よりも低い壁部４１によって区画された複数の収容区画が設けられてなる。該収容区画は、一つの精液注入区画４２と、該精液注入区画４２に隣接する一つまたは二つ以上の精子移動区画４３とからなる。
前記精液注入区画４２とは、運動精子のみを選択的に採取するswim up法において、密度勾配体を用いた遠心分離により精漿を除去して濃縮された精液を注入するための区画である。図１および図２に示される実施例において、該精液注入区画４２は、精子選択採取用シャーレ１の底部２と、該精子選択採取用シャーレ１の側壁３と、壁部４１とによって構成されてなる。該精子選択採取用シャーレ１がswim up法に用いられる場合の該精液注入区画４２の容量は、好ましくは０．１〜３．０ｍＬである。
一方、前記精子移動区画４３とは、前記精液注入区画４２に注入された精液中の運動精子が培養液中を移動する際の移動先として使用される区画である。図１および図２に示される実施例において、該精子移動区画４３は、精子選択採取用シャーレ１の底部２と、該精子選択採取用シャーレ１の側壁３と、壁部４１とによって構成されてなる。該精子移動区画４３は、該壁部４１を介して前記精液注入区画４２と隣接している。該精子移動区画４３もまた、該精液注入区画４２と同様、該精子選択採取用シャーレ１がswim up法に用いられる場合には０．１〜３．０ｍＬの容量を有していることが好ましい。

前記収容区画を区画する壁部４１の高さは、前記精子選択採取用シャーレ１の内部に培養液を満たす際、その液面が該収容区画の上面よりも上方にくるように、側壁３よりも低く設定される。該壁部４１の高さは、前記精液注入区画４２内の精子が培養液中を前記精子移動区画４３に移動する際の障壁となるため、採取したい精子の運動性に応じて適宜決定される。通常の体外受精におけるswim up法で採取される運動精子の運動性を考慮すると、該壁部４１の高さは１〜５ｍｍであることが好ましい。該壁部４１の高さが１ｍｍよりも低いと、体外受精に使用するには運動性が低いとされる精子まで精子移動区画４３に移動するおそれがあり、該壁部４１の高さが５ｍｍよりも高いと、精子移動区画４３に移動してくる運動精子の数が極端に少なくなり好ましくない。

前記壁部４１の上端は、精液注入区画４２から精子移動区画４３へと移動する精子の運動性を一定のレベル以上に設定するため、一定の幅を有している必要がある。該壁部４１の上端の幅はまた、精子が移動する際の障壁となるため、通常０．０１〜２０ｍｍであることが好ましく、１〜５ｍｍであることがより好ましい。該壁部４１の幅は、上端が一定であれば、下端から上端に向かって幅が減少するよう設定されていてもよい。該壁部４１の上幅が前記数値範囲に設定される場合、下端の幅はそれよりも大きく設定されることが好ましい。該壁部４１の上端の幅が大きければ、該精液注入区画４２から該精子移動区画４３へと移動する精子を視認しやすくなる。しかし、該壁部４１の上端の幅が２０ｍｍよりも大きいと、精液注入区画４２から該精子移動区画４３への精子の移動に時間がかかり、運動精子採取時に精子が該壁部４１上に残留している可能性がある。また、該壁部４１の幅が０．０１ｍｍよりも小さいと、精子の移動時間は短いが、移動する精子を視認することはできない。なお、該壁部４１の幅が大きい場合、その内部は図３に示されるように空洞であってもよい。

前記壁部４１の上部端面には、図３に示されるように、精液注入区画４２側から精子移動区画４３側へ向かって高くなる傾斜が形成されていてもよい。該傾斜もまた前記精液注入区画４２内の精子が培養液中を前記精子移動区画４３に移動する際の障壁になるとともに、該壁部４１における精子の分画効率向上を図ることができるものであり、採取したい精子の運動性に応じて適宜決定される。ここで、精子の分画効率とは、精液注入区画４２側からいったん精子移動区画４３に移動した精子のうち、該精液注入区画４２へとさらに移動してしまう精子の確率をいう。通常の体外受精におけるswim up法で採取される運動精子の運動性を考慮すると、該壁部４１の上部端面の傾斜は、水平方向に対して１〜１０°であることが好ましい。該壁部４１の上部端面の傾斜が１°よりも小さいと、精子の分画効率が低くなる。
また、前記傾斜を壁部４１の上部端面に形成する代わりに、図４に示されるように、壁部４１そのものを底面の鉛直方向に対して傾斜させてもよい。この場合、該壁部４１の傾斜は、該壁部４１と底面とで形成される角度が、１０〜８０°であることが、精子の分画効率向上の観点から好ましい。

前記収容区画、すなわち精液注入区画４２および精子移動区画４３の形状は、精液の注入や運動精子の移動、および該運動精子の採取を妨げないものであれば特に限定されない。前記精子選択採取用シャーレ１がswim up法において使用される場合、前記収容区画の好適な形状としては、例えば図１〜図７に示されるように底面が長方形のものの他、図８および図９に示されるように底面が円形のものや図示されないが底面が多角形のものなどがあげられる。
また、各収容区画は、底面と壁部とが直角に配置されたものであってもよいし、該壁部が該底面の鉛直方向から外方へ傾斜して配置されていてもよい。さらに、該底面と壁部とがなだらかな曲面によって接続された、底面の縁部に角のない形状を有していれば、運動精子の採取作業が行いやすい。
さらに、該収容区画には、精液注入区画４２と精子移動区画４３とを区別して認識するための識別記号や図形等が表示されてあってもよい。該識別記号等は、各収容区画の底面あるいは壁部４１や、精子選択採取用シャーレ１の底部２または側壁３などに適宜表示することができる。

前記収容区画は、精子移動区画４３が精子選択採取用シャーレ１内部に複数個配置されていてもよい。該精子移動区画４３は精液注入区画４２に壁部４１を介して隣接するよう配置されるため、該精液注入区画４２は全収容区画の中心に位置することになる。
例えば、図５に示される精子選択採取用シャーレ１は、底面が長方形の精液注入区画４２の両側に、同じく底面が長方形の精子移動区画４３が配置されてなる。該精子選択採取用シャーレ１をswim up法において使用する場合、精液注入区画４２内に注入された運動精子は、左右どちら側へ動いても精子移動区画４３内に移動できるため、図１および図２に示される精子選択採取用シャーレ１と比較して、構造は複雑であるが、精子採取効率はよい。

また、図８に示される精子選択採取用シャーレ１は、底面が円形の精液注入区画４２の周囲に、該精液注入区画４２の底面と同心円の底面を有する精子移動区画４３が配置されてなる。該精子選択採取用シャーレ１をswim up法において使用する場合、精液注入区画４２内に注入された運動精子がどの方向へ動いても精子移動区画４３内に移動できるため、運動精子の採取効率がよい。前記精子移動区画４３は、運動精子を採取する作業を行いやすくするために、図９に示されるように、さらに壁部４１あるいは後述する外壁４４によって複数の収容区画に区画されていてもよい。

本発明の精子選択採取用シャーレ１の形状としては、該精子選択採取用シャーレ１を側壁３の外側から把持しうることが容易な形状であれば特に限定されない。該形状は、図１〜図５に示されるように、前記精液注入区画４２および精子移動区画４３からなる収容区画そのものの形状であってもよいし、図６〜図９に示されるように、該収容区画が中央部に配置された底部２が円形のものや、図示されないが底面が多角形のもの等であってもよい。
前記収容区画そのものの形状からなる精子選択採取用シャーレ１においては、該収容区画は精子選択採取用シャーレ１の内部を壁部４１を用いて区画することにより形成される。一方、前記収容区画を中央部に配置した精子選択採取用シャーレ１においては、該収容区画は、精子選択採取用シャーレ１の内部を壁部４１および底部２上に設けられた外壁４４を用いて区画することにより形成される。該外壁４４の高さは、側壁３と同様、図７に示されるように壁部４１よりも高く設定される。

図６および図７に示される精子選択採取用シャーレ１は、底部２が円形である精子選択採取用シャーレ１の中央部に、底面が長方形の収容区画が該底部２の直径方向に延びるように設けられてなる。各収容区画、すなわち精液注入区画４２および精子移動区画４３は、精子選択採取用シャーレ１の底部２と、壁部４１と、別途底部２上に設けられた外壁４４によって構成される。
図８および図９に示される精子選択採取用シャーレ１もまた、底部２が円形である精子選択採取用シャーレ１の中央部に、底面が円形の収容区画が設けられてなる。精液注入区画４２は、精子選択採取用シャーレ１の底部２と壁部４１により構成され、精子移動区画４３は、精子選択採取用シャーレ１の底部２と、壁部４１と、別途設けられた外壁４４によって構成される。

このように、収容区画を中央部に配置した該精子選択採取用シャーレ１は、従来のシャーレと形状が同じであり操作性がよい。該精子選択採取用シャーレ１が内部に収容区画を有するものである場合、その大きさは必要最小限に小さく設計されることが好ましく、具体的には外径が３０〜６０ｍｍ程度であることが好ましい。

本発明の精子選択採取用シャーレ１には、さらに側壁３の外周面に、凸部が形成されていてもよい。該凸部は、精子選択採取用シャーレ１を側壁３の外側から把持する際に滑り止めとしての効果を有する。該凸部は側壁３の外周面全周にわたって環状に設けられていてもよいが、外周面に部分的に設けられていてもよい。
また、該側壁３は底部２に対して鉛直方向に配置されていてもよいし、底部２の鉛直方向に対してわずかに外側に傾斜するように配置されていてもよい。該側壁３が底部２の鉛直方向から傾斜している場合、精子選択採取用シャーレ１を側壁３の外側から把持する際の滑り止め効果が向上し、より好ましい。

本発明の精子選択採取用シャーレ１のswim up法における使用方法を、図６および図７に示される精子選択採取用シャーレ１について説明する。
まず、精子選択採取用シャーレ１内部に培養液４５が満たされる。該培養液４５の量は、液面が壁部４１の上端よりもわずかに上方に位置する程度の量であることが好ましい。次いで、精液注入区画４２の下方に、濃縮された精液が注入される。該培養液４５の表面は、培養液４５の蒸発を防ぐためにパラフィン等のオイル４６で覆われる場合があるが、該オイル４６の注入は精液の注入前であっても注入後であってもよい。この状態で、精子は自身の運動性により培養液４５中を精液注入区画４２から精子移動区画４３へと壁部４１を越えて移動する。該壁部４１がある程度の幅を有していれば、精子の移動を視認可能である。精液の注入から十分〜数十分経過後、精子移動区画４３内に存在する精子を運動精子とみなし、注射針やピペット等の吸引用ノズルで培養液４５ごと採取する。

本発明の精子選択採取用シャーレの一実施例を示す上面図である。 本発明の図１に示される精子選択採取用シャーレの断面図である。 本発明の精子選択採取用シャーレの他の実施例を示す断面図である。 本発明の精子選択採取用シャーレの他の実施例を示す断面図である。 本発明の精子選択採取用シャーレのさらに他の実施例を示す上面図である。 本発明の精子選択採取用シャーレのさらに他の実施例を示す上面図である。 本発明の図６に示される精子選択採取用シャーレの断面図である。 本発明の精子選択採取用シャーレのさらに他の実施例を示す上面図である。 本発明の精子選択採取用シャーレのさらに他の実施例を示す上面図である。 従来の運動精子の選択採取方法を示す説明図である。

符号の説明

１ 精子選択採取用シャーレ
２ 底部
３ 側壁
４１ 壁部
４２ 精液注入区画
４３ 精子移動区画
４４ 外壁
４５、９２ 培養液
４６ オイル
９１ 試験管
９３ 精子
９４ ピペット

Claims (8)

1. 底部と側壁とを有し、内部に複数の収容区画が設けられてなる精子選択採取用シャーレであって、各収容区画は、前記側壁よりも低く、かつ、上端が一定の幅を有する壁部により区画されてなり、前記収容区画は、精液が注入される一つの精液注入区画と、該精液注入区画と前記壁部を介して隣接し、該精液注入区画に注入された精液中の精子が移動しうる一つまたは二つ以上の精子移動区画とからなることを特徴とする精子選択採取用シャーレ。
2. 前記収容区画の容量は、０．１〜３．０ｍＬである請求項１記載の精子選択採取用シャーレ。
3. 前記収容区画の壁部は、高さが１〜５ｍｍであり、上端の幅が０．０１〜２０ｍｍである請求項１または２記載の精子選択採取用シャーレ。
4. 前記収容区画の壁部の上部端面には、精液注入区画側から精子移動区画側へ向かって高くなる傾斜が形成されてなる請求項１〜３のいずれかに記載の精子選択採取用シャーレ。
5. 前記精子選択採取用シャーレは、前記収容区画そのものの形状であり、該収容区画は該精子選択採取用シャーレの内部を前記壁部を用いて区画することにより形成される請求項１〜４のいずれかに記載の精子選択採取用シャーレ。
6. 前記精子選択採取用シャーレは、前記収容区画が中央部に設けられてなり、該収容区画は該精子選択採取用シャーレの内部を前記壁部と該精子選択採取用シャーレの底部上に設けられた外壁を用いて区画することにより形成される請求項１〜４のいずれかに記載の精子選択採取用シャーレ。
7. 前記精子選択採取用シャーレは、底部が円形であり、前記収容区画は該底部の直径方向に延びる底面が長方形の区画である請求項６記載の精子選択採取用シャーレ。
8. 前記精子選択採取用シャーレは、底部が円形であり、前記収容区画は、該底部の中央に配置された底面が円形の精液注入区画と、該精液注入区画の周囲に配置される該精液注入区画の底面と同心円の底面を有する精子移動区画とからなる請求項６記載の精子選択採取用シャーレ。

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