JP4528575B2 - アレルゲン検出測定装置 - Google Patents
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特許文献1に係る花粉抗原測定装置は、図22に示すように、ATカット水晶振動子の主面に、ラングミュア−ブロジェット法によりスギ花粉アレルゲン抗体の単分子膜を一層吸着させることにより、アレルゲン検出測定装置50を作製する。この水晶振動子の端子51は、発振回路52と接続されている。発振回路52はジェネレータ(電源回路)53と接続してある。発振回路52の出力端は周波数カウンタ54と接続しており、この周波数カウンタ54はコンピュータ55と接続している。そしてアレルゲン検出測定装置50は、ビーカ56中の蒸留水57中に浸漬してされている。なお、図19において58は花粉添加手段であり、例えば注射器を用いることができる。
ここで、前記マイクロセルの大きさは、検出測定手段での検出しやすさの観点から、断面形状が円形であり、直径3〜7mm、深さが8〜12mmであることが好ましい。しかし、前記マイクロセルの断面形状は円形に限定されることはなく、楕円形、多角形、不定形等であってもよい。また、マイクロセルの深さ方向において、断面積が減少するような構造であってもよい。
また、前記マイクロセルプレートの隣り合うマイクロセルの間隔が過小であると、アレルゲン含有液等(試験液)の注液や吸液が難しくなり、過大であると、マイクロセルアレイプレートの大きさが必要以上に大きくなる。このため、隣り合うマイクロセルの間隔は、マイクロセルの直径の0.2〜1倍であることが好ましい。
実施の形態1を図面に基づいて説明する。実施の形態1は、第1の態様の本発明に係る検出測定方法及び第3の態様に係る本発明の検出測定装置に関するものであり、具体的には、注液手段が洗浄手段を兼ねる構成(以下、注液洗浄手段と称する)の検出測定装置に関するものである。
実施の形態2では、第2の態様の本発明に係る検出測定方法について、図面に基づいて説明する。図15は、実施の形態2に係るアレルゲン検出測定装置の全体的な構成を示す概念図である。
(1)注液手段3aと洗浄手段3bを別個に設けたこと、
(2)マイクロセルアレイプレート70、アレイプレート可動手段72として図14に示す構造のものを用いたこと、
(3)封口部材として熱融着性フィルムを用い、加圧、加熱することによりマイクロセルを封口した構造であること、
(4)注液器を2つ設けたこと、
(5)検出測定手段として図16に示す構造のものを用いたこと、
(6)注液器洗浄液容器を設けず、マイクロセル洗浄液容器の洗浄液を注液し排出するサイクルを1回以上繰り返すことにより第2の注液器内を洗浄すること、
(7)マイクロセルアレイプレートが3つのセルを1単位として、スギ花粉抗体、ヒノキ花粉抗体、ダニ抗体が固定されている(71a・71b・71c)こと、
(8)注液器洗浄液容器内の洗浄液は、3つのマイクロセル(71a・71b・71c)に対する洗浄を一単位とし、一単位の逐次洗浄が終了した後、取り替えるように構成したこと、
以外は、上記実施の形態1と同様である。また、各手段の具体的構成も、ほぼ上記 実施の形態1と同じであるため、検出測定装置を構成する各手段に関する具体的説明は、上記実施の形態1と異なる部分について、下記検出測定工程とともに説明する。
以下、実施例を用いて本発明を更に説明する。
実施例1では、上記実施の形態1で説明した方法を用いて、スギ花粉量を測定した。
はじめに、図1の収集手段1において、50mMリン酸緩衝液中(pH7.4)に所定量のスギ花粉を導入し、スギ花粉を緩衝液に懸濁する。この懸濁溶液を、チューブ6を介して抽出手段2に送る。この送液は、例えばマイクロポンプ(図示せず)を用いる。
抽出手段2では、上記リン酸緩衝液中に花粉粒子を放置することにより、花粉を吸水させ、膨張させて花粉の殻を破り、花粉粒子からアレルゲンを抽出する。この後、2枚のフィルタを用いて、粒径の差を用いてアレルゲンと他の物質を選別する。具体的には、アレルゲンを通す程度の大きさの目を持つ第1のフィルタと、アレルゲンを通さない程度の大きさの目を持つ第2のフィルタを用いた。アレルゲン抽出溶液を第1のフィルタに通し、第1のフィルタを通過した溶液を、第2のフィルタに通す。これにより、第1のフィルタ上にはアレルゲンが残ることになる。抽出されたアレルゲンは、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)で標識されたスギ花粉アレルゲンを一定量含む溶液中に懸濁する。
注液洗浄手段のアーム14を動作させ、ピペット13の先をマイクロセル41の封口部材42を突き破ってマイクロセル内に挿入させ、抽出手段2から送られたアレルゲン含有溶液をマイクロセル内に注液する。
注液後、アーム14を動作させ、ピペット13をマイクロセルから抜き取り、抗原抗体反応のため30分間マイクロセルアレイプレート60を静置する。この反応で、FITCで標識されたアレルゲンと、標識されていない花粉から抽出されたアレルゲンとが、マイクロセルに固定されたスギ花粉アレルゲン抗体と競合して反応し、アレルゲン−抗体複合体を形成する。
反応後、アーム14を動作させ、ピペット13をマイクロセルに挿入し、マイクロセル中の溶液を吸液する。アーム14を動作させ、ピペット13を廃液容器10上に移動させ、溶液を排出する。再びアーム14を動作させ、ピペット13をマイクロセル洗浄液容器11に挿入し、洗浄液を吸引し、これをマイクロセルに注液する。このマイクロセル洗浄サイクルを3回繰り返すことで抗原抗体反応をしていない未反応のアレルゲンをマイクロセルから取り除く。ここで、洗浄液容器11には、洗浄液として50mMリン酸緩衝液(pH7.4)が入っている。なお、本実施例では洗浄の工程を3回繰り返したが、洗浄回数は3回には限られない。
次に、アーム14を動作させ、ピペット13を注液器洗浄液容器12に挿入し、洗浄液(蒸留水)を吸い込み、吸い出す注液器洗浄サイクルを1回行うとともに、洗浄機構により超音波洗浄を行い、ピペット13を洗浄する。
上記ピペット13の洗浄と並行して抗原抗体反応の検出を行う。図13の励起光照射部20から492nmの波長の励起光22をマイクロセル41に照射し、この励起光22により励起されたFITCからの蛍光23の強度を検出器21で測定する。
この後、使用済みマイクロセル中の溶液が外部に漏れることを防止するため、使用済みマイクロセルを粘着テープで封口する。
実施例2について、図面を参照しながら説明する。図14は、実施例2のアレルゲン検出測定装置のアレイプレート可動手段4の説明に供する構成図である。
図14では、同心円状に並んだマイクロセル71を持つマイクロセルアレイプレート70はアレイプレート可動手段72の上に設置される。このマイクロセルアレイプレートは、3つのマイクロセルを1単位として、それぞれスギ花粉抗体(71a)、ヒノキ花粉抗体(71b)、ダニ抗体(71c)が固定されている。アレイプレート可動手段72はマイクロセルアレイプレート70を回転方向R及び直径方向Xに送り出す。
はじめに、図15の収集手段1において、50mMリン酸緩衝液中(pH7.4)に所定量のスギ花粉・ヒノキ花粉・ダニ(死骸を含む)を導入し、これらを緩衝液に懸濁する。この懸濁溶液を、チューブ6を介して抽出手段2に送る。この送液は、例えばマイクロポンプを用いる。
収集手段1により収集されたスギ花粉・ヒノキ花粉・ダニ(死骸を含む)を、チューブ6を通じて抽出手段2に送る。抽出手段2において、スギ花粉・ヒノキ花粉・ダニ(死骸を含む)に含まれる各種アレルゲンが抽出されるとともに、以降の検出測定工程に悪影響を及ぼす可能性のある他の粒子と分離される。この後、抽出され、分離された混合アレルゲン含有溶液を、チューブ7を用いて注液手段3aに送る。
注液手段3aの第1の注液器(図示せず)により、図14に示すアレイプレート可動手段4上のマイクロセルアレイプレートの3つのマイクロセル71a・71b・71cに、抽出手段から送られた溶液(反応液)を随時一定量注液する。このとき、注液手段3aの第1の注液器で、マイクロセルを密閉している封口部材を突き刺して第1の注液器をマイクロセル71aに挿入し、反応液を注液する。この後、図14に示すアレイプレート可動手段をR・X方向に移動させて、第1の注液器の直下にマイクロセル71bを位置させ、マイクロセル71aと同様の動作を行う。マイクロセル71cに対しても同様である。
注液後、第1の注液器をマイクロセルから抜き取り、抗原抗体反応のため30分間マイクロセルアレイプレート70を静置する。この反応で、花粉等からから抽出されたアレルゲンが、マイクロセルに固定されたスギ花粉アレルゲン抗体と反応し、アレルゲン−抗体複合体を形成する。
洗浄手段3bの第2の注液器(図示せず)で、反応工程204aで抗原抗体反応を起こしたマイクロセル71a中の使用済み反応液を吸引し、洗浄手段3bに設けられた廃液容器(図示せず)に排出する。また、マイクロセル内に残存した未反応のアレルゲンを除去するために、洗浄手段3bを用いてマイクロセル洗浄液容器内の洗浄液(50mMリン酸緩衝液:pH7.4)をマイクロセル内に注液し、マイクロセル71aを洗浄する。この後、同様の工程をマイクロセル71b・71cに対しても行う(マイクロセルの移動は上記注液工程203aと同様である)。
しかる後、マイクロセル洗浄液容器内の洗浄液を吸い込み、廃液容器に排出する注液器洗浄サイクルを1回行い、第2の注液器を洗浄する。
逐次洗浄工程205a後のマイクロセル71a・71b・71cに対し、第1の注液器を用いて注液手段に設けられた蛍光標識付き抗体溶液を、注液工程203aと同様に所定量注液する。
注液後、第1の注液器をマイクロセルから抜き取り、抗原抗体反応のため30分間マイクロセルアレイプレート70を静置する。この反応で、アレルゲン−抗体複合体と、蛍光標識付き抗体とが抗原抗体反応を起こし、蛍光標識付き抗体−アレルゲン−抗体複合体を形成する。
この後、上記逐次洗浄工程205aと同様にして逐次洗浄工程205bを行う。
しかる後、マイクロセル洗浄液容器内の洗浄液を吸い込み、廃液容器に排出する注液器洗浄サイクルを1回行い、第2の注液器を洗浄する。
図16の励起光照射部88から励起光89を射出し、ミラー85、レンズ83、光通過管80を介して、励起光89をマイクロセル41に照射する。この励起光89により励起された蛍光標識からの蛍光90の強度を、光通過管80、ハーフミラー84、レンズ86を介して、検出器87で測定する。
この後、使用済みマイクロセル中の溶液が外部に漏れることを防止するため、使用済みマイクロセルを粘着テープで封止する。
上記実施例では、いわゆる競合法とサンドイッチ法を用いてアレルゲン量を測定したが、本明細書でいう抗原抗体反応(反応)とは、固定抗体とアレルゲンとの反応の他に、アレルゲン−固定抗体複合体に更に標識付き抗体と反応させる反応を含む。
ただし、物理的吸着ではなく、化学的にマイクロセルの内壁に抗体を結合させる方法であってもよいことは勿論である。
2 抽出手段
3 注液洗浄手段
3a 注液手段
3b 洗浄手段
4 アレイプレート可動手段
5 検出測定手段
6 チューブ
7 チューブ
8 封口手段
10 廃液容器
11 マイクロセル洗浄液容器
12 注液器洗浄液容器
13 ピペット
14 アーム
20 励起光照射部
21 検出器
22 励起光
23 蛍光
31 固定抗体
40 マイクロセルアレイプレート
41 マイクロセル
42 封口部材
50 特許文献1に係るアレルゲン検出測定装置
51 水晶振動子の端子
52 発振回路
53 ジェネレータ
54 周波数カウンタ
55 コンピュータ
56 ビーカ
57 蒸留水
58 花粉添加手段
70 マイクロセルアレイプレート
71 マイクロセル
72 アレイプレート可動手段
80 光通過管
82 光通過管固定器
83 レンズ
84 ハーフミラー
85 ミラー
86 レンズ
87 検出器
88 励起光照射部
89 励起光
90 蛍光
101 収集工程
102 抽出工程
103 注液工程
104 反応工程
105 洗浄工程
106 検出測定工程
107 封口工程
201 収集工程
202 抽出工程
203 注液工程
204 反応工程
205 逐次洗浄工程
206 検出測定工程
207 封口工程
301 圧力センサ
302 Xステージ
303 Yステージ
304 モータ
305 モータ
306 ステージ設置板
501 ピペット
502 マイクロセル
502a マイクロセルa
502b マイクロセルb
503 検出測定装置
Claims (9)
- 開口部が封口されその内部にアレルゲンに対する抗体が固定されたマイクロセルがプレート上に複数配置されてなるマイクロセルアレイプレートと、
前記マイクロセルアレイプレート上のマイクロセルに溶液を注液する注液器を有する注液手段と、
洗浄用の注液器を備え、マイクロセル内の未反応物質を洗い出す洗浄手段と、
前記マイクロセルアレイプレートを可動させて、前記注液器の直下にマイクロセルを位置させるアレイプレート可動手段と、
前記洗浄手段が洗浄したマイクロセル内にあるアレルゲンの種類と量を測定するアレルゲン検出測定手段と、
前記アレルゲン検出測定装置は、前記注液手段、前記アレイプレート可動手段、前記洗浄手段、及び前記アレルゲン検出測定手段の動作を統合的に制御する制御手段と、
を備えるアレルゲン検出測定装置であって、
前記アレルゲン検出測定装置は、
前記マイクロセルアレイプレートのマイクロセルの総数、マイクロセルの配置及びマイクロセル間の間隔に関する情報を取得し、
前記制御手段は、
マイクロセルの配置及びマイクロセル間の間隔に関する情報から移動幅を算出し、前記アレイプレート可動手段を動作させて、未開封のマイクロセルが前記注液器の先端の直下に位置するようにし、
更に前記注液手段を動作させて、前記注液器先端の直下に位置させたマイクロセルの封口を解くとともに、前記注液器により当該マイクロセル内に溶液を注液させ、
更に前記洗浄手段を動作させて、前記注液後所定時間経過したマイクロセル内の未反応物質を洗い出させ、
使用したマイクロセル数をカウントし、前記マイクロセルの総数に関する情報と照合することにより、マイクロセルアレイプレートに含まれるマイクロセルを全て使用したかどうかを判定し、
マイクロセルを全て使用した場合は測定を終了し、全て使用していない場合には、前記洗浄が終了した後、マイクロセルの配置及びマイクロセル間の間隔に関する情報から移動幅を算出し、未開封の他のマイクロセルが前記注液器の先端の直下に位置するように前記アレイプレート可動手段を動作させ、
前記注液器により当該マイクロセル内に溶液を注液させるステップと、前記注液後所定時間経過したマイクロセル内の未反応物質を洗い出させるステップと、前記洗浄手段が洗浄したマイクロセル内のアレルゲンの種類と量を測定するステップのいずれか2以上のステップを同時並行的に行うように動作させ、
前記注液器により当該マイクロセル内に溶液を注液させるステップで用いる前記注液手段の注液器又は前記注液後所定時間経過したマイクロセル内の未反応物質を洗い出させるステップで用いる前記洗浄用の注液器と、前記洗浄手段が洗浄したマイクロセル内のアレルゲンの種類と量を測定するステップで用いる前記アレルゲン検出測定手段とが、隣り合う2つのマイクロセルのそれぞれに位置するように、前記注液手段又は前記洗浄手段と、前記アレルゲン検出測定手段を動作させる、
ことを特徴とするアレルゲン検出測定装置。 - 請求項1に記載のアレルゲン検出測定装置において、
前記洗浄手段は、マイクロセル内に洗浄液を注液した後当該洗浄液を含むマイクロセル内の溶液を吸液してマイクロセル外に排出するか、またはマイクロセル内の溶液を吸液してマイクロセル外に排出した後、当該マイクロセル内に洗浄液を注液し、しかる後に当該洗浄液を吸液してマイクロセル外に排出するマイクロセル洗浄サイクルを1回以上繰り返す手段である、
ことを特徴とする前記アレルゲン検出測定装置。 - 請求項1又は2に記載のアレルゲン検出測定装置において、
前記アレルゲン検出測定装置はさらに、検出測定後のマイクロセルを再封口する再封口手段を備える、
ことを特徴とするアレルゲン検出測定装置。 - 請求項1に記載のアレルゲン検出測定装置において、
前記注液手段が前記洗浄手段を兼ねる、
ことを特徴とするアレルゲン検出測定装置。 - 請求項1ないし4の何れかに記載のアレルゲン検出測定装置において、
前記封口部材は、粘着シートまたは熱融着性フィルムであり、
前記注液器は、前記粘着シートまたは熱融着性フィルムを突き破りマイクロセル内に溶液を注液する、
ことを特徴とするアレルゲン検出測定装置。 - 請求項1ないし5の何れかに記載のアレルゲン検出測定装置において、
前記マイクロセルアレイプレートは、プレートとマイクロセルとが一体成型されてなるものである、
ことを特徴とするアレルゲン検出測定装置。 - 請求項1ないし6の何れかに記載のアレルゲン検出測定装置において、
前記マイクロセルは、アレルゲン抗体を吸着させることのできる素材からなる、
ことを特徴とするアレルゲン検出測定装置。 - 請求項1ないし7何れかに記載のアレルゲン検出測定装置において、
前記検出測定手段における検出測定方法が、光学的方法であり、
前記マイクロセルアレイプレートは、透明な素材からなる、
ことを特徴とするアレルゲン検出測定装置。 - 請求項1ないし8の何れかに記載のアレルゲン検出測定装置において、
マイクロセルアレイプレートが柔軟性を持つ、
ことを特徴とするアレルゲン検出測定装置。
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