JP4545984B2

JP4545984B2 - 電気泳動用媒体

Info

Publication number: JP4545984B2
Application number: JP2001144671A
Authority: JP
Inventors: 和敏原口
Original assignee: Kawamura Institute of Chemical Research
Current assignee: Kawamura Institute of Chemical Research
Priority date: 2001-05-15
Filing date: 2001-05-15
Publication date: 2010-09-15
Anticipated expiration: 2021-05-15
Also published as: JP2002340855A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、（Ａ）アクリルアミド系化合物の重合物と、（Ｂ）水に均一分散可能な水膨潤性粘土鉱物、及び（Ｃ）水との三成分を構成成分として含み、（Ａ）と（Ｂ）からなる三次元網目の中に（Ｃ）が包含されている、有機・無機複合ポリアクリルアミド系水性ゲルからなる、透明性及び機械的特性に優れた電気泳動用媒体、及び該媒体を用いた電気泳動装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
電気泳動分析はプラスチックやガラスなどの透明支持体の上に、セルロース、セルロースアセテート、でんぷん、寒天、シリカゲル、ポリアクリルアミドゲル等からなる電気泳動膜を形成し、これに緩衝液を含ませたものに、分析対象試料を添加し、次いで支持体の両端に電圧をかけ、支持体の表面または内部で試料を展開させた後、染色し、この染色したものの光透過濃度を測定して試料の各成分の定性、定量分析を行うもので、現在、化学、生化学、医療検査などの多くの分野で広く用いられている。
【０００３】
電気泳動用膜としては、古くからろ紙が用いられてきたが、性能上の面から最近ではポリアクリルアミド系ゲル膜やアガロース膜が用いられ、特にポリアクリルアミドゲル膜が多く用いられている。ポリアクリルアミド系ゲル膜は、水の存在下にアクリルアミドのような化合物（以下、単量体とも呼ぶ）を重合触媒の存在下、Ｎ、Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドのような有機架橋剤で、除酸素条件下で重合架橋させることによって得られる。
【０００４】
しかし、現在用いられているポリアクリルアミド系ゲル膜は、タフネスが無く、脆くて壊れ易い欠点を有している。このため、例えば必要なサンプル注入口を膜を切って作ることが出来ず、サンプルスロットホーマをゲル形成液中に予め挿入したりして、サンプル注入用のスロット（くぼみ）を作ることが行われており、電気泳動膜の製造上、また分離性能上、大きな障害となっている。
【０００５】
またゲル膜を支持体上に形成する場合も、ゲルが高い強度を持てば、ゲル媒体の取り扱い性が大きく向上し、分析の安定化に寄与することになる。これまで、かかるポリアクリルアミド系ゲル膜のもろさを改良する方法として、アガロースや水溶性高分子などを含ませる方法（特許公報平４−７７２６４）や三官能の有機架橋剤を添加する方法（特許公報平４−７７８６８）などが提案されているが、更なるゲル媒体の物性向上が望まれている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明が解決しようとする課題は、ポリアクリルアミド系ゲル電気泳動膜の機械的脆さを改良し、透明性に優れ、且つ破れにくく、取り扱い性に優れ、任意の形状のサンプル注入口を加工できるような機械特性を有する有機・無機複合ポリアクリルアミド系水性ゲルからなる電気泳動用媒体、及び該媒体を用いた電気泳動装置を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らはポリアクリルアミド系膜の脆さを改良する方法を鋭意検討した結果、水および水膨潤性粘土の存在下にアクリルアミド系化合物を重合させることで得られる有機・無機複合ポリアクリルアミド系水性ゲルが、上記問題を解決した、優れた電気泳動用膜となることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
即ち、本発明は、（Ａ）アクリルアミド系化合物の重合物と、（Ｂ）水に均一分散可能な水膨潤性粘土鉱物、及び（Ｃ）水との三成分を構成成分として含み、（Ａ）と（Ｂ）からなる三次元網目の中に（Ｃ）が包含されている有機・無機複合ポリアクリルアミド系水性ゲルからなる電気泳動用媒体である。
【０００９】
また、本発明は、（Ｂ）水に均一分散可能な水膨潤性粘土鉱物と（Ｃ）水との共存下に、（Ａ）アクリルアミド系化合物を重合させて得られる有機・無機複合ポリアクリルアミド系水性ゲルからなる電気泳動用媒体である。
【００１０】
更に、本発明の電気泳動用媒体は、有機・無機複合ポリアクリルアミド系水性ゲルを構成する、水に均一分散可能な水膨潤性粘土鉱物が、特に水膨潤性スメクタイトであるものや、水に均一分散可能な水膨潤性粘土鉱物の量がアクリルアミド系化合物に対して０．５重量％〜５００重量％であるもの、又、厚み３００μｍの有機・無機複合ポリアクリルアミド系水性ゲルの可視光透過率が８０％以上であるものを含む。また本発明は、これら有機・無機複合ポリアクリルアミド系水性ゲルからなる電気泳動媒体を用いた電気泳動装置である。
【００１１】
【実施の形態】
本発明は、（Ａ）アクリルアミド系化合物の重合物と、（Ｂ）水に均一分散可能な水膨潤性粘土鉱物、及び（Ｃ）水との三成分を構成成分として含み、（Ａ）と（Ｂ）からなる三次元網目の中に（Ｃ）が包含されている、有機・無機複合ポリアクリルアミド系水性ゲルからなる電気泳動用媒体である。
【００１２】
本発明に用いる（Ａ）アクリルアミド系化合物としては、アクリルアミド、Ｎ−メチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−（ヒドロキシメチル）アクリルアミド、ジアセトンアクリルアミド等のアクリルアミドホモログや、メタクリルアミドが挙げられ、これらの化合物は単独で、あるいは二種以上を併用して用いることができる。これらのアクリルアミド系化合物のうちではアクリルアミドが最も好ましく、またアクリルアミドと他のアクリルアミド系化合物との一種以上の併用も好ましい。
【００１３】
本発明に用いる（Ｂ）水に均一分散可能な水膨潤性粘土鉱物としては、粘土鉱物のうち、水に微細、且つ均一に分散し、望ましくは水に溶解もしくは膨潤する性質を有するものであり、特に水中で分子状（単一層状）またはそれに近いレベルで均一分散可能な層状粘土鉱物であることが好ましい。例えば、水膨潤性スメクタイトや水膨潤性雲母などが好ましく用いられる。具体的には、ナトリウムを層間イオンとして含んだ水膨潤性スメクタイト、即ち水膨潤性ヘクトライト、水膨潤性モンモリロナイト、水膨潤性サポナイト、水膨潤性合成雲母などが挙げられる。
【００１４】
ここで言う溶解とは、粘土鉱物の沈殿もしくは濁った水溶液となるような大きな粘土鉱物凝集体が無い状態を意味する。より好ましくは１〜１０層程度のナノメーターレベルの厚みで分散しているもの、特に好ましくは１層又は２層程度の厚みで分散しているものである。
【００１５】
本発明の有機・無機複合ポリアクリルアミド系水性ゲルを構成成分とする電気泳動用媒体は、有機架橋剤を全く含まなくとも、十分な機械的強度を有するゲルが得られるが、電気移動用媒体としての良好な性質を有するために、必要に応じて、他の成分や有機架橋剤が含まれていても良い。
【００１６】
これらの有機架橋剤としては、従来から公知のＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−プロピレンビスアクリルアミド、ジ（アクリルアミドメチル）エーテル、１，２−ジアクリルアミドエチレングリコール、１，３−ジアクリロイルエチレンウレア、エチレンジアクリレート、Ｎ，Ｎ’−ジアリルタータルジアミド、Ｎ，Ｎ’−ビスアクリリルシスタミンなどの二官能性化合物や、トリアリルシアヌレート、トリアリルイソシアヌレートなどの三官能性化合物が例示される。
【００１７】
本発明の有機・無機複合ポリアクリルアミド系水性ゲルを構成成分とする電気泳動用媒体は、アクリルアミド系化合物、水に均一分散可能な水膨潤性粘土鉱物および水を必須成分として含む溶液で、アクリルアミド系化合物をラジカル重合させて得られるもので、１層又は２層、もしくは１〜１０層程度のナノメーターレベルで分散した粘土鉱物がアクリルアミド系化合物の架橋剤の働きをして、ポリアクリルアミドと粘土鉱物が水中で均一に複合化した構造を有するものと推定される。
【００１８】
上記のラジカル重合反応は、分子状酸素の不存在下で過酸化物の存在及び／又は紫外線照射等公知の方法により発生させることができる。更に、この重合反応は加熱または紫外線照射により加速することもできる。ラジカル重合用開始剤および触媒としては、公知慣用のラジカル重合開始剤および触媒のうちから適時選択して用いることができる。
【００１９】
具体的には、重合開始剤として、水溶性の過酸化物例えばペルオキソ二硫酸カリウムやペルオキソ二硫酸アンモニウム、水溶性のアゾ化合物（例：ＶＡ−０４４、Ｖ−５０（和光純薬工業株式会社製））などが用いられる。また触媒としてはＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミンやβ−ジメチルアミノプロピオニトリルなどが用いられる。重合温度は、重合触媒や開始剤の種類に合わせて０℃〜１００℃の範囲で設定できる。
【００２０】
本発明の電気泳動用媒体として用いられる有機・無機複合ポリアクリルアミド系ゲルのゲル濃度としては、媒体として使用可能であれば良く、特に限定されないが、好ましくはアクリルアミド化合物の重合物、水膨潤性粘土および水からなるゲル媒体の重量に対して、アクリルアミド化合物の重合物の量が約２重量％から約３０重量％の範囲で用いられる。ここで、有機架橋剤が含まれる場合は、アクリルアミド化合物の重合物の量としては、アクリルアミド化合物の重合物と有機架橋剤とを合わせた量を用いる。
【００２１】
本発明の電気泳動用媒体として用いられる有機・無機複合ポリアクリルアミド系ゲルに含まれる水膨潤性粘土鉱物の量は、用いるアクリルアミド化合物やその濃度によっても異なり一概に規定できないが、好ましくはアクリルアミド系化合物に対して０．５重量％から５００重量％、より好ましくは５重量％から３００重量％、特に好ましくは１０重量％から２００重量％である。
【００２２】
電気泳動用媒体としては、無色透明のゲルが好ましく用いられるが、本発明の有機・無機複合ポリアクリルアミド系水性ゲルは粘土鉱物を含んでいるものの、それらが微細に分散した状態である為に透明性に優れる。本発明の有機・無機複合ポリアクリルアミド系水性ゲルからなる電気泳動用媒体の透明性は、厚み３００μｍの電気泳動用媒体で、可視光の光透過率が８０％以上であり、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上である。
【００２３】
粘土鉱物が均一微細分散していなかったり、共存する有機架橋剤による不均一架橋が生じるなどの結果、透明性が８０％より低い濁ったものは泳動像の検出または読みとりが不正確となる。
【００２４】
本発明の有機・無機複合ポリアクリルアミド系水性ゲルからなるゲル電気泳動用媒体には、通常、電気泳動用媒体に用いられる他の成分を必要に応じて含ませることができる。例えば、陰イオン活性剤（例：アルキル硫酸塩）や尿素、ホルムアミドのような変性剤、抗酸化剤（例：２−メルカプトエタノール）、水溶性ポリマー（例：ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール）、アガロース、湿潤剤（例：グリセリン）などが挙げられる。
【００２５】
また本発明の有機・無機複合ポリアクリルアミド系水性ゲルからなるゲル電気泳動用媒体（以下、ゲル媒体という）には、電気泳動分析される試料に応じてｐＨを緩衝できるｐＨ緩衝剤（例：燐酸二水素カリウム−燐酸水素二ナトリウム）を含有させることができる。
【００２６】
本発明のゲル媒体を層または膜として用いる場合には、平滑な支持体、例えば親水性表面を有するガラス板やプラスチックシート（例：親水化処理したポリエチレンテレフタレート）の上にゲル形成液を公知の方法により塗布して設けたのち、ゲル形成液を重合させることにより、ゲル層またはゲル膜に成形することができる。ゲル形成液の重合は０℃〜１００℃の範囲で行え、最も容易には室温または８０℃以下の温度で加熱して行うことができる。
【００２７】
また重合時間は重合温度やゲルの厚みによっても変化するので、一概に規定されないが、一般に数分〜数時間で完了する。ゲル形成液を支持体の表面で重合させる場合には、ゲル形成液の上にさらにカバーフィルム、シートなどで覆うことができる。またカバーフィルム上に電気泳動媒体を形成させた後、その上に支持体を付設する方法も利用できる。
【００２８】
本発明のゲル媒体は水平型および垂直型平板電気泳動法、ディスク電気泳動法等のいずれにも用いることができ、特にＤＮＡ、蛋白質などの生体高分子の電気泳動分析に好ましく用いられる。
【００２９】
【実施例】
次いで本発明を実施例により、より具体的に説明するが、もとより本発明は、以下に示す実施例にのみ限定されるものではない。
【００３０】
（実施例１と２）
エタノールとトルエンを用いて精製したアクリルアミド、１００℃で２時間真空乾燥した水膨潤性粘土（［Ｍｇ_５．３４Ｌｉ_０．６６Ｓｉ_８Ｏ_２０（ＯＨ）_４］Ｎａ^＋ _０．６６の組成を有する水膨潤性合成ヘクトライト（商標ラポナイトＸＬＧ、日本シリカ株式会社製）、重合開始剤（ペルオキソ二硫酸カリウム）、触媒（Ｎ,Ｎ,Ｎ’,Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン）及び水からなる均一透明なゲル形成液を調製した。各成分の重量比を表１に示す。ゲル形成液はいずれも無色透明溶液であり、粘土の凝集物による沈殿や濁りはなかった。また各溶液には溶存酸素が含まれないように酸素を除去しつつ調製した。
【００３１】
表面を親水性にした厚さ１８０μｍのポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）シート（支持体）の上に、約３００μｍの厚さになるように、表１記載のゲル形成液を塗布し、酸素を除いた窒素雰囲気中、２８℃で重合させたところ、有機架橋剤を含まないにも拘わらず、均一透明な有機・無機複合ポリアクリルアミド系水性ゲルからなるゲル膜が得られた。ゲル膜の光透過性を日本電色工業株式会社製ＮＤＨ−３００Ａを用いて測定した結果（全光透過率）を表１に併せて示す。
【００３２】
得られたゲル膜に、カッターを用いてサンプル注入口を形成した。次いで、表面を親水性にしたＰＥＴフィルム（カバーフィルム、厚み１００μｍ）をこのゲル膜の表面に置いて被覆し、電気泳動用媒体を得た。サンプル注入口の形成に際しては、鋭い切り口のサンプルスロットが容易に得ることができ、比較例１においてみられた切り口におけるひびわれや膜の破れは一切見られなかった。
【００３３】
次に、これらのゲル膜を用いて標準蛋白質（チトクロームＣ（分子量１２４００）、キモトリプシノーゲンＡ（分子量２５００）、オボアルブミン（分子量４５０００）、ウシ血清アルブミン（分子量６７０００））の電気泳動を行った。
この電気泳動媒体を０．１％コマシーブルー（Coomassie Blue）染色液に浸責して染色を行い、蛋白質の分離性能を目視により調べた。その結果、実施例１〜３では、比較例１と比較してシャープな分離パターンを示した。
【００３４】
（実施例３）
有機架橋剤としてＮ,Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドを使用する以外は実施例１で用いたのと同じ種類の粘土鉱物、アクリルアミド、開始剤を使用し、表１に示す組成のゲル形成液を調製した。平面平滑なガラス板２枚と０．５ｍｍ厚みのスペーサー板を用いて０．５ｍｍ厚み空間を有するガラス板セルを作成し、このセルの中にゲル形成液を注入し、２５℃で重合させて有機・無機複合ポリアクリルアミド系水性ゲルからなるゲル膜を作った。
【００３５】
充分にゲル化させたのち（ゲル膜は透明であった）、片面のガラス板をはずし、ポリアクリルアミドゲル膜を鋭い刃を用いてサンプル注入用のスロットを作ったところ、鋭い切り口のサンプルスロットが得られた。得られたゲル膜に再度ガラス板のカバーを施し、実施例１と同様にして標準蛋白質の電気泳動を行った結果、シャープな分離パターンが得られた。以上のように本発明によるゲル膜は、電気泳動特性上、特に問題が無く、且つ膜の欠点であった脆さが改良されて、ゲル膜を任意に加工裁断出来ることが判った。
【００３６】
（比較例１）
表１に示す組成のゲル形成液を用いる以外は実施例１と同様にしてアクリルアミドゲル膜を調製した。カッターを用いてサンプル注入口を形成したが、切り口にひびわれや膜の破れが生じ、実施例１のような鋭い切り口のスロットを形成することはできなかった。また実施例１と同様にして標準蛋白質の電気泳動を行ったが、電気泳動パターンのみだれが著しかった。
【００３７】
【表１】

【００３８】
【発明の効果】
本発明の有機・無機複合ポリアクリルアミド系水性ゲルからなる電気泳動用媒体は、透明性に優れ、また従来の有機架橋型ゲル媒体と比べて力学物性に優れタフネスを有するため、ひびや膜の破れなどが無く、安定してスロットが形成でき、また、支持体上のゲル層が高い強度を有するため製造時の取り扱い性に優れるなどの効果を有し、優れた電気泳動用ゲル媒体として用いることができる。
また、有機・無機複合ポリアクリルアミド系水性ゲルからなる電気泳動用媒体を用いた電気泳動装置はゲル媒体が取り扱いやすく、シャープな分離パターンと優れた再現性を有する。

Claims

（Ａ）アクリルアミド系化合物の重合物と、（Ｂ）水に均一分散可能な水膨潤性粘土鉱物、及び（Ｃ）水との三成分を構成成分として含み、（Ａ）と（Ｂ）からなる三次元網目の中に（Ｃ）が包含されている有機・無機複合ポリアクリルアミド系水性ゲルからなる電気泳動用媒体。
（Ｂ）水に均一分散可能な水膨潤性粘土鉱物と（Ｃ）水との共存下に、（Ａ）アクリルアミド系化合物を重合させて得られる有機・無機複合ポリアクリルアミド系水性ゲルからなる電気泳動用媒体。
（Ｂ）水に均一分散可能な水膨潤性粘土鉱物が水膨潤性スメクタイトであることを特徴とする請求項１又は２に記載の電気泳動用媒体。
（Ｂ）水に均一分散可能な水膨潤性粘土鉱物の量がアクリルアミド系化合物に対して０．５重量％〜５００重量％であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の電気泳動用媒体。
厚み３００μｍの有機・無機複合ポリアクリルアミド系水性ゲルでの可視光の光透過率が８０％以上であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の電気泳動用媒体。
請求項１〜５のいずれか１項に記載の有機・無機複合ポリアクリルアミド系水性ゲルからなる電気泳動用媒体を用いた電気泳動装置。