JP4583007B2 - 新規ｇ−タンパク質及びその利用 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生体内のホルモン、オータコイド、神経伝達物質などの生理活性物質が結合することにより受容体が発するシグナルを増幅し、伝達する機能を有する新規Ｇ−タンパク質及びそれをコードするポリヌクレオチドに関する。また、本発明は、この新規Ｇ−タンパク質を介した細胞シグナル伝達を調節する物質のスクリーニング方法等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
G-タンパク質は、シグナル伝達における重要な媒介物である。すなわちG-タンパク質は、７回膜貫通型受容体であるG-タンパク質共役型受容体（以下、「GPCR」という；G-protein coupled receptor）が受けた刺激のシグナルを細胞内に運ぶ伝達器としての役割を果たす。GPCRは広範な種類の組織で発現しており、このシグナル伝達系がホルモン受容、神経伝達、細胞の増殖・分化のような広範な細胞機能の発現に介在することが明らかになってきている（現代化学増刊34、61〜70、1997）。
【０００３】
詳述すれば、G-タンパク質は、GTPと結合するαサブユニットおよび、βサブユニットとγサブユニットから構成されるヘテロ三量体である。膜表面にあるGPCRにホルモンや神経伝達物質などのリガンドが結合すると、GPCRが活性化され、そのシグナルがG−タンパク質に伝えられる。シグナルが伝えられたGタンパク質では、αサブユニットにGDPが結合した不活性型からGDPが放出され、これに代えてGTPが結合する活性化型に変換する。
【０００４】
活性型G-タンパク質は、GPCRから離れるとともに、GTP結合型αサブユニットとβγサブユニットとに解離する。活性型G-タンパク質は、標的エフェクターであるアデニル酸シクラーゼ、Ca²⁺チャネル、Ｋ⁺チャネル、ホスホリパーゼCβ等を促進又は抑制することにより、多彩な細胞機能を調節する。哺乳動物のＧ−タンパク質αサブユニットには、例えばＧｉ、Ｇｏ、Ｇｑ、ＧｓおよびＧｔなどが含まれる。また、典型的には、Ｇ−タンパク質αサブユニットは、アデニル酸シクラーゼの活性を促進するタイプ、アデニル酸シクラーゼの活性を抑制するタイプ、ホスホリパーゼの活性を促進するタイプおよび、Ｒｈｏにシグナルを伝達するタイプの４つに分類される。
【０００５】
活性型G-タンパク質のαサブユニットに結合したGTPは、αサブユニットが有するGTPaseの作用によりGDPとなり、不活性型に戻る（「シグナル伝達」17〜30頁、2001年11月１日、共立出版社）。
【０００６】
ＧＰＣＲ遺伝子及びその遺伝子産物、並びに、ＧＰＣＲシグナル伝達経路に関する遺伝子及びその遺伝子産物は疾患の潜在的な原因因子である（Ｓｐｉｅｇｅｌら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：１１１９〜１１２５（１９９３）；ＭｃＫｕｓｉｃｋら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．３０：１〜２６（１９９３）；Laniaら、European J. Endocrinology 145: 543~559 (2001)）。例えば、GPCRであるＶ２バソプレシンレセプターの遺伝子における特定の欠陥は、様々な形態の腎性尿崩症（Ｈｏｌｔｚｍａｎら、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．２：１２０１〜１２０４（１９９３））を引き起こすことが明らかにされている。またGαサブユニットにおける変異は、成長ホルモンを分泌する脳下垂体の成長ホルモン分泌細胞の腫瘍、機能亢進甲状腺腫、卵巣及び副腎の腫瘍で見られる(Meij, J.T.A.(1996) Mol. Cell. Biochem. 157:31-38; Aussel, C.他(1988) J. Immunol. 140:215-220)。そのためＧＰＣＲシグナルに関連する遺伝子産物は創薬ターゲットとして有用であり、現在上市されている薬の５０％以上はＧＰＣＲをターゲットにしたものであることが報告されている。（Nature Review Drug Discovery, 1,７ (2002)）。
【０００７】
一般的に、GPCRに対するリガンド研究を行う上で、GPCRがどのG−タンパク質と共役するかが重要となってくる（Trends in Pharmacological Science, 22, 560~564 (2001)）。従って、新規なG-タンパク質及びそれをコードする遺伝子を同定できれば、当該G-タンパク質が関与する細胞シグナル伝達の異常に起因する疾患の治療、診断に有用である。また、細胞シグナル伝達の異常に起因する疾患の改善剤、治療剤又は予防剤として有効な医薬のスクリーニングに用いることができる。または、細胞シグナル伝達を活性化および抑制することにより病状を改善又は予防することが可能な、改善剤、治療剤又は予防剤として有効な医薬のスクリーニングに用いることができる。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、新規G-タンパク質αサブユニット及びそれをコードするポリヌクレオチド、G-タンパク質共役型受容体及びこのG-タンパク質αサブユニットを介した細胞シグナル伝達系を活性化又は抑制できる物質、このような物質のスクリーニング方法及びスクリーニングキット等を提供することを主目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成するために、本発明者は研究を重ね、G-タンパク質αサブユニット間で保存されているGTP結合部位及びGTPase活性化部位と高い相同性を有するアミノ酸配列部分、及び、G-タンパク質αサブユニット間で保存されている３量体形成ドメインと高い相同性を有するアミノ酸配列部分を有するヒトの新規タンパク質を見出し、Gm1タンパク質と命名した。また、本発明者は、アミノ酸配列に関し同様の特徴を有するマウス由来のGm1タンパク質及びラット由来のGm1タンパク質も見出した。
【００１０】
また、Gm1発現ベクターを保持する細胞ではG-タンパク質のエフェクター活性が高くなること等を見出した。
【００１１】
さらに、Gm1タンパク質が、ヒトの脳、胸腺、精巣、脾臓、小腸、子宮及び心臓において高く発現していることを見出した。
【００１２】
これらのことから本発明者は、本タンパク質（Gm1タンパク質）が、ヒトの脳、胸腺、精巣、脾臓、小腸、子宮及び心臓において機能する、GPCR刺激による細胞内シグナル伝達に関与する分子、新規G-タンパク質αサブユニットであるとの確信を得て、本発明を完成させた。
【００１３】
すなわち、本発明は以下の各項のタンパク質及びポリヌクレオチド等を提供する。
【００１４】
項１． 以下の(1)又は(2)のタンパク質。
(2)配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
(2) 配列番号１に記載のアミノ酸配列と85％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、Ｇ−タンパク質共役型受容体刺激による細胞内シグナル伝達に関与するタンパク質。
【００１５】
項２． 配列番号25に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
【００１６】
項３． 配列番号26に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
【００１７】
項４． 以下の(3)又は(4)のタンパク質。
(3) 配列番号１に記載のアミノ酸番号96〜126のアミノ酸配列を有し、かつ、Ｇ−タンパク質共役型受容体刺激による細胞内シグナル伝達に関与するタンパク質
(4) 配列番号１に記載のアミノ酸番号96〜126のアミノ酸配列と95％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、Ｇ−タンパク質共役型受容体刺激による細胞内シグナル伝達に関与するタンパク質
項５． 以下の(5)又は(6)のタンパク質。
(5) 配列番号１に記載のアミノ酸番号１〜126のアミノ酸配列をＮ末端側に有し、かつ、Ｇ−タンパク質共役型受容体刺激による細胞内シグナル伝達に関与するタンパク質
(6) 配列番号１に記載のアミノ酸番号１〜126のアミノ酸配列と65％以上の相同性を有するアミノ酸配列をＮ末端側に有し、かつ、Ｇ−タンパク質共役型受容体刺激による細胞内シグナル伝達に関与するタンパク質
項６． 項１から５のいずれかに記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００１８】
項７． 以下の(7)又は(8)の塩基配列を有するポリヌクレオチド。
(7) 配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
(8) 配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドと85％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつ、Ｇ−タンパク質共役型受容体刺激による細胞内シグナル伝達に関与するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
項８． 配列番号27に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【００１９】
項９． 配列番号28に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【００２０】
項10． 以下の(9)又は(10)のポリヌクレオチド
(9) 配列番号２に記載の塩基番号289〜378の塩基配列を有し、かつ、Ｇ−タンパク質共役型受容体刺激による細胞内シグナル伝達に関与するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(10) 配列番号２に記載の塩基番号289〜378の塩基配列からなるポリヌクレオチドと90％以上の相同性を有する塩基配列を有し、かつ、Ｇ−タンパク質共役型受容体刺激による細胞内シグナル伝達に関与するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
項11． 以下の(11)又は(12)のポリヌクレオチド
(11) 配列番号２に記載の塩基番号１〜378の塩基配列を5'末端側に有し、かつ、Ｇ−タンパク質共役型受容体刺激による細胞内シグナル伝達に関与するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(12) 配列番号２に記載の塩基番号１〜378の塩基配列からなるポリヌクレオチドと70％以上の相同性を有する塩基配列を5'末端側に有し、かつ、Ｇ−タンパク質共役型受容体刺激による細胞内シグナル伝達に関与するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
項12． 項６から11のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む組み換えベクター。
【００２１】
項13． 項12に記載の組み換えベクターを保持する形質転換体。
【００２２】
項14． 項13に記載の形質転換体を培養し、培養された形質転換体から項１から５のいずれかに記載のタンパク質を回収する項１から５のいずれかに記載のタンパク質の製造方法。
【００２３】
項15． 以下の（13）又は(14)のポリヌクレオチドからなるアンチセンスポリヌクレオチド。
(13) 配列番号２に記載の塩基配列の連続する少なくとも15塩基に相補的な塩基配列からなり、かつ、項１から５のいずれかに記載のタンパク質の発現を阻害するポリヌクレオチド
(14) 配列番号２に記載の塩基配列の連続する少なくとも15塩基からなるポリヌクレオチドと細胞内条件下でハイブリダイズし、かつ、項１から５のいずれかに記載のタンパク質の発現を阻害するポリヌクレオチド
項16． 以下の(15)又は(16)のリボザイム。
(15) 配列番号２に記載の塩基配列のうちの二つの領域であって各が連続する少なくとも９塩基からなる二つの領域にそれぞれ相補的な二つのポリヌクレオチド領域を有し、かつ、項６から11のいずれかに記載のポリヌクレオチドを分解する活性を有するリボザイム
(16) 配列番号２に記載の塩基配列のうちの二つの領域であって各が連続する少なくとも９塩基からなる二つの領域にそれぞれ細胞内条件下でハイブリダイズする二つのポリヌクレオチド領域を有し、かつ、項６から11のいずれかに記載のポリヌクレオチドを分解する活性を有するリボザイム
項17． 項１から５のいずれかに記載のタンパク質を特異的に認識する抗体。
【００２４】
項18． 項１から５のいずれかに記載のタンパク質を有効成分とする、G-タンパク質共役型受容体刺激による細胞内シグナル伝達調節剤。
【００２５】
項19． 項１から５のいずれかに記載のタンパク質を有効成分とする、G-タンパク質共役型受容体刺激による細胞内シグナル伝達異常に起因する疾患の治療又は予防剤。
【００２６】
項20． 項６から11のいずれかに記載のポリヌクレオチドを有効成分とする、G-タンパク質共役型受容体刺激による細胞内シグナル伝達調節剤。
【００２７】
項21． 項６から11のいずれかに記載のポリヌクレオチドを有効成分とする、G-タンパク質共役型受容体刺激による細胞内シグナル伝達異常に起因する疾患の治療又は予防剤。
【００２８】
項22． 項15に記載のアンチセンスポリヌクレオチドを有効成分とする、G-タンパク質共役型受容体刺激による細胞内シグナル伝達調節剤。
【００２９】
項23． 項15に記載のアンチセンスポリヌクレオチドを有効成分とする、G-タンパク質共役型受容体刺激による細胞内シグナル伝達異常に起因する疾患の治療又は予防剤。
【００３０】
項24． 項16に記載のリボザイムを有効成分とする、G-タンパク質共役型受容体刺激による細胞内シグナル伝達調節剤。
【００３１】
項25． 項16に記載のリボザイムを有効成分とする、G-タンパク質共役型受容体刺激による細胞内シグナル伝達異常に起因する疾患の治療又は予防剤。
【００３２】
項26． 項17に記載の抗体を有効成分とする、G-タンパク質共役型受容体刺激による細胞内シグナル伝達調節剤。
【００３３】
項27． 項17に記載の抗体を有効成分とする、G-タンパク質共役型受容体刺激による細胞内シグナル伝達異常に起因する疾患の治療又は予防剤。
【００３４】
項28． 以下の(17)又は(18)のオリゴヌクレオチド
(17) 配列番号２に記載の塩基配列において連続する少なくとも17塩基からなり、かつ、配列番号２に記載のポリヌクレオチドを特異的に認識できるオリゴヌクレオチド
(18) 配列番号２に記載の塩基配列において連続する少なくとも17塩基と80％以上の相同性を有し、かつ、配列番号２に記載のポリヌクレオチドを特異的に認識できるオリゴヌクレオチド
項29． プローブ又はプライマーとして用いられる項28に記載のオリゴヌクレオチド。
【００３５】
項30． (a) 被験物質と、項12に記載の組み換えベクター及びＧ−タンパク質共役型受容体タンパク質をコードするDNAを含む組み換えベクターを保持する試験細胞とを接触させる工程と、
(b) 試験細胞におけるG-タンパク質のエフェクターの活性又はそれと相関する指標値を測定する工程と、
(c） このエフェクター活性又はそれと相関する指標値を、被験物質を接触させていない試験細胞の当該エフェクター活性又はそれと相関する指標値と比較して、試験細胞におけるエフェクター活性又はそれと相関する指標値を変動させる被験物質を選択する工程と
を含むG-タンパク質共役型受容体及び項１から５のいずれかに記載のタンパク質を介したシグナル伝達調節物質のスクリーニング方法。
【００３６】
項31． (a) 被験物質と、項12に記載の組み換えベクター及びＧ−タンパク質共役型受容体タンパク質をコードするDNAを含む組み換えベクターを保持する試験細胞とを接触させる工程と、
(b) 試験細胞のG-タンパク質のエフェクターの活性又はそれと相関する指標値を測定する工程と、
(c） このエフェクター活性を、項12に記載の組み換えベクターを保持せずＧ−タンパク質共役型受容体タンパク質をコードするDNAを含む組み換えベクターを保持する対照細胞に当該被験物質を接触させた場合の当該エフェクター活性又はそれと相関する指標値と比較して、試験細胞と対照細胞との間でエフェクター活性又はそれと相関する指標値に差が生じる被験物質を選択する工程と
を含むG-タンパク質共役型受容体及び項１から５のいずれかに記載のタンパク質を介したシグナル伝達調節物質のスクリーニング方法。
【００３７】
項32． (a) 被験物質と、項12に記載の組み換えベクター及びＧ−タンパク質共役型受容体タンパク質をコードするDNAを含む組み換えベクターを保持する試験細胞とを接触させる工程と、
(b) 試験細胞のG-タンパク質のエフェクターの活性又はそれと相関する指標値を測定する工程と、
(c） このエフェクター活性又はそれと相関する指標値を、Ｇ−タンパク質共役型受容体タンパク質をコードするDNAを含む組み換えベクターを保持せず項12に記載の組み換えベクターを保持する対照細胞に当該被験物質を接触させた場合の当該エフェクター活性又はそれと相関する指標値と比較して、試験細胞と対照細胞との間でエフェクター活性又はそれと相関する指標値に差が生じる被験物質を選択する工程と
を含むG-タンパク質共役型受容体及び項１から５のいずれかに記載のタンパク質を介したシグナル伝達調節物質のスクリーニング方法。
【００３８】
項33． (a) 被験物質及びＧ−タンパク質共役型受容体のリガンドと、項12に記載の組み換えベクター及びＧ−タンパク質共役型受容体タンパク質をコードするDNAを含む組み換えベクターを保持する試験細胞とを接触させる工程と、
(b) 試験細胞におけるG-タンパク質のエフェクター活性又はそれと相関する指標値を測定する工程と、
(c） このエフェクター活性又はそれと相関する指標値を、被験物質を接触させず前記リガンドを接触させた試験細胞の当該エフェクター活性又はそれと相関する指標値と比較して、試験細胞におけるエフェクター活性又はそれと相関する指標値を変動させる被験物質を選択する工程と
を含むG-タンパク質共役型受容体及び項１から５のいずれかに記載のタンパク質を介したシグナル伝達調節物質のスクリーニング方法。
【００３９】
項34． (a) 被験物質及びＧ−タンパク質共役型受容体のリガンドと、請求項12に記載の組み換えベクター及びＧ−タンパク質共役型受容体タンパク質をコードするDNAを含む組み換えベクターを保持する試験細胞とを接触させる工程と、
(b) 試験細胞におけるG-タンパク質のエフェクター活性又はそれと相関する指標値を測定する工程と、
(c) このエフェクター活性を、被験物質を接触させずに前記リガンドを接触させた試験細胞の当該エフェクター活性と比較して、試験細胞におけるエフェクター活性の変動を見る工程と、
(d) このエフェクター活性又はそれと相関する指標値の変動率を、Ｇ−タンパク質共役型受容体タンパク質をコードするDNAを含む組み換えベクターを保持せず請求項12に記載の組み換えベクターを保持する対照細胞に当該被験物質及び当該リガンドを接触させた場合の当該エフェクター活性又はそれと相関する指標値の変動率と比較して、試験細胞と対照細胞との間でエフェクター活性又はそれと相関する指標値の変動率に差が生じる被験物質を選択する工程と
を含むG-タンパク質共役型受容体及び請求項１から５のいずれかに記載のタンパク質を介したシグナル伝達調節物質のスクリーニング方法。
【００４０】
項35． (a) 被験物質と、項12に記載の組み換えベクターを保持する細胞の細胞膜画分及びGPCRをコードするDNAを含む組み換えベクターを保持する細胞の細胞膜画分、又は、項12に記載の組み換えベクター及びGPCRをコードするDNAを含む組み換えベクターを保持する細胞の細胞膜画分とを接触させる工程と、
(b) この細胞膜画分へのGTPの結合量を評価する工程と、
(c) このGTP結合の評価量を、被験物質を接触させていない前記細胞膜画分へのGTP結合の評価量と比較して、細胞膜画分へのGTP結合の評価量を変動させる被験物質を選択する工程と
を含むG-タンパク質共役型受容体及び項１から５のいずれかに記載のタンパク質を介したシグナル伝達調節物質のスクリーニング方法。
【００４１】
項36． (a) 被験物質及びＧ−タンパク質共役型受容体のリガンドと、項12に記載の組み換えベクターを保持する細胞の細胞膜画分及びGPCRをコードするDNAを含む組み換えベクターを保持する細胞の細胞膜画分、又は、項12に記載の組み換えベクター及びGPCRをコードするDNAを含む組み換えベクターを保持する細胞の細胞膜画分とを接触させる工程と、
(b) この細胞膜画分へのGTP結合量を評価する工程と、
(c） このGTP結合の評価量を、被験物質を接触させず前記リガンドを接触させた前記細胞膜画分におけるGTP結合の評価量と比較して、細胞膜画分へのGTP結合の評価量を変動させる被験物質を選択する工程と
を含むG-タンパク質共役型受容体及び項１から５のいずれかに記載のタンパク質を介したシグナル伝達調節物質のスクリーニング方法。
【００４２】
項37． (a) 被験物質と、項１から５のいずれかに記載のタンパク質を発現可能な試験細胞とを接触させる工程と、
(d) 試験細胞における項１から５のいずれかに記載のタンパク質の発現量を測定する工程と、
(e) この発現量を、被験物質を接触させない試験細胞の当該タンパク質の発現量と比較して、試験細胞における当該タンパク質の発現量を変動させる被験物質を選択する工程と
を含むＧ−タンパク質共役型受容体及び項１から５のいずれかに記載のタンパク質を介したシグナル伝達調節物質のスクリーニング方法。
【００４３】
項38． 項30から37のいずれかに記載のスクリーニング方法により得られるG-タンパク質共役型受容体及び項１から５のいずれかに記載のタンパク質を介したシグナル伝達の調節物質。
【００４４】
項39． 項38に記載の物質を有効成分とする、G-タンパク質共役型受容体及び項１から５のいずれかに記載のタンパク質を介したシグナル伝達の調節剤。
【００４５】
項40． 項38に記載の物質を有効成分とする、G-タンパク質共役型受容体及び項１から５のいずれかに記載のタンパク質を介したシグナル伝達異常に起因する疾患の治療又は予防剤。
【００４６】
項41． 項12に記載の組み換えベクターを保持する試験細胞と；G-タンパク質のエフェクターの活性又はそれと相関する指標値の測定用試薬とを含む、G-タンパク質共役型受容体及び項１から５のいずれかに記載のタンパク質を介したシグナル伝達調節物質のスクリーニングキット。
【００４７】
項42． 試験細胞が、さらにG-タンパク質共役型受容体をコードするDNAを有する組換えベクターを保持するものである項41に記載のスクリーニングキット。
【００４８】
項43． さらに、G-タンパク質共役型受容体のリガンドを含む項41又は42に記載のスクリーニングキット。
【００４９】
項44． さらに、G-タンパク質共役型受容体をコードするDNAを有する組み換えベクターを保持する対照細胞を含む項41、42又は43に記載のスクリーニングキット。
【００５０】
項45． さらに、項12に記載の組み換えベクターを保持する対照細胞を含む項41、42又は43に記載のスクリーニングキット。
【００５１】
項46． 項12に記載の組み換えベクターを保持する細胞と；項１から５のいずれかに記載のタンパク質に結合できるがGTPaseにより分解されないGTPアナログとを含む、G-タンパク質共役型受容体及び項１から５のいずれかに記載のタンパク質を介したシグナル伝達調節物質のスクリーニングキット。
【００５２】
項47． 細胞が、さらにG-タンパク質共役型受容体をコードするDNAを有する組み換えベクターを保持するものである項46に記載のスクリーニングキット。
【００５３】
項48． 項12に記載の組み換えベクターを保持する細胞と；及びG-タンパク質共役型受容体をコードするDNAを有する組み換えベクターを保持する細胞と；項１から５のいずれかに記載のタンパク質に結合できるがGTPaseにより分解されないGTPアナログとを含む、G-タンパク質共役型受容体及び項１から５のいずれかに記載のタンパク質を介したシグナル伝達調節物質のスクリーニングキット。
【００５４】
項49． さらに、G-タンパク質共役型受容体のリガンドを含む項46、47又は48に記載のスクリーニングキット。
【００５５】
項50． 項１から５のいずれかに記載のタンパク質を発現可能な細胞と；項28若しくは29に記載のオリゴヌクレオチド又は項17に記載の抗体とを含む、G-タンパク質共役型受容体及び項１から５のいずれかに記載のタンパク質を介したシグナル伝達調節物質のスクリーニングキット。
【００５６】
【発明の実施の形態】
本発明のタンパク質
＜第１のタンパク質＞
本発明の第１のタンパク質は、以下の(1)又は(2)のタンパク質である。
(1) 配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
(2) 配列番号１に記載のアミノ酸配列と85％以上の相同性を示すアミノ酸配列からなり、かつ、GPCR刺激による細胞内シグナル伝達に関与するタンパク質。
【００５７】
配列番号１に示すアミノ酸配列は、G-タンパク質αサブユニット間で保存されているGTP結合部位及びGTPase活性化部位のアミノ酸配列と相同性が高いアミノ酸配列部分を有する。これらの部分は、配列番号１のアミノ酸配列におけるアミノ酸番号126〜133、287〜292、353〜359、428〜435の各領域である。これらのアミノ酸は、既にG-タンパク質αサブユニットとして同定されているGs及びGolfのGTP結合部位及びGTPase活性化部位のアミノ酸配列（NATURE,117-127,1991,vol349）と一致している。
【００５８】
また、配列番号１に示すアミノ酸配列は、G-タンパク質αサブユニット間で特にGsファミリーに属するGs及びGolfで高く保存されている特徴的配列と同じ配列（配列番号１のアミノ酸番号119〜126）を有し、しかもG-タンパク質αサブユニット間で保存されているαヘリックス構造をとり得る。
【００５９】
これらのことから、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質はG-タンパク質αサブユニットであると考えられる。
【００６０】
本発明において、タンパク質には、当該タンパク質の他に生物学的機能を損なわない範囲で、その塩又は誘導体が含まれる。誘導体としては、それには限定されないが、C末端又はその他のカルボキシル基がアミド、エステル等に変換されたもの、N末端又はその他のアミノ基がホルミル基、アシル基等で保護されているもの等が挙げられる。また、塩としては酸付加塩が好ましい。酸付加塩としては、塩酸、リン酸、硫酸等の無機酸との塩；蟻酸、酢酸、プロピオン酸等の有機酸との塩が挙げられる。
【００６１】
(2)の改変されたタンパク質において、GPCR刺激による細胞内シグナル伝達に関与する分子として機能することは、後述する本発明のスクリーニング方法により確認できる。
【００６２】
(2)の改変されたタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１に示すアミノ酸配列と90％以上、特に95％以上の相同性を有することが好ましい。
【００６３】
(2)のタンパク質において、生物学的機能を喪失することなくどのアミノ酸残基を何個置換、欠失又は付加できるかの指標は、後述するGTP結合量の評価などにより見出すことができる。生物学的機能を喪失しない改変は、例えば、既に同定されている各種のG-タンパク質αサブユニットのアミノ酸配列との相同性が低い部分について行うことができる。
【００６４】
例えばアミノ酸の置換の場合には、タンパク質の構造保持の観点から、極性、電荷、可溶性、親水性／疎水性、極性等の点で、置換前のアミノ酸と類似した性質を有するアミノ酸に置換することができる。例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリンは非極性アミノ酸に分類され；セリン、トレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミンは極性アミノ酸に分類され；フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンは芳香族側鎖を有するアミノ酸に分類され；リジン、アルギニン、ヒスチジンは塩基性アミノ酸に分類され；アスパラギン酸、グルタミン酸は酸性アミノ酸に分類される。従って、同じ群のアミノ酸から選択して置換することができる。
【００６５】
また、(2)のタンパク質には、例えばヒトのタンパク質に対応する他の生物種のタンパク質が含まれる。このような他生物種の対応タンパク質は、本発明のポリヌクレオチドの全長又は一部を用いた他生物種の遺伝子ライブラリーのスクリーニングや5'−RACE等により同定された塩基配列から演繹的に同定できる。また、後述するNCBIのBlastサーチにより選抜された他の生物種の対応遺伝子から演繹的に同定することもできる。
【００６６】
(2)のタンパク質としては、例えば配列番号25に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、及び、配列番号26に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。
＜第２のタンパク質＞
本発明の第２のタンパク質は以下の(3)又は(4)のタンパク質である。
【００６７】
(3) 配列番号１に記載のアミノ酸番号96〜126のアミノ酸配列を有し、かつ、Ｇ−タンパク質共役型受容体刺激による細胞内シグナル伝達に関与するタンパク質
(4) 配列番号１に記載のアミノ酸番号96〜126のアミノ酸配列と95％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、Ｇ−タンパク質共役型受容体刺激による細胞内シグナル伝達に関与するタンパク質
(4)の改変されたタンパク質としては、(3)のタンパク質の配列番号１に記載のアミノ酸番号96〜126のアミノ酸配列と96％以上、特に97％以上の相同性を有することが好ましい。
【００６８】
(3)及び(4)のタンパク質は、GPCR刺激による細胞内シグナル伝達に関与する分子、例えばG-タンパク質αサブユニットとして機能するために、通常、配列番号１のアミノ酸配列におけるアミノ酸番号75〜133、287〜292、353〜359、428〜435に示すアミノ酸配列を有するか、又は、これらの領域に対して通常80％以上、特に90％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有することが好ましい。また、総アミノ酸数は、通常320〜480程度、特に350〜460程度であることが好ましい。
【００６９】
(3)のタンパク質の機能を損なうことなく(4)のタンパク質を特定する方法は前述した通りである。
＜第３のタンパク質＞
本発明の第３のタンパク質は、以下の(5)又は(6)のタンパク質である。
(5) 配列番号１に記載のアミノ酸番号１〜126のアミノ酸配列をＮ末端側に有し、かつ、GPCR刺激による細胞内シグナル伝達に関与するタンパク質
(6) 配列番号１に記載のアミノ酸番号１〜126のアミノ酸配列と65％以上の相同性を有するアミノ酸配列をＮ末端側に有し、かつ、GPCR刺激による細胞内シグナル伝達に関与するタンパク質
(6)の改変されたタンパク質としては、(5)のタンパク質のN末端の126個のアミノ酸配列（以下、「特異的N末端アミノ酸配列」という）に対応するアミノ酸配列部分が、(5)の特異的N末端アミノ酸配列と70％以上、特に75％以上の相同性を有することが好ましい。
【００７０】
(5)及び(6)のタンパク質は、GPCR刺激による細胞内シグナル伝達に関与する分子、例えばG-タンパク質αサブユニットとして機能するために、通常、配列番号１のアミノ酸配列におけるアミノ酸番号75〜133、287〜292、353〜359、428〜435に示すアミノ酸配列を有するか、又は、これらの領域に対して通常80％以上、特に90％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有することが好ましい。また、総アミノ酸数は、通常320〜480程度、特に350〜460程度であることが好ましい。
【００７１】
(5)のタンパク質の生物学的機能を損なうことなく(6)のタンパク質を特定する方法は、前述した通りである。
【００７２】
従来公知のG-タンパク質αサブユニットには、配列番号１のアミノ酸番号１〜126のアミノ酸配列又はこれに類似した配列を有するものは見出されていない。
＜本発明のタンパク質の製造方法＞
本発明の(1)〜(6)のタンパク質は、i)ヒト又は他の生物種の細胞ないしは組織から当該タンパク質を含む膜画分を分離した後、公知のタンパク質精製方法により精製する方法、ii)後述する本発明の形質転換体を用いる方法、又はiii)公知のタンパク質の化学合成法等により製造することができる。
【００７３】
i)の方法においては、ヒトを含む哺乳動物の細胞ないしは組織を制限なく使用できる。特にヒトの細胞ないしは組織を使用することが好ましく、ヒトの脳、子宮又は心臓由来の細胞又は組織を使用することがより好ましい。
【００７４】
本発明のタンパク質を含む膜画分は、細胞ないしは組織を例えばHE／PIバッファー（20mM Hepes, 2mM EDTA,1×Protenase阻害剤カクテル（ナカライテスク社））に懸濁し、超音波処理、ホモジナイザー、26ゲージ程度の針を通過させること等により破砕又は融解し、得られた破砕液又は融解液を100〜150×g程度で５〜10分間程度の遠心分離を行い、得られた上清を18,000〜20,000g程度で20〜30分間程度遠心分離し沈殿を回収することにより得られる。
【００７５】
このようにして得られる細胞膜画分に本発明のタンパク質が含まれることは、例えば後述する本発明の抗体を用いたウェスタンブロッティングなどにより確認できる。
【００７６】
公知のタンパク質精製方法としては、例えばイオン交換、ゲル濾過、アフィニティ等の各種クロマトグラフィーが挙げられる。
【００７７】
iii)の方法としては、例えば「The Peptide」Academic Press, New York(1966)に記載の方法や市販のタンパク質合成用樹脂を用いる方法が挙げられる。
【００７８】
また、(2)のタンパク質は、(1)のタンパク質をコードするDNAに対して、Molecular Cloning: A Laboratory Manual第２版第１〜３巻、Cold Spring Harber Laboratory Press(1989)、Methods in Enzymology p448(1989)、PCR A Practical Approach IRL Press p200(1991)等に記載の種々の方法、例えば部位特異的突然変異導入、変異プライマーを用いたPCR等の公知の方法により変異を施し、得られた変異DNAを保持する形質転換体から得ることもできる。(3)のタンパク質を(4)のタンパク質から得る方法及び(6)のタンパク質を(5)のタンパク質から得る方法も同様である。
＜本発明のタンパク質の用途＞
本発明のタンパク質は、GPCR刺激による細胞内シグナル伝達の調節剤として好適に使用できる。さらにいえば、この細胞内シグナル伝達の異常に起因する疾患の治療又は予防に好適に使用できる。特に、本発明のタンパク質の欠損、発現量低下又は機能低下による細胞内シグナル伝達に起因する疾患の治療又は予防に好適に使用できる。
本発明のポリヌクレオチド
本発明のポリヌクレオチドは、前述した本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドである。このようなポリヌクレオチドとしては、以下の第１及び第２のポリヌクレオチドが挙げられる。
＜第１のポリヌクレオチド＞
(7) 配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
(8) 配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドと85％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつ、Ｇ−タンパク質共役型受容体刺激による細胞内シグナル伝達に関与するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
本発明において、ポリヌクレオチド（オリゴヌクレオチドを含む）には、当該塩基配列を有するポリヌクレオチド及びそれに相補的なポリヌクレオチドが含まれる。また、ポリヌクレオチドには、特に言及しない限り、DNA及びRNAの双方が含まれる。また、DNAには、その塩基配列を有する１本鎖DNAの他に、それに相補的な１本鎖DNA、及び２本鎖DNAが含まれる。DNAには、特に言及しない限り、cDNA、ゲノムDNA及び合成DNAが含まれる。RNAには、特に言及しない限り、totalRNA、mRNA、rRNA及び合成RNAが含まれる。
【００７９】
(8)のポリヌクレオチドは、(7)のポリヌクレオチドと87％以上、特に90％以上の相同性を有することが好ましい。
【００８０】
(8)のポリヌクレオチドは、配列番号２に記載の塩基配列からなる(7)のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするものであることが好ましい。本発明において、ストリンジェントな条件としては、例えば２×SSC、１×デンハルト溶液中で60℃程度の条件が挙げられる。
【００８１】
また、生物学的機能を喪失しない改変は、例えば、既に同定されている各種のG-タンパク質αサブユニットのポリヌクレオチド配列と相同性が低い部分について行うことができる。
【００８２】
(7)のポリヌクレオチドにおいて、それがコードするタンパク質の生物学的機能を損なうことなく、どの塩基を何個置換、欠失又は付加できるかの指標は、後述するcAMPアッセイ又はGTP結合量の評価などにより見出すことができる。
【００８３】
また、第１のタンパク質について前述したように、翻訳後に得られるアミノ酸が置換前のアミノ酸と、極性、電荷、可溶性、親水性／疎水性、極性などの点で、置換前のアミノ酸と類似した性質を有するような塩基の置換も行うことができる。
【００８４】
また、一つのアミノ酸が数個の翻訳コドンを有する場合、この翻訳コドン内での塩基の置換も勿論可能である。例えば、アラニンは、GCA、GCC、GCG、GCTの４つの翻訳コドンを有するところ、当該コドンの３番目の塩基はATGC間で相互に置換可能である。
【００８５】
(8)のポリヌクレオチドには、例えばヒトのポリヌクレオチドに対応する他の生物種のポリヌクレオチドが含まれる。このようなポリヌクレオチドは、例えばNCBIのblastサーチ（www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）により選抜することができる。具体的には、例えば配列番号２における塩基番号289〜378を含むような塩基配列をNCBIのblastサーチにかけて、他の生物種の塩基配列データベース及びESTデータベースより相同性の高い配列を検索する。検索により選択された配列の塩基番号289〜378に相当する領域の相同性が例えば90％以上の塩基配列を選抜することにより、対応する他の生物種の対応遺伝子を選抜することができる。
【００８６】
(8)のポリヌクレオチドは、(7)のポリヌクレオチドの配列番号２における塩基番号１〜222、400〜858、877〜1056、1078〜1281、1306〜1377に対応する塩基配列が、(5)のポリヌクレオチドの当該塩基配列との間で通常75％以上、特に80％以上の相同性を有するものであることが好ましい。
【００８７】
(8)のポリヌクレオチドとしては、例えば配列番号27に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド、及び、配列番号28に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。
＜第２のポリヌクレオチド＞
(9) 配列番号２に記載の塩基番号289〜378の塩基配列を有し、かつ、Ｇ−タンパク質共役型受容体刺激による細胞内シグナル伝達に関与するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(10) 配列番号２に記載の塩基番号289〜378の塩基配列からなるポリヌクレオチドと90％以上の相同性を有する塩基配列を有し、かつ、Ｇ−タンパク質共役型受容体刺激による細胞内シグナル伝達に関与するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(10)の改変されたポリヌクレオチドは、(9)のポリヌクレオチドの配列番号２に記載の塩基番号289〜378の塩基配列に対応する塩基配列が、(9)の当該配列と93％以上、特に95％以上の相同性を有することが好ましい。
【００８８】
(10)のポリヌクレオチドは、配列番号２に記載の塩基番号289〜378の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドの配列を有することが好ましい。
【００８９】
(9)及び(10)のポリヌクレオチドは、それがコードするタンパク質がGPCR刺激による細胞内シグナル伝達に関与する分子、例えばG-タンパク質αサブユニットとして機能するために、通常、配列番号２の塩基配列における塩基番号223〜399、859〜876、1057〜1077、1282〜1305に示すアミノ酸配列を有するか、又は、これらの領域に対して通常85％以上、特に90％以上の相同性を有する塩基配列を有することが好ましい。また、総塩基数は、通常963〜1443程度、特に1053〜1383程度であることが好ましい。
【００９０】
(9)のポリヌクレオチドがコードするタンパク質の生物学的機能を損なうことなく(10)のポリヌクレオチドを特定する方法は、前述した通りである。
＜第３のポリヌクレオチド＞
(11) 配列番号２に記載の塩基番号１〜378の塩基配列を5'末端側に有し、かつ、Ｇ−タンパク質共役型受容体刺激による細胞内シグナル伝達に関与するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(12) 配列番号２に記載の塩基番号１〜378の塩基配列からなるポリヌクレオチドと70％以上の相同性を有する塩基配列を5'末端側に有し、かつ、Ｇ−タンパク質共役型受容体刺激による細胞内シグナル伝達に関与するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(12)の改変されたタンパク質は、(11)のタンパク質の5'末端の378個の塩基配列（以下、「特異的5'末端塩基配列」という）に対応する塩基配列部分が、(11)の特異的5'末端アミノ酸配列と75％以上、特に80％以上の相同性を有することが好ましい。
【００９１】
(12)のポリヌクレオチドは、配列番号２に記載の塩基番号１〜378の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドの配列を5'末端側に有することが好ましい。
【００９２】
(11)及び(12)のポリヌクレオチドは、それがコードするタンパク質がGPCR刺激による細胞内シグナル伝達に関与する分子、例えばG-タンパク質αサブユニットとして機能するために、通常、配列番号２の塩基配列における塩基番号223〜399、859〜876、1057〜1077、1282〜1305に示すアミノ酸配列を有するか、又は、これらの領域に対して通常85％以上、特に90％以上の相同性を有する塩基配列を有することが好ましい。また、総塩基数は、通常963〜1443程度、特に1053〜1383程度であることが好ましい。
【００９３】
(11)のポリヌクレオチドがコードするタンパク質の生物学的機能を損なうことなく(12)のポリヌクレオチドを特定する方法は、前述した通りである。
【００９４】
従来公知のG-タンパク質αサブユニットタンパク質をコードするポリヌクレオチドには、配列番号２の塩基番号１〜378の塩基配列又はこれに類似した配列を有するものは見出されていない。
＜本発明のポリヌクレオチドの製造方法＞
(7)〜(12)のポリヌクレオチドは、例えば、配列番号２に示す塩基配列に基づき合成したオリゴヌクレオチド（例えば後述する本発明のオリゴヌクレオチド）をプローブとして用いてヒトcDNAライブラリーをハイブリダイゼーションによりスクリーニングする方法により得ることができる。また例えば、ヒトcDNAライブラリーをPCRの鋳型として用いて、例えば配列番号２の塩基配列を基に適当なプライマー（例えば後述する本発明のオリゴヌクレオチド）を作製し、常法に従いPCRを行うことによっても得ることができる。また、化学合成によっても得ることができる。
【００９５】
cDNAライブラリーとしては、脳、胸腺、精巣、脾臓、小腸、子宮又は心臓由来のものを用いることが好ましい。
【００９６】
(9)のポリヌクレオチドの変異により(10)のポリヌクレオチドを得る方法及び(11)のポリヌクレオチドの変異により(12)のポリヌクレオチドを得る方法は前述した通りである。
＜本発明のポリヌクレオチドの用途＞
本発明のポリヌクレオチドは、GPCR刺激による細胞内シグナル伝達の調節剤として好適に使用できる。さらにいえば、この細胞内シグナル伝達の異常に起因する疾患の治療又は予防に好適に使用できる。特に、本発明のタンパク質の欠損、発現量低下又は機能低下による細胞内シグナル伝達に起因する疾患の治療又は予防に好適に使用できる。
【００９７】
また、本発明のポリヌクレオチドは、GPCR及び本発明のタンパク質を介した細胞シグナル伝達の調節物質のスクリーニングに好適に使用できる。
本発明の組み換えベクター・形質転換体
本発明の組み換えベクターは、本発明のポリヌクレオチド（ここでは、DNA）を含むベクターである。換言すれば本発明のタンパク質を発現可能なベクターである。
【００９８】
発現ベクターは、公知のベクターを宿主に応じて広い範囲から選択することができる。例えば大腸菌を宿主とする場合にはpBR322、pUC12、pUC119、pBluescript等、バチルス属細菌を宿主とする場合にはpUB110、pC194等が挙げられる。酵母を宿主とする場合にはYip5、Yep24等が挙げられる。昆虫細胞を宿主とする場合にはAcNPV等が挙げられる。動物細胞を宿主とする場合にはpUC18、pUC19等が挙げられる。
【００９９】
本発明の組み換えベクターは、常法に従い、本発明のポリヌクレオチドを発現ベクターのプロモーターの下流の発現可能な位置に連結することにより作製できる。
【０１００】
宿主も公知のものを制限なく使用できる。例えば大腸菌（例えばK12）、バチルス属細菌（例えばMI114）のような細菌、酵母（例えばAH22）、昆虫細胞（例えばSf細胞）、動物細胞（例えばCOS-7細胞、Vero細胞、CHO細胞等）が挙げられる。
【０１０１】
本発明の組み換えベクターによる宿主の形質転換方法も、公知の方法から、宿主に応じて適した方法を選択すればよい。公知の導入方法としては、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、DEAEデキストラン法等が挙げられる。形質転換体からベクターが有する薬剤耐性マーカーなどを指標にして本発明の形質転換体を選択すればよい。
本発明のタンパク質の製造方法
本発明のタンパク質の製造方法は、本発明の形質転換体を培養し、培養された形質転換体から本発明のタンパク質を回収する方法である。
【０１０２】
形質転換体の培養条件は、形質転換体の種類に応じた条件を適宜選択すればよい。
【０１０３】
本発明の形質転換体が微生物である場合は、微生物の培養に通常使用される液体培地又は平板培地を用いて培養すればよい。培養温度は微生物の生育可能温度内であればよく、例えば15〜40℃程度が挙げられる。培地のpHも微生物の生育可能範囲であればよく、例えば6〜8程度が挙げられる。培養時間は、その他の培養条件により異なるが、通常１〜５日間程度、特に１〜２日間程度とすればよい。温度シフト型やIPTG誘導型等の誘導型の発現ベクターを用いる場合には、誘導時間は１日間以内、特に数時間程度とすればよい。
【０１０４】
本発明の形質転換体が哺乳動物細胞である場合にも、当該細胞に応じて適した条件で培養すればよい。例えばFBSを添加したDMEM培地（ニッスイ社製等）を用い、５％CO₂存在下に36〜38℃程度の温度で、数日ごとに新しい培地に交換しながら培養することができる。細胞がコンフルエントになるまで増殖したら、例えばトリプシンPBS溶液を加えて個々の細胞に分散させ、得られた細胞の懸濁液を数倍に希釈して新しいシャーレに播種し継代を続ければよい。培養日数は、通常２〜５日間程度、特に２〜３日間程度とすることが好ましい。
【０１０５】
形質転換体が昆虫細胞の場合も、細胞の種類に応じて適した培養条件とすればよい。例えばFBS及びYeastlateを含むGrace's medium等の昆虫細胞用培地を用いて、25〜35℃程度で培養することができる。培養時間は１〜５日間程度、特に２〜３日間程度とすることが好ましい。また、ベクターとしてBaculovirus等のウィルスを含む形質転換体の場合は、培養時間は細胞質効果が現れて細胞が死滅する前まで（例えば３〜７日間程度、特に４〜６日間程度）とするのが好ましい。
【０１０６】
培養終了後、形質転換体の細胞を遠心分離等で集め、必要に応じて、細胞を適当なバッファーに懸濁した後、ポリトロン、超音波処理、ホモジナイザー等で破砕すればよい。得られた破砕液を100〜150ｇ程度で５〜10分間程度遠心分離し、上清を18,000〜20,000ｇ程度で20〜30分間程度遠心分離し、沈殿を回収することにより、細胞膜画分が得られる。
【０１０７】
得られた膜画分を、公知のタンパク質精製方法、例えばイオン交換、疎水、ゲルろ過、アフィニティ等の各種クロマトグラフィーに供することにより、本発明のタンパク質を精製することができる。
【０１０８】
本発明のタンパク質は、例えばヒスチジンタグを結合させた状態で発現させたり、グルタチオンSトランスフェラーゼ融合タンパク質として発現させることができる。前者の場合には金属キレートアフィニティカラムを用い、後者の場合にはグルタチオンSトランスフェラーゼモノクローナル抗体カラムを用いることにより、より簡便に本発明のタンパク質を精製することができる。
本発明のアンチセンスポリヌクレオチド
＜構成＞
本発明のアンチセンスポリヌクレオチド（以下、「アンチセンス」という）は、以下の（13）又は(14)のポリヌクレオチドである。
(13) 配列番号２に記載の塩基配列の連続する少なくとも15塩基に相補的な塩基配列からなり、かつ、本発明のタンパク質の発現を阻害するポリヌクレオチド
(14) 配列番号２に記載の塩基配列の連続する少なくとも15塩基と細胞内条件下でハイブリダイズし、かつ、本発明のタンパク質の発現を阻害するポリヌクレオチド
本発明のアンチセンスは、本発明のタンパク質をコードするmRNAとハイブリダイズしてmRNAからタンパク質への翻訳を阻害することまたは、ｍRNAを分解することにより、このタンパク質の発現を阻害する。
【０１０９】
(13)のアンチセンスは、配列番号２に記載のポリヌクレオチドの、少なくとも30塩基、特に少なくとも50塩基に相補的な塩基配列を有することが好ましい。(14)のアンチセンスも、配列番号２に記載のポリヌクレオチドの、少なくとも30塩基、特に少なくとも50塩基からなるポリヌクレオチドと細胞内条件下でハイブリダイズするものであることが好ましい。
【０１１０】
アンチセンスの塩基数の上限は特に限定されないが、通常60塩基程度もあれば十分に目的を達成できる。
【０１１１】
本発明において細胞内条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドとしては、以下のストリンジェントな条件でハイブリダイズするようなポリヌクレオチドが挙げられる。ストリンジェントな条件としては、例えば２×SSC、１×デンハルト溶液中で60℃程度の条件が挙げられる。
【０１１２】
また、(13)のアンチセンスは、配列番号２の塩基番号１〜378の領域及び塩基番号379〜1377の領域の双方にまたがる連続する少なくとも15塩基に相補的な塩基配列を有することが好ましい。
【０１１３】
同様に、(14)のアンチセンスも、配列番号２の塩基番号１〜378の領域及び塩基番号379〜1377の領域の双方にまたがる連続する少なくとも15塩基からなるポリヌクレオチドと細胞内条件下でハイブリダイズするものであることが好ましい。
【０１１４】
また、(13)及び(14)のポリヌクレオチドにおける「配列番号２に記載の塩基配列の連続する少なくとも15塩基」は、配列番号２の5'末端に近いほど好ましい。
【０１１５】
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、１本鎖DNA、２本鎖DNA、１本鎖RNA、２本鎖RNA又はDNA・RNAハイブリッドのいずれであってもよい。２本鎖RNAを用いる場合は一般的にはRNAiと呼ばれている。また、本発明のタンパク質の発現を阻害する限り、これらのヌクレオチドの誘導体であってもよい。誘導体としては、ホスホロチオエートDNA、H-ホスホネートDNAなどを例示できる。
【０１１６】
本発明のアンチセンスによる本発明のタンパク質の発現の阻害は、例えば以下の方法で確認できる。ヒトの脳由来の細胞に、5nM〜10μM程度のアンチセンスを、必要に応じてリポフェクション試薬、リポフェクタミン試薬、リポソーム等の公知の細胞内導入試薬とともに加える。次いで、この細胞から細胞抽出液を公知の方法で調製し、後述する本発明の抗体を用いて、ELISAやウェスタンブロット等の公知の方法で本発明のタンパク質の発現量を測定すればよい。この発現量をアンチセンス非添加の場合と比較する。
【０１１７】
本発明のアンチセンスとしては、本発明のタンパク質の発現量を、アンチセンスを添加しない場合の例えば70％以下、好ましくは50％以下にするものが挙げられる。
【０１１８】
本発明のアンチセンスは、公知の化学合成法により製造できる。
＜アンチセンスの用途＞
本発明のアンチセンスは、GPCR刺激による細胞内シグナル伝達の調節剤として好適に使用できる。さらにいえば、この細胞内シグナル伝達の異常に起因する疾患の治療又は予防に好適に使用できる。特に、この細胞内シグナル伝達の異常亢進を抑制する目的に好適に使用できる。
リボザイム
＜構成＞
本発明のリボザイムは、以下の(15)又は(16)のリボザイムである。
(15) 配列番号２に記載の塩基配列のうちの二つの領域であって各が連続する少なくとも９塩基からなる二つの領域にそれぞれ相補的な二つのポリヌクレオチド領域を有し、かつ、本発明のポリヌクレオチドを分解する活性を有するリボザイム
(16) 配列番号２に記載の塩基配列のうちの二つの領域であって各が連続する少なくとも９塩基からなる二つの領域にそれぞれ細胞内条件下でハイブリダイズする二つのポリヌクレオチド領域を有し、かつ、本発明のポリヌクレオチドを分解する活性を有するリボザイム
(15)のリボザイムは、配列番号２に記載の塩基配列のうちの二つの領域であって各が連続する少なくとも10塩基、特に11塩基からなる二つの領域にそれぞれ相補的な二つのポリヌクレオチド領域を有することが好ましい。
【０１１９】
(16)のリボザイムは、配列番号２に記載の塩基配列のうちの二つの領域であって各が連続する少なくとも10塩基、特に11塩基からなる二つの領域にそれぞれ細胞内条件下でハイブリダイズする二つのポリヌクレオチド領域を有することが好ましい。
【０１２０】
(15)及び(16)のリボザイムにおいて、配列番号２に記載の塩基配列のうちの二つの領域は、隣接していても離れていてもよいが、それらの領域間には１〜４塩基程度の塩基が存在することが好ましい。例えばハンマーヘッド型リボザイムでは、１塩基が存在する場合が挙げられ、ヘアピン型リボザイムでは４塩基が存在する場合が挙げられる。
【０１２１】
リボザイムは、RNAの特定の部位を認識するアンチセンス配列を含むRNA分子であり、かつ、RNA切断酵素活性を有する。これによりリボザイムは、標的RNAを識別し、RNAの特定部位を特異的に切断する。
【０１２２】
本発明のリボザイムは、ハンマーヘッド型及びヘアピン型のいずれであってもよい。ハンマーヘッド型は、通常NUX（NはG、U、C又はAであり、XはC、U又はAである）を認識し、Xの3'側の位置でmRNAを切断する。
【０１２３】
本発明のハンマーヘッド型リボザイムとしては、例えば以下の塩基配列を有するリボザイムを例示できる。
TCGCCTCCTTCTGATGAGGCCGAAAGGCCGAAACCGCCTCGCGC（配列番号３）の塩基配列を有するリボザイム。この塩基配列を有するリボザイムは高次構造を採った後に配列番号２の塩基番号273〜295の塩基配列を認識する。
CGGCCGCCCGCTGATGAGGCCGAAAGGCCGAAACTGGGGCCAGC（配列番号４）の塩基配列を有するリボザイム。この塩基配列を有するリボザイムは高次構造を採った後に配列番号２の塩基番号111〜133の塩基配列を認識する。
CAGCGGCCGCCTGATGAGGCCGAAAGGCCGAAACTGTAGCACA（配列番号５）の塩基配列を有するリボザイム。この塩基配列を有するリボザイムは高次構造を採った後に配列番号２の塩基番号８〜30の塩基配列を認識する。
【０１２４】
また、ヘアピン型は、通常NNNG/CN*GUCNNNNNNNN（NはG、U、C又はA）を認識し、N*G間でmRNAを切断する。
【０１２５】
本発明のヘアピン型リボザイムとしては、例えば以下の塩基配列を有するリボザイムを例示できる。
TCGCCTCCTTAGAAGCCTACCAGAGAAACACACGTTGTGGTATATTACCTGGTA（配列番号６）の塩基配列を有するリボザイム。この塩基配列を有するリボザイムは高次構造を採った後に配列番号２の塩基番号287〜295の塩基配列を認識する。
CGGCCGCCCGAGAAGGGGACCAGAGAAACACACGTTGTGGTATATTACCTGGTA（配列番号７）の塩基配列を有するリボザイム。この塩基配列を有するリボザイムは高次構造を採った後に配列番号２の塩基番号116〜133の塩基配列を認識する。
CAGCGGCCGCAAGAAGTAGACCAGAGAAACACACGTTGTGGTATATTACCTGGTA（配列番号８）の塩基配列を有するリボザイム。この塩基配列を有するリボザイムは高次構造を採った後に配列番号２の塩基番号12〜30の塩基配列を認識する。
【０１２６】
本発明のリボザイムは、通常RNAからなるが、デオキシリボヌクレオチドを含むものや、生体内で分解され難いホスホチオエートDNA等の誘導体も本発明のリボザイムに含まれる。
【０１２７】
本発明のリボザイムは、周知の化学合成法、in vitro又はin vivoでの転写等により作製できる。具体的には、in vitro での転写では、例えばT7、T3又はSP6等のプロモーターをコードするDNAの下流に配列番号３、４、５、６、７又は８の配列に相補的な配列を有するDNAを連結する。このDNAを鋳型に用いてRNAポリメラーゼにより転写反応を行う。得られる転写産物をリボザイム用のRNAとして用いることができる。
【０１２８】
また、in vivoでの転写では、配列番号３、４、５、６、７又は８の配列に相補的な配列を有するDNAを哺乳動物の発現ベクターに組み込み、この発現ベクターを哺乳動物細胞に導入する。細胞の転写機構により配列番号３、４、５、６、７又は８の配列を有するRNAが合成される。
＜リボザイムの用途＞
本発明のリボザイムは、GPCR刺激による細胞内シグナル伝達の調節剤として好適に使用できる。さらにいえば、この細胞内シグナル伝達の異常に起因する疾患の治療又は予防に好適に使用できる。特に、この細胞内シグナル伝達の異常亢進を抑制する目的に好適に使用できる。
本発明の抗体
＜構成＞
本発明の抗体は、本発明のタンパク質を特異的に認識する抗体である。本発明の抗体は、ポリクローナル抗体でもよく、モノクローナル抗体でもよい。また本発明の抗体には、本発明のタンパク質を構成するアミノ酸配列の連続する５アミノ酸、好ましくは10アミノ酸からなるポリペプチドに対して抗原結合性を有する抗体も含まれる。さらに、これらの抗体の誘導体（キメラ抗体等）やペルオキシダーゼのような酵素で標識したものも本発明の抗体に含まれる。
＜本発明の抗体の製造方法＞
これらの抗体は、周知の製造方法（例えばCurrent protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al.(1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.12〜11.13）に従って製造することができる。
【０１２９】
具体的には、本発明の抗体がポリクローナル抗体である場合には、本発明のタンパク質を用いて家兎等の非ヒト動物を免疫し、この免疫動物の血清から常法に従って得ることができる。また本発明の抗体がモノクローナル抗体である場合には、例えば、本発明のタンパク質又はその部分配列を有するポリペプチドを用いてマウス等の非ヒト動物を免疫し、この免疫動物の脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させることにより得られたハイブリドーマから得ることができる（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al.(1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.4〜11.11）。＜抗体の用途＞
本発明の抗体は、GPCR刺激による細胞内シグナル伝達の調節剤として好適に使用できる。さらにいえば、この細胞内シグナル伝達の異常に起因する疾患の治療又は予防に好適に使用できる。特に、この細胞内シグナル伝達の異常亢進を抑制する目的に好適に使用できる。
【０１３０】
また本発明の抗体は、本発明のタンパク質の精製用のアフィニティクロマトグラフィー、本発明のタンパク質の発現に影響を与える物質のスクリーニングにも好適に使用できる。
本発明のオリゴヌクレオチド
本発明のオリゴヌクレオチドは、以下の(17)又は(18)のオリゴヌクレオチドである。
(17) 配列番号２に記載の塩基配列において連続する少なくとも17塩基からなり、かつ、配列番号２に記載のポリヌクレオチドを特異的に認識できるオリゴヌクレオチド
(18) 配列番号２に記載の塩基配列において連続する少なくとも17塩基と80％以上の相同性を有し、かつ、配列番号２に記載のポリヌクレオチドを特異的に認識できるオリゴヌクレオチド
(17)及び(18)のオリゴヌクレオチドの長さは、その用途に応じて適宜設定すればよい。配列番号２の全長配列からなるものであってもよい。
【０１３１】
(18)のオリゴヌクレオチドは、(17)のオリゴヌクレオチドと85％以上、特に90％以上の相同性を有することが好ましい。
【０１３２】
(17)及び(18)のオリゴヌクレオチドにおいて「特異的に認識する」とは、このオリゴヌクレオチドを用いて、例えばノーザンブロットやPCR等の公知の塩基配列検出手段により、配列番号２に記載の塩基配列を特異的又は選択的に検出できることをいう。
【０１３３】
本発明のオリゴヌクレオチドは、本発明のDNAの発現によって生じたRNA又はそれに由来するポリヌクレオチドを特異的に検出又は増幅するプローブ又はプライマーとして使用できる。具体的には、ノーザンブロット、in situ ハイブリダイゼーション又はPCRのような、特定塩基配列を検出する公知の方法においてプローブ又はプライマーとして使用できる。
【０１３４】
これにより本発明のDNAの発現の有無又は発現レベルを評価できる。従って、本発明のオリゴヌクレオチドは、本発明のタンパク質の欠損、発現量の異常増加又は低下によるシグナル伝達異常に起因する疾患の診断に好適に使用できる。被験試料は、被験者の子宮等の一部を採取し、それから常法に従って調製したtotalRNA又はそのRNAから調製される各種のポリヌクレオチドを用いてもよい。
【０１３５】
本発明のオリゴヌクレオチドとして、例えば5'-ATGGGTCTGTGCTACAGTCTGCGG（配列番号９）の塩基配列を有するもの、5'-ACGATGGTGCTTTTCCCAGACTCACCAGCCCCGAGCA（配列番号１０）の塩基配列を有するもの等が挙げられる。このオリゴヌクレオチドセットは本発明のタンパク質を増幅するPCRプライマーとして好適に使用できる。
本発明のスクリーニング方法
本発明のポリヌクレオチドを用いて、GPCR及び本発明のタンパク質を介した細胞シグナル伝達を活性化又は阻害（若しくは抑制）する物質をスクリーニングすることができる。
【０１３６】
GPCR刺激のシグナルは、G-タンパク質αサブユニット上でのGDP/GTP交換反応によるG-タンパク質の活性化を介してエフェクターに伝達される。従って、このエフェクターの活性の変動を指標に被験物質を探索すれば、GPCR及びG-タンパク質αサブユニットを介したシグナル伝達を活性化又は阻害する物質を得ることができる。また、G-タンパク質を発現している細胞の膜画分へのGTP結合量の変動を指標に被験物質を探索することによっても、GPCR及びG-タンパク質αサブユニットを介したシグナル伝達を活性化又は阻害する物質を得ることができる。
【０１３７】
この他、本発明のタンパク質の発現量を変動させる被験物質を探索することによっても、GPCR及びG-タンパク質αサブユニットを介したシグナル伝達を活性化又は阻害する物質を得ることができる。
＜第 1 の方法＞
(a) 被験物質と、本発明のポリヌクレオチド（ここでは本発明のタンパク質をコードするDNA）を含む組み換えベクター及びGPCRをコードするDNAを含む組み換えベクターを保持する試験細胞とを接触させる工程と、
(b) 試験細胞におけるG-タンパク質のエフェクターの活性又はそれと相関する指標値（以下、「エフェクター活性」と略称する）を測定する工程と、
(c) このエフェクター活性を、被験物質を接触させていない試験細胞の当該エフェクター活性と比較して、試験細胞におけるエフェクター活性を変動させる被験物質を選択する工程と
を含むGPCR及び本発明のタンパク質を介したシグナル伝達調節物質のスクリーニング方法。
【０１３８】
第1の方法によると、GPCRのアゴニストを選択することができる。
【０１３９】
本発明のタンパク質をコードするDNAを有する組換えベクター及びGPCRをコードするDNAを有する組換えベクターを保持させる細胞としては、それには限定されないが、哺乳動物細胞又は昆虫細胞等を用いることができる。哺乳動物細胞としては、例えばVero細胞、Hela細胞、CV1細胞、COS1細胞、CHO細胞等の公知の細胞を制限なく使用できる。昆虫細胞としては、例えばSf細胞、MG1細胞、High Five^TM細胞等の公知の細胞を制限なく使用できる。ベクターの種類も特に制限されず、細胞の種類に応じて公知のベクターの中から選択すればよい。
【０１４０】
GPCRをコードするDNAは、GPCRデータベース（www.cmbi.kun.nl/7tm/）に記載の塩基配列に基づき設計したプローブを用いてヒトcDNAライブラリーをスクリーニングする方法、前記塩基配列に基づき設計したプライマーを用いてヒトcDNAライブラリーを鋳型にしてPCRを行う方法、又は、化学合成法等により得ることができる。
【０１４１】
G-タンパク質のエフェクターは、G-タンパク質αサブユニットが標的とするエフェクター及びG-タンパク質βγサブユニットが標的とするエフェクターのいずれでもよい。また、G-タンパク質のエフェクター活性と相関する指標値も測定対象にすることができる。
【０１４２】
G-タンパク質αサブユニットが標的とするエフェクターとしては、アデニル酸シクラーゼ、Ca²⁺チャネル、K⁺チャネル、ホスホリパーゼCβ等が挙げられる。アデニル酸シクラーゼの活性は細胞内cAMP量を測定することにより評価できる。Ca²⁺チャネルの活性は細胞膜電位を測定することにより評価できる。K⁺チャネルの活性は細胞膜電位を測定することにより評価できる。ホスホリパーゼCβの活性はCa²⁺量を測定することにより評価できる。
【０１４３】
G-タンパク質βγサブユニットが標的とするエフェクターとしては、アデニル酸シクラーゼ、Ca²⁺チャネル、K⁺チャネル、ホスホリパーゼCβ、ホスファチジルイノシトール3-キナーゼβ又はγ等が挙げられる。ホスファチジルイノシトール3-キナーゼβ又はγの活性はCa²⁺量を測定することにより評価できる。
【０１４４】
活性を測定するエフェクターとしては、G-タンパク質αサブユニットが標的とするエフェクターが好ましく、アデニル酸シクラーゼがより好ましい。アデニル酸シクラーゼの活性を反映する細胞内cAMP量は、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウシ等を免疫して得られた抗cAMP抗体と¹²⁵I標識cAMPを使用したRIA、抗cAMP抗体と標識cAMPとを組み合わせた他のEIA、抗cAMP抗体をproteinA又は抗cAMP抗体産生に用いた動物のIgG等に対する抗体等を使用して固定したシンチラントを含むビーズと¹²⁵I標識cAMPとを使用するSPA法、抗cAMP抗体と酵素ドナー結合cAMPと酵素空アクセプターとを組み合わせたEFC法等の公知の方法により測定できる。これらの測定方法は市販のキットを用いて行える。
【０１４５】
また細胞内cAMP量は、例えば、cAMPに反応するCRE（cAMP response element）を含むDNAをレポーター遺伝子ベクターのレポーター遺伝子の上流に挿入したCRE-レポーター遺伝子ベクターを作製して試験細胞内にこのベクターも導入しておき、レポーター遺伝子の発現量を測定することによっても評価できる。CRE-レポーター遺伝子ベクターを導入した試験細胞において、cAMP量の上昇を伴う刺激は、CREを介したレポーター遺伝子発現とそれに引き続くレポータータンパク質の産生を誘導する。逆にcAMP量の減少は、CREを介したレポータータンパク質の産生を減少させる。CRE-レポーター遺伝子ベクターを用いることにより、cAMP量を簡便かつ高感度に測定することができる。
【０１４６】
レポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ遺伝子、分泌型アルカリフォスファターゼ（SEAP）遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）遺伝子、β-ガラクトシダーゼ遺伝子等の公知のものを制限なく使用できる。これらの遺伝子の発現量は以下のような市販の測定キットを用いて測定できる。ルシフェラーゼ遺伝子の発現量は、細胞溶解液に発光基質であるルシフェリン（例えば東洋インキ社製）を添加し基質の分解による発光をルミノメーター、液体シンチレーションカウンター又はトップカウンター等を用いて測定すればよい。アルカリフォスファターゼ遺伝子の発現量は、例えばLμMi-Phos530（和光純薬社製）を用いて測定できる。クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子の発現量は、FAST CAT Chrolamphenicol Acetyltransferase Assay Kit(和光純薬社製)を用いて測定できる。β-ガラクトシダーゼ遺伝子の発現量はAurora Gal-XE（和光純薬社製）を用いて測定できる。
【０１４７】
例えばルシフェラーゼ遺伝子を用いる場合には、CREを含むDNAを、ピッカジーンベイシックベクター又はピッカジーンエンハンサーベクター等（東洋インキ社製）等のルシフェラーゼ遺伝子上流のマルチクローニングサイトに挿入し、これをCRE-レポーター遺伝子ベクターとして使用できる。
【０１４８】
被験物質の種類は特に限定されない。例えばタンパク質、ペプチド、非ペプチド性化合物（ヌクレオチド、アミン、糖質、脂質等）、有機低分子化合物、無機低分子化合物、醗酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液等が挙げられる。
【０１４９】
細胞への被検物質の接触は、細胞が死滅せず、かつ、導入したベクターから本発明のタンパク質及びGPCRが発現できる条件（温度、pH、培地成分など）で行えばよい。細胞に接触させる被験物質の濃度は、物質の種類によっても異なるが、例えば0.001〜10μM程度とすることができる。
【０１５０】
被験物質を接触させた試験細胞のエフェクター活性が、被験物質を接触させない試験細胞のエフェクター活性に比べて、例えば25％程度、好ましくは50％程度、さらに好ましくは100％程度増大するような被験物質をGPCRのアゴニストとして選択することができる。
＜第 2 の方法＞
(a) 被験物質と、本発明のポリヌクレオチド（ここでは本発明のタンパク質をコードするDNA）を含む組み換えベクター及びGPCRをコードするDNAを含む組み換えベクターを保持する試験細胞とを接触させる工程と、
(b) 試験細胞のG-タンパク質のエフェクターの活性を測定する工程と、
(c) このエフェクター活性を、本発明のタンパク質をコードするDNAを含む組み換えベクターを保持せずGPCRをコードするDNAを含む組み換えベクターを保持する対照細胞に当該被験物質を接触させた場合の当該エフェクター活性と比較して、試験細胞と対照細胞との間でエフェクター活性に差が生じる被験物質を選択する工程と
を含むGPCR及び本発明のタンパク質を介したシグナル伝達調節物質のスクリーニング方法。
【０１５１】
第2の方法では、本発明のタンパク質の発現ベクターを保持する試験細胞のエフェクター活性の方が、このベクターを保持しない対照細胞のエフェクター活性より高くなるような被験物質を探索すればよい。これによりGPCR及び本発明のタンパク質を介したシグナル伝達のいずれかの段階を活性化する物質を候補物質として選択することができる。
【０１５２】
試験細胞において対照細胞に比べてエフェクター活性が例えば20％程度、好ましくは50％程度、さらに好ましくは100％程度高くなるような被験物質をシグナル伝達活性化物質として選択することができる。
【０１５３】
その他の構成は前述した第1の方法と同じである。
＜第３の方法＞
(a) 被験物質と、本発明のポリヌクレオチド（ここでは本発明のタンパク質をコードするDNA）を含む組み換えベクター及びGPCRをコードするDNAを含む組み換えベクターを保持する試験細胞とを接触させる工程と、
(b) 試験細胞のG-タンパク質のエフェクターの活性を測定する工程と、
(c) このエフェクター活性又はそれと相関する指標値を、GPCRをコードするDNAを含む組み換えベクターを保持せず本発明のタンパク質をコードするDNAを含む組み換えベクターを保持する対照細胞に当該被験物質を接触させた場合の当該エフェクター活性と比較して、試験細胞と対照細胞との間でエフェクター活性に差が生じる被験物質を選択する工程と
を含むGPCR及び本発明のタンパク質を介したシグナル伝達調節物質のスクリーニング方法。
【０１５４】
第３の方法では、GPCRの発現ベクターを保持する試験細胞のエフェクター活性の方が、GPCRの発現ベクターを保持しない対照細胞のエフェクター活性より高くなるような被験物質を探索すればよい。これによりGPCRのアゴニストを候補物質として選択することができる。
【０１５５】
試験細胞において対照細胞に比べてエフェクター活性が例えば20％程度、好ましくは50%程度、さらに好ましくは100%程度高くなるような被験物質をシグナル伝達活性化物質として選択することができる。
【０１５６】
その他の構成は前述した第１の方法と同じである。
＜第４の方法＞
(a) 被験物質及びGPCRのリガンドと、本発明のポリヌクレオチド（ここでは本発明のタンパク質をコードするDNA）を含む組換えベクター及びGPCRをコードするDNAを含む組み換えベクターを保持する試験細胞とを接触させる工程と、
(b) 試験細胞におけるG-タンパク質のエフェクター活性を測定する工程と、
(c) このエフェクター活性を、被験物質を接触させず前記リガンドを接触させた試験細胞の当該エフェクター活性と比較して、試験細胞におけるエフェクター活性を変動させる被験物質を選択する工程と
を含むGPCR及び本発明のタンパク質を介したシグナル伝達調節物質のスクリーニング方法。
【０１５７】
第４の方法では、被験物質を接触させた試験細胞のエフェクター活性に比べて被験物質を接触させない対照細胞のエフェクター活性が高くなる被験物質及び低くなる被験物質の双方を選択すればよい。これにより、GPCRのアゴニスト又はアンタゴニストを含めて、GPCRリガンドのGPCRへの結合に始まるシグナル伝達のいずれかの段階を活性化又は阻害する物質を選択することができる。
【０１５８】
GPCRのリガンドとしては、例えばアミン類が挙げられる。特にドーパミンを用いることが好ましい。また、細胞に接触させるリガンドと被験物質との比率は、リガンド：被験物質がモル比で、例えば１：0.1〜１：100程度、好ましくは１：１〜１：50程度とすることができる。
【０１５９】
GPCRリガンドのみ接触させた場合の試験細胞のエフェクター活性を100%とし、GPCRリガンド及び被験物質のいずれも接触させない試験細胞のエフェクター活性を0%として、GPCRリガンド及び被験物質の双方を接触させた試験細胞のエフェクター活性のパーセンテージを算出する。GPCRリガンド及び被験物質の双方を接触させた試験細胞のエフェクター活性のパーセンテージが例えば85％以下、好ましくは70％以下、さらに好ましくは50％以下になる被験物質を細胞シグナル伝達の阻害又は抑制の候補物質として選択できる。また、このパーセンテージが例えば125％以上、好ましくは150％以上、さらに好ましくは200％以上になる被験物質を細胞シグナル伝達の活性化の候補物質として選択できる。
【０１６０】
その他の構成は前述した第1の方法と同じである。
＜第５の方法＞
(a) 被験物質及びGPCRのリガンドと、本発明のヌクレオチド（ここでは本発明のタンパク質をコードするDNA）を含む組み換えベクター及びGPCRをコードするDNAを含む組み換えベクターを保持する試験細胞とを接触させる工程と、
(b) 試験細胞におけるG-タンパク質のエフェクター活性を測定する工程と、
(c) このエフェクター活性を、被験物質を接触させずに前記リガンドを接触させた試験細胞の当該エフェクター活性と比較して、試験細胞におけるエフェクター活性の変動を見る工程と、
(d) このエフェクター活性の変動率を、GPCRをコードするDNAを含む組み換えベクターを保持せず本発明のタンパク質をコードするDNAを含む組み換えベクターを保持する対照細胞に当該被験物質及び当該リガンドを接触させた場合の当該エフェクター活性変動率と比較して、試験細胞と対照細胞との間でエフェクター活性変動率に差が生じる被験物質を選択する工程とを含むGPCR及び本発明のタンパク質を介したシグナル伝達調節物質のスクリーニング方法。
【０１６１】
第５の方法では、GPCRをコードするDNAを含む組み換えベクターを保持する試験細胞のエフェクター活性変動率の方が、このベクターを保持しない対照細胞のエフェクター活性変動率に比べて高くなるような被験物質を探索すればよい。この方法によれば、外来性のGPCRに対するアンタゴニストとなる物質を選択できる。前述した第４の方法によれば、内在性のGPCRに対するアンタゴニストも選択されるところ、第４の方法により得られた物質を第５の方法でスクリーニングすれば、内在性のGPCRに対するアンタゴニストとなる物質を選択的に除去できる。
【０１６２】
試験細胞において対照細胞に比べてエフェクター活性変動率が例えば15％程度、好ましくは30％程度、さらに好ましくは50％程度高くなるような試験物質を外来性のGPCRに対するアンタゴニストの候補物質として選択することができる。
【０１６３】
その他の構成は前述した第1の方法と同じである。
＜第６の方法＞
(a) 被験物質と、本発明のポリヌクレオチド（ここでは本発明のタンパク質をコードするDNA）を含む組み換えベクターを保持する細胞の細胞膜画分及びGPCRをコードするDNAを含む組み換えベクターを保持する細胞の細胞膜画分、又は、本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチド（ここでは本発明のタンパク質をコードするDNA）を含む組み換えベクター及びGPCRをコードするDNAを含む組み換えベクターを保持する細胞の細胞膜画分とを接触させる工程と、
(b) この細胞膜画分へのGTPの結合量を評価する工程と、
(c) このGTP結合の評価量を、被験物質を接触させていない前記細胞膜画分へのGTP結合の評価量と比較して、細胞膜画分へのGTP結合の評価量を変動させる被験物質を選択する工程と
を含むGPCR及び本発明のタンパク質を介したシグナル伝達調節物質のスクリーニング方法。
【０１６４】
GPCR及びG-タンパク質を発現する細胞がGPCRリガンドにより刺激されると、G-タンパク質αサブユニットにGTPが結合する。この現象はGPCR及びG-タンパク質を発現する細胞の膜画分でも観察される。従って、第5の方法では、この細胞膜画分へのGTP結合量を増大させる物質をGPCRのアゴニストとして選択することができる。
【０１６５】
通常G-タンパク質αサブユニットに結合したGTPはGDPに分解される。従って、本発明のタンパク質への結合能はあるがGTPアーゼにより分解されないようなGTPアナログを用いて、このGTPアナログの本発明のタンパク質への結合量を測定することにより、本発明のタンパク質へのGTP結合量を評価することができる。このようなGTPアナログとしては、例えばGTPγS、GppNHp等が挙げられる。
【０１６６】
GTPアナログの細胞膜画分への結合量を測定するにあたっては、例えばGTPアナログを例えば放射標識しておき、細胞膜画分に標識GTPアナログを添加して一定時間インキュベートした後、細胞膜画分の放射活性を液体シンチレーションカウンター等で測定すればよい。
【０１６７】
細胞膜画分の調製方法及び確認方法は前述したとおりである。
【０１６８】
被験物質を接触させた試験細胞において、被験物質を接触させていない試験細胞に比べて、細胞膜画分へのGTP結合量が例えば25％程度、好ましくは50％程度、さらに好ましくは100％程度高くなるような被験物質をGPCRのアゴニストの候補物質として選択できる。
【０１６９】
その他の構成は前述した第1の方法と同じである。
＜第７の方法＞
(a) 被験物質及びGPCRのリガンドと、本発明のポリヌクレオチド（ここでは本発明のタンパク質をコードするDNA）を含む組み換えベクターを保持する細胞の細胞膜画分及びGPCRをコードするDNAを含む組み換えベクターを保持する細胞の細胞膜画分、又は、本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチド（ここでは本発明のタンパク質をコードするDNA）を含む組み換えベクター及びGPCRをコードするDNAを含む組み換えベクターを保持する細胞の細胞膜画分とを接触させる工程と、
(b) この細胞膜画分へのGTP結合量を評価する工程と、
(c) このGTP結合の評価量を、被験物質を接触させず前記リガンドを接触させ た細胞膜画分におけるGTP結合の評価量と比較して、細胞膜画分へのGTP結合 の評価量を変動させる被験物質を選択する工程と
を含むGPCR及び本発明のタンパク質を介したシグナル伝達調節物質のスクリーニング方法。
【０１７０】
第７の方法によれば、GPCRレセプターのアゴニスト及びアンタゴニストを含めて、細胞シグナル伝達のいずれかの段階（G-タンパク質αサブユニットへのGTPの結合まで）を活性化又は阻害（若しくは抑制）する物質を探索できる。
【０１７１】
GPCRリガンドのみ接触させた膜画分の放射活性を100%とし、GPCRリガンド及び被検物質のいずれも接触させない膜画分の放射活性を0%として、GPCRリガンド及び被検物質の双方を接触させた膜画分の放射活性のパーセンテージを算出する。GPCRリガンドと被検物質の双方を接触させた場合の放射活性パーセンテージが例えば75%以下、好ましくは50％以下、さらに好ましくは25％以下になる被検物質を、シグナル伝達を阻害又は抑制する候補物質として選択できる。また、GPCRリガンドと被検物質の双方を接触させた場合の放射活性パーセンテージが例えば125%以上、好ましくは150％以上、さらに好ましくは200％以上になる被検物質を、シグナル伝達を活性化する候補物質として選択できる。
【０１７２】
その他の構成は前述した第６の方法と同じである。また、使用可能なリガンド及びリガンドと被験物質との比率については、第４の方法と同じである。
＜第８の方法＞
(a) 被験物質と、本発明のタンパク質を発現可能な試験細胞とを接触させる工程と、
(b) 試験細胞における本発明のタンパク質の発現量を測定する工程と、
(c) この発現量を、被験物質を接触させない試験細胞の当該タンパク質の発現量と比較して、試験細胞における本発明のタンパク質の発現量を変動させる被
験物質を選択する工程と
を含むGPCR及び本発明のタンパク質を介したシグナル伝達調節物質のスクリーニング方法。
【０１７３】
この方法によれば、本発明のタンパク質の発現を増大又は減少させることにより、本発明のタンパク質を介したシグナル伝達を活性化又は抑制する物質を選択できる。
【０１７４】
本発明のタンパク質の発現量は、対応するmRNA量を測定することにより測定できる。このmRNA量は、前述した本発明のプローブを用いたノーザンブロット又は前述した本発明のプライマーを用いたPCR等の公知の方法で測定できる。
【０１７５】
具体的には、ノーザンブロット法を利用する場合には、試験細胞から常法に従いRNAを調製し、ナイロンメンブレン等にトランスファーし、放射性同位元素や蛍光物質等で標識したプローブとハイブリダイズさせた後、プローブとRNAとの２重鎖を標識に応じた方法で検出すればよい。PCRを利用する場合には、試験細胞のmRNAから常法に従いcDNAを調製し、これを鋳型として、本発明のオリゴヌクレオチドセットをプライマーとして常法に従いPCRを行えばよい。
【０１７６】
また、本発明のタンパク質の発現量は、タンパク質を直接定量することによっても測定できる。このタンパク質の量は、例えば本発明の抗体を用いたウェスタンブロット法等の公知の方法により測定できる。
【０１７７】
本発明のタンパク質を発現している細胞としては、通常、哺乳動物細胞、好ましくはヒトの細胞を使用できる。特に、ヒトの脳、胸腺、精巣、脾臓、小腸、子宮又は心臓由来の細胞を用いることが好ましい。
本発明のスクリーニングキット
本発明の第１のG-タンパク質共役型受容体及び本発明のタンパク質を介したシグナル伝達調節物質のスクリーニングキットは、本発明のポリヌクレオチド（ここではDNA）を有する組み換えベクターを保持する試験細胞と；G-タンパク質のエフェクターの活性の測定用試薬とを含むキットである。
【０１７８】
このキットは、前述した本発明の第１のスクリーニング方法に使用できる。試験細胞及びG-タンパク質のエフェクター活性の測定用試薬については、前述したとおりである。このキットを用いて第１のスクリーニング方法を行うに当たっては、試験細胞に、別途GPCRをコードするDNAを有する組み換えベクターを導入すればよい。又は、試験細胞は、本発明のポリヌクレオチドを有する組み換えベクターに加えてGPCR発現ベクターを保持するものであってもよい。
【０１７９】
本発明の第１のスクリーニングキットは、さらに、本発明のポリヌクレオチド（ここではDNA）を有する組み換えベクターを保持せず、GPCRをコードするDNAを有する組み換えベクターを保持する対照細胞を含んでいてよい。この場合は、本発明の第２のスクリーニング方法に使用できる。
【０１８０】
本発明の第１のスクリーニングキットは、さらに、GPCRをコードするDNAを有する組み換えベクターを保持せず、本発明のポリヌクレオチド（ここではDNA）を有する組み換えベクターを保持する対照細胞を含んでいてよい。この場合は、本発明の第３のスクリーニング方法に使用できる。
【０１８１】
本発明の第１のスクリーニングキットは、さらにGPCRのリガンドを含んでいてよい。この場合は、本発明の第４のスクリーニング方法に使用できる。リガンドも前述した通りである。
【０１８２】
本発明の第１のスクリーニングキットは、さらに、GPCRのリガンド、及び、GPCRをコードするDNAを有する組み換えベクターを保持せず本発明のポリヌクレオチド（ここではDNA）を有する組み換えベクターを保持する対照細胞を含んでいてよい。この場合は、本発明の第５のスクリーニング方法に使用できる。
【０１８３】
また、本発明の第２のGPCR及び本発明のタンパク質を介したシグナル伝達調節物質のスクリーニングキットは、本発明のポリヌクレオチド（ここではDNA）を有する組み換えベクターを保持する細胞と；本発明のタンパク質に結合できるがGTPaseにより分解されないようなGTPアナログとを含むキットである。このキットは、本発明の第６のスクリーニング方法に使用できる。GTPアナログについては前述したとおりである。
【０１８４】
このキットを用いて第６のスクリーニング方法を行うに当たっては、細胞に別途GPCRをコードするDNAを有する組み換えベクターを導入して使用すればよい。又は、前記細胞は、本発明のDNAを有する組み換えベクターの他にGPCR発現ベクターを保持するものであってもよい。
【０１８５】
本発明の本発明の第３のGPCR及び本発明のタンパク質を介したシグナル伝達調節物質のスクリーニングキットは、本発明のポリヌクレオチド（ここではDNA）を有する組み換えベクター及びGPCR発現ベクターを保持する細胞と；本発明のタンパク質に結合できるがGTPaseにより分解されないようなGTPアナログとを含むキットである。このキットは、本発明の第６のスクリーニング方法に使用できる。
【０１８６】
本発明の第２及び第３のスクリーニングキットは、さらに、GPCRのリガンドを含んでいてよい。この場合には、本発明の第７のスクリーニング方法に使用できる。
【０１８７】
また、本発明の第４のGPCR及び本発明のタンパク質を介したシグナル伝達調節物質のスクリーニングキットは、本発明のタンパク質を発現可能な細胞と；本発明のプローブ、本発明のプライマー又は本発明の抗体とを含むキットである。このキットは、本発明の第８のスクリーニング方法に使用できる。
医薬
本発明のタンパク質及び抗体は、以下の形態で医薬として使用できる。
【０１８８】
本発明のタンパク質及び抗体は、そのまま又は薬学的に許容される担体（賦形剤、増量剤、結合剤、潤沢剤等が含まれる）や慣用の添加剤などと混合して医薬組成物として調製できる。この医薬組成物は、調製する形態（錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤等の経口投与剤；注射剤、点滴剤、外用剤、座剤等の非経口投与剤）等に応じて経口投与又は非経口投与することができる。また投与量は、有効成分の種類、投与経路、投与対象又は患者の年齢、体重、症状等によって異なり一概に規定できないが、１日投与量として、0.01〜100mg程度を１日１回又は数回に分けて投与できる。
【０１８９】
また、本発明のポリヌクレオチド、アンチセンスポリヌクレオチド及びリボザイムは、前述した医薬組成物の形態で医薬として投与できる。その他、例えばリポソーム内に封入して送達するリポソームデリバリーシステム、マイクロインジェクション、直接注射法、遺伝子銃等を利用して細胞内に導入することもできる。これらの場合も、投与量、投与方法は、患者の年齢、体重、症状等によって異なり一概に規定できないが、当業者であれば適宜選択することができる。
【０１９０】
さらに、本発明のポリヌクレオチドは、遺伝子治療用のウィルスベクター等に組み込んで、目的細胞に導入することもできる。
【０１９１】
また、本発明のスクリーニング方法により得られたシグナル伝達調節物質は、前述した医薬組成物の形態で投与することができる。また、この物質がDNAによりコードされるものである場合には、遺伝子治療用のウィルスベクターに組み込んで、目的細胞に導入することもできる。
【０１９２】
【発明の効果】
本発明により、細胞シグナル伝達に関与する新規なG-タンパク質と考えられるタンパク質及びそれをコードするポリヌクレオチドが提供された。
【０１９３】
さらにいえば、GPCR及び本発明のタンパク質をそれぞれ発現するベクターを保持する細胞におけるG-タンパク質エフェクター活性が、本発明のタンパク質を発現するベクターを有さない細胞における当該エフェクター活性に比べて高いことから、本発明のタンパク質は、細胞の分化又は増殖に関与する、GPCR及びG-タンパク質を介したシグナル伝達に関与するタンパク質であると考えられる。
【０１９４】
また、本発明のタンパク質は、G-タンパク質間でGTP結合部位及びGTPase活性化部位として保存されているアミノ酸配列、及び、G-タンパク質間で保存されている３量体形成ドメインのアミノ酸配列とそれぞれ高い相同性を有する領域を有することから、G-タンパク質の１種であると考えられる。
【０１９５】
従って、本発明のタンパク質及びこれをコードするポリヌクレオチドは、GPCR及び本発明のタンパク質を介した細胞内シグナル伝達の調節剤として好適に使用できる。さらにいえば、この細胞内シグナル伝達の異常に起因する疾患の治療又は予防に好適に使用できる。特に、本発明のタンパク質の欠損、発現量の低下又は機能低下によるシグナル伝達異常に起因する疾患の治療に好適に使用できる。
【０１９６】
さらに、本発明のポリヌクレオチドは、GPCR刺激による細胞シグナル伝達調節物質のスクリーニングに好適に使用できる。
【０１９７】
また、本発明の抗体、アンチセンス及びリボザイムは、GPCR及び本発明のタンパク質を介した細胞内のシグナル伝達の調節剤として好適に使用できる。さらにいえば、この細胞内シグナル伝達の異常に起因する疾患の治療又は予防に好適に使用できる。特に、この細胞内シグナル伝達の異常亢進を抑制する目的に好適に使用できる。
【０１９８】
さらに、本発明の抗体は、本発明のタンパク質の精製用のアフィニティクロマトグラフィー、本発明のタンパク質の発現に影響を与える物質のスクリーニングに好適に使用できる。
【０１９９】
また、本発明のスクリーニング方法により得られた物質は、GPCR及び本発明のタンパク質を介した細胞内のシグナル伝達の調節剤として好適に使用できる。さらにいえば、この細胞内シグナル伝達の異常に起因する疾患の治療又は予防に好適に使用できる。
【０２００】
また、本発明のオリゴヌクレオチドは、本発明のタンパク質の欠損、その発現量の異常増加又は異常低下に起因する疾患の診断に好適に使用できる。
【０２０１】
本発明のタンパク質は、大脳などの脳組織で発現が認められることから、本発明のタンパク質、ポリヌクレオチド、抗体、アンチセンス、リボザイム、本発明のスクリーニング方法により得られる物質は、神経疾患等の予防又は治療に有用であると考えられる。また、本発明のオリゴヌクレオチドは神経疾患の診断に有用であると考えられる。
【０２０２】
また本発明のタンパク質は、心臓で発現が認められることから、本発明のタンパク質、ポリヌクレオチド、抗体、アンチセンス、リボザイム、本発明のスクリーニング方法により得られる物質は、心臓疾患等の予防又は治療に有用であると考えられる（Targets, 2002, vol.1 p206-213）。
【０２０３】
また本発明のタンパク質は、胸腺および脾臓で発現が認められることから、本発明のタンパク質、ポリヌクレオチド、抗体、アンチセンス、リボザイム、本発明のスクリーニング方法により得られる物質は、免疫疾患等の予防又は治療に有用であると考えられる。
【０２０４】
【実施例】
以下、本発明を実施例を示してより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【０２０５】
以下の実施例において、本発明のタンパク質を「Ｇｍ１」と略称する。
（実施例１）ヒトＧｍ１蛋白質をコードするｃＤＮＡのクローニング
ヒトＧｍ１の全長をコードするＤＮＡを有するプラスミドであるｐＣＲ−Ｇｍ１を以下のようにして作製した。
【０２０６】
ヒト脳由来ｃＤＮＡライブラリー（宝酒造社製）のプラスミド（ｐＡＰ３ｎｅｏ）２０ｎｇを鋳型に用い、10μMのフォワードプライマーｐｒＧｍ１ＡＴＧ（５’−ＡＴＧＧＧＴＣＴＧＴＧＣＴＡＣＡＧＴＣＴＧＣＧＧ；配列番号１１）、10μMのリバースプライマーｐｒＧＮＡＬ３’（５’−ＴＣＡＣＡＡＧＡＧＣＴＣＡＴＡＣＴＧＣＴＴ；配列番号１２）およびＴＡＫＡＲＡＬＡＴａｑポリメラーゼ（ＴＡＫＡＲＡＬＡＴａｑ ｗｉｔｈ ＧＣ Ｂｕｆｆｅｒ，宝酒造社製）を用いてＰＣＲを行うことにより増幅ＤＮＡを得た。
【０２０７】
ＰＣＲ条件は、９５℃で３０秒間、次いで６０℃で３０秒間、次いで７２℃で２分間の保温を１サイクルとしてこれを３５サイクル行った。
【０２０８】
得られたＤＮＡをアガロースゲル電気泳動後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製し、回収した。
この精製、回収されたＤＮＡをインサートＤＮＡとした。
【０２０９】
次にＴＯＰＯＴＡＣ１ｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Invitorogen社製）を用い、その添付プロトコールにしたがって、インサートＤＮＡ（５０ｎｇ）をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（１０ｎｇ）のクローニング部位に挿入することにより、ｐＣＲ−Ｇｍ１を作製した。
【０２１０】
このようにして得られたＤＮＡについてABI377ＤＮＡシークエンサーを用いて塩基配列を決定した結果、配列番号２に記載の塩基配列の塩基番号１〜1377の塩基配列を含み、配列番号１に記載のアミノ酸配列の全長をコードしていた。
（実施例２）Ｇｍ１をコードする核酸の発現分布の検出
Ｇｍ１をコードする核酸を特異的に増幅できるようにフォワードプライマーｐｒＧｍｌｒｔ‐５’（５’−ＡＴＧＧＧＧＴＧＴＴＴＧＧＧＣＧＧＣＡＡＣＡ；配列番号１３）及びリバースプライマーｐｒＧｍ１rｔ−３’（５’−ＡＣＧＡＴＧＧＴＧＣＴＴＴＴＣＣＣＡＧＡＣＴＣＡＣＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＣＡ；配列番号１４）を作製した。それぞれ１μｇのヒト骨髄由来トータルＲＮＡ（Ambion社製）、ヒト脳由来トータルＲＮＡ（Ambion社製）、ヒト脾臓由来トータルＲＮＡ（Ambion社製）、ヒト胸腺由来トータルＲＮＡ（Ambion社製）、ヒト小腸由来トータルＲＮＡ（Ambion社製）、ヒト肝臓由来トータルＲＮＡ（Ambion社製）、ヒト胎盤由来トータルＲＮＡ（Ambion社製）、ヒト子宮頸部由来トータルＲＮＡ（Ambion社製）、ヒト子宮由来トータルＲＮＡ（Ambion社製）、ヒト心臓由来トータルＲＮＡ（Ambion社製）、ヒト骨格筋由来トータルＲＮＡ（Ambion社製）、ヒト精巣由来トータルＲＮＡ（Ambion社製）およびヒト腎臓由来トータルＲＮＡ（Ambion社製）を鋳型に用い、それぞれ10μMの上記のプライマーセットおよびスーパースクリプトワンステップＲＴ−ＰＣＲシステム（インビトロジェン社製）を用いて添付のプロトコールに従いＲＴ−ＰＣＲを行うことによりｍＲＮＡを増幅した。ＲＴ−ＰＣＲの条件は、５５℃で３０分間保持し逆転写反応を行った後、９４℃で２０秒間、次いで６０℃で３０秒間、次いで７２℃で１分間の保温を１サイクルとし、これを３５サイクル行った。
【０２１１】
次にＲＴ−ＰＣＲ産物２０ｕｌをアガロースゲル電気泳動に供し、エチジウムブロマイドを用いて染色し、UV照射により特異的に増幅されたシグナルを確認した。ゲルの写真を図１に示す。図１から、Ｇｍ１は脳、胸腺、精巣、脾臓、小腸、子宮及び心臓で強く発現していることが分かる。
（実施例３）脳組織における In situ hybridization （本発明蛋白質をコードする核酸の脳組織における詳細な発現分布の検出）
実施例２により得られた本発明蛋白質をコードする核酸の脳組織での発現分布を以下の方法で検討した。
【０２１２】
マウス脳組織においてIn situ hybridizationを行うために以下に示す手順によってマウスＧｍ１遺伝子の5'末端側領域のｃＤＮＡのクローニングを行った。
【０２１３】
マウス脳由来ｃＤＮＡ（クローンテック社製）２０ｎｇを鋳型に用い、10μMのフォワードプライマーｐｒｍＧｍ１−１（５’−ＡＴＧＧＧＣＣＴＡＴＧＣＴＡＣＡＧＣＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴ；配列番号１５）、10μMのリバースプライマーｐｒｍＧｍ１−２（５’−ＧＣＴＧＣＡＧＧＴＣＣＣＧＣＴＴＣＴＧＣＴＣＧＣＧＣＡＧＣＡＴＧＣＧＧＴ；配列番号１６）およびＴＡＫＡＲＡＬＡＴａｑポリメラーゼ（ＴＡＫＡＲＡＬＡＴａｑ ｗｉｔｈ ＧＣ Ｂｕｆｆｅｒ、宝酒造社製）を用いてＰＣＲを行うことにより増幅ＤＮＡを得た。
【０２１４】
ＰＣＲ条件は、９５℃で３０秒間、次いで６０℃で３０秒間、次いで７２℃で２分間の保温を１サイクルとしてこれを３５サイクル行った。得られたＤＮＡをアガロースゲル電気泳動後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用い精製、回収した。この精製、回収されたＤＮＡをインサートＤＮＡとした。
【０２１５】
次いで、ＱＩＡＧＥＮ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（ＱｌＡＧＥＮ社製）を用い、それの添付プロトコールに従って、インサートＤＮＡ（５０ｎｇ）をｐＤｒｉｖｅベクター（１０ｎｇ）のクローニング部位に挿入することにより、ｐＤｒｍＧｍ１を作製した。
【０２１６】
次いで、ＱＩＡＧＥＮ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（ＱｌＡＧＥＮ社製）を用い、それの添付プロトコールに従って、インサートＤＮＡ（５０ｎｇ）をｐＤｒｉｖｅベクター（１０ｎｇ）のクローニング部位に挿入することにより、ｐＤｒｍＧｏｌｆを作製した。
（ In situ hybridization 用プローブの作製）
１μｇのｐＤｒｍＧｍ１プラスミドを制限酵素ＨｉｎｄIIIまたはＢａｍＨＩで切断することにより直鎖状プラスミドｐＤｒｍＧｍ１／ＨｉｎｄIIIおよびｐＤｒｍＧｍ１／ＢａｍＨＩを得た。ｌμｇのｐＤｒｍＧｍ１／ＨｉｎｄＩＩＩ、２μlのＤｌＧＲＮＡＬａｂｅｌｉｎｇＭｉｘ（ロッシュ、ダイアゴノスティック社製）および１μｌのＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ（ロシュ、ダイアゴノステイック社製）を混ぜ添付バッファー存在下で３７℃で３時間保温した。次いで、１μ１のＤＮａｓｅＩ（ロッシュ、ダイアゴノスティック社製）を加え３７℃で３０分問保温しｃＲＮＡを得た。このｃＲＮＡをエタノール沈殿し、２０μｌＴＥバッファーに懸濁し、これをｍＧｍ１センスｃＲＮＡとした。
【０２１７】
同様に１μｇのＰＤｒｍＧｍ１／ＢａｍＨＩ、２μ１のＤＩＧＲＮＡＬａｂｅｌｉｎｇＭｉｘ（ロシュ、ダイアゴノスティツク製）および１μ１のＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ（ロシュ、ダイアゴノスティック製）を混ぜ、添付バッファーの存在下で３７℃で３時間保温した。次いで、１μ１のＤＮａｓｅＩ（ロッシュ、ダイアゴノスティック製）を加え３７℃で３０分間保温しｃＲＮＡを得た。このｃＲＮＡをエタノール沈殿し、２０μｌＴＥバッファーに懸濁し、これをｍＧｍ１アンチセンスｃＲＮＡとした。
（ In situ hybridization よる検出）
脳におけるＧｍ１のｍＲＮＡの発現分布の詳細な解析を、ラベルされたｃＲＮＡを用いてIn situハイブリダイゼーション法［サイモンズら（Simmons et al.)、J.Histotechnol. 12:169-181(1989）］により行う。すなわち、公知の方法でパラホルムアルデヒド及びグルタルアルデヒドを用いて固定したマウス脳から脳切片作成装置（sliding microtome）を用いて厚さ５０μｍの脳切片を作成し、スライド・ガラス上に吸着させ乾燥させる。脳切片を脱パラフィン後、ターゲット溶液（ダコ社製）中でオートクレーブ処理し（１０５℃、１０分）、脱水、風乾する。プローブ（１００ｎｇ ｃＲＮＡ）とのハイブリダイゼーションを、ハイブリダイゼーション緩衝液（４０％ホルムアミド、４×ＳＳＣ、１ｍＭＥＤＴＡ、２５０μｇ／ｍｌ酵母ｔＲＮＡ、１×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液、１０％デキストランサルフェート）中で、６０℃で一晩行う。その後、脳切片を６５℃の２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの溶液で洗浄し、ＲＮａｓｅＡ処理（１０μｇ／ｍｌ、３７℃、３０分）し、２×ＳＳＣ、５０％ホルムアミドの溶液で洗浄し、脱水し、風乾後、ＤｌＧ標識抗体検出キット（ダコ製）でmRNAを検出する。
（実施例４）ヒトＧｍ１蛋白質の大腸菌中での発現プラスミドの構築
ヒトＧｍ１蛋白質を大腸菌中で大量に発現させるために、まずヒトＧｍ１蛋白質をグルタチオンＳトランスフェラーゼとの融合蛋白質の形で発現させ、次にヒトＧｍ１蛋白質の部分のみを切り出す。
【０２１８】
すなわち、実施例２により得たヒトｃＤＮＡ断片を含むプラスミドｐＣＲ−Ｇｍ１をＥｃｏＲＶおよびＳｐｅＩで二重消化した後、Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて末端を平滑化する。このＤＮＡをアガロースゲル電気泳動後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用い精製し、回収する。この精製、回収されたＤＮＡをインサートＤＮＡとする。ｐＧＥＸ−５Ｘ−１をＥｃｏＲＶで切断後、ＢＡＰ処理したものをベクターとして用い、当該ベクター５０ｎｇとインサートＤＮＡ１０ｎｇとをＴ４ライゲースを用いて連結し、発現プラスミドｐＧＥＸ−Ｇｍ１を作製する。
（実施例５）グルタチオンＳトランスフェラーゼ−ヒト融合蛋白質を発現している大腸菌からの組換え体ヒトＧｍ１蛋白質の精製
実施例４により得たグルタチオンＳトランスフェラーゼ−ヒト融合蛋白発現プラスミドｐＧＥＸ−Ｇｍ１を用いて大腸菌（Escherichia coli）ＪＭ１０９株をカルシウム法で形質転換する。この形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリン（シグマ社製）を含むＬＢ培地中で３７℃で培養し、O.D.₆₀₀が約０．６となった時点で、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）１ｍＭ（最終濃度）を加えてタンパク質の発現を誘導し、さらに６時間培養を続けた後、菌体を集菌する。
【０２１９】
この菌体を超音波で破砕した後、10,000gで５分間超遠心を行い、可溶性画分を得る。この可溶性画分を抗グルタチオンＳトランスフェラーゼモノクローナル抗体カラム（アマシャムバイオサイエンス社）にアプライし、グルタチオンＳトランスフェラーゼ−ヒト融合蛋白質を精製する。次に、精製したグルタチオンＳトランスフェラーゼ−ヒト融合蛋白質を活性型血液凝固因子Ｘ（ニューイングランドバイオラボ製）で処理して、ヒトＧｍ１蛋白質を切り出す。
【０２２０】
切り出されたヒトＧｍ１蛋白質を、順次、陽イオン交換カラム（S-sepharose FF;ファルマシア）、疎水性カラム（Phenyl-superose；ファルマシア社）、ハイドロキシアパタイトカラム（三井東圧化学）、陽イオン交換カラム(MONOS；ファルマシア社)を用いて、SDS-PAGE／クマシーブリリアントブルー染色でほぼ単一になるまで精製する。
（実施例６）ヒトＧｍ１蛋白質の部分ペプチド作製およびそのペプチドを用いた抗体ヒトＧｍ１ペプチド抗体の作製
ヒトＧｍ１蛋白質に特異的な抗体を以下に示す手順で作製した。配列番号１に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号７〜２０の１４アミノ酸よりなるペプチドを合成した。
【０２２１】
このペプチドにキャリアー蛋白質ＫＭＬを結合し免疫源として用いた。ここで得られたＫＭＬ融合ペプチドｐｔＧｍ１をニュージーランドホワイトラビットに免疫して、抗ヒトＧｍ１ペプチド血清を作製した。免疫は計５回行った。このウサギから抗血清を採取し、抗血清をプロテインＧカラム（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いて精製し、抗原特異的な抗ヒトＧｍ１蛋白質抗体を精製した。
【０２２２】
次いで、精製された抗ヒトGm1蛋白質抗体について、２種類のウェスタンブロット法を用いて、そのGm1特異的認識能力を確認した。その結果を図８及び図９に示した。
【０２２３】
図８から明らかなように、精製された抗ヒトGm1蛋白質抗体が有する力価として、5000倍希釈時において、バックグランドと比較して20平方ｍｍ（バンド面積）当たり約1.6×10⁶カウントの差異を生じるシグナル強度（LAS（Fuji film）使用）が認められた。即ち、当該抗体は、少なくとも5000倍希釈時において、バックグランドと比較して充分な優位さが確保できるような抗原認識能力を有することが判明した。
【０２２４】
また図９から明らかなように、Gm1を発現しているマウス脳では強いシグナルが確認された。一方、Golfを発現しているGH3細胞では全くシグナルが確認されなかった。これら結果は、当該抗ヒトGm1蛋白質抗体はGm1のみを特異的に認識する抗体であることを示している。尚、Gm1を発現しているCHO細胞はポジティブコントロールとして使用された。
（実施例７）ヒトＧｍ１蛋白質の動物細胞中での発現ベクターの構築
ヒトＧｍ１蛋白質を動物細胞中で一過性で発現させるための発現ベクターを構築する。すなわち、先ず、実施例２により得たヒトｃＤＮＡ断片を含むｐＣＲ−Ｇｍ１を制限酵素ＸｂａＩ及びＫｐｎＩで二重消化し、得られたＤＮＡ断片をｐｃＤＮＡ３．１のＸｂａＩ部位及びＫｐｎＩ部位に導入し、動物細胞中の一過性発現ベクターｐｃＤＮＡ−Ｇｍ１を得る。
（実施例８） ヒトドーパミン D1 レセプターおよびヒトドーパミン D2 レセプター蛋白質の動物細胞中での発現ベクターの構築
ヒトドーパミンD1レセプターおよびヒトドーパミンD2レセプター蛋白質を動物細胞中で一過性で発現させるための発現ベクターを以下の手順で構築した。
【０２２５】
ヒトドーパミンD1レセプターをコードするDNAを増幅するために、ヒト脳由来cDNAライブラリー（宝酒造製）のプラスミド（pAP3neo）20ngを鋳型に用い10μMのフォワードプライマーprDopaminD1−5’（5’−agctcggatccATGAGGACTCTGAACACCTCTGCCA；（配列番号１７）、10μMのリバースプライマーprDopaminD1−3’（5’−gtgcagaattcTCATCTGCGAGTTCAGGTTGGGT；配列番号１８）およびTAKARA LA Taqポリメラーゼ（TAKARA LA Taq with GC Buffer，宝酒造製）を用いてPCRを行った。
【０２２６】
ヒトドーパミンD2レセプターをコードするDNAを増幅するために、ヒト脳由来cDNAライブラリー（宝酒造製）のプラスミド（pAP3neo）20ngを鋳型に用い10μMのフォワードプライマーprDopaminD2−5’（5’−agctcggatccATGGATCCACTGAATCTGTCCTGGTATGA；配列番号１９）、10μMのリバースプライマーprDopaminD2−3’（5’−gtgcagaattcTCAGCAGTGAAGGATCTTCTGGAAGGCCTT；配列番号２０）およびTAKARA LA Taqポリメラーゼ（TAKARA LA Taq with GC Buffer、宝酒造製）を用いてPCRを行った。
【０２２７】
PCR条件は、95℃で30秒間次いで60℃で30秒間次いで72℃で2分間の保温を1サイクルとしてこれを35サイクル行った。得られたDNAはアガロースゲル電気泳動後、QIAquick Gel Extraction kit（QIAGEN製）を用い精製、回収された。この精製、回収されたDNAをインサートDNAとした。
【０２２８】
それぞれのインサートDNAをBamHIおよびEcoRIで二重消化しpcDNA3．1（＋）のBamHIおよびEcoRI部位に導入し、動物細胞発現ベクターpcDNA−D1RおよびpcDNA−D2Rを得た。
（実施例９）ヒトＧｍ１蛋白質をコードするバキュロウィルスベクターの構築
先ず、ヒトＧｍ１蛋白質を昆虫細胞中で過剰発現させるための移行ベクターを構築した。実施例２で得たヒトｃＤＮＡ断片を含むｐＣＲ−Ｇｍ１を制限酵素ＸｂａＩ、ＳｐｅＩで二重消化し、得られたＤＮＡ断片をｐＡｃＭＰ２（ファーミンゲン社）のＸｂａＩ部位に導入し、移行ベクターｐＡｃＭＰ−Ｇｍ１を得た。次いで、この移行ベクター５μｇとバキュロウィルスＤＮＡ、BaculoGold ＤＮＡ（ファーミンゲン社）１μｇを２×１０⁶細胞のＳｆ２１細胞にコトランスフェクションし、２７℃で５日間培養後、培養上清を回収し、ウィルス液とした。
（実施例１０）ヒト G β蛋白質およびヒト G γ蛋白質をコードするバキュロウイルスベクターの構築
ヒトGβ蛋白質およびヒトGγ蛋白質を昆虫細胞で過剰発現させるための移行ベクターを以下の手順で構築した。
【０２２９】
ヒトGβ蛋白質をコードするDNAを増幅するために、ヒト脳由来cDNAライブラリー（宝酒造製）のプラスミド（pAP3neo）20ngを鋳型に用い10μMのフォワードプライマーprGb1−5’（5’−ATGAGTGAGCTTGACCAGTTACGGCA；配列番号２１）、10μMのリバースプライマーprGb1−3’（5’−TTAGTTCCAGATCTTGAGGAAGCTAT；配列番号２２）およびTAKARA LA Taqポリメラーゼ（TAKARA LA Taq with GC Buffer、宝酒造製）を用いてPCRを行った。PCR条件は、95℃で30秒間次いで60℃で30秒間次いで72℃で2分間の保温を1サイクルとしてこれを35サイクル行った。得られたDNAはアガロースゲル電気泳動後、QIAquick Gel Extraction kit（QIAGEN製）を用い精製、回収された。この精製、回収されたDNAをインサートDNAとした。次にTOPO TA Cloning Kit（Invitorogen製）を用い添付プロトコールにしたがって、それぞれの得られたインサートDNA（50ng）pCR2．1−TOPOベクター（10ng）のクローニンク部位に挿入することにより、pCR−Gβを作製した。
【０２３０】
次にpCR−Gβを制限酵素BamHIおよびNotIで二重消化し、得られたDNA断片をpAcMP3（ファーミンゲン製）のBamHIおよびNotI部位に導入し、移行ベクター動物細胞発現ベクターpAcMP−Gβを得た。
【０２３１】
つぎにこの移行ベクター5μgとバキュロウイルスDNA，BaculoGold DNA（ファーミンゲン製）1μgを2×10６細胞のSf21細胞にコトランスフェクションし、27℃で5日間培養後、培養上清を回収し、ウイルスを得た。
（実施例１１）ヒト G γ蛋白質をコードするバキュロウイルスベクターの構築
ヒトGγ蛋白質を昆虫細胞で過剰発現させるための移行ベクターを以下の手順で構築した。
【０２３２】
ヒトGγ蛋白質をコードするDNAを増幅するために、ヒト脳由来cDNAライブラリー（宝酒造製）のプラスミド（pAP3neo）20ngを鋳型に用い10μMのフォワードプライマーprGg3−5’（5’−ATGAAAGGTGAGACCCCGGTGAACA；配列番号２３）、10μMのリバースプライマーprGg3−3’（5’−TCAGAGGAGAGCACAGAAGAACTT；配列番号２４）およびTAKARA LA Taqポリメラーゼ（TAKARA LA Taq with GC Buffer、宝酒造製）を用いてPCRを行った。PCR条件は、95℃で30秒間次いで60℃で30秒間次いで72℃で2分間の保温を1サイクルとしてこれを35サイクル行った。得られたDNAはアガロースゲル電気泳動後、QIAquick Gel Extraction kit（QIAGEN製）を用い精製、回収された。この精製、回収されたDNAをインサートDNAとした。次にTOPO TA Cloning Kit（Invitorogen製）を用い添付プロトコールにしたがって、それぞれの得られたインサートDNA（50ng）をpCR2．1−TOPOベクター（10ng）のクローニンク部位に挿入することにより、pCR−Gγを作製した。
【０２３３】
次にpCR−Gγを制限酵素XbaIおよびPstIで二重消化し、得られたDNA断片をpAcMP3（ファーミンゲン製）のXbaIおよびPstI部位に導入し、移行ベクターpAcMP−Gγを得た。
【０２３４】
つぎにこの移行ベクター5μgとベキュロウイルスDNA，BaculoGold DNA（ファーミンゲン製）1μgを2×10６細胞のSf21細胞にコトランスフェクションし、27℃で5日間培養後、培養上清を回収し、ウイルス液を得た。
（実施例１２）ヒトドーパミン D1 レセプターおよびヒトドーパミン D2 レセプターをコードするバキュロウイルスペクターの構築
ヒトドーパミンD1レセプター蛋白質およびヒトドーパミンD2レセプター蛋白質を昆虫細胞で過剰発現させるための移行ベクターを以下の手順で構築した。
【０２３５】
実施例８により得たヒトドーパミンD1レセプター発現ベクターpcDNA−D1RおよびヒトドーパミンD2レセプター発現ベクターpcDNA−D2RをBamHIおよびEcoRIで二重消化し、pAcMP3のBamHIおよびEcoRI部位に導入し、移行ベクターpAcMP−D1RおよびpAcMP−D2Rを得た。
【０２３６】
つぎにそれぞれにつき移行ベクター5μgとバキュロウイルスDNA，BaculoGold DNA（ファーミンゲン製）1μgを2×10６細胞のSf21細胞にコトランスフェクションし、27℃で5日間培養後、培養上清を回収し、ウイルス液を得た。
（実施例１３）バキュロウイルスベクターによるヒト Gm1 蛋白質の大量発現および精製
実施例９で得たヒトGm1蛋白質バキュロウイルスを含むウイルス液を2×10７細胞のSf21細胞にMOI5で感染させ27℃で培養する。感染5日後、細胞を回収し、HE／PIバッファー（20mM HEPSE、2mM EDTAに1XProtenase阻害剤カクテル（ナカライテスク）を加えたもの）に懸濁した。懸濁した細胞を26G針を15回通過させることにより細胞膜を破壊した。この細胞を4℃、110gで5分間遠心後、上清を４℃下で20000gで30分間遠心し、ヒトGm1蛋白質を含む細胞膜画分を回収した。
（実施例１４）バキュロウイルスベクターによるヒト G β蛋白質およびヒト G γ蛋白質の大量発現および精製
実施例９で得たヒトGβ蛋白質バキュロウイルスおよび実施例１０で得たヒトGγ蛋白質バキュロウイルスを含むウイルス液を2×10７細胞のSf21細胞にMOI5で感染させ27℃で培養する。感染5日後、細胞を回収し、HE／PIバッファー（20mM HEPSE、2mM EDTAに1XProtenase阻害剤カクテル（ナカライテスク）を加えたもの）に懸濁した。懸濁した細胞を26G針を15回通過させることにより細胞膜を破壊した。この細胞を4℃、110gで5分間遠心後、上清を4℃、20000gで30分間遠心し、ヒトGβ蛋白質およびヒトGγ蛋白質を含む細胞膜画分を回収した。
（実施例１５）バキュロウイルスベクターによるヒトドーパミン D1 レセプター蛋白質およびヒトドーパミン D2 レセプター G γ蛋白質の大量発現および精製
実施例１２で得たヒトドーパミンD1レセプター蛋白質発現バキュロウイルスおよびヒトドーパミンD2レセプター蛋白質発現バキュロウイルスのいずれかを含むウイルス液を2×10７細胞のSf21細胞にMOI5で感染させ27℃で培養する。感染5日後、細胞を回収し、HE／PIバッファー（20mM HEPSE、2mM EDTAに1XProtenase阻害剤カクテル（ナカライテスク）を加えたもの）に懸濁した。懸濁した細胞を26G針を15回通過させることにより細胞膜を破壊した。この細胞を4℃、110gで5分間遠心後、上清を4℃、20000gで30分間遠心し、ヒトドーパミンD1レセプター蛋白質又はヒトドーパミンD2レセプター蛋白質を含む細胞膜画分を回収した。
（実施例１６）バキュロウイルスベクター発現ヒト Gm1 蛋白質を用いた GTP 結合アッセイ
実施例１３で精製されたGm1蛋白質を含む膜画分を用いGTP結合アッセイを行う。
【０２３７】
実施例１３で作製した2μgのGm1蛋白質を含む膜画分および実施例１４で作製した2μgのGβ蛋白質とGγ蛋白質を含む細胞膜画分および実施例１５で作製した2μgのドーパミンD1レセプター蛋白質を含む膜画分を55μlの結合バッファー（59mM Tris，4．8mM MgC1₂，2mMEDTA，100mM NaCl，1μM GDP）に懸濁する。1μMのドーパミンを加え、30℃で10分間保温する。その後、200pMの〔35S〕GTPγSを加え30℃で30分間保温する。
【０２３８】
次いで、洗浄用緩衝液（氷冷した50mM Tris，5mM MgC1₂，150mM NaCl，0．1％BSA，0．05％CHAPS（pH7．4））を1．5ml加えて、ガラス繊維濾紙GF／Fを用いて濾過する。続いてこの濾紙を1mlのTris（pH7．4）で3回洗浄し、65℃で30分間保温した後、液体シンチレーションカウンターで濾紙上に付着した膜画分に結合した〔35S〕GTPγSの放射性活性を測定する。
（実施例１７） cAMP 量の変動を指標としたドーパミン D1 レセプターアンタゴニストのスクリーニング
CHO細胞の2×１０⁵個に、実施例８により得たドーパミンD1レセプター発現ベクター1μg及び実施例７により得たＧｍ１発現ベクター（ｐｃＤＮＡ‐Ｇｍ１；3μg）をリポフェクション法でトランスフェクションして試験細胞を調製した。
【０２３９】
次いで、この細胞を96穴プレートの各ウェル内に3×10⁴cells/well播種し、約24時間培養した。次いで、培養液を除き、新たに1mM IBMXを含むOPTI-MEN(インビトロジェン社) 80μlを細胞に加えて３７℃で１０分間保温した。
【０２４０】
次いで、GPCRリガンドとして10μMのドーパミン及び10μMの被験物質（ブタクラモル（Butaclamol）、クロルプロマジン（chlorpromazine）、フルフェナジン（fluphenazine）、ハロペリドール（haloperidol）、SCH-23390）を添加し、37℃で30分間反応させた。
【０２４１】
次いで、反応バッファーを除きｃAMP量をHitHunter ECF cyclic AMP化学発光アッセイキット（アプライドバイオシステムズ）を用いて測定した。対照として、同濃度のGPCRリガンドのみ接触させた試験細胞、及び、何も接触させない試験細胞について、同様にしてcAMP量を測定した。
【０２４２】
何も接触させない場合のcAMP量を０％とし、リガンドのみ接触させた場合のcAMP量を100%として、リガンドと被験物質とを接触させた場合のcAMP量のパーセンテージが85%以下になる物質をシグナル伝達抑制剤（アンタゴニスト）として選択した（図２）。
（実施例１８） cAMP 量の変動を指標としたドーパミン D1 レセプターアゴニストのスクリーニング
CHO細胞の2×１０⁵個に、実施例８により得たドーパミンD1レセプター発現ベクター（1μg）及び実施例７により得たＧｍ１発現ベクター（ｐｃＤＮＡ‐Ｇｍ１；3μg）をリポフェクション法でトランスフェクションして試験細胞を調製した。
【０２４３】
次いで、この細胞を96穴プレートの各ウェル内に3×10⁴cells/well播種し、約24時間培養した。次いで、培養液を除き、新たに1mM IBMXを含むOPTI-MEN(インビトロジェン社) 80μlを細胞に加えて３７℃で１０分間保温した。
【０２４４】
次いで、GPCRリガンドとして10μMのドーパミン又は、10μMの被験物質（アポモルフィン、CY208-248、SKF-38393、SKF-81297）を添加し37℃で30分間反応させた。
【０２４５】
次いで、反応バッファーを除きｃAMP量をHitHunter ECF cyclic AMP化学発光アッセイキット（アプライドバイオシステムズ）を用いて測定した。対照として、何も接触させない試験細胞について、同様にしてcAMP量を測定した。
【０２４６】
試験細胞に何も接触させない場合のcAMP量を１００％とし、試験細胞に各被験物質を接触させた場合のcAMP量のパーセンテージが125%以上になる物質をシグナル伝達活性化剤（アゴニスト）として選択した（図３）。
（実施例１９） cAMP 量の変動を指標としたスクリーニング
CHO細胞の１×１０⁶個に、実施例８により得たドーパミンD1レセプター発現ベクター（１００ｎｇ）、ＣＲＥ‐レポータープラスミド（ｐＣＲＥ‐１ｕｃ；２０ｎｇ；Stratagene社製）、実施例７により得たＧｍ１発現ベクター（ｐｃＤＮＡ‐Ｇｍ１；３０ｎｇ）をリポフェクション法でトランスフェクションして試験細胞を調製する。
【０２４７】
次いで、この細胞を24穴プレートの各ウェル内に５×10³cells/well播種し、約48時間培養する。次いで、細胞を0.2mMの緩衝液（３−イソブチル−メチルキサンチン、0.05% BSA、20mM HEPESを含むハンクスバッファー（pH7.4）；以下、「反応用バッファー」という）で洗浄する。次いで、反応用バッファーを細胞に加えて３７℃で30分間保温する。
【０２４８】
次いで、反応用バッファーを除き、新たに0.25mlの反応用バッファーを細胞に加えた後、GPCRリガンドとして1nMのドーパミン及び0.1nM〜10nMの被験物質を添加し、３７℃で３０分間保温する。さらに、細胞を細胞溶解液（ピッカジーンルシフェラーゼキット、東洋インキ製造社製）で溶解し、発光基質（ピッカジーンルシフェラーゼキット、東洋インキ製造社製）を添加して、ルミノメーターで蛍光強度を測定する。対照として、同濃度のGPCRリガンドのみ接触させた試験細胞、及び、何も接触させない試験細胞について、同様にして蛍光強度を測定する。
【０２４９】
何も接触させない場合の蛍光強度を０％とし、リガンドのみ接触させた場合の蛍光強度を100%として、リガンドと被験物質とを接触させた場合の蛍光強度のパーセンテージが50%以下になる物質又は150%以上になる物質をシグナル伝達調節剤として選択する。
（実施例２０）ヒトアデノシン A2a レセプター蛋白質の動物細胞中での発現ベクターの構築
ヒトアデノシンA2aレセプター蛋白質を動物細胞中で一過性で発現させるための発現ベクターを以下の手順で構築した。
【０２５０】
ヒトアデノシンA2aレセプターをコードするDNAを増幅するために、ヒト脳由来cDNAライブラリー（宝酒造製）のプラスミド（pAP3neo）20ngを鋳型に用い10μMのフォワードプライマーprAdenosineA2A-5'（5’−agctcggatccATGCCCATCATGGGCTCCTCGGTGTA； 配列番号３３）、10μMのリバースプライマーprAdenosineA2A-3'（5’−gtgcagaattcTCAGGACACTCCTGCTCCATCCT；配列番号３４）およびTAKARA LA Taqポリメラーゼ（TAKARA LA Taq with GC Buffer，宝酒造製）を用いてPCRを行った。
【０２５１】
PCR条件は、95℃で30秒間次いで60℃で30秒間次いで72℃で2分間の保温を1サイクルとしてこれを35サイクル行った。得られたDNAはアガロースゲル電気泳動後、QIAquick Gel Extraction kit（QIAGEN製）を用い精製、回収された。この精製、回収されたDNAをインサートDNAとした。
【０２５２】
それぞれのインサートDNAをBamHIおよびEcoRIで二重消化しpcDNA3．1（＋）のBamHIおよびEcoRI部位に導入し、動物細胞発現ベクターpcDNA−A2aを得た。
（実施例２１） cAMP 量の変動を指標としたアデノシン A2a レセプターアンタゴニストのスクリーニング
CHO細胞の2×１０⁵個に、実施例２０により得たアデノシンA2aレセプター発現ベクター（1μg）及び実施例７により得たＧｍ１発現ベクター（ｐｃＤＮＡ‐Ｇｍ１；3μg）をリポフェクション法でトランスフェクションして試験細胞を調製した。
【０２５３】
次いで、この細胞を96穴プレートの各ウェル内に3×10⁴cells/well播種し、約24時間培養した。次いで、培養液を除き、新たに1mM IBMXを含むOPTI-MEN(インビトロジェン社) 80μlを細胞に加えて３７℃で１０分間保温した。
【０２５４】
次いで、GPCRリガンドとして10μMのアデノシン及び10μMの被験物質（DMPX）を添加し、37℃で30分間反応させた。
【０２５５】
次いで、反応バッファーを除きｃAMP量をHitHunter ECF cyclic AMP化学発光アッセイキット（アプライドバイオシステムズ）を用いて測定した。対照として、同濃度のGPCRリガンドのみ接触させた試験細胞、及び、何も接触させない試験細胞について、同様にしてcAMP量を測定した。
【０２５６】
何も接触させない場合のcAMP量を０％とし、試験細胞にリガンドのみ接触させた場合のcAMP量を100%として、試験細胞にリガンドと被験物質とを接触させた場合のcAMP量のパーセンテージが85%以下になる物質をシグナル伝達抑制剤（アンタゴニスト）として選択した（図４）。
（実施例２２） cAMP 量の変動を指標としたアデノシン A2a レセプターアゴニストのスクリーニング
CHO細胞の2×１０⁵個に、実施例２０により得たアデノシンA2aレセプター発現ベクター（1μg）及び実施例７により得たＧｍ１発現ベクター（ｐｃＤＮＡ‐Ｇｍ１；3μg）をリポフェクション法でトランスフェクションして試験細胞を調製した。
【０２５７】
次いで、この細胞を96穴プレートの各ウェル内に3×10⁴cells/well播種し、約24時間培養した。次いで、培養液を除き、新たに1mM IBMXを含むOPTI-MEN(インビトロジェン社) 80μlを細胞に加えて３７℃で１０分間保温した。
【０２５８】
次いで、GPCRリガンドとして10μMのアデノシン又は、10μMの被験物質（CGS‐21680）を添加し37℃で30分間反応させた。
【０２５９】
次いで、反応バッファーを除きｃAMP量をHitHunter ECF cyclic AMP化学発光アッセイキット（アプライドバイオシステムズ）を用いて測定した。対照として、何も接触させない試験細胞について、同様にしてcAMP量を測定した。
【０２６０】
何も接触させない場合のcAMP量を１００％とし被験物質とを接触させた場合のcAMP量のパーセンテージが１２５%以上になる物質をシグナル伝達活性化剤（アゴニスト）として選択した（図５）。
（実施例２３）ＧＴＰ結合アッセイによるスクリーニング
実施例１３で作製した2μgのGm1蛋白質を含む膜画分および実施例１４で作製した2μgのGβ蛋白質とGγ蛋白質を含む細胞膜画分および実施例１５で作製した2μgのドーパミンD1レセプター蛋白質を含む膜画分を55μlの結合バッファー（59mM Tris，4．8mM MgC1₂，2mMEDTA，100mM NaCl，1μM GDP）に懸濁する。1μMのドーパミンおよび0．1nM−10nMの被験物質（例えば1nMのSCH−23390）を添加し、30℃で10分間保温する。その後、200pMの〔35S〕GTPγSを加え30℃で30分間保温する。
【０２６１】
次いで、洗浄用緩衝液（氷冷した50mM Tris，5mM MgC1₂，150mMNaCl，0．1％BSA，0．05％CHAPS（pH7．4））を1．5ml加えて、ガラス繊維濾紙GF／Fを用いて濾過する。続いてこの濾紙を1mlのTris（pH7．4）で3回洗浄し、65℃で30分間保温した後、液体シンチレーションカウンターで濾紙上に付着した膜画分に結合した〔35S〕GTPγSの放射性活性を測定する。
【０２６２】
GPCRのリガンドのみを加えた場合の放射活性を100％、リガンドおよび被験物質のいずれもを加えなかった場合の放射活性を0％とし、リガンドと被験物質との双方を加えた場合の放射活性のパーセンテージを算出し、50％以下になるような被験物質または、150％以上になるような被験物質をシグナル伝達調節物質として選択する。
（実施例２４） cAMP 量の変動を指標とした Gm1 を介するシグナル伝達経路の活性化測定
CHO細胞の2×１０⁵個に、実施例８により得たドーパミンD1レセプター発現ベクター（1μg）及び実施例７により得たＧｍ１発現ベクター（ｐｃＤＮＡ‐Ｇｍ１；3μg）をリポフェクション法でトランスフェクションして試験細胞を調製した。
【０２６３】
次いで、この細胞を96穴プレートの各ウェル内に3×10⁴cells/well播種し、約24時間培養した。次いで、培養液を除き、新たに1mM IBMXを含むOPTI-MEN(インビトロジェン社) 80μlを細胞に加えて３７℃で１０分間保温した。
【０２６４】
次いで、GPCRリガンドとして10μMのドーパミンを添加し37℃で30分間反応させた。
【０２６５】
次いで、反応バッファーを除きｃAMP量をHitHunter ECF cyclic AMP化学発光アッセイキット（アプライドバイオシステムズ）を用いて測定した。対照として、何も接触させない試験細胞について、同様にしてcAMP量を測定した。
【０２６６】
何も接触させない細胞のcAMP量を０％とし、ドーパミンD1レセプターのみを発現させた対照細胞のcAMP量を100%として、Gm1およびドーパミンD1レセプターを発現させた試験細胞のcAMP量を測定した結果、1２７%であった。このことより、Gm1を介するシグナル伝達系が存在することが証明された（図６）。
（実施例２５） cAMP 量の変動を指標とした Gm1 を介するシグナル伝達経路の活性化測定
CHO細胞の2×１０⁵個に、実施例８により得たアデノシンA2aレセプター発現ベクター（1μg）及び実施例７により得たＧｍ１発現ベクター（ｐｃＤＮＡ‐Ｇｍ１；3μg）をリポフェクション法でトランスフェクションして試験細胞を調製した。
【０２６７】
次いで、この細胞を96穴プレートの各ウェル内に3×10⁴cells/well播種し、約24時間培養した。次いで、培養液を除き、新たに1mM IBMXを含むOPTI-MEN(インビトロジェン社) 80ulを細胞に加えて３７℃で１０分間保温した。
【０２６８】
次いで、GPCRリガンドとして10μMのアデノシンを添加し37℃で30分間反応させた。
【０２６９】
次いで、反応バッファーを除きｃAMP量をHitHunter ECF cyclic AMP化学発光アッセイキット（アプライドバイオシステムズ）を用いて測定した。対照として、何も接触させない試験細胞について、同様にしてcAMP量を測定した。
【０２７０】
何も接触させない細胞のcAMP量を０％とし、アデノシンA2aレセプターのみを発現させた細胞のcAMP量を100%として、Gm1およびアデノシンA2aレセプターを発現させた場合のcAMP量を測定した結果、134%であった。このことより、Gm1を介するシグナル伝達系が存在することが証明された（図７）。
（実施例２６）マウス Gm1 蛋白質をコードするｃ DNA のクローニング
マウスGm1の全長をコードするDNAを有するプラスミドであるｐDr-mGm1を以下のようにして作製した。
【０２７１】
マウス脳由来ｃDNAライブラリー（Clontech社製）20ngを鋳型に用い、10μMのフォワードプライマー（5'-ATGGGCCTATGCTACAGCCTGCGGCCGCT；配列番号29）、10μMのリバースプライマーprmGm1STOP（5'-TCACAAGAGTTCGTACTGCTTGAGATGCATTCT；配列番号30）およびTAKARA LA Taqポリメラーゼ（TAKARA LA Taq with GC Buffer, 宝酒造社製）を用いてPCRを行うことにより増幅DNAを得た。
【０２７２】
PCR条件は、95℃で30秒間、次いで60℃で30秒間、次いで72℃で2分間の保温を1サイクルとしてこれを35サイクル行った。得られたDNAをアガロース電気泳動後、QIAquick Gel Extraction kit（QIAGEN社製）を用いて精製し、回収した。この精製、回収されたDNAをインサートDNAとした。
【０２７３】
次にQIAGEN PCR Cloning Kit（QIAGEN社製）を用い、その添付プロトコールにしたがって、インサートDNA（50ng）をpDriveベクター（25ng）のクローニング部位に挿入することにより、pDr-mGm1を作製した。
【０２７４】
このようにして得られたDNAについてABI377DNAシークエンサーを用いて塩基配列を決定した結果、配列番号27に記載の塩基配列の塩基番号１〜1347を含み、配列番号25に記載のアミノ酸配列の全長をコードしていた。
（実施例２７）ラット Gm1 蛋白質をコードするｃ DNA のクローニング
ラットGm1の全長をコードするDNAを有するプラスミドであるｐDr-rGm1を以下のようにして作製した。
【０２７５】
ラット脳由来ｃDNAライブラリー（Clontech社製）20ngを鋳型に用い、10μMのフォワードプライマーprrGm1ATG（5'-ATGGGCCTGTGCTACAGCCTACGGCCGCTG；配列番号31）、10μMのリバースプライマーprrGm1'STOP（5'-TCACAAGAGTTCGTACTGCTTGAGGTGCATTCT；配列番号32）およびTAKARA LA Taqポリメラーゼ（TAKARA LA Taq with GC Buffer, 宝酒造社製）を用いてPCRを行うことにより増幅DNAを得た。
【０２７６】
PCR条件は、95℃で30秒間、次いで60℃で30秒間、次いで72℃で2分間の保温を1サイクルとしてこれを35サイクル行った。得られたDNAをアガロース電気泳動後、QIAquick Gel Extraction kit（QIAGEN社製）を用いて精製し、回収した。この精製、回収されたDNAをインサートDNAとした。
【０２７７】
次にQIAGEN PCR Cloning Kit（QIAGEN社製）を用い、その添付プロトコールにしたがって、インサートDNA（50ng）をpDriveベクター（25ng）のクローニング部位に挿入することにより、pDr-rGm1を作製した。
【０２７８】
このようにして得られたDNAについてABI377DNAシークエンサーを用いて塩基配列を決定した結果、配列番号28に記載の塩基配列の塩基番号１〜1353を含み、配列番号26に記載のアミノ酸配列の全長をコードしていた。
【０２７９】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のタンパク質のヒト組織における発現分布を示す図面代用写真である。
【図２】種々の被験物質のドーパミンＤ１レセプターアンタゴニストとしての効果を示す図である（実施例１７）。
【図３】種々の被験物質のドーパミンＤ１レセプターアゴニストとしての効果を示す図である（実施例１８）。
【図４】DMPXのアデノシンＡ２ａレセプターアンタゴニストとしての効果を示す図である（実施例２１）。
【図５】CGS-21680のアデノシンＡ２ａレセプターアゴニストとしての効果を示す図である（実施例２２）。
【図６】ドーパミンによりドーパミンＤ１レセプター及びＧｍ１を介したシグナル伝達が行われたことを示す図である（実施例２４）。
【図７】アデノシンによりアデノシンＡ２ａレセプター及びＧｍ１を介したシグナル伝達が行われたことを示す図である（実施例２５）。
【図８】精製された抗ヒトGm1蛋白質抗体が有するGm1特異的認識能力のウェスタンブロット法を用いた確認試験（その１）の結果を示す図である（実施例６）。
【図９】精製された抗ヒトGm1蛋白質抗体が有するGm1特異的認識能力のウェスタンブロット法を用いた確認試験（その２）の結果を示す図である（実施例６）。

Claims (29)

1. 以下の（１）又は（２）のタンパク質。
   （１）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
   （２） 配列番号１に記載のアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号１に記載のアミノ酸配列におけるアミノ酸番号１１９−１３３、２８７−２９２、３５３−３５９及び４２８−４３５で示されるアミノ酸配列を保持し、かつ、Ｇ−タンパク質共役型受容体刺激による細胞内シグナル伝達に関与し、ドーパミンレセプター又はアデノシンＡ２レセプターからアデニル酸シクラーゼへのシグナル伝達を媒介する能力を有するタンパク質。
2. 配列番号２５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
3. 配列番号２６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
4. 請求項１から３のいずれかに記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
5. 配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
6. 配列番号２７に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
7. 配列番号２８に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
8. 請求項４から７のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む組み換えベクター。
9. 請求項８に記載の組み換えベクターを保持する形質転換体。
10. 請求項９記載の形質転換体を培養し、培養された形質転換体から請求項１から３のいずれかに記載のタンパク質を回収する請求項１から３のいずれかに記載のタンパク質の製造方法。
11. 請求項１から３のいずれかに記載のタンパク質を有効成分とする、ドーパミンレセプター又はアデノシンＡ２レセプターであるＧ−タンパク質共役型受容体刺激による細胞内シグナル伝達調節剤。
12. 請求項４から７のいずれかに記載のポリヌクレオチドを有効成分とする、ドーパミンレセプター又はアデノシンＡ２レセプターであるＧ−タンパク質共役型受容体刺激による細胞内シグナル伝達調節剤。
13. （ａ） 被験物質と、請求項８に記載の組み換えベクター及びドーパミンレセプター又はアデノシンＡ２レセプターであるＧ−タンパク質共役型受容体タンパク質をコードするＤＮＡを含む組み換えベクターを保持する試験細胞とを接触させる工程と、
    （ｂ） 試験細胞におけるＧ−タンパク質のエフェクターの活性又はそれと相関する指標値を測定する工程と、
    （ｃ） このエフェクター活性又はそれと相関する指標値を、被験物質を接触させていない試験細胞の当該エフェクター活性又はそれと相関する指標値と比較して、試験細胞におけるエフェクター活性又はそれと相関する指標値を変動させる被験物質を選択する工程とを含むドーパミンレセプター又はアデノシンＡ２レセプターであるＧ−タンパク質共役型受容体及び請求項１から３のいずれかに記載のタンパク質を介したシグナル伝達調節物質のスクリーニング方法。
14. （ａ） 被験物質と、請求項８に記載の組み換えベクター及びドーパミンレセプター又はアデノシンＡ２レセプターであるＧ−タンパク質共役型受容体タンパク質をコードするＤＮＡを含む組み換えベクターを保持する試験細胞とを接触させる工程と、
    （ｂ） 試験細胞のＧ−タンパク質のエフェクターの活性又はそれと相関する指標値を測定する工程と、
    （ｃ） このエフェクター活性を、請求項８に記載の組み換えベクターを保持せずドーパミンレセプター又はアデノシンＡ２レセプターであるＧ−タンパク質共役型受容体タンパク質をコードするＤＮＡを含む組み換えベクターを保持する対照細胞に当該被験物質を接触させた場合の当該エフェクター活性又はそれと相関する指標値と比較して、試験細胞と対照細胞との間でエフェクター活性又はそれと相関する指標値に差が生じる被験物質を選択する工程と
    を含むドーパミンレセプター又はアデノシンＡ２レセプターであるＧ−タンパク質共役型受容体及び請求項１から３のいずれかに記載のタンパク質を介したシグナル伝達調節物質のスクリーニング方法。
15. （ａ） 被験物質と、請求項８に記載の組み換えベクター及びドーパミンレセプター又はアデノシンＡ２レセプターであるＧ−タンパク質共役型受容体タンパク質をコードするＤＮＡを含む組み換えベクターを保持する試験細胞とを接触させる工程と、
    （ｂ） 試験細胞のＧ−タンパク質のエフェクターの活性又はそれと相関する指標値を測定する工程と、
    （ｃ） このエフェクター活性又はそれと相関する指標値を、ドーパミンレセプター又はアデノシンＡ２レセプターであるＧ−タンパク質共役型受容体タンパク質をコードするＤＮＡを含む組み換えベクターを保持せず請求項８に記載の組み換えベクターを保持する対照細胞に当該被験物質を接触させた場合の当該エフェクター活性又はそれと相関する指標値と比較して、試験細胞と対照細胞との間でエフェクター活性又はそれと相関する指標値に差が生じる被験物質を選択する工程と
    を含むドーパミンレセプター又はアデノシンＡ２レセプターであるＧ−タンパク質共役型受容体及び請求項１から３のいずれかに記載のタンパク質を介したシグナル伝達調節物質のスクリーニング方法。
16. （ａ） 被験物質及びドーパミンレセプター又はアデノシンＡ２レセプターであるＧ−タンパク質共役型受容体のリガンドと、請求項８に記載の組み換えベクター及びドーパミンレセプター又はアデノシンＡ２レセプターであるＧ−タンパク質共役型受容体タンパク質をコードするＤＮＡを含む組み換えベクターを保持する試験細胞とを接触させる工程と、
    （ｂ） 試験細胞におけるＧ−タンパク質のエフェクター活性又はそれと相関する指標値を測定する工程と、
    （ｃ） このエフェクター活性又はそれと相関する指標値を、被験物質を接触させず前記リガンドを接触させた試験細胞の当該エフェクター活性又はそれと相関する指標値と比較して、試験細胞におけるエフェクター活性又はそれと相関する指標値を変動させる被験物質を選択する工程と
    を含むドーパミンレセプター又はアデノシンＡ２レセプターであるＧ−タンパク質共役型受容体及び請求項１から３のいずれかに記載のタンパク質を介したシグナル伝達調節物質のスクリーニング方法。
17. （ａ） 被験物質及びドーパミンレセプター又はアデノシンＡ２レセプターであるＧ−タンパク質共役型受容体のリガンドと、請求項８に記載の組み換えベクター及びドーパミンレセプター又はアデノシンＡ２レセプターであるＧ−タンパク質共役型受容体タンパク質をコードするＤＮＡを含む組み換えベクターを保持する試験細胞とを接触させる工程と、
    （ｂ） 試験細胞におけるＧ−タンパク質のエフェクター活性又はそれと相関する指標値を測定する工程と、
    （ｃ） このエフェクター活性を、被験物質を接触させずに前記リガンドを接触させた試験細胞の当該エフェクター活性と比較して、試験細胞におけるエフェクター活性の変動を見る工程と、
    （ｄ） このエフェクター活性又はそれと相関する指標値の変動率を、ドーパミンレセプター又はアデノシンＡ２レセプターであるＧ−タンパク質共役型受容体タンパク質をコードするＤＮＡを含む組み換えベクターを保持せず請求項８に記載の組み換えベクターを保持する対照細胞に当該被験物質及び当該リガンドを接触させた場合の当該エフェクター活性又はそれと相関する指標値の変動率と比較して、試験細胞と対照細胞との間でエフェクター活性又はそれと相関する指標値の変動率に差が生じる被験物質を選択する工程と
    を含むドーパミンレセプター又はアデノシンＡ２レセプターであるＧ−タンパク質共役型受容体及び請求項１から３のいずれかに記載のタンパク質を介したシグナル伝達調節物質のスクリーニング方法。
18. （ａ） 被験物質と、請求項８に記載の組み換えベクターを保持する細胞の細胞膜画分及びドーパミンレセプター又はアデノシンＡ２レセプターであるＧＰＣＲをコードするＤＮＡを含む組み換えベクターを保持する細胞の細胞膜画分、又は、請求項８に記載の組み換えベクター及びドーパミンレセプター又はアデノシンＡ２レセプターであるＧＰＣＲをコードするＤＮＡを含む組み換えベクターを保持する細胞の細胞膜画分とを接触させる工程と、
    （ｂ） この細胞膜画分へのＧＴＰの結合量を評価する工程と、
    （ｃ） このＧＴＰ結合の評価量を、被験物質を接触させていない前記細胞膜画分へのＧＴＰ結合の評価量と比較して、細胞膜画分へのＧＴＰ結合の評価量を変動させる被験物質を選択する工程と
    を含むドーパミンレセプター又はアデノシンＡ２レセプターであるＧ−タンパク質共役型受容体及び請求項１から３のいずれかに記載のタンパク質を介したシグナル伝達調節物質のスクリーニング方法。
19. （ａ） 被験物質及びドーパミンレセプター又はアデノシンＡ２レセプターであるＧ−タンパク質共役型受容体のリガンドと、請求項８に記載の組み換えベクターを保持する細胞の細胞膜画分及びドーパミンレセプター又はアデノシンＡ２レセプターであるＧＰＣＲをコードするＤＮＡを含む組み換えベクターを保持する細胞の細胞膜画分、又は、請求項８に記載の組み換えベクター及びドーパミンレセプター又はアデノシンＡ２レセプターであるＧＰＣＲをコードするＤＮＡを含む組み換えベクターを保持する細胞の細胞膜画分とを接触させる工程と、
    （ｂ） この細胞膜画分へのＧＴＰ結合量を評価する工程と、
    （ｃ） このＧＴＰ結合の評価量を、被験物質を接触させず前記リガンドを接触させた前記細胞膜画分におけるＧＴＰ結合の評価量と比較して、細胞膜画分へのＧＴＰ 結合の評価量を変動させる被験物質を選択する工程と
    を含むドーパミンレセプター又はアデノシンＡ２レセプターであるＧ−タンパク質共役型受容体及び請求項１から３のいずれかに記載のタンパク質を介したシグナル伝達調節物質のスクリーニング方法。
20. （ａ） 被験物質と、請求項１から３のいずれかに記載のタンパク質を発現可能な試験細胞とを接触させる工程と、
    （ｂ） 試験細胞における請求項１から３のいずれかに記載のタンパク質の発現量を測定する工程と、
    （ｃ） この発現量を、被験物質を接触させない試験細胞の当該タンパク質の発現量と比較して、試験細胞における当該タンパク質の発現量を変動させる被験物質を選択する工程と
    を含むドーパミンレセプター又はアデノシンＡ２レセプターであるＧ−タンパク質共役型受容体及び請求項１から３のいずれかに記載のタンパク質を介したシグナル伝達調節物質のスクリーニング方法。
21. 請求項８に記載の組み換えベクターを保持する試験細胞と；Ｇ−タンパク質のエフェクターの活性又はそれと相関する指標値の測定用試薬とを含む、ドーパミンレセプター又はアデノシンＡ２レセプターであるＧ−タンパク質共役型受容体及び請求項１から３のいずれかに記載のタンパク質を介したシグナル伝達調節物質のスクリーニングキット。
22. 試験細胞が、さらにドーパミンレセプター又はアデノシンＡ２レセプターであるＧ−タンパク質共役型受容体をコードするＤＮＡを有する組換えベクターを保持するものである請求項２１に記載のスクリーニングキット。
23. さらに、ドーパミンレセプター又はアデノシンＡ２レセプターであるＧ−タンパク質共役型受容体のリガンドを含む請求項２１又は２２に記載のスクリーニングキット。
24. さらに、ドーパミンレセプター又はアデノシンＡ２レセプターであるＧ−タンパク質共役型受容体をコードするＤＮＡを有する組み換えベクターを保持する対照細胞を含む請求項２１、２２又は２３に記載のスクリーニングキット。
25. さらに、請求項８に記載の組み換えベクターを保持する対照細胞を含む請求項２１、２２又は２３に記載のスクリーニングキット。
26. 請求項８に記載の組み換えベクターを保持する細胞と；請求項１から３のいずれかに記載のタンパク質に結合できるがＧＴＰａｓｅにより分解されないＧＴＰアナログとを含む、ドーパミンレセプター又はアデノシンＡ２レセプターであるＧ−タンパク質共役型受容体及び請求項１から３のいずれかに記載のタンパク質を介したシグナル伝達調節物質のスクリーニングキット。
27. 細胞が、さらにドーパミンレセプター又はアデノシンＡ２レセプターであるＧ−タンパク質共役型受容体をコードするＤＮＡを有する組み換えベクターを保持するものである請求項２６に記載のスクリーニングキット。
28. 請求項８に記載の組み換えベクターを保持する細胞と；及びドーパミンレセプター又はアデノシンＡ２レセプターであるＧ−タンパク質共役型受容体をコードするＤＮＡを有する組み換えベクターを保持する細胞と；請求項１から３のいずれかに記載のタンパク質に結合できるがＧＴＰａｓｅにより分解されないＧＴＰアナログとを含む、ドーパミンレセプター又はアデノシンＡ２レセプターであるＧ−タンパク質共役型受容体及び請求項１から３のいずれかに記載のタンパク質を介したシグナル伝達調節物質のスクリーニングキット。
29. さらに、ドーパミンレセプター又はアデノシンＡ２レセプターであるＧ−タンパク質共役型受容体のリガンドを含む請求項２６、２７又は２８に記載のスクリーニングキット。

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