JP4523841B2 - 生体分子の安定化のための組成物およびプロセス - Google Patents

Description

本発明は、一般にバイオテクノロジーの分野に関する。特に、本発明は、生物学的分子を安定化するか、または場合により保存するための組成物およびプロセス、ならびに対応する安定化された生体分子を含んでなるデバイスに関する。

産業製品ならびにプロセスにおけるタンパク質およびポリペプチドの使用には、特に臨床／診断および製薬目的のための大量のこれらの生体分子が必要である。産業的量でのタンパク質の単離および精製などの必要とされる基本的な技術はほとんどが確立されているが、所望される生来または活性な分子特性の予想されるアプリケーションの維持では、そのような生体分子の使用の最も困難な局面が存在する。特に、生体分子の貯蔵および輸送では、しばしば、活性の消失を考慮しなければならず、このため、後の適用が成功しない恐れがある。従って、市販のタンパク質調製物は、ほとんどの場合、存在することにより貯蔵または輸送中の活性の消失を最小限にすることができる化合物を含んでなる。さらに、貯蔵および輸送は、ほとんどが低温下で行われるが、例えば、特定のタンパク質の冷凍は、分子の変化のため、所望されないことがある。

文献的に、特定の植物および動物は、完全な脱水に近い状態で生存するための機構を発達させている。このストレス状態は無水生活と称され、乾燥条件に暴露される生物体において観察される。無水生活中、生物体は、再水和作用より正常な代謝が継続することを可能にするまで、ある種の休止状態となる。これらの生物体の一般的な特徴的特性は、無水生活条件中に誘導される高濃度の非還元糖の合成である。多様な生物体における脱水に対する応答としての多量のトレハロースの観察される蓄積は、分子完全性に対する損傷からの膜およびタンパク質の保護を生じ、水分の除去に関して、所定の寛容性に相関関係を示す。糖は、除去される水分子を置き換えるか、または場合により機能的に置換し、細胞内容物が安定化されると仮定されている分子内有機ガラスの形成に関与すると仮定されている。

当該技術分野において、通常迅速に変性し得るタンパク質種を安定化するための抗体被覆マイクロタイタープレートの製造におけるトレハロースの使用が記載されている（Ｖ.Ｋ.グエン(V.K.Nguyen)ら、ＥＬＩＳＡにおけるマイクロタイタープレート上に乾燥固定化されたタンパク質の免疫反応の保護：重症筋無力症における自己抗体の検出のための応用(Protection of immunoreactivity of dry immobilized proteins on microtitration plates in ELISA: application for detection of autoantibodies in Myasthenia gravis)J. of Biotechnology,72、p.115-125(1999)）。この場合、抗体が固定化されているマイクロタイタープレートは、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびトレハロース含有フィルムで被覆され、その後、乾燥される。この様式で作製されるＥＬＩＳＡプレートの固定化された乾燥抗体は、高い温度（５０℃まで）でも３０日間までの貯蔵能力を示した。

しかし、特に、商業上の観点から見て、室温またはさらに熱帯条件での貯蔵能力の増加は、この技術では達成することができない。特に、大量の固定化されたタンパク質の調製に関連して、生体分子の実質的に一定の生物学的活性、または機能性を伴って、１年間を超える期間の貯蔵能力を有することが所望される。

上記の技術のさらなる欠点に、抗体を援助するアプリケーションの体系において、抗体との非特異的結合が生じ、それによって、実験結果全体に悪影響を及ぼす所望されない交差反応が生じることが公知であるタンパク質混合物のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の使用がある。

特に植物種子および花粉では、水分の除去に対する反応において、ＬＥＡクラスのタンパク質が該種子および花粉において形成されることが公知である。（ＬＥＡ＝「後期胚形成主要タンパク質」）（Ｊ.イングラム(J.Ingram)およびＤ.バーテルズ(D.Bartels)、Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.,47、p.377-403(1996)）。ＬＥＡタンパク質はまた、線虫においても同定され、タンパク質の組織化が制御される両親媒性α−へリックスを形成すると思われる特殊な１１アミノ酸モチーフを含んでなる。ＬＥＡタンパク質は極めて親水性であり、熱による変性に耐性である。ガマ(Typha latifolia)の花粉から精製されるこのクラスのタンパク質による初期の実験によって、インビトロで、このタンパク質とのインキュベーションにより、スクロースガラスを安定化することができることが示されている。従って、非還元糖およびタンパク質クラスＬＥＡの代表物は、無水生活植物の細胞質ならびに涸渇に耐性である種子および花粉における安定なバイオガラスの形成において相乗的様式で共に稼動すると推測される（Ｊ.ブラウン(J.Brown)ら、線虫に見出される植物涸渇遺伝子、Nature,416、p.38(2002)）。

従って、本発明の目的は、生体分子を安定化するか、または場合により、保存するための組成物およびプロセスの供給であり、それによって、当該分野の欠点が克服され、分子の生物学的活性が、冷却することさえ伴わずにより長い期間、保存することができる。

目的は、主要な特許請求の範囲に記載の組成物により、本発明に従って解決される。

本発明に従う組成物は、トレハロース（Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−グルコピラノース）、スクロース（β−Ｄ−フルクトフラノシル−α−Ｄ−グルコピラノシド）、ならびにそれらの誘導体よりなる群から選択される少なくとも１つの非還元二糖、およびＬＥＡクラスの少なくとも１つのタンパク質またはポリペプチドを含んでなる。

好適な実施態様に従えば、本発明に従う組成物は、トレハロースならびに以下の一般式（配列番号１）：
（１）−（２）−（３）−（４）−（５）−（６）−（７）−（８）−（９）−（１０）−Ｅ、
（式中、
（１）はＫもしくはＴを表し、
（２）はＡ、Ｇ、Ｋ、ＭもしくはＴを表し、
（３）はＲ、Ｄ、Ａ、Ｅ、ＱもしくはＫを表し、
（４）はＥ、ＫもしくはＳを表し、
（５）はＴ、Ｆ、ＹもしくはＡを表し、
（６）はＫ、Ｒ、ＴもしくはＡを表し、
（７）はＤ、ＥもしくはＱを表し、
（８）はＳ、Ｒ、ＹもしくはＫを表し、
（９）はＡもしくはＴを表し、
（１０）はＧ、ＡもしくはＲを表す）
を特徴とする１１アミノ酸モチーフを伴うＬＥＡクラスの少なくとも１つのタンパク質またはポリペプチドを含んでなる。

特に好適な実施態様では、組成物は、受託番号ＡＦ４２３０６９またはＳ３９４７５でジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）に寄託されたヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を有するＬＥＡサブクラス３の少なくとも１つのタンパク質またはポリペプチドを含んでなる。

本発明に従う組成物は、特に好適には、
（ａ）Ｋ−Ｔ−Ａ−Ｅ−Ｆ−Ｒ−Ｄ−Ｓ−Ａ−Ｇ−Ｅ（配列番号２）、
（ｂ）Ｋ−Ｇ−Ｑ−Ｅ−Ｆ−Ｋ−Ｅ−Ｒ−Ａ−Ｇ−Ｅ（配列番号３）、
（ｃ）Ｋ−Ａ−Ｅ−Ｅ−Ｔ−Ｋ−Ｑ−Ｒ−Ａ−Ｇ−Ｅ（配列番号４）、
（ｄ）Ｋ−Ｍ−Ｄ−Ｅ−Ｔ−Ｋ−Ｑ−Ｒ−Ａ−Ｇ−Ｅ（配列番号５）、
（ｅ）Ｋ−Ａ−Ｒ−Ｋ−Ｔ−Ｋ−Ｄ−Ｓ−Ａ−Ａ−Ｅ（配列番号６）、
（ｆ）Ｋ−Ａ−Ｋ−Ｅ−Ｙ−Ｋ−Ｄ−Ｙ−Ｔ−Ａ−Ｅ（配列番号７）、
（ｇ）Ｋ−Ａ−Ｒ−Ｅ−Ｔ−Ｔ−Ｅ−Ｋ−Ａ−Ｒ−Ｅ（配列番号８）、および
（ｈ）Ｔ−Ｋ−Ｄ−Ｓ−Ａ−Ａ−Ｅ−Ｋ−Ａ−Ｒ−Ｅ（配列番号９）
よりなる群から選択される１１アミノ酸モチーフを伴うＬＥＡサブクラス３の少なくとも１つのタンパク質またはポリペプチドを含んでなる。

好適な実施態様に従えば、組成物は、用時溶液に関してそれぞれの場合において、それぞれ０.０１〜１５、もしくは場合により０.００００１〜１重量パーセントの量で、非還元二糖およびＬＥＡクラスのタンパク質またはポリペプチドの成分を含んでなる。

例えば、組成物は、６.８のｐＨ値を伴う５０mMリン酸および１００mM ＮａＣｌの溶液に、０.１重量パーセントの精製されたＬＥＡタンパク質および５重量パーセントのトレハロースを添加することによって、生成される。所望であれば、例えば、アジ化ナトリウム（０.０２重量％）などのさらなる成分を添加することもできる。

配列およびモチーフ情報相同物の手段によって、異なる供給源由来のタンパク質クラスＬＥＡの代表物を、本発明に従って入手および適用することができることは、当業者に明らかである。以下の通り、相同物が、特にトレハロースおよび／またはスクロースなどの非還元二糖から形成される生物学的ガラスを安定化することができる限り、すべての相同物が誘導される。

タンパク質クラスＬＥＡの例示的代表物を以下の表に示すが、これらの例は本発明を制限するわけではない。当業者であれば、示したデータから代表的配列情報を容易に入手することができる。

本発明に従って提唱されるＬＥＡタンパク質またはポリペプチドは、天然の供給源から単離するか、組換え的に産生させるか、もしくは合成することができる。使用すべきプロセスは、当業者に周知である。

本発明のさらなる局面は、生体分子を安定化するかまたは保存するための方法の供給に関し、ここで、保護すべき分子は、本発明に従い組成物中でインキュベートされる。十分な期間のインキュベーション後、次いで、調製物を、例えば、室温で乾燥し、使用時まで冷却を伴わずに貯蔵することができる。特定の表面上に固定化された生体分子の安定化のためにプロセスを使用する限り、これらの充填された表面は、本発明に従う組成物で被覆される。このことは、例えば、表面上に組成物を噴霧するか、または組成物中に表面を浸漬することによって、行うことができる。浸漬法の場合、表面は、好ましくは、本発明に従う組成物による均質な湿潤が生じ得るように、１秒間当たり約２mmの速度で引き出される。

本発明のさらなる局面は、本発明の組成物で被覆されている表面の供給に関する。生体分子は、好適な表面上に直接的または間接的に固定化され、本発明の組成物により安定化または保存される。特に好適な表面は、例えば、バイオチップ、センサーチップ、マイクロタイタープレート、試験チューブなどの分析および・または診断デバイスの成分である。表面の材料は限定されず、例えば、ガラス、石英ガラス、石英、ケイ素、ポリマー（ＰＭＭＡ、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ＰＶＣなど）、ならびに例えば、ニトロセルロース、ナイロンおよびマイクロファイバー膜などの膜、ならびに紙から選択することができる。

本明細書で使用する用語「生物学的分子」および「生体分子」は、科学、診断および／または製薬アプリケーションの体系内に関連がある特性を有する実質的に生物由来の任意の物質ならびに化合物を包含する。天然供給物から単離することができる分子などの生来の分子だけではなく、それらから誘導される形態、フラグメントおよび誘導体、ならびに生来の分子の少なくとも１つの特性が存在する限り、組換え形態および人工分子もまた、包含される。好適な生体分子は、核酸およびそれらの誘導体（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、リボザイム、オリゴヌクレオチド、プラスミド、染色体）、ペプチドおよびタンパク質（酵素、受容体タンパク質、タンパク質複合体、ペプチドホルモン、抗体）、ならびにそれらの活性フラグメント、炭水化物および特に、グリコシル化タンパク質およびグリコシド、および脂肪、脂肪酸および脂質などのそれらの誘導体などの分析、診断および／または製薬目的に適用することができる生体分子である。

本発明に従う組成物およびプロセスはまた、上記の生体分子のキャリアである限り、細胞組織および完全細胞ならびにそのタンパク質（オルガネラ、膜および膜フラグメントなど）に適用することができることは、当業者に明らかである。この理由のため、組織、細胞およびそのタンパク質は、基本的に、用語「生体分子」に包含される。

使用した用語「安定化」および「保存」は、生体分子の構造または機能的完全性およびそれらの基づく生物学的特性に関する。特定のアプリケーションのために生体分子の必要とされる活性には、例えば、その１次、２次、および／または３次構造の広範な維持が必要である。核酸プローブの生物学的活性は、例えば、プローブに相補的である核酸標的とのハイブリダイゼーション複合体を形成するための特性を含んでなる。抗体の生物学的活性は、例えば、その抗原の特異的結合を含んでなる。

以下の実施例によって、本発明をより詳細に説明する。

表面の被覆
本発明に従う組成物の形成は、０.１％（重量／容積）組換えＬＥＡタンパク質および５％（重量／容積）トレハロースおよび１００ｍｌリン酸緩衝液（５０mMリン酸、１００mM ＮａＣｌ、ｐＨ６.８）を溶解することによって生じる。その後、０.０２％（重量／容積）アジ化ナトリウムを微生物の不純に対する細胞障害剤として添加する。０.２マイクロメートルフィルターを使用して得られる溶液の滅菌濾過後、得られたものをオートクレイブ滅菌用ボトルに貯蔵する。

本発明に従う適切な表面に積層するために、固定化された生体分子を伴うバイオチップ（例えば、顕微鏡用スライド）を、クリーンルーム（または滅菌作業ベンチ）内で溶液に浸漬し、１秒間あたり２mmの速度で溶液から引き出す。この様式で、トレハロース／ＬＥＡ溶液の薄い層をチップ上で乾燥し、生体分子の安定化をもたらす。

貯蔵のために、この様式で試験した安定化された生体分子を伴うチップを、プラスチックバックで包装し、窒素の大気下で室温で貯蔵することができる。バックは、好ましくは、タンパク質の可能な光分解を防止するために遮光したカートン内に包装することができる。

使用のために、包装からチップを取り、アッセイ緩衝液（例えば、ＰＢＳ緩衝液）で再水和（５分間、ＲＴ）する。次に、サンプル液体を、直接チップ上でインキュベートし、アッセイを行う。当該分野において公知のすべての種類のリガンド相互作用を行うことができる。所望であれば、安定化剤の除去を省くこともできる。この場合、サンプルを、トレハロース積層表面上に直接置く。このことは、トレハロースおよびＬＥＡのいずれもが検出を妨害しないことが予め明らかである場合、とりわけ実践的である。

Claims (19)

1. 生体分子が表面上に固定化され、少なくとも１つの非還元二糖および少なくとも１つのＬＥＡタンパク質またはＬＥＡポリペプチドを含んでなる組成物で被覆されている、生体分子を安定化または保存するための方法。
2. 前記非還元二糖は、トレハロース（Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−グルコピラノース）、スクロース（β−Ｄ−フルクトフラノシル−α−Ｄ−グルコピラノシド）、ならびにそれらの誘導体よりなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
3. 前記非還元二糖はトレハロースである、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記少なくとも１つのＬＥＡタンパク質またはＬＥＡポリペプチドは、以下の一般式（配列番号１）：
   （１）−（２）−（３）−（４）−（５）−（６）−（７）−（８）−（９）−（１０）−Ｅ、
   （式中、
   （１）はＫもしくはＴを表し、
   （２）はＡ、Ｇ、Ｋ、ＭもしくはＴを表し、
   （３）はＲ、Ｄ、Ａ、Ｅ、ＱもしくはＫを表し、
   （４）はＥ、ＫもしくはＳを表し、
   （５）はＴ、Ｆ、ＹもしくはＡを表し、
   （６）はＫ、Ｒ、ＴもしくはＡを表し、
   （７）はＤ、ＥもしくはＱを表し、
   （８）はＳ、Ｒ、ＹもしくはＫを表し、
   （９）はＡもしくはＴを表し、
   （１０）はＧ、ＡもしくはＲを表す）
   を有することを特徴とする１１アミノ酸モチーフを含んでなる、
   請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記組成物は、アクセッション番号ＡＦ４２３０６９またはＳ３９４７５でＧｅｎＢａｎｋに登録されたヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を有するＬＥＡサブクラス３の少なくとも１つのタンパク質またはポリペプチドを含んでなる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
6. ＬＥＡサブクラス３の前記少なくとも１つのタンパク質またはポリペプチドは、
   （ａ）Ｋ−Ｔ−Ａ−Ｅ−Ｆ−Ｒ−Ｄ−Ｓ−Ａ−Ｇ−Ｅ（配列番号２）、
   （ｂ）Ｋ−Ｇ−Ｑ−Ｅ−Ｆ−Ｋ−Ｅ−Ｒ−Ａ−Ｇ−Ｅ（配列番号３）、
   （ｃ）Ｋ−Ａ−Ｅ−Ｅ−Ｔ−Ｋ−Ｑ−Ｒ−Ａ−Ｇ−Ｅ（配列番号４）、
   （ｄ）Ｋ−Ｍ−Ｄ−Ｅ−Ｔ−Ｋ−Ｑ−Ｒ−Ａ−Ｇ−Ｅ（配列番号５）、
   （ｅ）Ｋ−Ａ−Ｒ−Ｋ−Ｔ−Ｋ−Ｄ−Ｓ−Ａ−Ａ−Ｅ（配列番号６）、
   （ｆ）Ｋ−Ａ−Ｋ−Ｅ−Ｙ−Ｋ−Ｄ−Ｙ−Ｔ−Ａ−Ｅ（配列番号７）、
   （ｇ）Ｋ−Ａ−Ｒ−Ｅ−Ｔ−Ｔ−Ｅ−Ｋ−Ａ−Ｒ−Ｅ（配列番号８）、および
   （ｈ）Ｔ−Ｋ−Ｄ−Ｓ−Ａ−Ａ−Ｅ−Ｋ−Ａ−Ｒ−Ｅ（配列番号９）
   よりなる群から選択される１１個のアミノ酸を有するモチーフを含んでなる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
7. 前記組成物は、用時溶液に関して、前記非還元二糖が０.０１〜１５、前記ＬＥＡタンパク質またはＬＥＡポリペプチドが０.００００１〜１重量パーセントの量でそれぞれ含んでなる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
8. 固定化されかつ安定化され、またはそれぞれ保存される生体分子を伴う表面の製造のための方法であって、ここで、前記生体分子は、少なくとも１つの非還元二糖および少なくとも１つのＬＥＡタンパク質またはＬＥＡポリペプチドを含んでなる組成物で被覆される、上記方法。
9. 請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法を介して得られる、固定化されかつ安定化され、またはそれぞれ保存される生体分子を伴う表面。
10. 分析および／または診断デバイスを構成する成分として、少なくとも１つの非還元二糖および少なくとも１つのＬＥＡタンパク質またはＬＥＡポリペプチドを含んでなる組成物で被覆された、固定化されかつ安定化され、またはそれぞれ保存される生体分子を伴う表面。
11. 少なくとも１つの非還元二糖および少なくとも１つのＬＥＡタンパク質またはＬＥＡポリペプチドを含んでなる組成物で被覆された、ガラス、石英ガラス、石英、ケイ素、ポリマー、ニトロセルロース、ナイロンおよびマイクロファイバー膜ならびに紙から選択され、固定化されかつ安定化され、またはそれぞれ保存される生体分子を有する材料の表面。
12. 前記組成物は、用時溶液に関して、前記非還元二糖が０.０１〜１５、前記ＬＥＡタンパク質またはＬＥＡポリペプチドが０.００００１〜１重量パーセントの量でそれぞれ含んでなる、請求項１０または１１に記載の表面。
13. 前記非還元二糖は、トレハロース（Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−グルコピラノース）、スクロース（β−Ｄ−フルクトフラノシル−α−Ｄ−グルコピラノシド）、ならびにそれらの誘導体よりなる群から選択される、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の表面。
14. 前記非還元二糖はトレハロースである、請求項１３に記載の表面。
15. 前記少なくとも１つのＬＥＡタンパク質またはＬＥＡポリペプチドは、以下の一般式（配列番号１）：
    （１）−（２）−（３）−（４）−（５）−（６）−（７）−（８）−（９）−（１０）−Ｅ、
    （式中、
    （１）はＫもしくはＴを表し、
    （２）はＡ、Ｇ、Ｋ、ＭもしくはＴを表し、
    （３）はＲ、Ｄ、Ａ、Ｅ、ＱもしくはＫを表し、
    （４）はＥ、ＫもしくはＳを表し、
    （５）はＴ、Ｆ、ＹもしくはＡを表し、
    （６）はＫ、Ｒ、ＴもしくはＡを表し、
    （７）はＤ、ＥもしくはＱを表し、
    （８）はＳ、Ｒ、ＹもしくはＫを表し、
    （９）はＡもしくはＴを表し、
    （１０）はＧ、ＡもしくはＲを表す）
    を特徴とする１１個のアミノ酸を含んでなるモチーフを有する、
    請求項１０〜１４のいずれか１項に記載の表面。
16. 前記組成物は、アクセッション番号ＡＦ４２３０６９またはＳ３９４７５でＧｅｎＢａｎｋに登録されたヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を有するＬＥＡサブクラス３の少なくとも１つのタンパク質またはポリペプチドを含んでなる、請求項１０〜１５のいずれか１項に記載の表面。
17. ＬＥＡサブクラス３の前記少なくとも１つのタンパク質またはポリペプチドは、
    （ａ）Ｋ−Ｔ−Ａ−Ｅ−Ｆ−Ｒ−Ｄ−Ｓ−Ａ−Ｇ−Ｅ（配列番号２）、
    （ｂ）Ｋ−Ｇ−Ｑ−Ｅ−Ｆ−Ｋ−Ｅ−Ｒ−Ａ−Ｇ−Ｅ（配列番号３）、
    （ｃ）Ｋ−Ａ−Ｅ−Ｅ−Ｔ−Ｋ−Ｑ−Ｒ−Ａ−Ｇ−Ｅ（配列番号４）、
    （ｄ）Ｋ−Ｍ−Ｄ−Ｅ−Ｔ−Ｋ−Ｑ−Ｒ−Ａ−Ｇ−Ｅ（配列番号５）、
    （ｅ）Ｋ−Ａ−Ｒ−Ｋ−Ｔ−Ｋ−Ｄ−Ｓ−Ａ−Ａ−Ｅ（配列番号６）、
    （ｆ）Ｋ−Ａ−Ｋ−Ｅ−Ｙ−Ｋ−Ｄ−Ｙ−Ｔ−Ａ−Ｅ（配列番号７）、
    （ｇ）Ｋ−Ａ−Ｒ−Ｅ−Ｔ−Ｔ−Ｅ−Ｋ−Ａ−Ｒ−Ｅ（配列番号８）、および
    （ｈ）Ｔ−Ｋ−Ｄ−Ｓ−Ａ−Ａ−Ｅ−Ｋ−Ａ−Ｒ−Ｅ（配列番号９）
    よりなる群から選択される１１個のアミノ酸のモチーフを含んでなる、請求項１０〜１６のいずれか１項に記載の表面。
18. 請求項９〜１７のいずれか１項に記載の表面を含んでなる、分析および／または診断デバイス。
19. バイオチップ、センサーチップ、マイクロタイタープレート、試験チューブおよび培養ディッシュよりなる群から選択される、請求項１８に記載のデバイス。