JP4451660B2

JP4451660B2 - パクリタキセル溶媒化合物

Info

Publication number: JP4451660B2
Application number: JP2003548769A
Authority: JP
Inventors: ダニエル・エイ・ベニーニ; ジャック・ゼット・グーグータス; ジョン・ディ・ディマルコ
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Current assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 2001-11-30
Filing date: 2002-11-25
Publication date: 2010-04-14
Anticipated expiration: 2022-11-25
Also published as: WO2003047508A3; TW200300671A; JP2005511646A; CN1596250A; EP1451168A4; MXPA04005038A; KR20050044621A; WO2003047508A2; US20030144344A1; AU2002365883A1; BR0214277A; IL161372A0; US6858644B2; EP1451168A2; HUP0600533A2; PL368945A1

Description

本発明は、治療処置用パクリタキセル（paclitaxel）の供給源として有用な、有機溶媒を含有するパクリタキセルの新規結晶性溶媒化合物に関する。さらに本発明の概念は、かかる溶媒化合物をパクリタキセル含有物質から形成する方法、およびこれらの溶媒化合物からパクリタキセルを得る方法も包含する。

パクリタキセル、すなわち、下記構造式を有する重要な抗腫瘍性特性を持つジテルペン・タキサン化合物は、北米西岸原産のイチイ属種，Ｔaxus brevifoliaの樹皮から最初に抽出される天然産物である。

それは商業上、ブリストル−マイヤーズ・スクイブ・カンパニーのＴaxol（登録商標）として入手しうる。Ｔaxol（登録商標）は、インビボ動物モデルにおいて優れた抗腫瘍活性を有することが認められており、また最近の研究により、チューブリンの異常な重合および細胞周期中の有糸分裂の崩壊を伴う、そのユニークな作用モードが解明されている。Ｔaxol（登録商標）は、難治性の進んだ卵巣癌、乳房癌、ノン−スモール（non−small）細胞肺癌およびＡＩＤＳ−関連カポージ肉腫の処置用として承認されている。

パクリタキセル臨床実験の結果が、科学雑誌（定期刊行物）に報告され、かつ多数の著作物、たとえばＲowinskyらの「Ｐharmac．Ｔher．」（５２、３５−８４、１９９１年）；Ｓpencerらの「Ｄrugs」（４８（５）、７９４−８４７、１９９４年）；Ｋ．Ｃ．Ｎicolauらの「Ａngew．Ｃhem．Ｉnt．Ｅd．Ｅng．」（３３、１５−４４、１９９４年）；Ｆ．Ａ．Ｈolmesらの“タキサン抗癌剤−基礎科学と最新現状”（Ｇunda Ｉ．Ｇeorgら著、３１−５７、アメリカン・ケミカル・ソサイアティ、ワシントンＤ．Ｃ．、１９９５年）；Ｓ．Ｇ．Ａrbuckらの“Ｔaxol（登録商標）の科学と応用”（Ｍatthew Ｓuffness著、３７９−４１６、ＣＲＣプレス、フロリダ州ボカ・レイトン、１９９５年）およびこれらの引用参考文献で概説されている。

特許文献に、植物源からパクリタキセルを単離する数多くの方法が記載されているが、それらの多くは、種々の有機溶剤系による抽出、次いでクロマトグラフィー分離を必要とする。
たとえば、ＲaoのＵ．Ｓ．特許Ｎo．５３８０９１６、５４７５１２０および５６７０６７３（またＰＣＴ出願公開Ｎo．ＷＯ９２／０７８４２）に記載の手順では、エタノール、クロロホルム、リグロイン、ベンゼンおよびメタノールを用いる一連の溶剤抽出、次いでＨＰＬＣカラムと溶離剤としてアセトニトリルを用いる逆相クロマトグラフィーが採用されている。

ＮairのＵ．Ｓ．特許Ｎo．５２７９９４９および５４７８７３６（またＰＣＴ出願公開Ｎo．ＷＯ９７／０９４４３）に記載の手順では、最初の７０％エタノール／水抽出物を脱色する活性炭と、Ｃelite（登録商標）（珪藻土）による早めの濾過が採用される。脱色した抽出物は続いて酢酸エチルで抽出され、そして蒸発させられ、タキサン化合物を沈殿させる。タキサン化合物は酢酸エチルに再溶解され、第１シリカカラムに装填され、ヘキサン／酢酸エチル勾配で溶離され、さらに、縦列のシリカカラムで、あるいは別法として逆相クロマトグラフィーで精製される。

Ｕ．Ｓ．特許Ｎo．６１３６９８９に、パクリタキセル含有のアセトン混合物を形成する方法が開示され、この方法は、パクリタキセル含有物質をメタノールで抽出して、メタノール抽出物を得；該メタノール抽出物を塩化メチレンと水による液−液抽出で分配して、メタノール／水を含有するメタノール性相と、塩化メチレンおよびパクリタキセルを含有する塩化メチレン相を持つ二相系を形成し；塩化メチレン相からメタノールと水を除去して、パクリタキセル含有の濃縮抽出物を得；該濃縮抽出物をシリカマトリックスと接触せしめ、次いでシリカマトリックスを溶離して、少なくとも５％（ｗ／ｗ）のパクリタキセルを含有する溶出液を得；そしてこの溶出液にアセトンを加えて、アセトン混合物を得る。

このＵ．Ｓ．特許によれば、少なくとも５％のパクリタキセルを含有するアセトン混合物のアセトン／水沈殿は、少なくとも２０％のパクリタキセルを含有する沈殿物を供給するだろうし、また少なくとも１０％のパクリタキセルを含有するアセトン混合物のアセトン／水沈殿は、４０〜５０％のパクリタキセルを含有する沈殿物を供給するだろう。
上述のＵ．Ｓ．特許はパクリタキセルの単離に指向されているが、これら特許のいずれにも、パクリタキセルと有機溶媒の１種以上の溶液からの、新規で以前に知られていないパクリタキセル溶媒化合物の結晶化についての記載はない。

医薬製剤の開発での従来技術において、パクリタキセルは有機溶剤と共に使用されている。パクリタキセルは、水への溶解性が乏しいことが知られており、これはパクリタキセルを患者に投与するのに利用できる製剤を限定する。通常使用される製剤は、５０％（ｖ／ｖ）のアルコールと８８倍過剰のポリオキシエチル化ひまし油（Ｃremophor（登録商標）ＥＬ）を含有する。
パクリタキセルの患者への投与の他の手段を発見するのに、種々の努力がなされている。たとえば、Ｕ．Ｓ．特許Ｎo．５８７７２０５に、パクリタキセルを第１有機溶剤（たとえばＮ，Ｎ’−ジメチルアセタミドまたはジメチルスルホキシド）に溶解した後、水性溶媒での最終希釈のため第２溶剤、たとえばポリエチレングリコール４００に溶解することが記載されている。

Ｕ．Ｓ．特許Ｎo．６０１７９４８に、患者への投与に好適であると断言するパクリタキセル製剤の開示があり、この製剤は水混和性の非水性溶剤、たとえばＮ−メチルピロリドン、プロピレングリコール、酢酸エチル、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ’−ジメチルアセタミド、ベンジルアルコール、２−ピロリドンまたは安息香酸ベンジル中のパクリタキセルの溶液からなる。
上述のＵ．Ｓ．特許は共に、注入で投与する液体製剤に指向される。これらＵ．Ｓ．特許のいずれにも、これらそれぞれの製剤からのパクリタキセル溶媒化合物の結晶化についての開示はない。

（発明の概要）
パクリタキセルの明瞭な結晶形について、その存在が知られている。本発明は１つの側面において、結晶形で存在するパクリタキセルの新規で生物学的に活性な有機溶媒化合物であって、該溶媒化合物から高純度のパクリタキセルを単離することができる該溶媒化合物に指向される。
本明細書記載のパクリタキセルの新規溶媒化合物は、以前より知られていない、三次元結晶配列の、適当な有機溶媒分子の座（sites）を有するパクリタキセル分子である。適当な有機溶媒は、本明細書記載のパクリタキセル分子のユニークな配列を変化させずに、溶媒座（solvent sites）に組込むことができる分子を有するものである。

かかるパクリタキセルの新規溶媒化合物は、パクリタキセルの精製における有用な中間体であることが認められる。該溶媒化合物はそれ自体、生物学的活性を有することが認められる。
ある具体例において、本明細書記載の新規溶媒化合物は、パクリタキセル含有物質、たとえば粗タキサン混合物から得ることができ、ここで、タキサン化合物はたとえば天然源から得られる。他の具体例において、該新規溶媒化合物は、半合成パクリタキセルから、または比較的純粋なパクリタキセルを１種以上の有機溶媒に溶解して調製される混合物から得ることができる。

本発明は他の側面において、パクリタキセル含有物質と、上記のユニークな結晶配列のパクリタキセル分子における溶媒座と適合しうる溶媒分子を有する有機溶媒からなる混合物からの、結晶性パクリタキセル溶媒化合物の製造法を包含する。上記混合物から、結晶構造の中にパクリタキセルおよび溶媒分子を含有する結晶性パクリタキセル溶媒化合物固体を単離する。

さらに本発明は、本明細書記載の溶媒化合物からのパクリタキセルの回収法を包含し、該回収法は結晶性溶媒化合物構造から溶媒分子を除去することからなる。なお、この方法は、本明細書において“脱溶媒”工程と称せられ、かつ当該分野で公知のいずれかの溶媒除去手段の使用で行なうことができる。
なお本発明の他の側面は、ヒトおよび／または他の哺乳類の腫瘍を抑制する方法であって、腫瘍を持つ宿主に対し、これら新規パクリタキセル結晶形の抗腫瘍有効量を投与することから成る抑制法に関係する。

図１は、結晶構造にＮＭＰＯ、アセトニトリルおよび水を組込んだ、Ｄ型バルクの、以前より知られていない結晶性パクリタキセル溶媒化合物の観測した粉末Ｘ線回折（ＰＸＲＤ）パターンである。観測した上のパターン（元の溶媒混合物におけるスラリーからＲＴで測定）は、−４３℃の単結晶の完全Ｘ線分析から得た原子座標（atomic coordinates）からシミュレーションした下のパターンと十分に一致する。
図２は、結晶構造にＤＭＦおよび水を組込んだ、Ｅ型の、以前より知られていない結晶性パクリタキセル溶媒化合物のシミュレーションした粉末Ｘ線回折（ＰＸＲＤ）パターンである。このシミュレーションパターンは、−５３℃の完全単一Ｘ線分析から得た原子座標から計算した。

図３は、観測した原子座標に基づく、Ｄ型溶媒化合物の一部中のパクリタキセル分子（molecule）および溶媒分子の固体状態配列を示す図である。アセトニトリル分子は図示せず。
図４は、観測した原子座標に基づく、Ｄ型溶媒化合物の別の部分中の対称−独立パクリタキセルおよび溶媒分子の固体状態配列を示す図である。アセトニトリル分子は図示せず。

図５は、観測した原子座標に基づく、Ｅ型溶媒化合物の一部中のパクリタキセルおよび溶媒分子の固体状態配列を示す図である。
図６は、観測した原子座標に基づく、Ｅ型溶媒化合物の別の部分中の対称−独立パクリタキセルおよび溶媒分子の固体状態配列を示す図である。
図７は、パクリタキセルの場合に得られる細胞毒性（ＩＣ_５０値）を表にしたものである。
図８は、本発明に従って製造したパクリタキセルＮＭＰＯ溶媒化合物の場合に得られる細胞毒性（ＩＣ_５０値）を表にしたものである。

（好ましい具体例の詳細な説明）
市販のＴaxol（登録商標）に用いるパクリタキセルは、無溶剤の結晶性粉末（本明細書においてＡ型と称す）で製造される。本発明の特性決定を行うプロセスにおいて、単結晶Ｘ線回折実験を介して、Ａ型は斜方晶系であり、その単位胞（単位格子）は、水素結合した“ダイマー”を形成する水素結合に付随する、パクリタキセルの２つの結晶学的に依存しない分子を含有するが、溶媒分子を全く含有しないことがわかった。

本明細書で用いる語句“パクリタキセル・ダイマー”および“ダイマー”とは、互いに水素結合した２つのパクリタキセル分子を指称する。１１の水素結合の網状結合は、２つのパクリタキセル分子を対称関連の隣接原子に結びつける。この配列の別の特徴は、２つの独立したパクリタキセル分子間の割れ目に埋まる大きな溶媒座の存在であるが、Ａ型の結晶構造およびそれによるパクリタキセル分子の配列は、本明細書開示の新しい結晶形のいずれとも全く異なる。

Ａ型パクリタキセル（細長い薄平板晶（thin plates））は主として、高水不溶性の結晶粒状無溶剤形状で存在する。それは標準実験室条件（相対湿度（ＲＨ）約５０〜６０％；２０〜３０℃）下で、実質的に非吸湿性である。しかしながら、相対湿度が約９０％を越える雰囲気と接触させるか、あるいは水性の懸濁液、分散液もしくはエマルジョン中では、Ａ型は（時間、温度、攪拌等を関数として）、熱力学的により安定な形状（本明細書でＢ型と称す）に変換する。Ｂ型は、２つの独立パクリタキセル分子（１つのパクリタキセル“ダイマー”）当り、６つの水座を有するトリ水和物斜方晶系形状である。これらの水和結晶は、微細な毛髪のような外観を呈し、かつＡ型と比べ水溶性がいっそう低くなる。

Ｂ型トリ水和物は、水性懸濁液中で、または大過剰の水が存在する水性溶媒からの結晶化によって形成される。この形状は、一般に譲渡されたＥＰ特許出願Ｎo．７１７０４１に開示されている。本発明の特性決定を行うプロセスにおいて、単結晶Ｘ線回折実験を介して、Ｂ型は斜方晶系であり、その単位胞は、“ダイマー”を形成する水素結合に付随する、パクリタキセルの２つの結晶学的に依存しない分子を含有することがわかった。Ｂ型の結晶構造およびそれによるパクリタキセル分子の配列は、Ａ型および本明細書開示の新しい結晶形のいずれとも全く異なる。

Ｍastropaoloらは、ジオキサン、水およびキシレン中のＴaxol（登録商標）の溶液から、溶剤の蒸発によって得られるパクリタキセルの新しい結晶性溶媒化合物を開示した［「Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．」（ＵＳＡ９２、６９２０−６９２４、１９９５年７月）］。この溶媒化合物を、本明細書でＣ型と称するが、これは本発明の新規溶媒化合物とは違って、不安定であり、またとにかく、粗パクリタキセルの精製を果すことについては示されていない。薄平板状結晶は、２分子のパクリタキセル当り５水分子と３ジオキサン分子を含有することが報告されている。Ｃ型の結晶構造およびそれによるパクリタキセル分子の配列は、本明細書開示の新しい結晶形のいずれとも全く異なる。

本発明の具体例によれば、新規で比較的安定なパクリタキセル溶媒化合物は、有機溶媒の１種以上中のパクリタキセル含有物質からなる溶液から、コントロールの仕方で結晶化される。結晶化は、温度振動（temperature oscillation）と共に、抗溶媒（anti−solvent）として水をコントロールして加えることにより行なう。この点で、新規溶媒化合物の結晶化が、トリ水和物の沈殿と比べ有利となるように、水をアリコートで加える。このコントロールは、結晶性パクリタキセル溶媒化合物の収量と品質を最適化し、かつトリ水和物の形成を実質的に回避する。

好ましくは、有機溶媒はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ，Ｎ’−ジメチルアセタミド（ＤＭＡＣ）、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰＯ）、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン（ＤＭＥＵ）、１，３−ジメチル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２−（１Ｈ）−ピリミジノン（ＤＭＰＵ）、アセトニトリルおよびこれらの混合物からなる群から選ばれる。しかしながら、現開示の溶媒化合物の結晶構造中の溶媒座に適合しうる他の溶媒も使用しうる。これら溶媒の１種以上を用いて形成される溶媒化合物の種々具体例を、以下に記載する。

たとえばＥ型の１つの具体例において、パクリタキセルと水性ＤＭＦからなる溶液から結晶化することにより、ＤＭＦ：パクリタキセルの見掛モル比約０．５：１を有する溶媒化合物が得られる。Ｅ型の好ましい具体例において、水性ＤＭＦ中のパクリタキセルの溶液からの結晶化により、三元結晶構造が得られ、これはパクリタキセル“ダイマー”当り、１つのＤＭＦ溶媒分子と約２つの水分子を含有する。

Ｄ型の１つの具体例において、パクリタキセルと水性ＮＭＰＯからなる溶液からの結晶化により、ＮＭＰＯ：パクリタキセルの見掛モル比約１：１を有する溶媒化合物が得られる。Ｄ型の好ましい具体例において、パクリタキセル、アセトニトリル（ＣＨ_３ＣＮ）、酢酸およびＮＭＰＯからなる水溶液からの結晶化により、２分子のパクリタキセル（“ダイマー”）当り、約３分子の水、約２分子のＮＭＰＯおよび約１分子のアセトニトリルを特徴とするＤ型溶媒化合物が得られる。

他の具体例において、パクリタキセルと水性ＤＭＰＵからなる溶液からの沈殿により、ＤＭＰＵとパクリタキセルを１：１の近似モル比で含有する未知構造の固体が得られる。
他の具体例において、パクリタキセルと水性ＤＭＳＯからなる溶液からの沈殿により、ＤＭＳＯとパクリタキセルを１〜２：１の近似モル比で含有する未知構造の固体が得られる。

本発明の溶媒化合物は、類似した結晶構造や性質、および溶媒：パクリタキセルのほぼ同比を有する等価物も包含すると解釈すべきである。
該溶媒化合物の製造法は、種々の供給源から得ることができるパクリタキセル含有物質を、１種以上の有機溶媒の水溶液とコンバインすることを包含する。かかる混合物は必要に応じて、７−エピ−パクリタキセル異性体の形成を抑制する酸性化剤を含有してもよい。適当な酸性化剤のいずれも使用されてよい。これらの非制限的具体例としては、希酢酸またはクエン酸が挙げられる。

次に、パクリタキセルと溶媒のコンバインによって形成される固体を濾過で単離し、次いで過剰の非結晶溶媒を当該分野で公知の手段によって除去することができる。得られる単離生成物は、結晶性溶媒化合物中に一定割合の溶媒を含有する。単離した溶媒化合物は次工程で、“脱溶媒”に付し、すなわち、当該分野で公知の溶媒除去手段にさらして、結晶構造から溶媒分子を除去し、かつ溶媒化合物のたとえばＡ型パクリタキセルへの変換を行なうことができる。また本発明のＥ型溶媒化合物は、必要に応じて脱溶媒でＢ型に変換されてもよい。

本明細書記載の溶媒化合物、特にパクリタキセルのＤ型ＮＭＰＯ溶媒化合物は意外にも、粗産物流れから得られるパクリタキセルの純度を改善する。またこれらの溶媒化合物は、溶解すると、Ａ型に類する生物学的活性を有する。さらにそれらを、減圧下の加熱によってＡ型に変換されてもよい。Ｄ型は、比較的高い湿度の条件下でも、Ａ型に変形する。

１つの具体例において、本発明はパクリタキセル溶媒化合物の単離法を包含し、該単離法は、パクリタキセル含有物質、たとえば植物源から得られるタキサン化合物（taxanes）の粗混合物を、有機溶媒と接触せしめ、かつ必要に応じて加熱を行って、、パクリタキセルの溶解を促進することから成る。タキサン化合物の粗混合物は一般に、植物源を溶剤で抽出して得られる有機溶剤中のタキサン化合物の混合物である。酸性化剤の添加が好ましい。次に本明細書の記載に準じ、混合物から溶媒化合物を沈殿させることができる。沈殿後、スラリーを濾過して、溶媒化合物を単離する。

所定量の粗タキサン混合物および有機溶媒から生成しうるスラリーの品質の増加は、最初に温度をスラリーが希薄になる温度まで上昇せしめ、次いでスラリーが濃厚となるまで降温し、この操作を複数サイクルで繰返すことによる。当業者であれば、過度の実験を行なうことなく、所定の溶媒系の場合の上限および下限温度の設定値を調整し、かつ最適化することができる。

また単離操作は、粗および半合成パクリタキセル含有物質の精製に有効で、かつ多分、完全合成パクリタキセルの使用にも有効となりうる。
以下に示す詳細な説明において、全ての明記した数量およびプロセス条件（時間、温度等を含む）は、単なる例示であって、一定範囲の等価値を含むことが理解される。このような数字で表わした例の全ては、語句“約”によって、それが明快に言及されていようとなかろうと、少し変動することが理解され、また語句“約”の範囲は、当業者が過度の実験を行なうことなく適宜に決定しうる数値の範囲である。

パクリタキセル単離に適当なパクリタキセル含有物質は、高パクリタキセル分、好ましくは乾燥重量で少なくとも約０．００５％を含有するいずれの組織からも選択されてよい。適当なパクリタキセル含有物質の具体例としては、タキサス（Ｔaxus）属を含むイチイ属植物のさまざまな種、最も好ましくはＴ．brevifoliaまたはＴ．yunnanensisの樹皮、およびイチイ属鑑賞植物、たとえばＴ．cuspidata、Ｔ．ｘ media spp Ｈicksii、Ｔ．x dark green spreaderおよびＨill．Ｔ．chinensis、Ｔ．wallichiana、Ｔ．canadensis、Ｔ．globosa、Ｔ．sumatranaおよびＴ．floridanaの根や針状葉からの組織が挙げられる。他の適当な物質としては、Ｔaxus種から得た植物組織の培養物が挙げられる。培養組織を得る方法は概して、たとえばＣociancichおよびＰaceのＵ．Ｓ．特許Ｎo．５７４４３３３、ヨーロッパ特許Ｎo．５５３７８０Ｂ１やＳtrobelらのＵ．Ｓ．特許Ｎo．５４５１３９２に記載されている。

またパクリタキセル含有物質は、半合成かそうでない天然の供給源からも得ることができる。たとえば、Ｕ．Ｓ．特許Ｎo．５４５１３９２に、これも本発明の実施に好適な、細胞を培養する培養基が記載されている。また、たとえば細胞パスタあるいは発酵ブイヨンに、抽出可能なパクリタキセルを発現する微生物も適当である。適当な微生物の具体例は、ＰageらのＵ．Ｓ．特許Ｎo．５４５１３９２に記載の、幾つかのＴaxus種と関連するＥrwiniaの種である。他の具体例としては、パクリタキセルを産生しうる、Ｔaxomyces属の微生物、より詳しくは、Ｔaxomyces andreanaeが挙げられる。さらに他の具体例としては、組換えＤＮＡ技法の使用でパクリタキセルを産生するよう処理された（engineered）微生物が挙げられる。

他の具体例において、該溶媒化合物は、比較的純粋なパクリタキセルと有機溶媒の１種または混合物からなる水溶液からの沈殿によって得られる。本発明を制限するものではないが、この方法で用いる比較的純粋なパクリタキセルは一般に、約９０％以上の純度を有する。
溶媒化合物の沈殿において、必要に応じて結晶化を起こすのに、種晶添加を用いてもよい。この点で、所望溶媒化合物の種晶を溶液に加え、溶媒化合物の形成を誘発せしめることができる。

さらに本発明は、新規結晶性パクリタキセル溶媒化合物のＡ型パクリタキセルへの変換法を提供し、該方法は商業に使用される。この変換は好ましくは、減圧下高温で溶媒化合物を乾燥することから成る。好ましい具体例において、減圧と温度の適切な組合せの、減圧乾燥中に本発明の結晶性パクリタキセル溶媒化合物を、脱溶媒し、Ａ型パクリタキセルに変換する。

本発明の化合物は、インビトロおよびインビボの両方で、抗腫瘍活性を示す。種々の腫瘍の処置のため、Ａ型パクリタキセルと同様な方法で、本発明化合物を用いてよい［「Ｐhysician's Ｄesk Ｒeference」（４９版、メディカル・エコノミックス、６８２頁、１９９５年）参照］。本発明化合物の投与の用量、方式およびスケジュールについては、特に制限はない。癌処置の熟練した腫瘍学者であれば、過度の実験を行なうことなく、本発明化合物を投与する適当な処置プロトコルを確かめることができよう。すなわち、適当な投与ルートのいずれかを介して、活性化合物を非経口または経口投与しうる。非経口投与としては、静脈内、腹膜内、筋肉内および皮下投与が挙げられる。

本発明の処置法を実行するのに用いる用量は、予防療法を施したりあるいは最大限の治療応答をひき起こすのを可能にする用量である。用量は、投与の種類、選択した個々の生成物（product）、および処置される被険者の個人的特徴に応じて変化する。一般に、用量は、異常な細胞増殖によって起こる障害の処置に治療上有効な用量である。本発明化合物は、所望の治療効果を得るために、必要なたびごとに投与することができる。

幾人かの患者は、比較的高いまたは低い用量に対して迅速に応答し、そして控えめの維持用量を要求したり、あるいは維持用量を全く要求しないこともある。ｉ．ｖ．ルートによる用量は、たとえば１〜１００時間にわたり約２０〜５００ｍｇ／ｍ^２の範囲にあってよい。経口ルートによる用量は、５〜１０００／体重（Ｋｇ）／日の範囲にあってよい。使用される実際の用量は、個々の配合組成物、投与ルート、および処置される個々の部位、宿主、および腫瘍の種類に従って変化するだろう。用量の決定に際し、薬物の作用を変更する、患者の年令、体重、性別、食事療法および身体の健康状態を含む多くのファクターが考慮されるだろう。

また本発明は、抗腫瘍有効量の活性化合物と、医薬的に許容しうる担体、賦形剤、希釈剤またはアジュバントの１種以上とを組合せて含有する医薬組成物も提供する。医薬組成物は、通常の方法に従って製造することができる。本発明組成物の配合に、Ｕ．Ｓ．特許Ｎo．４９６０７９０および４８１４４７０の実施例をまねることができる。たとえば、活性化合物を錠剤、丸剤、粉末混合物、カプセル剤、注射可能剤、溶液、坐剤、エマルジョン、分散液、食品プレミックス（premix）、および他の適当な形状で配合されてよい。

また医薬組成物は、無菌固体組成物、たとえば凍結乾燥し、次いで要すれば、他の医薬的に許容しうる賦形剤とコンバイした組成物の形状で製造されてもよい。かかる固体組成物は、これに殺菌水、生理的食塩水、または水と有機溶剤、たとえばプロピレングリコール、エタノール等との混合物、あるいは幾つかの他の殺菌注射可能媒体を加えて再調製した後、直ちに非経口投与用として使用することができる。

典型的な医薬的に許容しうる担体は、たとえばマンニトール、尿素、デキストラン、ラクトース、ポテトおよびトウモロコシ・スターチ、ステアリン酸マグネシウム、タルク、植物油、ポリアルキレングリコール、エチルセルロース、ポリ（ビニルピロリドン）、炭酸カルシウム、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、安息香酸ベンジル、炭酸ナトリウム、ゼラチン、炭酸カリウム、および珪酸である。

また医薬製剤は、非毒性の助剤物質、たとえばソルビタン・モノラウレート、トリエタノールアミン・オレエート、ポリオキシエチレン・モノステアレート、グリセリル・トリパルミテート、およびジオクチル・ナトリウム・スルホスクシネートなどの、乳化剤、保存剤もしくは湿潤剤等を含有してもよい。

以下に実施例を挙げて、本発明化合物の製造法および使用法を説明するが、これらの実施例は限定よりむしろ例示と見なされる。
実施例１
Ｄ型（ＮＭＰＯ）パクリタキセル溶媒化合物：
５３３ｍｇのパクリタキセルを２６．６ｍＬのＮＭＰＯに溶解する。これに１３．３ｍＬのアセトニトリルを加え、次いで１３．３ｍＬの０．１％水性酢酸を加える。溶液を４０℃に加熱し、０．１％酢酸水溶液を２回に分けて加える。次いでこれを９０分にわたり２０℃に冷却し、音波破砕する。次にスラリーを５８℃に加熱し、次いで９０分にわたり２０℃に冷却する。

次いでスラリーを５８℃に加熱し、１時間撹拌し、４．５時間にわたり２０℃に冷却する。次いでスラリーを音波破砕し、３０分にわたり５８℃に再加熱し、５８℃で１時間撹拌する。スラリーを４．５時間にわたり２０℃に冷却し、１６時間ゆっくり撹拌する。次いでスラリーをデカントし、濾過する。濾過ケークを０．１％水性酢酸中の２５％アセトニトリル（２ｍＬ）で洗う。次いで濾過ケークを高減圧下４０℃で乾燥して、無色固体を得る（４５０ｍｇ）。^１Ｈ−ＮＭＲによるＮＭＰＯとパクリタキセルの比は１．０：１で、これはＤ型の単結晶構造に一致する（潜在力＝８５５μｇ／ｍｇ；領域％＝９９．７）。（Ｄ型結晶は理想的に、Ｈ_２Ｏ、ＮＭＰＯ、ＣＨ_３ＣＮおよびパクリタキセルを３：２：１：２のモル比で含有する）

Ｄ型ＮＭＰＯ溶媒化合物結晶は、−４３℃で以下に示す単位胞（単位格子）（unit cell）標軸（parameters）を有する細長い薄平板晶から成る。（単位胞の詳しい説明は、Ｓtout＆ＪensenのＸ−Ｒay Ｓtructure Ｄetermination（Ｘ線構造決定）のチャプター３：実用指針、マクミラン・カンパニー、ニューヨーク（１９６８年）で知ることができる）
格子次元（cell dimensions）：
ａ＝９．５４１（１）Å
ｂ＝２８．４５６（４）Å
ｃ＝３７．２３８（５）Å
容積：１０１１０Å^３
空間群：Ｐ２_１２_１２_１斜方晶系
単位胞の理想組成：パクリタキセル８、ＮＭＰＯ８、ＣＨ_３ＣＮ４、Ｈ_２Ｏ１２
密度（計算値）：１．３１５ｇ／ｃｍ^３

Ｄ型のパクリタキセルおよび溶媒分子のユニークな配列は、図３および４に示され、これらは下記表１〜２に列挙する分別原子座標（fractional atomic coordinates）に基づく。
表１〜３における各結晶形の場合に報告された近似の分別座標は、パクリタキセルと例示の溶媒以外の溶媒からなる追加の同形結晶性溶媒化合物型を含む。

各表において、４０以下の原子番号は、パクリタキセル“ダイマー”の分子“ｂ”中の原子を表わす。分子“ａ”の対応原子は、分子“ｂ”の対応原子より４０以上の番号を有する。すなわち、たとえば表１中の“Ｎ４４’”は、分子“ａ”に入り、かつ分子“ｂ”のＮ４’に相当する。分子“ａ”および分子“ｂ”は、各図で標識された、パクリタキセル“ダイマー”の２つの分子である。

原子０１１１、０１１２および０１１３は、３つの水分子である。原子Ｎ１０１、Ｃ１０２およびＣ１０３は、アセトニトリル分子である。原子Ｎ９１、Ｏ９２およびＣ９３−Ｃ９６は、２つのＮＭＰＯ溶媒分子の１つである。幾つかのわずかな自然格子膨張（natural lattice expansion）を除き、結晶構造は周囲条件下で同じのままである。従って、表１中の近似の座標は、測定時の温度に応じて変化するだろう。また、これら座標の統計的変差が、報告の誤差値と一致して起こりうる。

表１

以下に示す座標は、ＮＭＰＯ溶媒分子の１つと分子Ａの側鎖フェニル基を表わす。

表２

実施例２
Ｄ型のＡ型への変換：
実施例１のＮＭＰＯ−溶媒和パクリタキセルのサンプルをさらに、高減圧下８２℃で１６時間乾燥して、０．０５モル当量のＮＭＰＯを含有する物質を得たところ、粉末Ｘ線回折によってＡ型であることが認められた。

実施例３
パクリタキセル精製：
１０．６６ｇのパクリタキセル（２２７ｎｍのパクリタキセル領域％＝５６）を含有する粗タキサン混合物は、ＮＭＰＯ／アセトニトリル／０．１％酢酸（２：１：１（ｖ／ｖ／ｖ）比）からなる溶媒混合物１．０５５Ｌ中の溶液で存在する。溶液を撹拌下４０℃に加温し、次いで８０分にわたり種晶添加と共に、０．１％酢酸水溶液を加える（５２０ｍＬ、４回に分けて）。４０℃で３０分間保持した後、スラリーを９０分にわたり２０℃に冷却せしめ、次いで２０℃で３０分間保持する。次にスラリーを５８℃に加熱し、３０分間撹拌し、９０分にわたり２０℃に冷却せしめる。

スラリーを２０℃で３０分間撹拌した後、また５８℃に加熱する。５８℃に到達後、別途０．１％水性酢酸（５２０ｍＬ）を一度に加える。次いで温度振動サイクルを、以下の通りに行なう。
セットポイント１＝５８℃；時間１＝４５分
セットポイント２＝５８℃；時間２＝１８０分
セットポイント３＝２０℃；時間３＝３０分
セットポイント４＝２０℃
その後、最終温度２０℃に保持する。

次いでスラリーを４時間撹拌し、濾過し、それぞれ８０ｍＬの２５％アセトニトリル／０．１％水性酢酸、次いで０．１％水性酢酸で洗い、乾燥する。
乾燥ケークから、１０．５２ｇの結晶性パクリタキセル溶媒化合物を含有する１３．４７ｇの物質を得る。^１Ｈ−ＮＭＲにより、ＮＭＰＯとパクリタキセルの比は１．０：１であった。生成物の２２７ｎｍのパクリタキセル領域％は９２であった。母液の２２７ｎｍのパクリタキセル領域％は９．５であった。

実施例４
Ｅ型（ＤＭＦ）パクリタキセル溶媒化合物：
２５２ｍｇのパクリタキセルを、１２．５ｍＬのＤＭＦおよび６．２５ｍＬのＣＨ_３ＣＮに溶解し、２０℃で撹拌する。溶液を４０℃に加熱しながら撹拌し、別途１２．５ｍＬの０．１％水性酢酸を１分にわたり、３回に分けて加える。溶液を４０℃で１時間保持し、この時点では結晶は見られなかった。混合物を極小の撹拌下で９０分にわたり２０℃に冷却すると、この時点でスラリーの形成が見られ、２０℃で１時間保持する。

その後、混合物を３０分にわたり５８℃に加熱して、スラリーを希薄にする。混合物を撹拌下、５８℃で３０分間保持し、次いで９０分にわたり２０℃に冷却する。２０℃で１６時間保持した後（その間にスラリーは濃くなる）、混合物を撹拌下５８℃に加熱する（スラリーの希薄が見られる）。スラリーを５８℃で１時間保持する。次いで１２．５ｍＬの０．１％酢酸を１分にわたり３回に分けて加え、この時点でスラリーは劇的に濃厚になる。

スラリーを５８℃で３０分間撹拌し、次いで３時間にわたり２０℃に冷却し、撹拌下２０℃で保持する。スラリーのわずかな沈降が見られる（約２０％）。約２ｍＬのスラリーを取出し、約５分にわたり濾過する。濾過ケークを２５％ＣＨ_３ＣＮ／０．１％酢酸（２ｍＬ）中で洗い、次いで高減圧下４０℃で１６時間乾燥して、２１０．０ｍｇの固体を得る。^１Ｈ−ＮＭＲ分光分析で測定したＤＭＦとパクリタキセルのモル比は、約０．５：１．０で、これはＥ型の単結晶構造に一致した。

Ｅ型ＤＭＦ溶媒化合物の単結晶（針状晶）は、−５３℃で以下に示す単位胞標軸を有した。
格子次元：
ａ＝９．５１２（１）Å
ｂ＝２７．７８７（４）Å
ｃ＝３４．７８８（５）Å
容積：９１９５Å^３
空間群：Ｐ２_１２_１２_１斜方晶系
単位胞の理想組成：パクリタキセル８、ＤＭＦ４、Ｈ_２Ｏ８
密度（計算値）：１．３１２ｇ／ｃｍ^３

Ｅ型のパクリタキセルおよび溶媒分子のユニークな配列は、図５および６に示され、これらは下記表３に列挙する分別原子座標に基づく。幾つかのわずかな自然格子膨張を除き、結晶構造は周囲条件下で同じのままである。従って、表３中の近似の座標は、測定時の温度に応じて変化するだろう。また、これら座標の統計的変差が、報告の誤差値と一致して起こりうる。

表３

実施例５
パクリタキセルのＤＭＡＣ溶媒化合物：
２５０ｍｇのパクリタキセルを、１２．５ｍＬのＤＭＡＣおよび６．２５ｍＬのアセトニトリルに溶解し、２０℃で撹拌する。６．２５ｍＬの０．１％酢酸を加え、得られる混合物を４０℃に加熱する。別途１２．５ｍＬの０．１％酢酸溶液を１分にわたり３回に分けて加え、得られる混合物を４０℃で１時間保持し、この時点で沈澱の始まるのが見られる。混合物を極小の撹拌下９０分にわたり２０℃に冷却し、この温度で１時間保持し、その時間の終りに、混合物は濃厚なスラリーである。

次いでスラリーを３０分にわたり５８℃に加熱し、この温度で撹拌下さらに３０分にわたり保持し、スラリーの希薄が見られる。希薄のスラリーを９０分にわたり２０℃に冷却し、２０℃で１６時間保持する。得られる混合物を撹拌下、５８℃に加熱する。多少の沈降が見られる。スラリーを５８℃で１時間保持する。１２．５ｍＬの０．１％酢酸を、１分にわたり３回に分けて加える。スラリーを５８℃でさらに３０分間保持する。混合物を３時間にわたり２０℃に冷却し、この温度で撹拌下保持する。約１０日後、混合物の８０％が沈降した。２ｍＬのスラリーを取出し、素早く濾過し、２５％アセトニトリルおよび０．１％酢酸の２ｍＬ溶液で洗う。未知構造の固体が得られる。しかしながら、^１Ｈ−ＮＭＲ分光分析により、ＤＭＡＣとパクリタキセルのモル比１．０：１．０が認められる。洗浄後の固体中のこの量の溶媒の出現から、結晶性溶媒化合物の形成が示唆される。

実施例６
パクリタキセルのＤＭＳＯ溶媒化合物：
２５３ｍｇのパクリタキセルを、１２．５ｍＬのＤＭＳＯおよび６．２５ｍＬのＣＨ_３ＣＮおよび６．２５ｍＬの０．１％酢酸水溶液に溶解する。得られる混合物を４０℃に加熱し、別途１２．５ｍＬの０．１％酢酸を加える。混合物を４０℃で３０分間保持し、かなりの沈殿が見られる。スラリーを９０分にわたり２０℃に冷却し、２０℃で１時間撹拌する。次いでスラリーを３０分にわたり５８℃に加熱し、５８℃で３０分間保持し、５分間急撹拌し、次いで３時間にわたり２０℃に冷却し、２０℃で３０分間保持する。

再度、溶液を５８℃に３０分間加熱し、この温度で３０分間保持し、５分間急撹拌する。溶液を６７℃まで簡単に加熱し、１２．５ｍＬの０．１％水性酢酸を加える。次いで溶液を３時間にわたり２０℃に冷却せしめ、２０℃で１８時間保持する。沈澱の完了を見た後も、多少の沈降が見られる（約２０〜３０％）。スラリーを濾紙で濾過し、２ｍＬの２５％ＣＨ_３ＣＮ／０．１％酢酸で洗う。濾過ケークを高減圧下４０℃で１８時間乾燥して、２３０ｍｇの未知構造の固体を得る。しかしながら、^１Ｈ−ＮＭＲによる分析で、ＤＭＳＯとパクリタキセルのモル比は約１．３：１であることがわかった。洗浄後の固体中のこの量の溶媒の出現から、結晶性溶媒化合物の形成が示唆される。

実施例７
パクリタキセルのＤＭＰＵ溶媒化合物：
２５８ｍｇのパクリタキセルを１２．５ｍＬのＤＭＰＵ、６．２５ｍＬのＣＨ_３ＣＮおよび６．２５ｍＬの０．１％酢酸に溶解する。さらに１２．５ｍＬの０．１％酢酸を加える。上記実施例１に記載の温度振動プロトコルを行なう。１０〜２０時間の一時停止後、スラリーを検定し、沈澱の完了を確定する。沈降は全く見られない。スラリーを１５分にわたり濾過し、３ｍＬの０．１％酢酸／２５％ＣＨ_３ＣＮ溶液中で洗う。濾過ケークを高減圧下４０℃で１８時間乾燥して、２３５ｍｇの未知構造の固体を得る。しかしながら、^１Ｈ−ＮＭＲ分光分析により、ＤＭＰＵとパクリタキセルのモル比約１．０：１．０が認められる。固体中のこの量の溶媒の出現から、結晶性溶媒化合物の形成が示唆される。

比較例１
粗パクリタキセル物質の１．０６２ｇサンプルを、アセトン４ｍＬに溶解し、次いで実質的に上記方法に従い、曇り点に０．１％水性酢酸を加えて、沈澱を行なう。混合物を定期的に加温し、冷却し、さらにアセトン（２ｍＬ）および水を加える。沈澱がゆっくり進行するのが見られる。混合物を一夜撹拌し（１６時間）、物質をデカントする。

ＨＰＬＣ分析により、沈澱物の純度は、アミド有機溶媒またはＤＭＳＯによる結晶化を行ったときと同程度まで増大しないことがわかる。顕微鏡検査により、針状結晶が観察されたが、さらに特性決定あるいは溶媒含有量の試験はしなかった。しかしながら、実施例１または４〜７の操作に従い、純粋なパクリタキセルとアセトンを用いると、^１Ｈ−ＮＭＲにより溶媒／パクリタキセル＝１：１０の比較的低い比が見られることが注目される。

実施例８
細胞毒性
実施例１のＮＭＰＯ溶媒化合物の細胞毒性を細胞系にて、Ｔ．Ｌ．Ｒissらの「Ｍol．Ｂiol．Ｃell３（Ｓuppl．）」（１８４ａ、１９９２年），“インビトロ増殖の場合のＭＴＴ、ＸＴＴ、および新規テトラゾリウム化合物ＭＴＳの比較および化学的感受性アッセイ”で報告されたＭＴＳ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム・内部塩）アッセイによって検定する。細胞を９６ウェル（well）ミクロタイター平板にて４０００細胞／ウェルで平板培養し、２４時間後に薬物を加え、逐次稀釈する。

細胞を３７℃で７２時間培養し、このとき、３３３μｇ／ｍＬ（最終濃度）のテトラゾリウム染料，ＭＴＳを２５μＭ（最終濃度）の電子カップリング剤，フェナジン・メトスルフェートと共に加える。生存細胞中の脱水素酵素は、該ＭＴＳを４９２ｎｍで光を吸収する結晶形に還元し、これを分光光度分析で定量することができる。

吸光度が大きくなればなる程、生存細胞の数が大きくなる。結果をＩＣ５０で示す。なお、ＩＣ５０とは、細胞増殖（すなわち、４５０ｎｍの吸光度）を未処理対照細胞のそれの５０％に抑制するのに要する薬物濃度である。図７および８に示されるデータは、ＮＭＰＯのパクリタキセル溶媒化合物とパクリタキセルの比較できるインビトロの生物学的活性を示す。

Ｄ型結晶性パクリタキセル溶媒化合物の粉末Ｘ線回折図である。Ｅ型結晶性パクリタキセル溶媒化合物のシミュレーション粉末Ｘ線回折図である。Ｄ型溶媒化合物一部中のパクリタキセル分子および溶媒分子の固体状態配列を示す図である。Ｄ型溶媒化合物一部中の別部分中の対称−独立パクリタキセル分子および溶媒分子の固体状態配列を示す図である。Ｅ型溶媒化合物一部中のパクリタキセル分子および溶媒分子の固体状態配列を示す図である。Ｅ型溶媒化合物の別部分中の対称−独立パクリタキセル分子および溶媒分子の固体状態配列を示す図である。パクリタキセルの場合の細胞毒性（ＩＣ５０値）を示す一覧表と平均差を示すグラフである。表中、Ｍissingは欠測を示す。パクリタキセルＮＭＰＯ溶媒化合物の場合の細胞毒性（ＩＣ５０値）を示す一覧表と平均差を示すグラフである。表中、Ｍissingは欠測を示す。

Claims

高純度を有するパクリタキセルの製造のための中間体としての、パクリタキセル２分子当り、３分子の水、２分子のＮ−メチル−２−ピロリドンおよび１分子のアセトニトリルを含有する、パクリタキセル溶媒和物の結晶。
該結晶は、単位胞標軸として９．５４Åのａ軸、２８．４６Åのｂ軸および３７．２４Åのｃ軸、および空間群対称ｐ２_１２_１２_１、斜方晶系、並びに表１：

で示される分別原子座標に基づく配置および配座中の８つのパクリタキセル分子、を特徴とする、請求項１記載の溶媒和物の結晶。
ａ）パクリタキセル含有物質をＮ−メチル−２−ピロリドンおよびアセトニトリル中に溶解し；そして、これに酸水溶液を加えて混合物を得て；および、
ｂ）該混合物を冷却し、次いで得られたスラリーをろ過し、続いて該スラリーから溶媒を除去してパクリタキセル溶媒和物の結晶固体を回収する、
ことを特徴とする、
請求項１または２のいずれかに記載のパクリタキセル溶媒和物の結晶の製造法。
工程（ａ）の混合物を温度振動に付してから、工程（ｂ）を始める、請求項３に記載の製造法。