WO2006118282A1

WO2006118282A1 - 精子選択採取用シャーレ

Info

Publication number: WO2006118282A1
Application number: PCT/JP2006/309058
Authority: WO
Inventors: Satoru Kaneko; Kazuyoshi Harada
Original assignee: Nipro Corporation
Priority date: 2005-04-28
Filing date: 2006-04-28
Publication date: 2006-11-09
Also published as: JP4586622B2; JP2006304683A

Abstract

　通常の体外受精においてswim up法による運動精子の回収を目的としたシャーレであって、運動精子のみを採取作業および採取量の面で効率よく採取できる精子選択採取用シャーレを提供することを目的とする。底部２と側壁３とを有し、内部に複数の収容区画が設けられてなる精子選択採取用シャーレ１であって、各収容区画は、前記側壁３よりも低く、かつ、上端が一定の幅を有する壁部４１により区画されてなり、前記収容区画は、精液が注入される一つの精液注入区画４２と、該精液注入区画４２と前記壁部４１を介して隣接し、該精液注入区画４２に注入された精液中の精子が移動しうる一つまたは二つ以上の精子移動区画４３とからなることを特徴とする精子選択採取用シャーレ１を用いる。

Description

精子選択採取用シャーレ

技術分野

[0001] 本発明は、生殖補助技術 (ART)での体外受精において、運動性の高い精子 (運動精子)を選択的に採取するために使用される精子選択採取用シャーレに関する。背景技術

[0002] 体外受精とは、卵管閉塞等の女性側因子、良好な精子の数が少ない等の男性側因子、あるいはその両方の因子に起因する不妊症例に対し行われるものであり、患者から採取した卵子と精子を体外で受精させ、ある程度培養した後に体内に戻す施術である。 ARTにおいては、精液より取り出された形態的に正常な運動精子を受精に用いることが重要とされて、る。

[0003] 運動精子は、密度勾配体を用いた遠心分離により精漿を除去して精液を濃縮した後、該精液を培養液の下部に注入して一定時間放置し、自身の運動性により培養液中を上昇（swim up)した精子を回収する方法（swim up法）によって得られる。この swi m up法は、図 10に示されるように、一般的な試験管 91内で行われることが多ぐ培養液 92の上部に存在する精子 93を swim upしてきた運動精子としてピペット 94にて採取する。しかし、このように swim up法を試験管内で行うことは、運動精子の回収率が悪ぐまた必ずしも運動精子のみを採取できるとは限らな力つた。

[0004] 前記試験管に代えて、 swim up法による運動精子の回収を目的としたシャーレが公知となっている（例えば、特許文献 1参照)。このシャーレは、シャーレ底面に設けられた凹部に精液を注入して上部に培養液を満たし、該凹部からシャーレ底面に swim u pしてきた運動精子のみを選択的に採取するためのものである。

しかし、このようなシャーレは、少量の運動精子を選択的に採取する顕微受精において使用される場合には、顕微鏡下で採取作業が行える点等で優れているが、精子の量が多い通常の体外受精において使用される場合には運動精子の採取効率が悪い。

また、最近では、一定時間放置後に培養液上部に存在する精子のみが運動精子ではないとする説もある。すなわち、運動性が高ぐ一度培養液上部に swim upした精子力再度培養液下部に移動している可能性もある。

[0005] 一方、周壁で囲まれた培養物の収容区画が複数個設けられた培養容器が公知である（例えば、特許文献 2参照)。この容器は、培養物を各収容区画の底面に固定し、培養液を全収容区画を覆うように満たして培養物の培養を行うためのものである。該容器は、最初に精液を注入する区画を選び、そこカゝら培養液中を他の区画へと移動した精子を運動精子として採取する使用方法で用いれば、前述のシャーレと比較して、運動精子を採取する作業の効率はよい。

しかし、該培養容器は運動精子の選択的採取を目的とした容器ではないため、 swi m up法による運動精子の選択採取に使用する場合には不具合が生じる。すなわち、格子状に収容区画が配置される場合は、一つの区画から他の区画までの距離が様々であるため、どの区画に移動した精子を運動精子とするかにより、採取作業に時間がかかったり、採取する運動精子の量が減少したりするおそれがある。また、円形に収容区画が配置される場合は、中心の区画と他の区画を仕切る壁部の幅が一定でない。したがって、幅が薄い部分力移動する運動精子と、幅が厚い部分力移動する運動精子とで運動性の高さが異なるため、幅によっては採取可能な運動性を有する精子が中心の区画に残り、運動精子の採取量が減少する可能性がある。

[0006] 特許文献 1：特開 2003— 289850号公報

特許文献 2：実開平 4 12898号公報

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0007] そこで本発明は、通常の体外受精において swim up法による運動精子の回収を目的としたシャーレであって、運動精子のみを採取作業および採取量の面で効率よく採取できる精子選択採取用シャーレを提供することを目的とする。

課題を解決するための手段

[0008] 本発明者らは、鋭意検討を行った結果、精液を注入する区画と、精子の移動先となる区画を、上端が一定の幅を有する壁部を介して隣接させて配置することで、一定レベル以上の運動性を有する精子を確実に、かつ、効率よく採取することができるシャーレを提供することができることを見出し、本発明に到達した。

すなわち、本発明は、

(1) 底部と側壁とを有し、内部に複数の収容区画が設けられてなる精子選択採取用シャーレであって、各収容区画は、前記側壁よりも低ぐかつ、上端が一定の幅を有する壁部により区画されてなり、前記収容区画は、精液が注入される一つの精液注入区画と、該精液注入区画と前記壁部を介して隣接し、該精液注入区画に注入された精液中の精子が移動しうる一つまたは二つ以上の精子移動区画とからなることを特徴とする精子選択採取用シャーレ、

(2) 前記収容区画の容量は、 0. 1〜3. OmLである（1)記載の精子選択採取用シヤーレ、

(3) 前記収容区画の壁部は、高さが l〜5mmであり、上端の幅が 0. 01〜20mm である（1)または（2)記載の精子選択採取用シャーレ、

(4) 前記収容区画の壁部の上部端面には、精液注入区画側から精子移動区画側へ向かって高くなる傾斜が形成されてなる（1)〜（3)のいずれかに記載の精子選択採取用シャーレ、

(5) 前記精子選択採取用シャーレは、前記収容区画そのものの形状であり、該収容区画は該精子選択採取用シャーレの内部を前記壁部を用いて区画することにより形成される (1)〜 (4)のいずれかに記載の精子選択採取用シャーレ、

(6) 前記精子選択採取用シャーレは、前記収容区画が中央部に設けられてなり、該収容区画は該精子選択採取用シャーレの内部を前記壁部と該精子選択採取用シヤーレの底部上に設けられた外壁を用いて区画することにより形成される（1)〜 (4) のいずれかに記載の精子選択採取用シャーレ、

(7) 前記精子選択採取用シャーレは、底部が円形であり、前記収容区画は該底部の直径方向に延びる底面が長方形の区画である（6)記載の精子選択採取用シヤーレ、

(8) 前記精子選択採取用シャーレは、底部が円形であり、前記収容区画は、該底部の中央に配置された底面が円形の精液注入区画と、該精液注入区画の周囲に配置される該精液注入区画の底面と同心円の底面を有する精子移動区画とからなる（

6)記載の精子選択採取用シャーレ

に関する。

発明の効果

[0010] 本発明の精子選択採取用シャーレは、精液を注入する区画 (精液注入区画）と、精子の移動先となる区画 (精子移動区画)を隣接させて配置し、精液を注入してから一定時間経過後に精子移動区画に存在する精子を運動精子として採取することにより、運動性の高い精子だけを容易に採取することができる。また、本発明の精子選択採取用シャーレは、精液注入区画と精子移動区画が上端が一定の幅を有する壁部を介して隣接して!/、るため、一定レベル以上の運動性を有する精子を確実に採取することが可能である。採取可能な精子の運動性のレベルは、収容区画を区画する壁部の高さや幅、あるいは壁部の上部端面に設けられた傾斜の角度に応じて、適宜設定することができる。

さらに、本発明の精子選択採取用シャーレは、精子移動区画の数により、作業効率および精子採取効率のバランスを取ることができ、精液注入区画に注入される精液の状態に応じて好適な形状に設定されたシャーレを用いることができる。すなわち、運動精子の数が少な、精液を用いる場合は、精子移動区画の数が多、精子選択採取用シャーレを用いることで、貴重な運動精子をできるだけ多量に採取することができる。また、運動精子の数が多い精液を用いる場合は、精子移動区画の数が少ない精子選択採取用シャーレを用いることで、採取作業にかかる時間をできるだけ短くすることがでさる。

図面の簡単な説明

[0011] [図 1]本発明の精子選択採取用シャーレの一実施例を示す上面図である。

[図 2]本発明の図 1に示される精子選択採取用シャーレの断面図である。

[図 3]本発明の精子選択採取用シャーレの他の実施例を示す断面図である。

[図 4]本発明の精子選択採取用シャーレの他の実施例を示す断面図である。

[図 5]本発明の精子選択採取用シャーレのさらに他の実施例を示す上面図である。

[図 6]本発明の精子選択採取用シャーレのさらに他の実施例を示す上面図である。 [図 7]本発明の図 6に示される精子選択採取用シャーレの断面図である。

[図 8]本発明の精子選択採取用シャーレのさらに他の実施例を示す上面図である。

[図 9]本発明の精子選択採取用シャーレのさらに他の実施例を示す上面図である。

[図 10]従来の運動精子の選択採取方法を示す説明図である。

符号の説明

[0012] 1 精子選択採取用シャーレ

2 底部

3 側壁

41 壁部

42 精液注入区画

43 精子移動区画

44 外壁

45、 92 培養液

46 オイル

91 試験管

93 精子

94 ピペット

発明を実施するための最良の形態

[0013] 以下に、本発明の精子選択採取用シャーレを添付図面に示す好適な実施例に基づ、て詳細に説明する力本発明はこれらの説明に限定されるものではな、。

図 1は本発明の精子選択採取用シャーレの一実施例を示す上面図であり、図 2は図 1に示される精子選択採取用シャーレの断面図である。図 3および図 4は、本発明の精子選択採取用シャーレの他の実施例を示す断面図である。図 5、図 8および図 9 は、本発明の精子選択採取用シャーレのさらに他の実施例を示す上面図である。また、図 6は、本発明の精子選択採取用シャーレのさらに他の実施例を示す上面図であり、図 7は図 6に示される精子選択採取用シャーレの断面図である。また、図 10は従来の運動精子の選択採取方法を示す説明図である。

[0014] 図 1および図 2に示されるように、本発明の精子選択採取用シャーレ 1は、底部 2と側壁 3とを有してなる。該精子選択採取用シャーレ 1を構成する材料としては、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリアミドなど、電子線滅菌が可能であり、かつ、透明性の高いものが好ましく採用される。

該精子選択採取用シャーレ 1は、後述する収容区画を完全に満たし、かつ、該収容区画の上面よりも上方に液面がくるように、内部に培養液を満たした状態で使用される。前記培養液とは、セファロチン等の抗生物質や緩衝液としての Hepes等を含む培養液などがあげられる。

[0015] 前記精子選択採取用シャーレ 1の内部には、前記側壁 3よりも低い壁部 41によって区画された複数の収容区画が設けられてなる。該収容区画は、一つの精液注入区画 42と、該精液注入区画 42に隣接する一つまたは二つ以上の精子移動区画 43とからなる。

前記精液注入区画 42とは、運動精子のみを選択的に採取する swim up法において、密度勾配体を用いた遠心分離により精漿を除去して濃縮された精液を注入するための区画である。図 1および図 2に示される実施例において、該精液注入区画 42は、精子選択採取用シャーレ 1の底部 2と、該精子選択採取用シャーレ 1の側壁 3と、壁部 41とによって構成されてなる。該精子選択採取用シャーレ 1が swim up法に用いられる場合の該精液注入区画 42の容量は、好ましくは 0. 1〜3. OmLである。

一方、前記精子移動区画 43とは、前記精液注入区画 42に注入された精液中の運動精子が培養液中を移動する際の移動先として使用される区画である。図 1および図 2に示される実施例において、該精子移動区画 43は、精子選択採取用シャーレ 1 の底部 2と、該精子選択採取用シャーレ 1の側壁 3と、壁部 41とによって構成されてなる。該精子移動区画 43は、該壁部 41を介して前記精液注入区画 42と隣接している。該精子移動区画 43もまた、該精液注入区画 42と同様、該精子選択採取用シャーレ 1が swim up法に用いられる場合には 0. 1〜3. OmLの容量を有していることが好ましい。

[0016] 前記収容区画を区画する壁部 41の高さは、前記精子選択採取用シャーレ 1の内部に培養液を満たす際、その液面が該収容区画の上面よりも上方にくるように、側壁 3よりも低く設定される。該壁部 41の高さは、前記精液注入区画 42内の精子が培養液中を前記精子移動区画 43に移動する際の障壁となるため、採取した、精子の運動性に応じて適宜決定される。通常の体外受精における swim up法で採取される運動精子の運動性を考慮すると、該壁部 41の高さは l〜5mmであることが好ましい。該壁部 41の高さが lmmよりも低いと、体外受精に使用するには運動性が低いとされる精子まで精子移動区画 43に移動するおそれがあり、該壁部 41の高さが 5mmよりも高いと、精子移動区画 43に移動してくる運動精子の数が極端に少なくなり好ましくない。

[0017] 前記壁部 41の上端は、精液注入区画 42から精子移動区画 43へと移動する精子の運動性を一定のレベル以上に設定するため、一定の幅を有している必要がある。該壁部 41の上端の幅はまた、精子が移動する際の障壁となるため、通常 0. 01〜20 mmであることが好ましぐ l〜5mmであることがより好ましい。該壁部 41の幅は、上端が一定であれば、下端力も上端に向力つて幅が減少するよう設定されていてもよい。該壁部 41の上幅が前記数値範囲に設定される場合、下端の幅はそれよりも大きく設定されることが好ましい。該壁部 41の上端の幅が大きければ、該精液注入区画 42 から該精子移動区画 43へと移動する精子を視認しゃすくなる。しかし、該壁部 41の上端の幅が 20mmよりも大きいと、精液注入区画 42から該精子移動区画 43への精子の移動に時間がかかり、運動精子採取時に精子が該壁部 41上に残留している可能性がある。また、該壁部 41の幅が 0. 01mmよりも小さいと、精子の移動時間は短いが、移動する精子を視認することはできない。なお、該壁部 41の幅が大きい場合、その内部は図 3に示されるように空洞であってもよい。

[0018] 前記壁部 41の上部端面には、図 3に示されるように、精液注入区画 42側から精子移動区画 43側へ向カゝつて高くなる傾斜が形成されていてもよい。該傾斜もまた前記精液注入区画 42内の精子が培養液中を前記精子移動区画 43に移動する際の障壁になるとともに、該壁部 41における精子の分画効率向上を図ることができるものであり、採取したい精子の運動性に応じて適宜決定される。ここで、精子の分画効率とは、精液注入区画 42側からいったん精子移動区画 43に移動した精子のうち、該精液注入区画 42へとさらに移動してしまう精子の確率をいう。通常の体外受精における s wim up法で採取される運動精子の運動性を考慮すると、該壁部 41の上部端面の傾斜は、水平方向に対して 1〜10° であることが好ましい。該壁部 41の上部端面の傾斜が 1° よりも小さいと、精子の分画効率が低くなる。

また、前記傾斜を壁部 41の上部端面に形成する代わりに、図 4に示されるように、壁部 41そのものを底面の鉛直方向に対して傾斜させてもよい。この場合、該壁部 41 の傾斜は、該壁部 41と底面とで形成される角度力 10〜80° であることが、精子の分画効率向上の観点力好まし、。

[0019] 前記収容区画、すなわち精液注入区画 42および精子移動区画 43の形状は、精液の注入や運動精子の移動、および該運動精子の採取を妨げな、ものであれば特に限定されない。前記精子選択採取用シャーレ 1が swim up法において使用される場合、前記収容区画の好適な形状としては、例えば図 1〜図 7に示されるように底面が長方形のものの他、図 8および図 9に示されるように底面が円形のものや図示されないが底面が多角形のものなどがあげられる。

また、各収容区画は、底面と壁部とが直角に配置されたものであってもよいし、該壁部が該底面の鉛直方向から外方へ傾斜して配置されていてもよい。さらに、該底面と壁部とがなだらかな曲面によって接続された、底面の縁部に角のない形状を有していれば、運動精子の採取作業が行いやすい。

さらに、該収容区画には、精液注入区画 42と精子移動区画 43とを区別して認識するための識別記号や図形等が表示されてあつてもよい。該識別記号等は、各収容区画の底面あるいは壁部 41や、精子選択採取用シャーレ 1の底部 2または側壁 3などに適宜表示することができる。

[0020] 前記収容区画は、精子移動区画 43が精子選択採取用シャーレ 1内部に複数個配置されていてもよい。該精子移動区画 43は精液注入区画 42に壁部 41を介して隣接するよう配置されるため、該精液注入区画 42は全収容区画の中心に位置すること〖こなる。

例えば、図 5に示される精子選択採取用シャーレ 1は、底面が長方形の精液注入区画 42の両側に、同じく底面が長方形の精子移動区画 43が配置されてなる。該精子選択採取用シャーレ 1を swim up法において使用する場合、精液注入区画 42内に注入された運動精子は、左右どちら側へ動、ても精子移動区画 43内に移動できるため、図 1および図 2に示される精子選択採取用シャーレ 1と比較して、構造は複雑であるが、精子採取効率はよい。

[0021] また、図 8に示される精子選択採取用シャーレ 1は、底面が円形の精液注入区画 4 2の周囲に、該精液注入区画 42の底面と同心円の底面を有する精子移動区画 43が配置されてなる。該精子選択採取用シャーレ 1を swim up法において使用する場合、精液注入区画 42内に注入された運動精子がどの方向へ動いても精子移動区画 43 内に移動できるため、運動精子の採取効率がよい。前記精子移動区画 43は、運動精子を採取する作業を行いやすくするために、図 9に示されるように、さらに壁部 41 あるいは後述する外壁 44によって複数の収容区画に区画されて、てもよ、。

[0022] 本発明の精子選択採取用シャーレ 1の形状としては、該精子選択採取用シャーレ 1 を側壁 3の外側力把持しうることが容易な形状であれば特に限定されな、。該形状は、図 1〜図 5に示されるように、前記精液注入区画 42および精子移動区画 43からなる収容区画そのものの形状であってもよいし、図 6〜図 9に示されるように、該収容区画が中央部に配置された底部 2が円形のものや、図示されないが底面が多角形のもの等であってもよい。

前記収容区画そのものの形状力もなる精子選択採取用シャーレ 1においては、該収容区画は精子選択採取用シャーレ 1の内部を壁部 41を用いて区画することにより形成される。一方、前記収容区画を中央部に配置した精子選択採取用シャーレ 1においては、該収容区画は、精子選択採取用シャーレ 1の内部を壁部 41および底部 2 上に設けられた外壁 44を用いて区画することにより形成される。該外壁 44の高さは、側壁 3と同様、図 7に示されるように壁部 41よりも高く設定される。

[0023] 図 6および図 7に示される精子選択採取用シャーレ 1は、底部 2が円形である精子選択採取用シャーレ 1の中央部に、底面が長方形の収容区画が該底部 2の直径方向に延びるように設けられてなる。各収容区画、すなわち精液注入区画 42および精子移動区画 43は、精子選択採取用シャーレ 1の底部 2と、壁部 41と、別途底部 2上に設けられた外壁 44によって構成される。

図 8および図 9に示される精子選択採取用シャーレ 1もまた、底部 2が円形である精子選択採取用シャーレ 1の中央部に、底面が円形の収容区画が設けられてなる。精液注入区画 42は、精子選択採取用シャーレ 1の底部 2と壁部 41により構成され、精子移動区画 43は、精子選択採取用シャーレ 1の底部 2と、壁部 41と、別途設けられた外壁 44によって構成される。

[0024] このように、収容区画を中央部に配置した該精子選択採取用シャーレ 1は、従来のシャーレと形状が同じであり操作性がよい。該精子選択採取用シャーレ 1が内部に収容区画を有するものである場合、その大きさは必要最小限に小さく設計されることが好ましぐ具体的には外径が 30〜60mm程度であることが好ましい。

[0025] 本発明の精子選択採取用シャーレ 1には、さらに側壁 3の外周面に、凸部が形成されていてもよい。該凸部は、精子選択採取用シャーレ 1を側壁 3の外側力も把持する際に滑り止めとしての効果を有する。該凸部は側壁 3の外周面全周にわたって環状に設けられて、てもよ、が、外周面に部分的に設けられて、てもよ、。

また、該側壁 3は底部 2に対して鉛直方向に配置されていてもよいし、底部 2の鉛直方向に対してわずかに外側に傾斜するように配置されて、てもよ、。該側壁 3が底面 2の鉛直方向から傾斜してヽる場合、精子選択採取用シャーレ 1を側壁 3の外側から把持する際の滑り止め効果が向上し、より好ましい。

[0026] 本発明の精子選択採取用シャーレ 1の swim up法における使用方法を、図 6および図 7に示される精子選択採取用シャーレ 1について説明する。

まず、精子選択採取用シャーレ 1内部に培養液 45が満たされる。該培養液 45の量は、液面が壁部 41の上端よりもわずかに上方に位置する程度の量であることが好ましい。次いで、精液注入区画 42の下方に、濃縮された精液が注入される。該培養液 45の表面は、培養液 45の蒸発を防ぐためにパラフィン等のオイル 46で覆われる場合があるが、該オイル 46の注入は精液の注入前であっても注入後であってもよい。この状態で、精子は自身の運動性により培養液 45中を精液注入区画 42から精子移動区画 43へと壁部 41を越えて移動する。該壁部 41がある程度の幅を有していれば、精子の移動を視認可能である。精液の注入から十分〜数十分経過後、精子移動区画 43内に存在する精子を運動精子とみなし、注射針やピペット等の吸引用ノズルで培養液 45ごと採取する。

Claims

請求の範囲

[1] 底部と側壁とを有し、内部に複数の収容区画が設けられてなる精子選択採取用シヤーレであって、各収容区画は、前記側壁よりも低ぐかつ、上端が一定の幅を有する壁部により区画されてなり、前記収容区画は、精液が注入される一つの精液注入区画と、該精液注入区画と前記壁部を介して隣接し、該精液注入区画に注入された精液中の精子が移動しうる一つまたは二つ以上の精子移動区画とからなることを特徴とする精子選択採取用シャーレ。

[2] 前記収容区画の容量は、 0. 1〜3. OmLである請求項 1記載の精子選択採取用シヤーレ。

[3] 前記収容区画の壁部は、高さが l〜5mmであり、上端の幅が 0. 01〜20mmである請求項 1または 2記載の精子選択採取用シャーレ。

[4] 前記収容区画の壁部の上部端面には、精液注入区画側力精子移動区画側へ向かって高くなる傾斜が形成されてなる請求項 1〜3のいずれかに記載の精子選択採取用シャーレ。

[5] 前記精子選択採取用シャーレは、前記収容区画そのものの形状であり、該収容区画は該精子選択採取用シャーレの内部を前記壁部を用いて区画することにより形成される請求項 1〜4のいずれかに記載の精子選択採取用シャーレ。

[6] 前記精子選択採取用シャーレは、前記収容区画が中央部に設けられてなり、該収容区画は該精子選択採取用シャーレの内部を前記壁部と該精子選択採取用シヤーレの底部上に設けられた外壁を用いて区画することにより形成される請求項 1〜4のいずれかに記載の精子選択採取用シャーレ。

[7] 前記精子選択採取用シャーレは、底部が円形であり、前記収容区画は該底部の直径方向に延びる底面が長方形の区画である請求項 6記載の精子選択採取用シヤーレ。

[8] 前記精子選択採取用シャーレは、底部が円形であり、前記収容区画は、該底部の中央に配置された底面が円形の精液注入区画と、該精液注入区画の周囲に配置される該精液注入区画の底面と同心円の底面を有する精子移動区画とからなる請求項 6記載の精子選択採取用シャーレ。