JP4542545B2 - 抗フォン・ビルビラント因子切断プロテアーゼ（ａｄａｍｔｓ１３）抗体のための診断アッセイ - Google Patents

Description

（発明の分野）
本発明は、抗ｖＷＦ−ｃｐ抗体を含むことが疑われるサンプル内で、抗フォン・ビルビラント因子切断プロテアーゼ（ＡＤＡＭＴＳ１３）抗体（「抗ｖＷＦ−ｃｐ抗体」）を定量するためのアッセイシステムにおいて使用されるキットに関連する。このキットは、患者内の抗ｖＷＦ−ｃｐ抗体の存在に関連する障害を診断するための方法において、そして、血栓性微小血管症の異なる形態間を識別するために使用され得る。

（発明の背景）
一次止血における１つの重要なタンパク質は、フォン・ビルビラント因子（ｖＷＦ）である。血漿フォン・ビルビラント因子（ｖＷＦ）は、脈管の損傷部位への血小板の接着を媒介する多量体タンパク質であり、特に非常に大きなｖＷＦ多量体が、止血能力が高い。ｖＷＦ多量体の大きさを制御する血漿因子の存在が、長い間疑われてきた。フォン・ビルビラント因子切断プロテアーゼ（「ｖＷＦ−ｃｐ」）は、人間におけるフォン・ビルビラント因子多量体のタンパク質分解切断によって、血小板性血栓症の増大を制限することに関与する（Ｆｕｒｌａｎら（１９９６）Ｂｌｏｏｄ ８７：４２２３−４２３４）。近年、フォン・ビルビラント因子切断プロテアーゼおよび対応する遺伝子の分子構造は記載されており（ＷＯ ０２／４２４４１；Ｚｈｅｎｇら（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：４１０５９−４１０６３）、そして、ＡＤＡＭＴＳファミリーの新しいメンバーとして同定されており、ＡＤＡＭＴＳ１３と命名されている。ｖＷＦｃｐは、タンパク質分解切断により、ｖＷＦ多量体を調節する。

大きな、そして特大のｖＷＦ多量体は、動脈血栓症において中心的な役割を果たし、それによって、ｖＷＦの異常に大きな多量体が、血栓性微小血管症の２つの類似する形態−血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＰＰ）および溶血性尿毒性症候群（ＨＵＳ）−（両方共に、微小循環において汎発性の塞栓をもたらす血小板凝集の形成を生じる）において認められている。ＴＴＰを有する患者は、ｖＷＦ−ｃｐの欠乏を有し、従って、ＨＵＳを有す患者は、前立腺の正常な活性を示す。

ＴＴＰにはいくつかの型が存在する：急性特発性または散発性の形態、最終的に再発を伴う間欠性の形態、および慢性再発性の形態。慢性再発性のＴＴＰは、ｖＷＦ−ｃｐの後天性または先天性の欠失に関連する。ＴＴＰの稀な遺伝形態は、ＡＤＡＭＴＳ−１３遺伝子座の特異的な遺伝子変異に関連している。急性の特発性ＴＴＰまたは後天性ＴＴＰは通常、慢性の再発性ＴＴＰより重篤であり、これらのＴＴＰにおいて、患者は、フォン・ビルビラント因子切断プロテアーゼを阻害する、ｖＷＦ−ｃｐに対する後天性の抗体を有する（Ｆｕｒｌａｎら（１９９８）Ｂｌｏｏｄ ９１：２８３９−２８４６；Ｆｕｒｌａｎ
ら（１９９８）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３９：１５７８−１５８４）。後天性ＴＴＰはまた、妊娠中、または分娩後の期間に時折生じる。間欠性の再発性ＴＴＰはまた、ｖＷＦ−ｃｐインヒビターの再発に関連する。ＴＴＰの他の形態（例えば、チクロピジン関連のＴＴＰ）については、これらの患者が、ｖＷＦ−ｃｐに対する後天性の抗体を有することがまた観察されている（Ｍｏａｋｅ，（２００２）Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４７：５８９−６００）。しかし、通常血漿中に大きなｖＷＦ多量体を有する後天性のＴＴＰを有する幾人かの患者は、ｖＷＦ−ｃｐのレベルの深刻なレベルを欠く。

一般に、タンパク質に対する阻害抗体は、血液の損失または血栓をもたらす、例えば、凝固カスケード内の深刻な問題を生じる。

先天性および後天性のＴＴＰは、後天性のＴＴＰを罹患する患者の８０％までの血漿中の、ｖＷＦ−ｃｐに対する阻害抗体の存在、および遺伝性ＴＴＰを有する患者の血漿中のｖＷＦ−ｃｐの完全な欠失により識別される。従来、患者の血漿中の阻害抗体は、非生理学的条件下での平衡酵素アッセイによって定量され、そして、急性の抗体媒介性のＴＴＰの診断を確認する。

先天性および後天性のＴＴＰの診断のためのｖＷＦ−ｃｐの種々のアッセイが記載されている。ｖＷＦ−ｃｐの活性およびｖＷＦ−ｃｐのインヒビターの存在は、患者の血漿サンプルと共に精製したｖＷＦ多量体をインキュベーションし、その後、抗ｖＷＦ抗体で変性ｖＷＦ基質を免疫ブロッティングし、そして多量体分析することによって定量される（Ｆｕｒｌａｎら（２００２）Ｓｅｍ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．２８：１６７−１７２）。この方法は、プロテアーゼ活性の低い範囲において非常に感度がよい；しかし、この精度は、正常以下または正常な範囲のプロテアーゼ活性においては中程度でしかない。ｖＷＦ−ｃｐ活性およびｖＷＦ−ｃｐインヒビターを定量するための、Ｇｅｒｒｉｔｓｅｎら［（１９９９）Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．８２：１３８６−１３８９］により記載されるコラーゲン結合アッセイは、６時間以内で完了し得るが、この方法は、変性したｖＷＦ多量体の免疫ブロッティングと比較して、プロテアーゼ活性の非常に低い範囲において感度が悪い（Ｆｕｒｌａｎら．２００２前出）。しかし、先行技術において記載されるアッセイは、非常に厄介であり、時間がかかり、そして、この技術に精通した研究室の専門家を必要とする。さらに、公知の先行技術のアッセイは、ｖＷＦ−ｃｐの触媒機能を損ねるｖＷＦ−ｃｐインヒビターの検出を可能にするのみである。触媒活性以外のｖＷＦ−ｃｐ機能（例えば、内皮細胞結合）を損ね得る阻害抗体は、これらのアッセイによっては検出され得ない。

従って、酵素触媒性のプロテアーゼ活性以外のｖＷＦ−ｃｐ機能を損ねる、患者の血漿中の抗ｖＷＦ−ｃｐ抗体を検出および定量することを可能にする試験システムに対する必要性が存在する。

（発明の要旨）
本発明の目的は、サンプル内で抗ｖＷＦ−ｃｐ抗体を定量するためのキットを提供することである。このキットは、ｖＷＦ−ｃｐまたはｖＷＦ−ｃｐフラグメントの生物学的特性を実質的に損ねることなく、固相上に固定化されたｖＷＦ−ｃｐおよび／または１つ以上のｖＷＦ−ｃｐフラグメントを含む。さらに、本発明のキットはまた、抗原／抗体アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ、ＲＩＡなど）を実施するために、当該分野で公知の任意の補助剤（例えば、緩衝塩、緩衝顕示溶液、ブロッキング剤、顕示剤など）を含み得る。開示されるキットは、種々の様式（例えば、１つ以上の容器またはマイクロタイター
プレートの形態）で提供され得る。

驚くべきことに、本発明者らは、固相上に固定化されたｖＷＦ−ｃｐまたはｖＷＦ−ｃｐフラグメントが、サンプル内で抗ｖＷＦ−ｃｐ抗体の存在を定量するための、単純で、効率的で、迅速かつ再現性のあるアッセイシステムを提供することを見出した。本発明のシステムを用いると、先行技術のシステムにおいては検出されなかったｖＷＦ−ｃｐインヒビターが定量された。本発明のキットは、先行技術のアッセイよりも現在のアッセイにおいて感度が良くなり、そして、公知のシステムの検出限界を下回り得るｖＷＦ抗体の量を検出するために使用され得る。本発明のキットを用いて実施されるアッセイは、異なる特異性を有し、ｖＷＦ−ｃｐの異なる生物学的機能の欠陥に基づく、抗ｖＷＦ−ｃｐ抗体間を識別することを可能にする。本発明のキットを用いて実施されるアッセイはさらに、ＴＴＰおよびｖＷＦ−ｃｐインヒビターに関連する他の障害の迅速な診断、ならびに種々の形態の血栓性微小血管症（ＴＭ）の区別を可能にする。

（発明の詳細な説明）
本発明の１つの局面は、サンプル内で抗ｖＷＦ−ｃｐ抗体を定量するためのキットに関し、このキットは、ｖＷＦ−ｃｐまたはｖＷＦ−ｃｐフラグメントの生物学的特性を実質的に損ねることなく、固相上に固定化されたｖＷＦ−ｃｐおよび／またはｖＷＦ−ｃｐフラグメントを含む。ｖＷＦ−ｃｐまたはｖＷＦ−ｃｐフラグメントは、サンプル内に存在する抗ｖＷＦ−ｃｐ抗体に結合し得る抗原定量部位を提供する診断剤として、キットにおいて使用され得る。

用語「定量」とは、本明細書中で使用される場合、サンプル内での抗ｖＷＦ−ｃｐ抗体のｖＷＦ−ｃｐ抗原結合領域の検出、定量およびマッピングを含むことを意味する。「定量」は、検出システム（例えば、色素アッセイ）での、抗体／ｖＷＦ−ｃｐまたは抗体／ｖＷＦ−ｃｐフラグメントの複合体の形成を示す少なくとも１つの陽性反応を意味する。任意の抗ｖＷＦ抗体を含まないことが知られているサンプル（例えば、正常ヒト血漿）が、ネガティブコントロールとして使用される。「定量」は、代表的に、抗ｖＷＦ−ｃｐ抗体を含むことが疑われるサンプルの規定された希釈物を、固定化されたｖＷＦ−ｃｐまたはｖＷＦ−ｃｐフラグメントと接触すること、そして、この検出システムにより得られる反応の強度を、公知の規定された量の抗ｖＷＦ抗体を含むサンプルの規定された希釈物（標準として使用される）で得られる反応強度と比較することを意味する。抗ｖＷＦ−ｃｐ抗体のｖＷＦ−ｃｐ抗原結合部位の「マッピング」は、抗ｖＷＦ−ｃｐ抗体を含むことが疑われるサンプルを、完全なｖＷＦ−ｃｐ、およびｖＷＦ−ｃｐ分子の異なる領域に由来するｖＷＦ−ｃｐフラグメントと接触することによって実施される。これにより、サンプル中に存在し得る抗ｖＷＦ−ｃｐ抗体の完全なスペクトルが、捕捉され得、ｖＷＦ−ｃｐの領域／ドメイン内に特異的な結合活性を有する抗ｖＷＦ−ｃｐ抗体が同定され得る。

用語「サンプル」は、本明細書中で使用される場合、患者の血液、血漿または組織のような、生物学的流体を指すことを意味する。サンプルは、特に、抗ｖＷＦ−ｃｐ抗体の存在に関連する障害を有することが疑われるヒト患者から得られ得る。

用語「固相」は、任意の特定の制限は意味せず、例えば、有機ポリマー（例えば、ポリアミド、またはビニルポリマー（例えば、ポリ（メタ）アクリレート、ポリスチレンおよびポリビニルアルコール、またはこれらの誘導体））、天然ポリマー（例えば、セルロース、デキストラン、アガロース、キチンおよびポリアミノ酸）、または無機ポリマー（例えば、ガラスまたはメタロヒドロキシド）であり得る、不溶性のポリマー材料を指す。固相は、微小キャリア、粒子、膜、ストリップ、紙、フィルム、真珠またはプレート（例えば、マイクロタイタープレート）の形態であり得る。ｖＷＦ−ｃｐまたはｖＷＦ−ｃｐフラグメントは、共有結合によって固相に直接固定化され得るか、または、キャリア（例え
ば、リンカー分子または固相に固定化された抗体）を介して固相に固定化され得る。

用語「生物学的特性」は、本明細書中で使用される場合、少なくとも１つの抗ｖＷＦ−ｃｐ抗体に結合し得る、ｖＷＦ−ｃｐまたはｖＷＦ−ｃｐフラグメントの機能的に活性なエピトープ、または抗原定量基として意味される。固相上へのｖＷＦ−ｃｐまたはｖＷＦ−ｃｐフラグメントの固定化は、免疫学的特性（特に、ｖＷＦ−ｃｐまたはｖＷＦ−ｃｐフラグメントの機能的エピトープまたは抗原定量基の構造）が保存され、サンプル内に存在する少なくとも１つの抗ｖＷＦ−ｃｐ抗体によって認識されるように有効に提示される様式で実施される。

ｖＷＦ−ｃｐまたはｖＷＦ−ｃｐフラグメントは、全体として、または部分的に、組換え技術によって生成され得、そして、原核生物または真核生物の宿主系で発現することによって調製され得る。原核生物宿主は、Ｅ．ｃｏｌｉまたはＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのような細菌細胞であり得る。真核生物細胞は、酵母細胞（例えば、Ｐｉｃｈｉａ株）；昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ、Ｓ２）；および哺乳動物細胞（例えば、ＭＲＣ５、ＣＨＯ、ＣＯＳ、３Ｔ３、ＨＥＫ ２９３、ＢＨＫ、ＳＫ−Ｈｅｐ、ＨｅｐＧ２およびＨｅｌａ）からなる群より選択され得る。

広範な種々のベクターが、ｖＷＦ−ｃｐまたはｖＷＦ−ｃｐフラグメントの調製のために使用され得、そして、原核生物および真核生物の発現ベクターから選択され得る。原核生物発現のためのベクターの例としては、ｐＲＳＥＴ、ｐＥＴ、ｐＢＡＤなどのようなプラスミドが挙げられ、ここで、真核生物発現ベクターにおいて用いられるプロモーターとしては、ｌａｃ、ｔｒｃ、ｔｒｐ、ｒｅｃＡ、ａｒａＢＡＤなどが挙げられる。真核生物発現のためのベクターの例としては、（ｉ）酵母における発現については、ＡＯＸ１、ＧＡＰ、ＧＡＬ１、ＡＵＧ１などのプロモーターを使用する、ｐＡＯ、ｐＰＩＣ、ｐＹＥＳ、ｐＭＥＴなどのベクター；（ｉｉ）昆虫細胞における発現については、ＰＨ、ｐ１０、ＭＴ、Ａｃ５、ＯｐＩＥ２、ｇｐ６４、ｐｏｌｈなどのプロモーターを使用する、ｐＭＴ、ｐＡｃ５、ｐｌＢ、ｐＭＩＢ、ｐＢＡＣなどのベクター；そして（ｉｉｉ）哺乳動物細胞における発現については、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＥＦ−１ａ、ＵｂＣ、ＲＳＶ、ＡＤＶ、ＢＰＶおよびβ−アクチンのようなプロモーターを使用する、ｐＳＶＬ、ｐＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡ３、ｐＢＰＶなどのようなベクター、および、ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルスなどのウイルス系に由来するベクターが挙げられる。

ｖＷＦ−ｃｐフラグメントは、配列番号１〜６からなる群より選択され得る。

ｖＷＦ−ｃｐフラグメントは、ｖＷＦ−ｃｐに含まれるアミノ酸配列を示し、好ましくは少なくとも６アミノ酸、より好ましくは、約６〜約５０アミノ酸を有する、ペプチドであり得る。上記ペプチドを本発明における診断試薬として使用する１つの利点は、抗ｖＷＦ−ｃｐ抗体の特異性の選択的な定量である。このペプチドは、標準的なペプチド合成技術によって生成され得る。

本発明の１つの実施形態によれば、ｖＷＦ−ｃｐまたはｖＷＦ−ｃｐフラグメントは、異種性の配列に融合される。この異種性の配列は、異種性のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチド、特に機能的ペプチドであり得る。この異種性の配列は、固相への結合特性を有する配列であり得る（例えば、この固相は、異種性の配列への共有結合を可能にするか、またはキャリアに対する親和性を有する、反応性部位を有し得る）。

この異種性のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドは、β−ガラクトシダーゼ、ｃ−ｍｙｃ産物、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、ＦＬＡＧ−タグおよびこれらの誘
導体からなる群より選択され得る。この異種性の配列はまた、一連のいくつかの同じアミノ酸または一連のいくつかの異なるアミノ酸を含み得る。好ましくは、この異種性の配列は、固相と共有結合を形成し得るペプチド、または、特に特異的な抗ポリ−ヒスチジン抗体に高い親和性を有するポリヒスチジンである。この異種性の配列は、そのＮ末端またはＣ末端において、ｖＷＦ−ｃｐまたはｖＷＦ−ｃｐフラグメントに融合され得る。この異種性の配列は、代表的にはｖＷＦ−ｃｐのＣ末端に融合される。ｖＷＦ−ｃｐまたはｖＷＦ−ｃｐフラグメントは、ｖＷＦ−ｃｐまたはｖＷＦ−ｃｐフラグメントの生物学的特性が負に影響を受けないように、この異種性の配列に融合される。ｖＷＦ−ｃｐまたはｖＷＦ−ｃｐフラグメントのエピトープの提示を立体的に競合しないように、短いペプチドスペーサーが、この異種性の配列とｖＷＦ−ｃｐまたはｖＷＦ−ｃｐフラグメントとの間に挿入され得る。

１つの実施形態によれば、ｖＷＦ−ｃｐまたはｖＷＦ−ｃｐフラグメントは、機能的な親和性ペプチド、特に、いくつかのヒスチジン残基（ある場合には、３〜２０のヒスチジン残基、そして別の場合には、６〜１５のヒスチジン残基）を有するペプチドに、融合される。タンパク質の精製のために、タンパク質のＣ末端に融合されたポリ−ヒスチジン（いわゆる「Ｈｉｓタグ」）の形態で親和性ペプチドを使用することは、ＥＰ ０ ２８２
０４２に記載されている。

固相への固定化は、固相および異種性の配列の反応基を介して、または、異種性の配列に対して親和性を有するキャリアを介して、達成（例えば、直接、または共有結合により）され得る。

本発明の１つの好ましい実施形態において、異種性の配列は、キャリアに対して高い親和性を有し、そして、ｖＷＦ−ｃｐまたはｖＷＦ−ｃｐフラグメントが、キャリアに対するその異種性部分の結合を介して固相に固定化される。従って、異種性の配列は、特異的な結合特性、または、キャリアに対して高い親和性を有する。本発明の１つの実施形態によれば、このキャリアは、ｖＷＦ−ｃｐ融合タンパク質の異種性部分に対して親和性を有する抗体である。

本発明の１つの実施形態において、ｖＷＦ−ｃｐまたはｖＷＦ−ｃｐフラグメントは、異種性の配列としてポリヒスチジンタグに融合され、抗ｈｉｓ−タグ抗体が、ｖＷＦ−ｃｐまたはｖＷＦ−ｃｐフラグメントを固相上に固定化するためのキャリアとして使用される。他の異種性の親和性ペプチドおよび、当業者に公知のそれぞれの抗親和性ペプチド抗体がまた、ｖＷＦ−ｃｐまたはｖＷＦ−ｃｐフラグメント融合タンパク質を固定化するために使用され得る。

ｖＷＦ−ｃｐおよび／もしくはｖＷＦ−ｃｐフラグメントまたはその融合タンパク質は、異なるスポット（例えば、マイクロタイタープレートの異なるウェルの中）に別個に、固相上に固定化され、この場所で、代表的には、ｖＷＦ−ｃｐまたは特異的ｖＷＦフラグメントのような１つの規定された抗原が、１つのスポット内に含まれる。このアッセイシステムを用いると、抗ｖＷＦ−ｃｐ抗体の完全なスペクトルが捕捉され得、ｖＷＦ−ｃｐの領域／ドメイン内の特異的な結合活性を有する抗ｖＷＦ−ｃｐ抗体が同定される。ｖＷＦ−ｃｐ抗体の特異性の定量、およびｖＷＦ−ｃｐ分子内の抗原結合部位の定量により、それぞれ、抗体の全範囲が同定され得、そして抗ｖＷＦ−ｃｐ抗体に関連する障害を有する患者の特異的な処置が適合され得るので、このことは、非常に重要である。例えば、抗ｖＷＦ−ｃｐ抗体は、患者の血漿を、本明細書中に記載されるような、アッセイにおいて使用され、かつ、抗体に対して親和性を有するｖＷＦ−ｃｐフラグメントを特異的な吸着剤として使用する、親和性クロマトグラフィーに供することによって、特異的な抗ｖＷＦ−ｃｐ抗体を有すると同定された患者の血漿から選択的に除去され得る。このことは、先
行技術の方法と比較して、抗ｖＷＦ−ｃｐ抗体に関連する障害を有する患者の改善された処置を可能にする。

本発明の１つの実施形態によれば、上記のキットはさらに、診断剤として、固相に固定化された抗ｖＷＦ−ｃｐ抗体を含む。この抗ｖＷＦ−ｃｐ抗体は、ポリクローナル抗体、従来のハイブリドーマ技術により得られるモノクローナル抗体、または、組換え技術（例えば、ファージディスプレイまたはリボソームディスプレイ）により得られる抗体もしくは抗体フラグメントであり得る。このような本発明のキットにおけるセットアップは、血栓性微小血管障害の差示的な診断を可能にする。特に、固相上に固定化されたｖＷＦ−ｃｐ、ｖＷＦ−ｃｐフラグメントおよび抗ｖＷＦ−ｃｐ抗体を含むキットを提供することによって、サンプル内の抗ｖＷＦ抗体の存在／非存在およびｖＷＦ−ｃｐの存在／非存在が、１つの単純な試験システムを用いて定量され得る。

代替的な実施形態において、本発明は、ｖＷＦ−ｃｐまたはそのフラグメントを定量するためのアッセイシステムにおいて使用されるキットに関し、このキットは、上で規定される抗ｖＷＦ−ｃｐ抗体を含み、この抗体は、本明細書中で規定されるように固相に固定化されている。

本発明はまた、サンプル内で抗ｖＷＦ−ｃｐ抗体を定量するための方法に関し、この方法は、ｖＷＦ−ｃｐまたはｖＷＦ−ｃｐフラグメントの生物学的特性を実質的に損ねることなく固相上に固定化されたｖＷＦ−ｃｐおよび／または１つ以上のｖＷＦ−ｃｐフラグメントを提供する工程、抗ｖＷＦ−ｃｐ抗体の存在に関連する障害を有することが疑われる患者の生物学的サンプルを固定化されたｖＷＦ−ｃｐおよび／または１つ以上のｖＷＦ−ｃｐフラグメントに接触させる工程、ならびに抗ｖＷＦ−ｃｐ抗体／ｖＷＦ−ｃｐおよび／または抗ｖＷＦ−ｃｐ抗体／ｖＷＦ−ｃｐフラグメントの複合体を検出する工程を包含する。

抗ｖＷＦ−ｃｐ抗体／ｖＷＦ−ｃｐまたは抗ｖＷＦ−ｃｐ抗体／ｖＷＦ−ｃｐフラグメントの複合体は、当該分野で周知の方法によって（例えば、標識抗体を用いる検出によって）検出され得る。この検出方法は、酵素アッセイ、色素形成アッセイ、発光アッセイ（ｌｕｍｉｎｏ ａｓｓａｙ）、蛍光発生アッセイおよび放射免疫アッセイからなる群より選択され得る。抗体／抗原−／複合体形成の検出を実施するための反応条件は、選択される検出方法に依存する。使用されるそれぞれの検出系に最適なパラメーター（例えば、緩衝系、温度およびｐＨ）を選択することは、当業者の知識の範囲内である。

本発明はまた、上記のキットを用いて、血栓性微小血管障害を差示的に診断するための方法に関し、ここで、このキットは、固相上に固定化された、ｖＷＦ−ｃｐおよび／もしくは１つ以上のｖＷＦフラグメント、またはｖＷＦ−ｃｐおよび／もしくはｖＷＦフラグメント、ならびに抗ｖＷＦ−ｃｐ抗体のいずれかを診断剤として含む。この診断剤は、好ましくは、各々が、固相上で別個のスポット（例えば、マイクロタイタープレートの別個のウェル）に配置される。このことは、１つのアッセイシステムによって、ｖＷＦ−ｃｐもしくは抗ｖＷＦ−ｃｐ抗体のいずれかまたはこの両方を含むサンプルの間を区別し、そして、血栓性微小血管障害（例えば、ＴＴＰまたはＨＵＳの異なる形態）の間を区別することを可能にする。

本発明のキットおよび方法は、抗ｖＷＦ−ｃｐ抗体の存在に関連する障害の診断に使用され得る。

本発明のキットおよび方法はまた、血栓性微小血管症の異なる形態または異なる障害の診断のために使用され得る。血栓性微小血管（ＴＭ）障害は、血栓性血小板減少性紫斑病
（ＴＰＰ）、新生児血小板減少症、ヘーノホ（ヘノッホ）−シェーンライン紫斑病、子癇前症（ｐｒｅｃｌａｍｐｓｉａ）、または溶血性尿毒性症候群（ＨＵＳ）、ＨＥＬＬＰ症候群、ＡＲＤＳ、末梢指虚血症候群、非塞栓性腸間膜虚血、急性膵炎、急性肝炎、リウマチ性紫斑病、医薬関連形成性血小板減少症、術後ＴＭ、癌関連ＴＭ、播種性血管内凝固（ＤＩＣ）、全身性エリテマトーデス、肝硬変、尿毒症、または急性炎症性障害であり得る。

本明細書において提供される例は、明らかに、後天性のＴＴＰ患者における抗ｖＷＦ−ｃｐ抗体の存在（標準的なｖＷＦ−ｃｐ活性アッセイにおいては中和されないが、基質切断活性を単にブロッキングすることとは異なる機構によってｖＷＦ−ｃｐ活性を損なう傾向が多い）が、本発明のキットおよび方法を使用して定量され得ることを示す。このことは、ＴＴＰの迅速かつ感度のよい診断、ならびに、緊急に必要とされる、命を救う臨床的インターベンション（すなわち、血漿処置）を可能にする。本発明のキットおよび方法は、ＴＴＰの種々の形態の差示的な診断に使用され得る。

本発明のキットおよび方法を用いると、全てのＩｇＧクラスならびにＩｇＭの抗体が検出され得るが、先行技術の方法は、ＩｇＧクラスの抗ｖＷＦ−ｃｐ抗体の検出を可能にするのみである。

本発明はさらに、以下の実施例に例示されるが、これらに限定されない。

（実施例１：ｖＷＦ−ｃｐおよびｖＷＦ−ｃｐフラグメント／Ｈｉｓ（６×）−タグの構築）
ｖＷＦ−ｃｐタンパク質の発現について、ＷＯ ０２／４２４４２に記載されるｖＷＦ−ｃｐ ｃＤＮＡクローンを使用する。

ｖＷＦ−ｃｐ ｈｉｓ−タグ融合物を構築するために、２つの連続ＰＣＲを実施して、３つのグリシンコドン、６つのヒスチジンコドン、終止コドンおよびＸｈｏＩ制限部位を追加する。

（ＰＣＲ１）
ＷＯ ０２／４２４４１に記載される野生型の全長ｐｃＤＮＡ３．１．（＋）／ｖＷＦ−ｃｐ（ＡＤＡＭＴＳ１３）を、鋳型として使用する。プライマー７１８９（５’ ＧＴＧ ＡＴＧ ＧＴＧ ＡＴＧ ＧＴＧ ＴＣＣ ＡＣＣ ＴＣＣ ＧＧＴ ＴＣＣ ＴＴＣ ＣＴＴ ＴＣＣ ＣＴＴ ＣＣＡ ３’）およびプライマー６５２６（５’ ＣＴＧ
ＣＣＴ ＣＧＣ ＣＣＧ ＧＡＡ ＣＣＣ ＣＡ ３’）を用いて、ｐｃＤＮＡ３．１．（＋）／ｖＷＦ−ｃｐからのＣ末端ＳｇｒＡＩ／ＸｈｏＩフラグメントを含む１．３ｋｂフラグメントを増幅する。このフラグメント、ならびにプライマー７１９０（５’ ＣＣＣ ＴＣＴ ＡＧＡ ＣＴＣ ＧＡＧ ＴＣＡ ＡＴＧ ＧＴＧ ＡＴＧ ＧＴＧ ＡＴＧ ＧＴＧ ＴＣＣ ＡＣＣ ３’）およびプライマー６５２６を使用して、２回目のＰＣＲを実施する。得られる産物を精製し、ＳｇｒＡＩおよびＸｈｏＩで消化し、ｐｃＤＮＡ３．１．（＋）／ｖＷＦ−ｃｐ野生型構築物内の対応するＳｇｒＡＩ／ＸｈｏＩフラグメントを置き換えるために使用する。

ＷＯ ０２／４２４４２に開示される全長ｖＷＦ−ｃｐ ｃＤＮＡクローンを鋳型として使用し、以下のプライマーの組み合わせを使用するＰＣＲによって、成熟なタンパク質の遺伝子の異なるフラグメントを含むｖＷＦ−ｃｐフラグメント構築物を作製する（また、表４のプライマーおよびそれぞれのｖＷＦ−ｃｐドメイン配列も参照のこと）。
（Ｅ．ｃｏｌｉ発現系：ｐＢＡＤ／Ｔｏｐｏ Ｔｈｉｏｆｕｓｉｏｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇ
ｅｎ））
融合：チオレドキシン（Ｎ末端）、６×Ｈｉｓテイル（Ｃ末端）

このＰＣＲフラグメントを、適切な制限酵素で切断し、ｐＲＳＥＴ（図１）のようなベクター内にクローニングし、そして、同じ酵素で切断して、所望のプラスミド生じる。

ｖＷＦ−ｃｐフラグメント−ｈｉｓタグ融合物の構築のために、ｖＷＦ−ｃｐフラグメントを、上記のｖＷＦ−ｃｐ／ｈｉｓ−タグの構築に従って改変する。この構築物を、合成オリゴヌクレオチドであるｏ．ｐＲＥＴ−ＦＰｄＨＩＳ（１）−６９２９およびｏ．ｐＲＳＥＴ−ＦＰｄＨＩＳ（２）−６９３０（図１）によりＮｄｅＩ−ＸｈｏＩフラグメントを置き換えることによって、ＨＩＳ−６タグを用いてクローニングする。

ｖＷＦ−ｃｐ、ｖＷＦ−ｃｐフラグメントまたはこのそれぞれのｈｉｓタグ融合物を、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９内で組換え的に発現させ、精製して、以下に記載されるように、固相上への固定化に使用する。

（ｖＷＦ−ｃｐ／Ｃ−Ｈｉｓを安定に発現するＨＥＫ ２９３細胞クローン）
ＨＥＫ ２９３（ＡＴＣＣ）細胞を、リン酸カルシウム沈降を使用して、ｐｃＤＮＡ３．１．（＋）／ｖＷＦ−ｃｐ／Ｃ−Ｈｉｓおよびハイグロマイシンカセットを有する選択プラスミドと同時にトランスフェクトする。初代クローンおよびその後のサブクローンを、１００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンおよび８００μｇ／ｍｌのＧ４１８（ｐｃＤＮＡ上にコードされたネオマイシンホスホトランスフェラーゼ）を補充した培養培地内で選択する。組換え的に発現されたｖＷＦ−ｃｐ／ｈｉｓタグを精製して、以下に記載されるように、固相上への固定化に使用する。

（実施例２：キャリア上へのｖＷＦ−ｃｐおよび／またはｖＷＦ−ｃｐフラグメントのカップリング）
組換え型のｖＷＦ−ｃｐ、ｖＷＦ−ｃｐフラグメントを、固相上に直接か、または、キャリアとしてモノクローナル抗ｖＷＦ−ｃｐ抗体を介してのいずれかで結合させる。ｖＷＦ−ｃｐ−Ｈｉｓ−タグまたはｖＷＦ−ｃｐフラグメント−Ｈｉｓタグを、抗Ｈｉｓタグ抗体を介して、ＥＬＩＳＡプレートの表面上に固定化する。患者の血漿と共にインキュベートした後、ｖＷＦ−ｃｐまたはｖＷＦ−ｃｐフラグメントに結合した抗ｖＷＦ−ｃｐ抗体を、ヒト抗体の定常領域を認識する、二次抗体ホスファターゼ結合体により検出する。ホスファターゼは、適切な基質と反応し、色素形成反応を生じ、黄色を呈する。色の強度を測定し、サンプル内の抗体の量を、既知の量の抗ｖＷＦ抗体を含む標準曲線と比較することによって定量する。

（ＥＬＩＳＡのセットアップ）
市販の、ＢＳＡを含まない、抗Ｈｉｓタグ抗体（「キャリア抗体」；Ｑｉａｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中２μｇ／ｍＬの最終濃度まで希釈する。１ウ
ェルあたり１００μｌを９６ウェルマイクロタイタープレート内で、室温にて４時間インキュベートする。ＰＢＳＴ ｐＨ７．４（０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳ緩衝液）を用いる３回の洗浄工程の後、ＰＢＳ ｐＨ７．４および２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンを含む２５０μｌのブロッキング溶液を添加し、４℃にて一晩インキュベートして、全てのフリーな結合部位をブロッキングする。この溶液を、１００μｌの組換え型ｖＷＦ−ｃｐ−Ｈｉｓタグ標識化調製物で置き換え、ｖＷＦ−ｃｐ濃度は、１０Ｕ／ｍＬのプロテアーゼ活性に対応する１．５μｇ／ｍＬである。ｖＷＦ−ｃｐサンプルを、ＰＢＳ ２％ ＢＳＡ中で最終濃度まで希釈する。コーティングされた抗Ｈｉｓ抗体に起因して、組換え型ｖＷＦｃｐ／ｈｉｓタグが捕捉され、そして、キャリア抗体を介して固定化される。室温にて２時間後、１０回の洗浄工程が続く。この洗浄緩衝液は、ＰＢＳ
ｐＨ７．４および０．１％（ｖ／ｖ） Ｔｗｅｅｎ ２０を含む。患者の血漿サンプルを、２％
ＢＳＡを含むＰＢＳ ｐＨ７．４中１：２０、１：５０、１：１００、１：２００、１：３００、１：４００、１：６００、１：８００および１：１２００に希釈し、各希釈の１００μｌを、組換え型ｖＷＦ−ｃｐを含有するウェルにて、室温で３時間インキュベートする。抑制性の抗体を固定化されたｖＷＦ−ｃｐの表面に結合させ、未結合の抗体をＰＢＳＴ ｐＨ７．４を使用する１０回の洗浄工程により洗浄する。ヒト抗体の検出を、マウス抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ特異的抗体またはマウス抗ヒトＩｇＭ抗体（アルカリホスファターゼ結合体化）を用いて実施する。抗体を、ＰＢＳ ２％ ＢＳＡ中１：６００００で最終作業溶液まで希釈し、室温にて２時間インキュベートし（１００μｌ／ウェル）、次いで、ＰＢＳＴ ｐＨ７．４を用いて１０回洗浄する。アルカリホスファターゼ基質（ｐＮＰＰ）の添加により黄色が生じ、これにより、色素強度が、結合抗体（抗体／ｖＷＦ−ｃｐ）の量を反映する。色素強度を、ＥＬＩＳＡリーダーで測定し、血漿サンプル内の抗体の量を、段階希釈によるＮＰの標準曲線を参照して算出する。ネガティブコントロールとして、正常なヒト血漿（ＮＨＰ）の希釈物をそれ相応に処理する。結果を図２Ａおよび２Ｂに示す。この結果は、患者内のヒト抗ｖＷＦ−ｃｐ抗体が、少なくとも１：６００の血漿希釈において明らかに検出され得ることを示す。

正常なヒト血漿をコントロールとして使用し、標準偏差（ＳＤ）をいくつかの血漿ロットについて計算した。正常なヒト血漿の抗体力価＋２ＳＤを超える抗体力価を、陽性と評価する。

（ＴＴＰ患者のサンプルの分析）
ＴＴＰを有する患者からのサンプルおよび正常な血漿サンプルを、固定化されたｖＷＦ−ｃｐを含むＥＬＩＳＡに供する。結果を表１に示す。患者１は、１：６００のＩｇＧ力価と、１：４００のＩｇＭ力価を有する。患者２のＩｇＧ力価は、かなり高い（１：２０００）が、ＩｇＭ力価は、１：１００のみである。患者１は、急性のＴＴＰに罹患しており、その一方で、患者２は、ＴＴＰ後の寛解状態にある。患者１は、抑制性力価を示さないが、患者２は、約６０Ｕ／ｍＬの抑制性力価を有する。正常なヒト血漿は反応を示さない。

ＴＴＰを有する患者のサンプルおよび正常な血漿サンプルを、ｖＷＦ−ｃｐの異なる領域に由来する固定化されたｖＷＦ−ｃｐフラグメントを含むＥＬＩＳＡに供する。結果を表２に示す。患者＃１（抑制性力価なし）のＩｇＧおよびＩｇＭは、ドメイントロンボスポンジン２〜８およびＣｕｂドメイン上に抗体の結合を示す。患者＃２のＩｇＧおよびＩｇＭは、触媒性ドメイン上に結合を示し、これは、抑制性力価と一致する。正常なヒト血漿は、いずれのドメインとも反応しない。患者の血漿を、２連で、２つの異なる血漿希釈（１：５０および１：１００）で試験する。

ＴＴＰを有する患者および正常な血漿からのサンプルを、固定化された抗ｖＷＦ−ｃｐ抗体を含むＥＬＩＳＡに供する。結果を表３に示す。

患者＃１および＃２のＡＤＡＭＴＳ−１３レベルは、明確に検出され得る；正常なヒト血漿が同じレベルを示す。患者＃３は、片側の対立遺伝子に遺伝的欠損を有し、活性の５０％減少を生じることを特徴とする。タンパク質量の５０％の減少はまた、本発明者らのアッセイシステムにおいても認められ得る。患者＃４は、異種性のナンセンス変異に起因して、ＡＤＡＭＴＳ−１３タンパク質を完全に欠損することを特徴とする。従って、タンパク質は検出され得ない。

本明細書中に記載される実施例および実施形態は、例示的な目的のみのためのものであり、これらを踏まえて、種々の改変または変更が当業者に示唆され、そして、本出願の精神および範囲、ならびに添付の特許請求の範囲内に包含されるべきことが理解される。本明細書中に引用された全ての刊行物、特許および特許出願は、各個々の刊行物、特許または特許出願が、個々に、参考として援用されると示される程度と同程度に、あらゆる目的のために、その全体が参考として本明細書により援用される。

図１は、組換え型のｖＷＦ−ｃｐ、ｖＷＦ−ｃｐフラグメント、またはｈｉｓ−タグ異種性の配列に融合されたｖＷＦ−ｃｐもしくはｖＷＦ−ｃｐフラグメントの発現のために使用され得るプラスミドの例を示す。 図２Ａおよび２Ｂは、患者血漿対ヒト正常血漿の血漿サンプルにおけるＩｇＧ抗体（図２Ａ）およびＩｇＭ抗体（図２Ｂ）の定量を示す。エラーバーは、いくつかの血漿のロットから計算した正常ヒト血漿＋２倍標準偏差を示す。

Claims (14)

1. 血栓性微小血管症の種々の形態を区別するためのキットであって、該キットは、
   （ａ）固相上に固定化されたｖＷＦ−ｃｐおよび／または１つ以上のｖＷＦ−ｃｐフラグメントであって、ここで、該固定化されたｖＷＦ−ｃｐまたはｖＷＦ−ｃｐフラグメントの生物学的特性は損なわれていない、ｖＷＦ−ｃｐおよび／または１つ以上のｖＷＦ−ｃｐフラグメント、ならびに
   （ｂ）該固相上に固定化された抗ｖＷＦ−ｃｐ抗体
   を含み、ここで、該ｖＷＦ−ｃｐ、ｖＷＦ−ｃｐフラグメントおよび抗ｖＷＦ−ｃｐ抗体が、各々、該固相上の異なるスポットに別個に配置される、キット。
2. 前記ｖＷＦ−ｃｐフラグメントが、配列番号１〜６からなる群より選択される、請求項１に記載のキット。
3. 前記ｖＷＦ−ｃｐフラグメントが、少なくとも６アミノ酸長を有する、請求項１に記載のキット。
4. 前記ｖＷＦ−ｃｐまたはｖＷＦ−ｃｐフラグメントが、異種性の配列に融合されている、請求項１に記載のキット。
5. 前記異種性の配列が、タンパク質、ポリペプチドおよびペプチドからなる群より選択される、請求項４に記載のキット。
6. 前記ペプチドが、３〜２０の連続するヒスチジン残基を含む、請求項５に記載のキット。
7. 前記ｖＷＦ−ｃｐまたはｖＷＦ−ｃｐフラグメントが、前記固相上に直接固定化される、請求項１に記載のキット。
8. 前記ｖＷＦ−ｃｐまたはｖＷＦ−ｃｐフラグメントが、キャリアを介して前記固相上に固定化される、請求項１に記載のキット。
9. 前記キャリアが抗体である、請求項８に記載のキット。
10. 前記ｖＷＦ−ｃｐまたはｖＷＦ−ｃｐフラグメントが、キャリアを介して前記固相上に固定化される、請求項４に記載のキット。
11. 前記キャリアが抗体である、請求項１０に記載のキット。
12. 前記抗体は、前記ｖＷＦ−ｃｐまたはｖＷＦ−ｃｐフラグメントに融合された前記異種性配列に指向されている、請求項１１に記載のキット。
13. 前記固相が、プレート、膜、紙、フィルム、ストリップおよび真珠からなる群より選択される、請求項１に記載のキット。
14. 前記ｖＷＦ−ｃｐおよびｖＷＦ−ｃｐフラグメントが、各々、前記固相上の異なるスポットに別個に配置される、請求項１に記載のキット。

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