JP4403212B2 - 神経障害および神経心理学的障害の治療のための製剤学的薬剤 - Google Patents

Description

この発明は置換された環状アミン類、薬剤学的組成物および神経障害および神経心理学的障害の治療法に関する。
シナプス伝達は、シナプス前部および後部神経の両者において特殊構造の多量の配列を含む複雑な形態の細胞間伝導である。高親和性の神経伝達物質運搬体も上記成分の一つでありシナプス前部端末およびその周囲のグリア細胞上に位置している（ＫａｎｎｅｒおよびＳｃｈｕｌｄｉｎｅｒ，ＣＲＣ Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２２，１０３２（１９８７））。運搬体は神経伝達物質をシナプスから引き離し、それによってシナプス中の神経伝達物質濃度をその持続時間と共に調節するのであり、これによってシナプス伝達の大小に影響を与えるのである。伝達物質が隣接シナプスへ拡散することを避けることによって運搬体はシナプス伝達の適合度を維持しているのである。最後に、放出された伝達物質をシナプス前部末端中に導入することによって運搬体は伝達物質の再利用を可能としているのである。
神経伝達物質の運搬は膜をはさんでの細胞外ナトリウムと電圧の相違に依存し；強烈な神経発射が為された条件下、例えば急な発作の間、運搬体は逆に機能して神経伝達物質をカルシウムとは独立に非細胞外的（ｎｏｎ−ｅｘｏｃｙｔｏｔｉｃ）な方法で放出することもある（Ａｔｔｗｅｌｌ等、Ｎｅｕｒｏｎ，１１，４０１−４０７（１９９３））。神経伝達物質運搬体の薬理学的変調はこのようにシナプス活性を改変する手段を提供し、これによって神経障害および心理学的障害の治療に有効な治療法を提供するものである。
アミノ酸のグリシンは哺乳動物の中枢神経系における主要な神経伝達物質であり、抑制および興奮性シナプスの両者で機能するものである。神経系とは、その神経系の中枢および末端部分の両者を意味するものである。グリシンのこのような明確に異なった機能は、その各々が異なったクラスのグリシン運搬体と結合する２つの異なったタイプの受容体によって媒介されている。グリシンの抑制作用は痙攣性（ｃｏｎｖｕｌｓａｎｔ）アルカロイドストリキニーネに感受性のグリシン受容体により媒介されており、したがって“ストリキニーネ−感受性”と言われている。このような受容体は内在性クロライドチャンネルを有し、このものは受容体にグリシンが結合すると開き；クロライドコンダクタンスが増加することによって作用ポテンシャルの発射のための閾値が上がる。ストリキニーネ−感受性グリシン受容体は脊髄索および脳幹に主として見出され、このような受容体の活性化を増強する薬剤は上記域における神経伝達の抑制を増強するであろう。
中枢神経系における主要な興奮性神経伝達物質であるグルタミン酸塩の作用を調節することによってグリシンは興奮性の伝達という機能をするのである。ＪｏｈｎｓｏｎおよびＡｓｃｈｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ，３２５，５２９−５３１（１９８７）；Ｆｌｅｔｃｈｅｒ等、Ｇｌｙｅｉｎｅ Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ，（Ｏｔｔｅｒｓｏｎ ａｎｄ Ｓｔｏｒｍ−Ｍａｔｈｉｓｅｎ，ｅｄｓ．１９９０）、１９３−２１９頁を参照されたい。具体的にはグリシンはＮ−メチル−Ｄ−アスパルテート（ＮＭＤＡ）受容体と呼ばれている種類のグルタミン酸エステル受容体において必須の共アゴニストである。ＮＭＤＡ受容体の活性化によりナトリウムおよびカルシウムコンダクタンスを増大させ、これにより神経の脱極性化が為され、それによって作用ポテンシャルを高める（ｆｉｒｅ）可能性を増大せしめるのである。ＮＭＤＡ受容体は脳に広く分布し、特に大脳皮質および海馬構造中に高濃度で分布している。
モレキュラークローニングにより哺乳類の脳中にＧｌｙ Ｔ−１およびＧｌｙ Ｔ−２と呼ばれる２種類のグリシン運搬体が見出された。Ｇｌｙ Ｔ−１は主に前脳に見出され、その分布はグルタミン酸経路およびＮＭＤＡ受容体の分布に相当する（Ｓｍｉｔｈ等、Ｎｅｕｒｏｎ，８，９２７−９３５（１９９２））。モレキュラークローニングにより更に、Ｇｌｙ Ｔ−１ａ、Ｇｌｙ Ｔ−１ｂおよびＧｌｙ Ｔ−１ｃと呼ばれるＧｌｙ Ｔ−１の３つの変種の存在が明らかとなった（Ｋｉｍ等、Ｍｏｌｅｃｕｌｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，４５，６０８−６１７（１９９４））が、それらは各々脳および末梢組織において独特の分布を見せている。これら変種は異なったスプライシングおよび異なったエクソンの利用によって生じ、そのＮ−末端領域が異なっている。それとは反対にＧｌｙ Ｔ−２は脳幹および脊髄索に主に見出され、その分布はストリキニーネー感受性グリシン受容体の分布に非常に近い（Ｌｉｕ等、Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇｙｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６８，２２８０２−２２８０８（１９９３）；ＪｕｒｓｋｙおよびＮｅｌｓｏｎ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６４，１０２６−１０３３（１９９５））。これらのデータは、グリシンのシナプスレベルを調節することによってＧｌｙ Ｔ−１およびＧｌｙ Ｔ−２が各々選択的にＮＭＤＡ受容体およびストリキニーネ−感受性グリシン受容体の活性に選択的に影響を与えるという観点と一致しているのである。
グリシン運搬体を抑制もしくは活性化する化合物は受容体機能を変えるものと考えられ、種々の病気の症状に治療的利益を与えるものである。例えば、Ｇｌｙ Ｔ−２の抑制はシナプスレベルのグリシンを増強させ、それによってストリキニーネ−感受性グリシン受容体を有する神経の活性を減少させるために用いることができ、すなわち脊髄索における痛み、これについてはこれらの受容体により媒介されることが示されていたが、に関連する（即ち痛覚（ｎｏｃｉｃｅｐｔｉｖｅ））情報の伝達を減少させ、Ｙａｋｓｈ、Ｐａｉｎ，３７，１１１−１２３（１９８９）。更に、脊髄策におけるストリキニーネ−感受性グリシン受容体を通じてのグリシン性伝達の抑制を強化することにより筋機能亢進を減少させるために用いることができ、このことは痙直、筋クローヌスおよびてんかんのような増大された筋収縮と付随した病気や症状を治療するのに有効である（Ｔｒｕｏｎｇ等、Ｍｏｖｅｍｅｎｔ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，３，７７−８７（１９８８）；Ｂｅｃｋｅｒ，ＦＡＳＥＢ Ｊ．，４，２７６７−２７７４（１９９０））。グリシン受容体の調節により治療することのできる痙直はてんかん、卒中、脳外傷、多発性硬化症、脊髄索損傷、ジストニー、および神経系の他の病状および損傷と付随して生じるものである。
ＮＭＤＡ受容体は記憶および学習に関係している（Ｒｉｓｏｎ ａｎｄ Ｓｔａｎｔｏｎ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｂｉｏｂｅｈａｖ．Ｒｅｖ．，１９，５３３−５５２（１９９５）；Ｄａｎｙｓｚ ｅｔ ａｌ．，Ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，６，４５５−４７４（１９９５））。そして更にＮＭＤＡに媒介された神経伝達の機能低下は精神分裂症の症状の底に潜むか、あるいは寄与しているようである（Ｏｌｎｅｙ ａｎｄ Ｆａｒｂｅｒ、Ａｒｃｈｉｖｅｓ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ，５２，９９８−１００７（１９９６））。このようにＧｌｙ Ｔ−１を抑制しそれによってＮＭＤＡ受容体のグリシンによる活性化する薬剤は新規な抗精神薬および抗痴呆剤として使用することができ、また注意欠損障害および器質性脳遺伝的症候群のような認識行程が損なわれている他の病気に用いることができる。逆にＮＭＤＡ受容体の過剰な活性化は多くの病状と関連しており、特に卒中に付随して起こる神経死や、アルツハイマー病、多発梗塞性痴呆、ＡＩＤＳ症候群、ハンチングトンス氏病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症や卒中もしくは脳外傷のような神経細胞死が生じる他の症状のような神経変質が起きる病状と関連しているのであった。Ｃｏｙｌｅ ＆ Ｐｕｔｔｆａｒｃｋｅｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６２，，６８９−６９５（１９９３）；Ｌｉｐｔｏｎ ａｎｄ Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３３０，６１３−６２２（１９９３）；Ｃｈｏｉ，Ｎｅｕｒｏｎ，１，６２３−６３４（１９８８）。即ちＧｌｙ Ｔ−１の活性を増強させる薬剤はＮＭＤＡ受容体のグリシン活性化を減少させることとなり、このような活性は上記およびそれと関連した症状を治療するために用いることができる。同様に、ＮＭＤＡ受容体上のグリシンサイトを直接ブロックする薬剤も上記およびそれと関連した症状を治療するために用いることができる。
発明の要旨
本発明により、ある種の化合物がＧｌｙ Ｔ−１もしくはＧｌｙ Ｔ−２運搬体を経由するグリシン輸送を抑制することが判明し、プロドラッグを包含するこのような輸送を抑制する化合物のプリカーサーであり、またこのような輸送を抑制する化合物を製造するための中間体であることが判明した。
すなわち、本発明は
１．次の式ＩおよびIIの内の一つで表される化合物またはそれらの薬学的に許容し得る塩：

式中
（１）Ｘは窒素または炭素であり、Ｘが窒素であるときＲ²は存在しない；
（２）Ｒ²は（ａ）水素、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキン、シアノ、（Ｃ２−Ｃ７）アルカノイル、アミノカルボニル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノカルボニルもしくはジアルキルアミノカルボニルであり、ここで各アルキルは個々に独立してＣ１ないしＣ６である；
（ｂ）（Ｒ¹が−Ｏ−Ｒ⁸または−Ｓ−Ｒ^8*でないとき）ヒドロキシ、フルオロ、クロロ、ブロモもしくは（Ｃ２−Ｃ７）アルカノイルオキシを含有し、
（ｃ）Ｒ¹、Ｒ^xbもしくはＲ^ybのいずれか一つからの隣接する炭素もしくは窒素と二重結合を形成し、
（ｄ）Ｒ¹とオキサ結合を形成するか環Ｅに融合している（例えば化合物Ｃ６を参照）酸素か、または
（ｅ）Ｒ^2bを介してＸに結合しているＲ^2aである；
（２ⁱ）Ｒ^xはＲ^xbを介してＸに結合している環含有構造Ｒ^xaであり；
（２ⁱⁱ）Ｒ^yはＲ^ybを介してＸに結合している環含有構造Ｒ^yaであり；
（２ⁱⁱⁱ）Ｒ^xa、Ｒ^yaおよびＲ^2aは各々独立してアリール、ヘテロアリール、アダマンチルまたは酸素、硫黄および窒素からなる群から選択される０ないし２個の異項原子を有する５ないし７員の非芳香族性環であり、式中
（ａ）アリールはフェニルもしくはナフチル、
（ｂ）ヘテロアリールは５員環、６員環、５員環に融合した６員環、６員環に融合した５員環、または６員環に融合した６員環を含有し、該ヘテロアリールは芳香族であり酸素、硫黄および窒素からなる群から選択される異項原子を含有し他の環の原子は炭素である；（ｃ）Ｒ^xa、Ｒ^yaおよびＲ^2aは各々独立してＲ^q、Ｒ^rＯ−もしくはＲ^sＳ−で置換されていてもよく、式中Ｒｑ、ＲｒおよびＲｓはそれらの構造がＲ^xaで定義されているのと同様に各々独立してアリール、ヘテロアリール、アダマンチルまたは５ないし７員の非芳香族性環である、および
（ｄ）Ｒ^xa、Ｒ^ya、Ｒ^2a、Ｒ^q、Ｒ^rおよびＲ^sは、フルオロ、クロロ、ブロモ、ニトロ、ヒドロキシ、シアノ、トリフルオロメチル、アミドスルホニルからなる群から選択される置換基で追加的に置換されていてもよく、これらは２個までの独立的な（Ｃ１−Ｃ６）Ｎ−アルキル置換基、アダマンチル、（Ｃ１−Ｃ１２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ１２）アルケニル、アミノ、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ、ジアルキルアミノ基（以上各アルキルは独立してＣ１〜Ｃ６である）、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、（Ｃ２−Ｃ７）アルカノイル、（Ｃ２−Ｃ７）アルカノイルオキシ、トリフルオロメトキシ、ヒドロキシカルボニル、（Ｃ２−Ｃ７）アルキルオキシカルボニル、アミノカルボニルであり、これらはその水素が２個まで独立的に（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルスルホニル、アミジノ基で置換されていることができ、これらは独立して３個までの（Ｃ１−Ｃ６）アルキルまたはアリールもしくはヘテロアリール環構造に隣接する位置に結合した２つの酸素と共にメチレンジオキシもしくはエチレンジオキシで置換されていてよく、このメチレンジオキシもしくはエチレンジオキシは２個までの独立した（Ｃ１−Ｃ６）アルキルで置換することができる、式中、
（ｉ）Ｒ^xa、Ｒ^yaおよびＲ^2aの置換基は組合わされてＲ^xa、Ｒ^yaおよびＲ^2aの内の２個の間で第２の橋を形成してもよいが、これは次の（１）〜（１０）を含有する：
（１）（Ｃ１−Ｃ２）アルキルもしくはアルケニル、これらは１もしくはそれ以上の（Ｃ１−Ｃ６）アルキルで独立して置換することができる、（２）硫黄、（３）酸素、（４）水素の部分に１個の（Ｃ１−Ｃ６）アルキルで置換されていてもよいアミノ、（５）カルボニル、（６）水素の部分が２個までの（Ｃ１−Ｃ６）アルキルで独立して置換されていてもよい−ＣＨ₂Ｃ（＝Ｏ）−、（７）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ、（８）水素の部分が２個までの（Ｃ１−Ｃ６）アルキルで独立して置換されていてもよい−ＣＨ₂−Ｏ−、（９）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒ²⁴）−、式中Ｒ²⁴は水素もしくは（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（１０）水素の部分が２個までの（Ｃ１−Ｃ６）アルキルで独立して置換されていてもよい−ＣＨ₂−ＮＨ−、または（１１）水素の部分が２個までの（Ｃ１−Ｃ６）アルキルで独立して置換されていてもよい−ＣＨ＝Ｎ−もしくはＲ^xa、Ｒ^yaおよびＲ^2aの内の２個が単結合で直接結合されていてもよい。
（２^iv）Ｒ^xbおよびＲ^2bは各々独立して単結合もしくは（Ｃ１−Ｃ２）アルキレン；
（２^v）Ｒ^ybは単結合、オキサ（すなわち−Ｏ−）、（Ｃ１−Ｃ２）アルキレン、エチレンもしくは−ＣＨ＝（該二重結合はＸと共にある）、チア、メチレンオキシもしくはメチレンチオ、または−Ｎ（Ｒ⁶）−もしくは−ＣＨ₂−Ｎ（Ｒ^6*）−のいずれかであり、Ｒ⁶およびＲ^6*は水素もしくは（Ｃ１−Ｃ６）アルキルであり、Ｘが窒素のときＸは他の異項原子には結合されていない；
（３）Ｒ¹は単結合もしくは二重結合；直鎖の（Ｃ１−Ｃ３）脂肪族基；または（Ｘは炭素原子及びＲ^ybはＸに結合している異項原子を含まない）−Ｏ−Ｒ⁸もしくは−Ｓ−Ｒ^8*、このときＲ⁸もしくはＲ^8*のいずれかは単結合、（Ｃ１−Ｃ３）アルキレンまたは（Ｃ２−Ｃ３）アルキレンであり、ＯもしくはＳはＸに結合している；
式中Ｒ¹は１個までのヒドロキシ、１個までの（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシもしくは１個までの（Ｃ２−Ｃ７）アルカノイルオキシ、２個までの独立した（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、１個までのオキソ、１個までの（Ｃ１−Ｃ６）アルキリデンで置換されていてもよく、ただし、このヒドロキシ、アルコキシ、アルカノイルオキシ、オキソ置換基は窒素もしくは酸素に結合している炭素原子には結合していないものである、または（Ｒ¹が−Ｏ−Ｒ⁸でＸが炭素原子のとき）Ｘへのオキサ結合が１，３−ジオキソランを形成してもよい、
式中Ｒ¹のアルキルもしくはアルキリデン置換基は結合して３ないし７員の非芳香族環を形成してもよく、および式中Ｘが窒素のときＸは単結合によりＲ¹に結合し、Ｒ¹をＮに結合しているＲ¹の末端炭素は飽和されているものである；
（４）ｎは０もしくは１であり、ｎが１のときＲ^3*は（Ｃ１−Ｃ６）アルキル（正電荷を有する付属した窒素と共に）もしくは酸素（Ｎ−オキサイドを形成）そしてＸは炭素である；
（５）環Ｄは３ないし８員環、３ないし６員のスピロ環で置換されている３ないし８員環、または５ないし６員環と融合している３ないし８員環であり、図示された第３級窒素を欠く融合環は芳香族もしくは異項芳香族であることができ、環Ｄの各構成環については酸素、硫黄もしくは図示された窒素を含めた窒素から選択された２個までの異項原子が存在し、残りは炭素原子であり、ただしこの環原子は４級窒素を含有せず、また飽和環においては環窒素原子は少なくとも２個の介在炭素原子によって他の環異項原子と分離されているものである；
ここで環Ｄの炭素および窒素環原子は（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニレン、シアノ、ニトロ、トリフルオロメチル、（Ｃ２−Ｃ７）アルキルオキシカルボニル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキリデン、ヒドロキシル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、オキソ、ヒドロキシカルボニル、Ｒ^aで定義されたアリールまたはＲ^aで定義されたヘテロアリールで置換されていることができ、ただしアルキリデン、ヒドロキシカルボニルもしくはオキソで置換された環原子は炭素であり、またヒドロキシルもしくはアルコキシで置換された環原子は少なくとも２個の介在炭素原子によって他の環異項原子と分離されているものである；および
Ｒ¹、Ｒ³およびＧは少なくとも２個の原子がＸと図示された環窒素とを分離しているようなものである；
（６）式中環Ｅは３ないし８員環、３ないし６員のスピロ環で置換されている３ないし８員環、または５ないし６員環と融合している３ないし８員環であり、図示された第３級窒素を欠く融合環は芳香族もしくは異項芳香族であることができ、環Ｅの各構成環については酸素、硫黄もしくは図示された窒素を含めた窒素から選択された２個までの異項原子が存在し、残りは炭素原子であり、ただしこの環原子は４級窒素を含有せず、また飽和環においては環窒素原子は少なくとも２個の介在炭素原子によって他の環異項原子と分離されているものである；
ここで環Ｅの炭素および窒素環原子は（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニレン、シアノ、ニトロ、トリフルオロメチル、（Ｃ２−Ｃ７）アルキルオキシカルボニル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキリデン、ヒドロキシル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、オキソ、ヒドロキシカルボニル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシカルボニル、Ｒ^aで定義されたアリールまたはＲ^aで定義されたヘテロアリールで置換されていることができ、ただしアルキリデン、ヒドロキシカルボニルもしくはオキソで置換された環原子は炭素であり、またヒドロキシルもしくはアルコキシで置換された環原子は少なくとも２個の介在炭素原子によって他の環異項原子と分離されているものである；および
式中Ｇ^*およびＲ¹⁸はＲ^xおよびＲ^yに結合している炭素から図示されている環の窒素と少なくとも２原子分分離している；
（７）Ｒ¹⁹は（ａ）Ｒ¹、Ｒ³もしくはＧと二重結合を形成し、
（ｂ）水素であり、
（ｃ）（Ｃ１−Ｃ３）アルキルもしくはアルキレンであり、
または
（ｄ）融合環中に導入されている；
（８）Ｒ⁴およびＲ^4*は独立して水素もしくは（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、またはＲ⁴およびＲ^4*の内の一つは（Ｃ１−Ｃ６）ヒドロキシアルキル；および
（９）Ｒ５は（ＣＯ）ＮＲ¹³Ｒ¹⁴、（ＣＯ）ＯＲ¹⁵、（ＣＯ）ＳＲ¹⁶、（ＳＯ₂）ＮＲ¹⁷Ｒ¹⁸、（ＰＯ）（ＯＲ¹⁹）（ＯＲ²⁰）、（ＣＲ²²）（ＯＲ²³）（ＯＲ²⁴）、ＣＮまたはテトラゾール−５−イルであり、式中Ｒ¹³、Ｒ¹⁴、Ｒ¹⁵、Ｒ¹⁶、Ｒ¹⁷、Ｒ¹⁸、Ｒ¹⁹およびＲ²⁰は各々独立して水素、（Ｃ３−Ｃ８）シクロアルキルを包含した（Ｃ１−Ｃ８）アルキルであり、式中Ｒ１５の酸素またはＲ１６の硫黄に結合している炭素はそれ以上第２級分枝を持たず、（Ｃ２−Ｃ６）ヒドロキシアルキル、Ｃ２−Ｃ６のアルキルを有するアミノアルキルおよびアミノは２個までの独立した（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、アルキルがＣ１−Ｃ６であるアリールアルキル、アルキルがＣ１−Ｃ６であるヘテロアリールアルキル、アリールもしくはヘテロアリールで置換されることができ、Ｒ²²は水素またはＯＲ²⁵であり、Ｒ²³、Ｒ²⁴およびＲ²⁵は（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、フェニル、ベンジル、アセチル、またはＲ²²が水素であるときＲ²³およびＲ²⁴のアルキルは結合されて１，３−ジオキシランもしくは１，３−ジオキサンを包含する；
式中、
アリールはフェニルもしくはナフチルであり、
ヘテロアリールは５員環、６員環、５員環に融合した６員環、６員環に融合した５員環、または６員環に融合した６員環であり、このヘテロアリールは芳香族であり酸素、硫黄および窒素からなる群から選択される異項原子を含有し他の環の原子は炭素である；
式中、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキルのアリールまたはヘテロアリールアルキルのヘテロアリールは、フルオロ、クロロ、ブロモ、ニトロ、シアノ、トリフルオロメチル、アミドスルホニルからなる群から選択される置換基で追加的に置換されていてもよく、これらは２個までの独立的な（Ｃ１−Ｃ６）Ｎ−アルキル置換基、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミン、各アルキルが独立してＣ１〜Ｃ６であるジアルキルアミン、アミノ、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、（Ｃ２−Ｃ７）アルカノイル、（Ｃ２−Ｃ７）アルカノイルオキシ、トリフルオロメトキシ、ヒドロキシカルボニル、（Ｃ２−Ｃ７）アルコキシカルボニル、２個まで独立的に（Ｃ１−Ｃ６）アルキルで置換できるアミノカルボニル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルスルホニル、３個までの（Ｃ１−Ｃ６）アルキルで置換できるアミジノ、アリールもしくはヘテロアリール環構造に隣接する位置に結合した２個の酸素を有するメチレンジオキシもしくはエチレンジオキシからなる群から選択される置換基で置換されていてよく、このメチレンジオキシもしくはエチレンジオキシは２個までの独立した（Ｃ１−Ｃ６）アルキルで置換することができる、
式中、Ｒ¹³およびＲ¹⁴は窒素原子と共に酸素及び硫黄から選択されるもう一つ追加の異項原子を含有していてもよい５〜７員環を形成することもできる。
本発明における好ましい実施態様としては、（Ａ）Ｒ^xa、Ｒ^yaおよびＲ^2aの少なくとも一つはフルオロ、クロロ、ブロモ、ヒドロキシ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、ニトロ、シアノ、（Ｃ３−Ｃ８）アルキル、Ｒ^q、Ｒ^rＯ−、Ｒ^sＳ−で置換されているか、（Ｂ）Ｒ^xa、Ｒ^yaおよびＲ^2aの環構造はそれらへの置換基を含めて、１５〜２０の環原子を共に有する少なくとも２個の芳香族環構造を含むものである。好ましくは、Ｒ^xa、Ｒ^yaおよびＲ^2aの少なくとも一つが、フルオロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、ニトロ、シアノまたは（Ｃ３−Ｃ８）アルキルで置換されている。好ましくは、Ｒ^xa、Ｒ^yaおよびＲ^2aの少なくとも一つが、Ｒ^q、Ｒ^rＯ−又はＲ^sＳ−で置換されているものである。好ましくは、Ｒ^xa、Ｒ^yaおよびＲ^2aの少なくとも一つのアリールもしくはヘテロアリールがフェニルである。好ましくは、Ｒ^ybがオキサ、メチレンオキシ、チア、メチレンチアである。好ましくは、Ｒ^ybがオキサもしくはチアである。好ましくは、Ｒ⁵が（ＣＯ）ＮＲ¹³Ｒ¹⁴、（ＣＯ）ＯＲ¹⁵もしくは（ＣＯ）ＳＲ¹⁶である。好ましくは、Ｒ¹⁵が（Ｃ２−Ｃ６）アルキル、（Ｃ２−Ｃ４）ヒドロキシアルキル、フェニル、アルキルがＣ１−Ｃ３であるフェニルアルキル、またはアルキルがＣ２−Ｃ６でアミノが２個までの独立した（Ｃ１−Ｃ３）アルキルで置換されていてもよいアミノアルキルで、式中フェニルもしくはフェニルアルキルのフェニルは置換されていてもよいものである。好ましくはｎがゼロである。好ましくは、Ｒ¹⁵が水素である。好ましくは、Ｒ⁴が水素、メチルもしくはヒドロキシメチルであり、Ｒ^4*が水素である。好ましくは、Ｒ^xa、Ｒ^yaおよびＲ^2aの少なくとも一つがヘテロアリールであり、このヘテロアリールとしてジアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チオリル、ジアジニル、トリアジニル、ベンゾアゾリル、ベンゾジアゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾオキソリル、ベンゾチオリル、キノリル、イソキノリル、ベンゾジアジニル、ベンゾトリアジニル、ピリジル、チエニル、フラニル、ピロリル、インドリル、イソインドイルもしくはピリミジルを包含するものである。好ましくは、Ｒ¹が−Ｏ−Ｒ⁸もしくは−Ｓ−Ｒ^8*である。
好ましくは、Ｒ^xa、Ｒ^yaおよびＲ^2aの内の２者の間での第２の橋がＬであり、次の式を満たすものである：

式中ＡおよびＢは各々Ｒ^xaおよびＲ^yaのアリールもしくはヘテロアリール基である。好ましくは式中Ｒ^xa−Ｒ^xb、Ｒ^ya−Ｒ^ybおよびＸが次の式を形成するものである：

式中Ｙは単結合もしくは二重結合によりＲ¹に結合している炭素またはＲ¹に結合している窒素であって、式中Ｒ²¹は（ｉ）Ｒ^xおよびＲ^yの２個のアリールもしくはヘテロアリール環を結合する単結合を完成する、（ii）（Ｃ１−Ｃ２）アルキレンもしくはアルケニレン、（iii）硫黄または（iv）酸素のいずれかであり、式中Ｒ^xおよびＲ^yは上記のように置換されていてもよい。好ましくはＲ²¹がＣＨ₂ＣＨ₂もしくはＣＨ＝ＣＨである。
好ましくは、Ｒ^xa、Ｒ^yaおよびＲ^2aのアルキレンジオキシ置換基が次のものである：

式中アルキレンジオキシは２個までの独立した（Ｃ１−Ｃ３）アルキルで置換されていることができる。
好ましくは、環Ｄが式Ａ′およびＢ′のものである：

式中Ｚは炭素もしくは窒素であり、式Ａ′およびＢ′の各々は破線で表されている結合の２個までが２個の二重結合が隣り合わせていない限り二重結合であることができ、式Ａ′およびＢ′の環は環Ｄにおけると同様の置換基を有することができる。好ましくは、Ｇ^*を含有する環系が式Ｃ′およびＤ′の一つである：

式中Ｚは炭素もしくは窒素であり、式中式Ｃ′は破線で表されている結合の１個までが二重結合であることができ、式Ｄ′は破線で表されている結合の２個までが二重結合であることができ、そして式中の環は環Ｅにおけると同様の置換基を有することができる。好ましくは、環Ｄもしくは環Ｅが３個までの置換基で置換されている。好ましくは、Ｒ^xaおよびＲ^yaは一緒になって６個までの置換基で置換されていてよく、Ｒ^2a、Ｒ^q、Ｒ^rおよびＲ^sは各々３個までの置換基で置換されていてよく、そしてＲ^q、Ｒ^rもしくはＲ^sの各存在はＲ^xa、Ｒ^yaおよびＲ^2aの各環構造への置換とみなされる。好ましくは、式中Ｒ¹³、Ｒ¹⁴、Ｒ¹⁵、Ｒ¹⁶、Ｒ¹⁷、Ｒ¹⁸、Ｒ¹⁹もしくはＲ²⁰のアリール、ヘテロアリール、アリールアルキルのアリールもしくはヘテロアリールアルキルのヘテロアリールが３個までの置換基で置換されている。好ましくは、該化合物が視覚的に純粋な鏡像異性体である。好ましくは、該化合物が視覚的に純粋な鏡像異性体である（即ち、少なくとも約８０％ｅｅ、好ましくは少なくとも約９０％ｅｅ、より好ましくは少なくとも約９５％ｅｅ）。
本発明では、好ましくは本発明の化合物および製剤学的に許容し得る賦形剤を含有する薬剤組成物を提供する。好ましくは、本発明の化合物が次のための有効量存在する薬剤組成物である：
（１）精神分裂症の治療もしくは予防、（２）痴呆症の治療もしくは予防強化剤、（３）てんかんの治療もしくは予防、（４）痙直の治療もしくは予防、（５）筋痙縮の治療もしくは予防、（６）痛みの治療もしくは予防、（７）卒中後の神経細胞死の予防、（８）神経変性症に罹っている動物における神経細胞死の予防、（９）うつ病のような情緒障害の治療もしくは予防、（１０）記憶もしくは学習の強化、または、（１１）学習障害の治療もしくは予防。
本発明では更に以下のような治療、予防もしくは強化のために有効な量の本発明化合物を投与する方法を提供するものである：
（１）精神分裂症の治療もしくは予防に有効な量の本発明化合物を投与する精神分裂症の治療もしくは予防法、（２）痴呆症の治療もしくは予防に有効な量の本発明化合物を投与する痴呆症の治療もしくは予防法、（３）てんかんの治療もしくは予防に有効な量の本発明化合物を投与するてんかんの治療もしくは予防法、（４）痙直の治療もしくは予防に有効な量の本発明化合物を投与する痙直の治療もしくは予防法、（５）筋痙縮の治療もしくは予防に有効な量の本発明化合物を投与する筋痙縮の治療もしくは予防法、（６）痛みの治療もしくは予防に有効な量の本発明化合物を投与する痛みの治療もしくは予防法、（７）卒中後の神経細胞死の予防に有効な量の本発明化合物を投与する卒中後の神経細胞死の予防法、（８）神経変性症に罹っている動物における神経細胞死の予防に有効な量の本発明化合物を投与する神経変性症に罹っている動物における神経細胞死の予防法、（９）うつ病のような情緒障害の治療もしくは予防に有効な量の本発明化合物を投与する情緒障害の治療もしくは予防法、（１０）記憶もしくは学習の強化に有効な量の本発明化合物を投与する記憶もしくは学習の強化法、または、（１１）学習障害の治療もしくは予防に有効な量の本発明化合物を投与する学習障害の治療もしくは予防法。
好ましい態様としては、治療もしくは予防されるべき痙直はてんかん、卒中、脳外傷、多発性硬化症、脊髄索損傷、ジストニーと付随して生じている場合である。また好ましくは、治療もしくは予防されるべき神経変質症が、アルツハイマー病、多発梗塞性痴呆、ＡＩＤＳ症候群、ハンチングトンス氏病、筋萎縮性側索硬化症や神経細胞死が生じる卒中もしくは脳外傷のような場合である。
本発明は又本発明の化合物の合成法を提供するものであり、その方法としては、
Ａ）次の式の化合物を
１）

式中¹Ｌは求核置換解離基である
次の式の化合物と反応させるか、または
２）

Ｂ）次の式の化合物を
１）

次の式の化合物と
２）

式中²Ｌは求核置換解離基である、
反応させる本発明化合物の合成方法である。
本発明は又次式の化合物

式中、Ｒ^cおよびＲ^dは各々独立してＲ^xの定義と同じであり、式中Ｒ^1*は窒素、酸素または硫黄を含まないこと、上記の図示されたカルボニルと共役した二重結合は含まないことを除いてＲ¹の定義と同じである。
を用いてＲ^dＮＨ₂を還元的にアルキル化する本発明化合物の合成方法を提供する。
本発明は又、Ｒ^fＯＨもしくはＲ^f*ＳＨを次式の化合物

式中Ｒ^fおよびＲ^f*は各々独立してＲ^xの定義と同じであり、式中Ｒ^1*は窒素、酸素または硫黄を含まないこと、および上で図示したＬ⁶−置換炭素に結合している原子での二重結合は含まないことを除いてＲ¹の定義と同じである。
と反応させて各々エーテルもしくはチオエーテルを形成する本発明化合物の合成方法を提供する。好ましくは、この方法は更に次式

のヒドロキシルを他の求核置換解離基で置き換えることにより次式

の化合物を合成することを更に含有するものである。好ましくは、この方法は次式

の化合物をホスフィン化合物の存在下アゾジカルボキシレートと反応させることを包含する。
本発明は又、Ｒ^eＭと式

の化合物を反応させて次式

式中Ｒ^cおよびＲ^eは独立してＲ^xの定義と同じであり、Ｍは金属含有置換基で例えばＲ^eＭは有機金属試薬であり、Ｒ^1*は窒素、酸素または硫黄を含まないこと、上記の図示されたカルボニルと共役した二重結合は含まないことを除いてＲ¹の定義と同じである。
の化合物を形成することを包含する、本発明の化合物を合成する方法を提供するものである。
本発明は又、次式

の化合物を脱水して次式

式中Ｃ^*は隣接する炭素と共に二重結合を有し、Ｒ^cおよびＲ^eは独立してＲ^xの定義と同じであり、Ｒ²⁷およびＲ^27*は窒素、酸素もしくは硫黄を含まないことを除いてＲ¹の定義と同じである。
の化合物を形成することを包含する、本発明の化合物を合成する方法を提供するものである。
本発明は又、次式

式中Ｃ^*は隣接する炭素と共に二重結合を有す。
の化合物を還元して次式

式中Ｒ^cおよびＲ^eは独立してＲ^xの定義と同じであり、Ｒ²⁷およびＲ^27*は窒素、酸素もしくは硫黄を含まないことを除いてＲ¹の定義と同じである。
の化合物を形成することを包含する、本発明の化合物を合成する方法を提供するものである。
本発明は又、次式の化合物のいずれか一方を還元して

環Ｃⁱⁱもしくは環Ｃ^ixにおける二重結合を還元する、
式中Ｒ²⁸は環への結合が二重結合でないことを除いてはＲ¹と同様であり、環Ｃ^ixは環形成炭素間で形成される二重結合と共に破線で示された１もしくはそれ以上の結合においてモノもしくはジ不飽和であり、２個の二重結合が隣接することはなく、環Ｃⁱⁱもしくは環Ｃ^ixは融合フェニルであってもよく、次のように置換されていることもできる。
環Ｃⁱⁱもしくは環Ｃ^ixの炭素および窒素環原子は（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニレン、シアノ、ニトロ、トリフルオロメチルおよび（Ｃ２−Ｃ７）アルキルオキシカルボニルから選択される２個までの置換基で置換されていてもよく、Ｉ^-は負の対向イオンである。
の化合物を形成することを包含する、本発明の化合物を合成する方法を提供するものである。
還元される化合物が環Ｃⁱⁱを含有することが好ましい。
本発明は又、本発明の化合物を製造するために使用することのできる次式の化合物：

を提供するものである。本発明は又、次式の化合物と

次式の化合物

式中Ｌ⁴は求核置換解離基であり環Ｃⁱはフェニルと融合もしくは置換されていることができ環Ｃⁱⁱの定義と同じ
を反応させる、上記化合物の製造方法をも提供するものである。
本発明は又、次式

式中環Ｃ^ixはフェニルと融合していてもよいし置換されていてもよく、環Ｃⁱⁱで定義されたものと同様であり、環形成炭素間で形成される二重結合と共に破線で示された１もしくはそれ以上の結合においてモノもしくはジ不飽和であり、２個の二重結合が隣接することはない、の本発明化合物を提供するものである。
本発明は又、次式：

式中Ｉ^-は負の対向イオンであり、Ｒ^28*はＲ¹で定義されたように置換基を有していてもよい（Ｃ１−Ｃ３）脂肪族基であり、環Ｃⁱⁱは融合フェニルであってもまた置換されていてもよく、環Ｃⁱⁱで定義されたものと同様である、
で表わされる、本発明の化合物を合成するために使用することのできる化合物を提供するものである。本発明は又、次式の化合物と

次式の化合物

式中Ｌ⁵は求核置換解離基であり環Ｃ^viはフェニルと融合もしくは置換されていることができ環Ｃ^viiの定義と同じ
を反応させる、該化合物の製造方法を提供するものである。
本発明は又、次式の化合物を提供するものであり、

この化合物は本発明の化合物を合成するために用いることができ、式中Ｒ²⁸はＲ¹と同様に置換されていることができる（Ｃ１−Ｃ３）脂肪族基であり、環Ｃ^viiiはフェニルと融合していてもよくもしくは置換されていてもよく、環Ｃⁱⁱの定義と同様である。本発明は又、次式の化合物を還元することを包含する、

環Ｃ^viiにおける二重結合を還元し、式中環Ｃ^viiiはフェニルと融合していてももしくは置換されていてもよく、環Ｃⁱⁱの定義と同様である、
上記化合物の合成法を提供するものである。
本発明は又、次式の化合物：

を、次式の化合物

と反応させることからなる次式

の、本発明化合物を製造するために使用することのできる化合物の製造法を提供するものである。
本発明は又、次式の化合物

をＡｒ−Ｑ
式中Ａｒは電子回避基で置換されているアリールまたは電子回避基で置換されているヘテロアリールであり、式中Ｑはハライド（好ましくはフルオロもしくはクロロである）
と反応させて、次式

の化合物を形成することからなる、本発明化合物を合成する方法を提供するものである。
本発明は又、次式の化合物

をＲ^dＮＨＳＯ₂Ａｒ
式中Ａｒはアリールもしくはヘテロアリールである、
と反応させることからなる、本発明の化合物を合成するために使用することのできる式Ｘ

の化合物の合成方法を提供するものである。好ましくは、この方法は式Ｘの化合物を次の化合物へと変換することを更に包含するものである：

本発明は又、次式の化合物

を次式

式中Ｌ４は求核的置換解離基である、
と反応させることからなる、本発明の化合物を合成するために使用することのできる次式

の化合物の合成方法を提供するものである。
本発明は又、次式の化合物

のケトンを還元することからなる、本発明の化合物を合成するために使用することのできる次式

の化合物の合成方法を提供するものである。
本発明は又、次式の化合物：

この化合物は本発明の化合物を合成するために用いることができ、式中Ｉ^-は負の対向イオンであり、式中Ｒ²⁸は環への結合が二重結合でないことを除いてＲ¹と同じであり、環Ｃ^xはフェニルと融合していてもよいし置換されていてもよく、環Ｃⁱⁱの定義と同様である、
を提供するものである。本発明は又、次式の化合物

を次式の化合物

式中Ｌ⁵は求核的置換解離基であって、環Ｃ^xiはフェニルと融合していてもよくまた置換されていてもよく、Ｃⁱⁱで定義したものと同様である、
と反応させることからなる、該化合物の合成方法を提供するものである。
本発明は又、次式の化合物：

この化合物は本発明の化合物を合成するために用いることができ、式中Ｒ²⁸は環への結合が二重結合でないことを除いてＲ¹と同じであり、環Ｃ^xiiはフェニルと融合していても、また置換されていてもよく、環Ｃⁱⁱの定義と同様である、を提供するものである。本発明は又、次式

の化合物を還元して環Ｃ^x中の二重結合を還元することを包含する該化合物の合成方法を提供するものである。
【図面の簡単な説明】
図面は本発明の化合物の合成にあたって採用することのできるいくつかの反応を示しているものである。
定義
次の用語は以下に示す意味を有するものである：
・環の異項原子の計算
２つの環が結合して１個のバイサイクリック環系を形成している場合、その結合部の１箇所に位置する窒素は各構成環各々の異項原子と考える。
・賦形剤
賦形剤は、非経口、腸内（例えば経口もしくは吸入）もしくは局所投与に適した製薬学的に許容し得る有機もしくは無機担体物質で、これらは活性成分と有害に反応しないものである。好適な製薬学的に許容し得る担体としては水、食塩溶液、アルコール、アラビアゴム、ベンジルアルコール、ゼラチン、ラクトース、アミロースもしくはでん粉のような炭水化物、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、ヒドロキシメチル、セルロース、ポリビニルピロリドンのようなものが挙げられるが、これらに限定されることはない。
・有効量
「有効量」の意味は臨床医には自明であろうが、次のような作用のため有効な量を指すものである：
（１）治療されるべき病気の症状の１もしくはそれ以上を軽減、改善もしくは除去すること、
（２）治療されるべき病気の症状の治療に対応して薬理学的な変化が導入されること、または
（３）病気の発症を抑えるか、頻度を少なくすること。
・神経細胞死抑制
本発明の化合物の投与がなければ起こっていたことが予測される量の細胞死が減少している場合、神経細胞死が「抑制」されているとする。
・オキソ置換
「置換基」としてオキソと言った場合、「＝Ｏ」置換をいうものとする。
発明の詳細な説明
本発明の化合物は以下に示すいくつかの合成スキームの１つに従って一般には製造されるが、当業者によって認められている他のスキームも無論用いることができる。

反応１および反応２においてＬ¹およびＬ²は十分に求核置換解離基で、ハライド殊にブロマイド、トシレート、ブロシレート（ｐ−ブロモベンゼンスルホネート）等が挙げられる。この反応はカルボン酸カリウムのような塩基もしくはジイソプロピルエチルアミンのような３級アミンの存在下で行なわれるのが好ましい。この解離基がハライドであるとき、ヨードカリウムのようなヨード塩の存在下でこの反応は行なうことができる。好適な有機溶媒としては例えばメタノール、ジオキシサン、アセトニトリルもしくはジメチルホルムアルデヒドが挙げられる。この反応は好ましくは約１５℃から４０℃の温度で行なわれる。これ以上温度が高くなるのを回避することによって、ビスアルキル化によって生ずる４級アンモニウムの生成を避けることができる。

化合物Ｉⁱは更に還元されて例えば反応５によって次の化合物を製造する：

更に反応６を採用して環Ｃ^vを完全に還元することができる。上記の反応３〜６においてＲ¹と環の間の結合は環の２、３、もしくは４位のいずれかで為されている。反応３のアルキル化においてＬ⁴はハライド、殊にブロマイドのような十分に求核性置換解離基である。上には示していないが、環Ｃは置換されていてもよい。好適な有機溶媒としては例えば原料物質を効率的に溶解しアルキル化試薬とは反応しないようなものが挙げられる。反応物によって、該溶媒としてベンゼン、アセトニトリル、テトラヒドロフランもしくはエタノールを挙げることができる。この反応は約２０℃〜約１００℃の温度範囲で行なわれるのが好ましい。
反応４および５において、環Ｃは公知の幾つかの還元反応の一つによって還元されるが、この方法としては例えばボロハイドライドナトリウムのような金属ハイドライドとの反応が挙げられる。Ｒ．Ｍ．Ａｃｈｅｓｏｎ，Ｇ．Ｐａｇｌｉｅｔｔｉ，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｐｅｒｋｉｎ Ｉ、ｐ．４５，１９７６を参照されたい。上記のスキームは、Ｉⁱ、ＩⁱⁱおよびＩⁱⁱⁱのような一部還元された種々の化合物の別個の生成法を記載しているが、これらの生成物の割合およびその単離が容易であるかどうかは使用される金属ハイドライドのタイプおよび使用される溶媒のようなファクターにより、各ケースによって変わってくる。反応６においては、環Ｃ^vは、例えば適当な水素化触媒の存在下での水素化のような、多くの公知の還元法の内の１方法により更に還元される。例えば、多くの場合水素化はアルコール溶媒中Ｐｄ／Ｃ触媒と接触させて行なうことができる。
反応７においては図に示されているようにＲ^cおよびＲ^dは各々独立にＲ^xと同様に定義される。出発原料IIIは例えば反応１５（反応１と類似している）の化学反応を用いて次のように合成することができる。

式中Ｒ^1*は、窒素を含まないこと、上に図示されているカルボニルに結合した酸素は含まないこと、そして上に図示されているカルボニルに共役した二重結合を含まないことを除いてはＲ¹と同様に定義され、Ｌ³はハライド殊にブロマイド、トシレート、ブロシレート（ｐ−ブロモベンゼンスルホネート）等のような十分求核性置換解離基である。
反応７においては図に示されているように、還元的アルキル化を行なえる条件下でＲ^d−ＮＨ₂をIIIと反応させてIVを形成する。還元的アルキル化は、カーボン上のパラジウムのような触媒の存在下での水素との反応、触媒的水素化に不安定な基が存在するときのシアノボロハイドライドナトリウムとの反応、またはトリアセトキシボロハイドライドナトリウムとの反応を含むいくつかの公知の方法例えば、“Ｒｅｄｕｃｔｉｖｅ Ａｌｋｙｌａｔｉｏｎ，”Ｗ．Ｓ．Ｅｍｅｒｓｏｎｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｖｏｌ．４，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９４８，ｐ．１７４ ｅｔ ｓｅｑ．を参照されたい、によって行なうことができる。中間体のシッフ塩基がこの反応において形成されることが認められ、このシッフ塩基が還元されて結合を形成する。このシッフ塩基中間体は単離され、ついで別の反応で還元される。溶剤の選択は出発原料の溶解性、脱水反応によりシッフ塩基を形成するのにどの程度好ましいか、およびこの還元工程における溶媒の好適性のようなファクターによって変わってくる。シッフ塩基を還元するための触媒的水素化に用いる好適な溶媒としてはエタノールが挙げられる。シッフ塩基を還元するためのボロハイドライドを使用する方法に好適な溶媒としてはメタノールもしくはエタノールのようなアルコール性溶媒が挙げられる。ケースによっては還元されるシッフ塩基を形成する脱水反応を促進する反応の間、乾燥法を用いることができる。このような乾燥法は、共沸混合物として水を除けるように選択された条件下で還流する方法や、モレキュラーシーブや他の乾燥試薬を用いる方法がある。反応温度としては約２０℃から使用溶媒の還流温度までの範囲が好ましいものとして挙げられる。
また一方、IVは図に示されたように反応１６により、Ｒ^d−ＮＨ₂とＸを反応１もしくは反応２に記載された条件下で反応させることにより合成することもできる。他の方法として、出発原料IIIⁱは次のように調製される。

これらの反応１７および１８は各々上記の反応３および６に記載された化学反応を用いる。化合物IIIⁱは図に示されているように反応７、８および１２におけるIIIと置換することもできる。
反応８においては図に示されているようにＲ^eは独立してＲ¹に定義されているものと同様である。反応８においては、IIIもしくはIIIⁱをアリールリチウムまたはアリールもしくはアリールアルキルグリニャー試薬のような有機金属試薬と反応させてＶを形成するものであり、これについては例えばＣａｒｙ ａｎｄ Ｓｕｎｄｂｅｒｇ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｐａｒｔ ２，Ｐｌｅｎｕｍ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７７，ｐｐ．１７０−１８０の５．１．２章やそこで言及されている文献中に記載されている。Ｒ⁵がエステルを含む場合は有機金属試薬がこのエステル基と反応する可能性があることを当業者であれば理解するであろう；目的生成物の収率があまりに低い場合には、溶媒、有機金属試薬もしくは置換エステルを変更することもできる。
反応９においては図に示されているように、Ｖは脱水に適した条件により二重結合を形成する。このような条件としては例えばＨ．Ｗｅｉｌａｎｄ，Ｂｅｒ．４５：４８４ ｅｔ ｓｅｑ．（１９１２）に記載されているようなものがあり、ここではＶは酢酸無水物と共に還流する。この図の中では二重結合はＲ^1*の隣接炭素原子と共に形成されている。この二重結合はＲ^cおよびＲ^eがアリールもしくはヘテロアリールでＲ^1*の隣接炭素が飽和で完全には置換されていないような方向で通常は形成されるが、Ｒ^c、Ｒ^eおよびＲ^1*の組成物によって他の方向も可能である。反応１０では図に示されるように、炭素−炭素二重結合を還元するための種々の既知の方法のいずれかを用いてVIを還元するが、この還元法としては適当な触媒の存在下での水素化等が挙げられる。
反応１１では図に示されているように、Ｖは例えば４−ジメチルアミノピリジンのようなアシル化触媒の存在下、無水酢酸でアシル化する。
反応１２では図に示されているように、IIIもしくはIIIⁱのケトン基を、例えばリチウムトリ−ｔｅｒｔ−ブトキシアルミノハイドライドとの反応のような公知のケトンの選択的還元法等多くの既知の方法の内の一つを選んで還元する。反応１３については、図に示されているようにIXのヒドロキシルを解離基Ｌ⁶で置換するが、この解離基が例えばクロロもしくはブロモの場合には、例えばIXとチオニルクロリドもしくはチオニルブロミドと反応させる。反応１４については図に示されているようにＲ^fは独立してＲ^xの定義を満たすものである。ＸはＫ₂ＣＯ₃もしくはソジウムハイドライドのような塩基の存在下Ｒ^fＯＨと反応させる。さもなければ、XIのチオ含有類似体はＸとＲ^fＳＨと反応させることにより合成することできる。
反応１９においてはIXは、例えばＭｉｔｚｕｎｏｂｕ反応の条件下Ｒ^dＮＨＳＯ₂Ａｒと反応させてXIIを得、次いでＪ．Ｒ．Ｈｅｎｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３０：５７０９−５７１２，１９８９に記載されているのと同様の反応２０によりIVに変換させる。
多数の他のよく知られている合成法が適用できる。例えば対応エステルの加水分解により酸を形成することができる。アミン誘導体は１級、２級もしくは３級アミンのアルキル化により形成することができる。多数の二重結合含有化合物は水素化により対応する単結合を形成することができる。
本発明の化合物はまた、上記で概要を述べた古典的化合物溶液を固相合成技術に適用することにより調製することもできる。例えばＲ¹³、Ｒ¹⁵、Ｒ¹⁶、Ｒ¹⁷およびＲ²⁰は機能性樹脂を表わす水素以外の残基または機能性樹脂に結合した好適に選択されたリンカーであることができる。リンカーおよびＲ⁵で表わされる官能基は上述の反応で使用される条件下で安定でなければいけない。Ｒ¹³、Ｒ¹⁵、Ｒ¹⁶、Ｒ¹⁷およびＲ²⁰が水素である本発明の化合物は次いで樹脂もしくはリンカーから切り離され、完全な形の分子の残部を残すのである。例えばロボット合成機を用いたペプチド［オリゴ（Ｎ−置換グリシン）］の固相合成がＺｕｃｋｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１４，０６４６−１０６４７（１９９２）ａｎｄ Ｓｐｅｌｌｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ ９５／０４０７２によって記載されている。同様の条件下で、Ｒｉｎｋアミドポリスチレン樹脂をブロム酢酸を用いＮ，Ｎ′−ジイソプロピルカルボジイミドの存在下アシル化反応させ、次いでこのブロミンを反応１および反応２のアミン成分を用いて分離し、この分離によりＮ−置換グリシンアミド（Ｒ¹³およびＲ¹⁴は水素）を提供することができる。
いくつかの場合には、上記の化学反応は改変しなければならない。例えば保護基を用いて、置換基として異項環に導入されたり結合された反応性基による副反応を回避する。ここで記載された反応、エステルの加水分解アミンのアルキル化もしくは水素化反応を用いて次のような本発明の化合物が合成される。

ここに記載されている化合物の多数の塩形態が本発明において使用又は本発明化合物の合成の途中に利用し得るし、好適である。一つの異性体が他のものより活性であるときには立体異性体が使用できる場合もある。このような場合、特定の異性体を単離することが好ましい。本発明はもちろん特定の立体異性体およびラセミ混合物のいずれも用いることができる。ここに記載されているように、たとえば市販の光学的に純粋な出発原料〔もしくは鏡像異性体選択（enantioselective）反応を用いて作られた〕を用いて始める化学的方法も、光学的に純粋なタイプの本発明の化合物を合成するために用いることができる。このような光学的に純粋な化合物も本発明の範囲内にあるものである。鏡像異性体過剰率（Enantiometric excess（ｅｅ））は結晶化もしくはキラール支持体上のクロマトグラフィーのような精製技術によって増強することができる。鏡像異性体過剰率はＮＭＲ、光旋光および適当なクロマトグラフィーを含む多くの分析技術により測定することができる。
更に追加的な関連した化合物が、本件の親出願と同時に出願された米国特許出願中に記載されており、この特許出願としては米国特許出願第０８／６５６，０６３号（Ｄｏｃｋｅｔ Ｎｏ．３１７７４３−１０３，Ｏｇｎｙａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．）、米国特許出願第０８／６５５，９１２号（Ｄｏｃｋｅｔ Ｎｏ．３１７７４３−１０６，Ｏｇｎｙａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．）、米国特許出願第０８／８０７，７５４号（神経症および神経心理学的傷害の治療のための薬剤、Ｄｏｃｋｅｔ Ｎｏ．３１７７４３−１０３Ａ，Ｏｇｎｙａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．）および米国特許出願第０８／８０７，６８２号（神経症および神経心理学的傷害の治療のための薬剤、Ｄｏｃｋｅｔ Ｎｏ．３１７７４３−１０６Ａ，Ｏｇｎｙａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．）である。また本発明の親出願たる米国特許出願第０８／６５５，８４７号（Ｄｏｃｋｅｔ Ｎｏ．３１７７４３−１０７，Ｏｇｎｙａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．）および米国特許出願第０８／８０７，６８１号（Ｄｏｃｋｅｔ Ｎｏ．３１７７４３−１０７Ａ，Ｏｇｎｙａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．）も参考のために記載する。
本発明の化合物の成分の或る種の組合せは他のものに比べ安定性に欠けることに留意すべきである。たとえば環Ｄもしくは環Ｅが十分に飽和であるとき、安定性を保つために環構成異項原子のいずれの２つも通常少なくとも２個の環構成炭素原子で分離されているべきである。薬剤として有用なほどに十分な安定性を有する化合物は有用性の大きいものである。
好ましい実施態様では、環Ｄもしくは環Ｅは多くても１個のアリールもしくはヘテロアリールで置換されている。
グリシン運搬体遺伝子および各々の遺伝子生成物は、シナプス接続部からシナプス前部神経末端もしくはグリア細胞へのグリシンの再引上げを担っており、それによってグリシンの作用を終わらせているのである。不適当に調節されたグリシン受容体に付随している神経傷害もしくは症状、あるいはグリシン受容体活性を調節する治療剤で治療できるような傷害もしくは症状としては痙攣（Ｂｅｃｋｅｒ，ＦＡＳＥＢ Ｊｏｕｒｎａｌ，４，２７６７−２７７４（１９９０））および痛感認識（Ｙａｋｓｈ，Ｐａｉｎ，３７，１１１−１２３（１９８９））のようなものがある。更にグリシンはＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸エステル（ＮＭＤＡ）受容体において相互作用し、このものは学習および記憶障害および転換、アルツハイマー病およびその他の同族の病気および精神分裂病のようなある種の臨床症状に関係してきたのである。Ｒｉｓｏｎ ａｎｄ Ｓｔａｎｔｏｎ，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｂｉｏｂｅｈａｖ．Ｒｅｖ．，１９，５３３−５５２（１９９５）；Ｄａｎｙｓｚ ｅｔ ａｌ．，Ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，６，４５５−４７４（１９９５）を参照されたい。
Ｇｌｙ Ｔ−１に媒介されるグリシン運搬を抑制する化合物は他の領域の中で前頭部に位置するＮＭＤＡ受容体におけるグリシン濃度を増大させる。この濃度上昇はＮＭＤＡ受容体の活性を上昇させ、それによって精神分裂症を緩和し、認識機能を強めるのである。一方、ＮＭＤＡ受容体のグリシン受容体成分と直接作用する化合物は、Ｇｌｙ Ｔ−１活性の抑制もしくは増強によって生ずる細胞外グリシンの利用の増強もしくは減少すると同一もしくは同様の効果を有することができる。例えば、Ｐｉｔｋａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，２５３，１２５−１２９（１９９４）；Ｔｈｉｅｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，４６，５０１−５０９（１９９２）；およびＫｒｅｔｓｃｈｍｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１６，１５６１−１５６９（１９９６）を参照されたい。Ｇｌｙ Ｔ−２に媒介されるグリシン運搬を抑制する化合物は主に脳幹および脊髄索に位置する受容体におけるグリシン濃度を増大せしめ、グリシンはその位置でシナプス伝達の抑制剤として作用するのである。これらの化合物はてんかん、痛みおよび痙攣、筋痙攣および他のそのような症状に有効である。例えば、Ｂｅｃｋｅｒ，ＦＡＳＥＢ Ｊ．，４，２７６７−２７７４（１９９０）およびＹａｋｓｈ，Ｐａｉｎ，３７，１１１−１２３（１９８９）を参照されたい。
本発明の化合物は例えば経口で、舌下に、直腸に、経鼻に、膣内に、局所的に（パッチもしくは他の経皮輸送器を含めて）、エアロゾルを使用した経肺で、または例えば筋肉内、皮下、腹腔内、心房内、静脈内もしくはくも膜下といった非経口投与によって投与される。投与は周期的もしくは連続的輸送のためのポンプを使って行なうことができる。本発明の化合物は単独で投与してもよいし、製薬学的に許容し得る担体もしくは標準製剤プラスチックによる賦形剤と共に投与することもできる。投与が経口で行なわれる場合、本発明の化合物は錠剤、カプセル、ロゼンジ、チューイングガム、トローチ、粉末剤、シロップ剤、エリキシル剤、水性溶液および水性懸濁液等の形で使用される。錠剤の場合には使用される担体はラクトース、クエン酸ナトリウムおよびリン酸塩を包含する。でんぷんのような種々の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムおよびタルクのような潤滑剤が錠剤には普通使用される。カプセル形での経口投与のための有用な希釈剤はラクトースおよび高分子量ポリエチレングリコールである。所望であれば、ある程度の甘味剤及び／又は香味剤を添加する。非経口投与については本発明の化合物の滅菌溶液を通常調製し、これらの溶液のｐＨを好適なものに調整し、緩衝液とする。静脈内用については、溶質の総濃度を調整して生成物をアイソトニックなものとする。眼への投与用については、塗布器もしくは点眼瓶のようなよく知られている眼薬用輸送システムにより輸送できる軟膏剤や滴下し得る液体を加えることができる。このような生成物はヒアルロン酸、硫酸コンドロイチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロースもしくはポリビニルアルコールのような粘稠化剤、ソルビン剤、ＥＤＴＡもしくはベンジルクロミウムクロライドのような防腐剤および通常の量の希釈剤及び／又は担体を含有することができる。肺への投与については希釈剤および／又は担体をエアロゾールが生成できるように適当なものと選択する。
本発明の化合物の坐剤形態は、膣用、尿道用及び直腸用に有用である。このような坐剤は一般に室温で固体であるが体温では融ける物質の混合物から成っている。この物質は普通このような賦形剤をつくるために用いられるが、テオブロミン油、グリセリン化ゼラチン、水素化野菜油、種々の分子量のポリエチレングリコールおよびポリエチレングリコールの脂肪酸エステルの混合物のようなものが挙げられる。坐剤投与形態について、更に検討を要する場合はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ Ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９８０，ｐｐ．１５３０−１５３３を参照されたい。ゲルやクリームの類似体が膣用、尿道用および直腸投与用に用いることができる。
多くの投与のための賦形剤が当業者にとって自明であり、緩放出剤、リポソーム製剤およびポリマー基質等があるが、これらに限定されることはない。
本発明において使用される製薬学的に許容し得る酸付加塩の例としては塩化水素酸、臭化水素酸、リン酸、メタリン酸、硝酸および硫酸のような鉱酸、および酒石酸、酢酸、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、フマル酸、安息香酸、グリコール酸、グルコン酸、コハク酸、ｐ−トルエンスルホン酸およびアリールスルホン酸のような有機酸から誘導されるものを挙げることができる。本発明で使用される製薬学的に許容し得る塩基付加塩のナトリウムもしくはカルシウムのような非毒性金属からのもの、アンモニウム塩およびトリエチルアミン塩のような有機アミノ塩を挙げることができる。多くのこのような好適な塩が当業者には自明であろう。
医者や健康管理者は患者の体重、年齢および体調に応じて好適な剤、投与量および処置を選択できる。投与量は、本発明の化合物の血清における濃度を保持するように約０．０１μｇ／ｃｃから約１０００μｇ／ｃｃの間、特に約０．１μｇ／ｃｃから約１００μｇ／ｃｃの間で選択できる。非経口投与については、好ましくは約０．０１ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約０．１ｍｇ／ｋｇから約１ｍｇ／ｋｇの量が選ばれる。経口投与の場合、約０．１ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇの量が、より好ましくは約０．１ｍｇ／ｋｇから約１ｍｇ／ｋｇの量が投与される。坐剤の場合には好ましくは約０．１ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約０．１ｍｇ／ｋｇから約１ｍｇ／ｋｇの量が選ばれる。
グリシン輸送の抑制活性の測定のために、真核細胞、好ましくはウズラ線維芽細胞由来のＱＴ−６細胞に形質移入してヒトＧｌｙ−Ｔ １の３種の公知の変性体、即ちＧｌｙ−Ｔ １ａ、Ｇｌｙ−Ｔ １ｂもしくはＧｌｙ−Ｔ １ｃの内の１種またはヒトＧｌｙ−Ｔ ２を発現させる。これらＧｌｙ−Ｔ １運搬体の配列はＫｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｐｈａｒｍ．４５：６０８−６１７，１９９４に記載されているが、Ｇｌｙ−Ｔ １ａの極Ｎ末端をコードする配列は対応のラット由来配列から単に推測して記載されている。このＮ末端蛋白質をコードする配列はＫｉｍ等によって推測されたものに相当しているが現在は確認されている。ヒトＧｌｙ−Ｔ ２の配列は１９９６年８月２０日に出願されたＡｌｂｃｒｔ等の米国特許出願第０８／７００，０１３号に記載されている。好適な発現ベクターとしてはｐＲｃ／ＣＭＶ（ｌｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），Ｚａｐ ＥｘｐｒｅｓｓＶｅｃｔｏｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ；以下“Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ”と記載），ｐＢｋ／ＣＭＶもしくはｐＢｋ−ＲＳＶ ｖｅｃｔｏｒｓ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ），Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ II ＳＫ ＋／− Ｐｈａｇｅｍｉｄ Ｖｅｃｔｏｒｓ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ），ＬａｃＳｗｉｔｃｈ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ），ｐＭＡＭおよびｐＭＡＭ ｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）等がある。
好適な発現ベクターは、好適な宿主細胞、好ましくは真核細胞でも、真菌でも原核細胞でもようが非哺乳動物宿主中で含有されているＧｌｙ−Ｔ ＤＮＡの発現を促進できる。好ましい宿主細胞として、両生類、鳥類、真菌、昆虫および爬虫類の細胞が挙げられる。
上記のように本発明の化合物は多数の薬理学的作用を有している。該化合物の比較性は次のような方法を含む多数の方法で評価することができる：
・Ｇｌｙ−Ｔ １およびＧｌｙ−Ｔ ２運搬体により媒介される活性の比較。この試験は化合物を（ａ）Ｇｌｙ−Ｔ １運搬体に比べより活性で精神分裂症の治療もしくは予防、認識の増進および記憶の強化に有用であるもの、または（ｂ）Ｇｌｙ−Ｔ ２運搬体に比べより活性で痙攣、痛み、痙直もしくは筋痙攣の治療もしくは予防に有用であるものとして確定する。
・ＮＭＤＡ受容体結合のための試験。この試験はこの部位に十分な結合があるかどうか、アンタゴニスト活性かアゴニスト活性かを確定し、このような結合の薬剤学的効果の更なる試験へと進めるものである。
・原発性神経組織培養物中のカルシウム線密度（ｆｌｕｓ）の強化もしくは消滅における化合物の活性を試験。カルシウム線密度を増強すると試験化合物が（ａ）ＮＭＤＡ受容体においてアンタゴニスト活性を全くもしくは少ししか持たず、Ｇｌｙ−Ｔ １運搬体抑制を用いてのグリシン活性の増強には影響を与えないか、または（ｂ）比較のために用いられたＧｌｙ−Ｔ １抑制剤に対し顕著な増強が見られ、ＮＭＤＡ受容体との直接の相互作用がわずかしかないような場合にはこの化合物は受容体アゴニストである。上記のケースのいずれかである場合、この試験は精神分裂症の治療もしくは予防、認識の増強もしくは記憶の増強における活性を確認するものである。これと逆に、カルシウム線密度を減少させる試験化合物は、受容体アンタゴニスト活性が本化合物のもつどのような活性にも勝るような場合に、グリシン輸送を抑制することによるグリシン活性の増加に正味の効果を有するのである。このような場合、この試験は細胞損傷および卒中やその他の虚血性導入状況後に生じる細胞死を制限もしくは抑制したり、また神経変質症に付随する細胞損傷を制限もしくは抑制する活性を確定するものである。
ここに記載されている動物ための治療もしくは予防法は哺乳動物、特にヒトに適用するのが好ましい。
以下に示す実施例は本発明を更に説明するものであるが、本発明を限定するものでないことは勿論である。
実施例１ ３−ビス（４−フルオロフェニル）メトキシピペリジン−１−イル酢酸エチルエステル（化合物Ｃ ₅ ）
３−ビス（４−フルオロフェニル）メトキシピペリジン０．１７０ｇ（０．５ｍｍｏｌ）〔これは３−ジフェニルメトキシピペリジン合成のためにイー．ファルク，ピ．クログスガード−ラーセン（Ｅ．Ｆａｌｃｈ，Ｐ．Ｋｒｏｇｓｇａａｒｄ−Ｌｅｒｓｅｎ）のＥｕｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９１，２６，６９−７８に記載された合成スキムを用いて３−ヒドロキシピペリジンヒドロクロライド（アルドリッヒ）から三段階で調製された〕、エチルブロモ酢酸（アルドリッヒ）０．０９２ｇ（０．５５ｍｍｏｌ）及び炭酸カリウム０．２７６ｇ（２ｍｍｏｌ）のアセトニトリル１ｍｌ中の混合物をアルゴン雰囲気中で２０時間かき混ぜた。反応混合物を濾過し、溶媒を蒸発させ、残渣を３０％酢酸エチル含有ヘキサンを用い、薄層液体クロマトグラフ（ＴＬＣ）で精製し、油状の３−ビス（４−フルオロフェニル）メトキシピペリジン−１−イル酢酸エチルエステル（化合物Ｃ₅）０．１５０ｇ（収率７７％）を得た。生成物のＮＭＲスペクトルは以下の通りであった。
¹Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃，３００ ＭＨｚ）δ７．６０−７．３５（ｍ，４Ｈ），５．７２（ｓ，１Ｈ），４．３８（ｑ，２Ｈ），３．９０−３．６５（ｍ，１Ｈ），３．４２（ｂｒ．ｓ，２Ｈ），３．２５（ｄ，１Ｈ），２．９７（ｄ，１Ｈ），２．４２（ｄｔ，２Ｈ），２．１７（ｄ，１Ｈ），２．００−１．８０（ｍ，１Ｈ），１．７０（ｄｔ，１Ｈ），１．６０−１．５０（ｍ，１Ｈ），１．４６（ｔ，３Ｈ）；¹³Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃，７５ ＭＨｚ）δ１７０．１６，１６３．５２，１６０．２７，１３８．１４，１３８．１１，１２８．５０，１２８．４０，１１５．１３，１１４．８５，７９．３０，７２．４５，６０．２７，５９．３１，５７．８３，５２．８０，３０．０６，２３．１２，１４．０１。
実施例２ 反応１及び反応２による付加的な合成
反応１及び反応２を用いて次のような化合物が合成された。

アミン：１）４，４−ジフェニルピペリジン（Ｊ．Ｍ．Ｗｅｔｚｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３８：１５７９−１５８１，１９９５）；２）ｄ，ｄ−ジフェニル−４−ピペリジノメタノール（Ａｃｒｏｓ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）；３）２，２−ジフェニル−４Ａ，５，６，７，８，８Ａ−ヘキサヒドロ−４Ｈ−１，３−ジオキシノ〔５，４−ｂ〕ピリジン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｒａｒｅ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）；４）ペルヘキシンマレイン酸［２−（２，２−ジシクロヘキシルエチル）ピペリジン］（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）；５）３，３−ジフェニル−２−エチルピロリジン［３，３−ジフェニル−２−エチル−１−ピロリドン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｒａｒｅ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）のナトリウムボロハイドライドの還元により調製された］；６）２，２−ジフェニル−１，３−ジオキソラン−４−イルピペリジンヒドロクロライド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｒａｒｅ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）。
試薬：Ａ）エチルブロモ酢酸エステル（Ａｌｄｒｉｃｈ）；Ｂ）ベンジル２−ブロモ酢酸エステル（Ａｌｄｒｉｃｈ）。
溶媒：Ｘ）アセトニトリル。
実施例３ ３−ジフェニルメチル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン−１−イル酢酸エチルエステル（化合物Ｃ１）の合成
段階１：３−ジフェニルメチルピリジン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｒａｒｅ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）０．４９０ｇ（２ｍｍｏｌ）及びエチルブロモ酢酸エステル（Ａｌｄｒｉｃｈ）０．３３４ｇ（４ｍｍｏｌ）のアセトニトリル２ｍｌ中の混合物を還流化１時間加熱した。溶媒を蒸発し、残渣をジエチルエーテル中に懸濁し、濾過し、黄色粉末状の１−エトキシカルボニルメチル−３−ジフェニルメチルピリジニウムブロマイド０．８ｇを得た。
¹Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ₃ＯＤ，３００ ＭＨｚ）δ８．８７（ｄ，１Ｈ），８．７７（ｓ，１Ｈ），８．４２（ｄ，１Ｈ），８．１０（ｄｄ，１Ｈ），７．５０−７．１０（ｍ，１０Ｈ），５．９６（ｓ，１Ｈ），５．５５（ｓ，２Ｈ），４．２８（ｑ，２Ｈ），１．２９（ｔ，３Ｈ）。
段階２：１−エトキシカルボニルメチル−３−ジフェニルメチルピリジニウムブロマイド（段階１からのもの）０．２０６ｇ（０．５ｍｍｏｌ）の氷冷却された溶液にナトリウムボロハイドライド０．０３４ｇ（０．９２ｍｍｏｌ）を少しずつ撹拌しながら１時間以上で加えた。溶媒を蒸発し、残渣をジエチルエーテルに溶解し、水洗し、硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を蒸発した後、残渣を、３０％エチル酢酸エステル含有ヘキサンを用いてシリカゲルカラムクロマトグラフを行ない、薄黄色油状の３−ジフェニルメチル−１，２，３，６，−テトラヒドロピリジン−１−イル酢酸エチルエステル（化合物Ｃ１）０．１０７ｇ（６４％）を得た。ＮＭＲスペクトルは以下の通りであった。
¹Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃，３００ ＭＨｚ）δ７．４０−７．１０（ｍ，１０Ｈ），５．２２（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），４．６１（ｓ，１Ｈ），４．１２（ｑ，２Ｈ），３．２５（ｓ，２Ｈ），３．０３（ｓ，２Ｈ），２．６８（ｔ，２Ｈ），２．２２（ｂｒ．ｓ，２Ｈ），１．１９（ｔ，３Ｈ）；¹³Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃，７５ ＭＨｚ）δ１７０．２４，１４１．８６，１３７．８９，１２９．１１，１２８．１０，１２６．１９，１２３．２４，６０．３１，５８．７９，５６．２４，５５．１３，４９．５１，２５．６４，１４．０５．
Ｅｌ−ＭＳ：３３５（１０，Ｍ⁺，Ｃ₂₂Ｈ₂₅ＮＯ₂），２６２（５０）。
実施例４ 付加的合成
化合物Ｃ８を、実施例３の製造方法を用いて、４−ジフェニルメチルピリジンの相当する第４級塩のナトリウムボロハイドライド還元により２９％収率で調製した。
実施例５ 化合物Ｃ１の水素化による３−ジフェニルメチルピペリジン−１−イル酢酸エチルエステル（化合物Ｃ２）の調製
３−ジフェニルメチル−１，２，３，６，−テトラヒドロピリジン−１−イル酢酸エチルエステル（化合物Ｃ１）０．０４１ｇ（０．１２２ｍｍｏｌ）を室温で４０ｐｓｉ、６時間、４ｍｌのエタノール中１０％Ｐｄ／Ｃ ０．０４０ｇを用いて水素化した。混合物をセライトを通して触媒から分離し、溶媒を蒸発し、油状の３−ジフェニルメチルピリジン−１−イル酢酸エチルエステル（化合物Ｃ２）０．０３８ｇ（収率９３％）を得た。生成物のＮＭＲスペクトルは以下の通りであった。
¹Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃，３００ ＭＨｚ）δ７．４０−７．１０（ｍ，１０Ｈ），４．１１（ｑ，２Ｈ），３．５２（ｄ，１Ｈ），３．１０（ｓ，２Ｈ），２．８７（ｄ，１Ｈ），２．７２（ｄ，１Ｈ），２．６５−２．４０（ｍ，１Ｈ），２．２０−２．００（ｍ，１Ｈ），１．８７（ｔ，１Ｈ），１．７０−１．５０（ｍ，３Ｈ），１．１７（ｔ，３Ｈ），１．００−０．８（ｍ，１Ｈ）；¹³Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃，７５ ＭＨｚ）δ１６８．８９，１４２．１１，１４１．８１，１２６．９２，１２６．９０，１２６．３６，１２６．２８，１２４．５８，１２４．５０，５８．７８，５８．４７，５７．２９，５５．３４，５２．０５，３７．９７，２７．８６，２３．５８，１２．５７．
Ｅｌ−ＭＳ：３３７（５，Ｍ⁺，Ｃ₂₂Ｈ₂₇ＮＯ₂），２６４（７０）。
実施例６Ａ 付加的合成
化合物Ｃ７を実施例５の製造方法を用いて、化合物Ｃ８の水素化により調製した。
実施例６Ｂ 実施例６Ａの操作を用いる付加的合成
化合物Ｃ１３を、化合物Ｃ１４（実施例６Ａの製造方法を用いて調製された）を水素化し、ついでＨＣｌで酸性化して調製した。
実施例６Ｃ ２−（２，２−ジシクロヘキシルエチル）ピペリジン−１−イル酢酸塩酸塩（化合物Ｃ９）の合成
２−（２，２−ジシクロヘキシルエチル）ピペリジン−１−イル酢酸エチルエステル（化合物Ｃ１０）０．４１３ｇ（１．１３６ｍｍｏｌ）のメタノール溶液４ｍｌに１Ｎ水酸化ナトリウム８ｍｌを加え、混合物を１時間還流して加熱した。反応混合物を半分の容量まで濃縮し、４Ｎ塩酸水溶液で酸性化し、メチレンクロライドで４回抽出した。一緒にされた抽出物を乾燥し、蒸発して、２−（２，２−ジクロヘキシルエチル）ピペリジン−１−イル）酢酸塩酸塩（化合物Ｃ９）０．４００ｇ（収率９５％）を得た。
実施例６Ｄ 実施例６Ｃの操作を用いる付加的合成
化合物Ｃ１１を化合物Ｃ２の加水分解により調製し、ＨＣｌで酸性化した。
化合物Ｃ１２を化合物Ｃ１の加水分解により調製し、ＨＣｌで酸性化した。
実施例７ Ｇｌｙ Ｔ−１及びＧｌｙ Ｔ−２を発現する細胞の調製
この実施例はＱＴ−６細胞の増殖及び形質移入のために用いられる方法及び物質を明らかにする。
ＱＴ−６細胞はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＴＣＣ（ＲＬ＝１７０８））から入手した。
ＱＴ−６の増殖用完全ＱＴ−６培地は１０％燐酸トリプトース、５％牛胎児血清（Ｓｉｇｍａ）；１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ）及び１％無菌ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ；Ｓｉｇｍａ）となるように添加された培地１９９（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ；以下“Ｓｉｇｍａ”）である。ＱＴ−６細胞の増殖及び形質移入するために必要な溶液は次のものを含有した：
ＤＮＡ／ＤＥＡＥ混合物：ＴＢＳ４５０μｌ、ＤＥＡＥデキストラン（Ｓｉｇｍａ）４５０μｌ及びＴＥ中のＤＮＡ（４μｇ）１００μｌ、該ＤＮＡは好適な発現ベクター中にＧｌｙ Ｔ−１ａ、Ｇｌｙ Ｔ−１ｂ、Ｇｌｙ Ｔ−１ｃ又はＧｌｙ Ｔ−２を含有している。使用されたＤＮＡは以下に定義されるものであった。
ＰＢＳ：０．２μのフィルターを通して滅菌された１ｍＭ ＣａＣｌ₂及び１ｍＭ ＭｇＣｌ₂を含有する標準燐酸塩緩衝食塩水溶液。
ＴＢＳ：フィルター滅菌され、４℃で保存された、溶液Ｂ １ｍｌ、溶液Ａ １０ｍｌを蒸留水で１００ｍｌとした溶液。
ＴＥ：ｐＨ８．０の０．０１Ｍトリス、０．００１Ｍ ＥＤＴＡ。
ＤＥＡＥデキストラン：Ｓｉｇｍａ、＃Ｄ−９８８５、貯蔵液はＴＢＳ中にＤＥＡＥ０．１％（１ｍｇ／ｍｌ）からなるように調製された。該貯蔵液はフィルター滅菌され、１ｍｌ標本として凍結された。
クロロキン：Ｓｉｇｍａ、＃Ｃ−６６２８、貯蔵液は水中にクロロキン１００ｍＭからなるように調製された。該貯蔵液はフィルター滅菌され、０．５ｍｌ標本中に貯蔵され、凍結された。
溶液Ａ（１０Ｘ）
ＮａＣｌ ８．００ｇ
ＫＣｌ ０．３８ｇ
トリス塩基 ３．００ｇ
Ｎａ₂ＨＰＯ₄ ０．２０ｇ
該溶液はＨＣｌでｐＨ７．５に調節され、蒸留水で１００．０ｍｌとされ、フィルター滅菌され、そして室温で貯蔵された。
溶液Ｂ（１００Ｘ）
ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ １．５ｇ
ＭｇＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ １．０ｇ
該溶液は蒸留水で１００．０ｍｌとされ、フィルター滅菌された；ついで該溶液は室温で貯蔵された。
ＨＢＳＳ：１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ ＣａＣｌ₂、１０ｍＭ グルコース、５ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ₂・Ｈ₂Ｏを含有し、ＮａＯＨでｐＨ７．４に調節されたもの。
用いられた標準増殖及び継代操作は次の通りであった。細胞は２２５ｍｌフラスコ中で増殖された。継代のために、細胞は温ＨＢＳＳで３回洗浄された（５ｍｌで各々洗浄）。０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡ ２ｍｌ溶液を加え、該培養物は渦巻き撹拌され、ついで該トリプシン／ＥＤＴＡ溶液は急激に吸引された。該培養液はついで２分間（細胞が離昇するまで）インキュベートされ、ついでＱＴ−６培地１０ｍｌが加えられ、そして、該培養液はフラスコを渦巻き撹拌し、その底を軽くたたいてさらに移動させる。該細胞を取り出し、１５ｍｌの円錐チューブに移し、１０分間１０００×ｇで遠心分離し、ＱＴ−６培地１０ｍｌ中に懸濁した。試料を計測のため除去し、該細胞液をＱＴ−６培地を用いて１×１０⁵セル／ｍｌの濃度に希釈し、継代細胞の２２５ｍｌフラスコ当りに６５ｍｌの培養液を加えた。
形質移入は次のようにして行なわれた。
用いられたラットＧｌｙ Ｔ−２（γＧｌｙ Ｔ−２）クローンは、Ｌｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，２２８０２−２２８０８（１９９３）に記載されているように、ＥｃｏＲｌ−ＨｉｎｄIIIフラグメントとしてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ＋（ｓｔｒａｔａｇｅｎ）中にクローンされたＧｌｙ Ｔ−２の全配列を含む。ついでＧｌｙ Ｔ−２は次のように、ｐＲｃ／ＲＳＶベクター中にサブクローンされる；該γＧｌｙ Ｔ−２配列のヌクレオチド２０８から７０２に相当するＰＣＲフラグメントは、５′プライマーとしてのオリゴヌクレオチド：５′ＧＧＧＧＧＡＡＧＣＴＴＡＴＧＧＡＴＴＧＣＡＧＴＧＣＴＣＣ３′及び３′プライマーとしてのオリゴヌクレオチド：５′ＧＧＧＧＧＧＧＴＡＣＣＣＡＡＣＡＣＣＡＣＴＧＴＧＣＴＣＴＧ３′を用いてＰＣＲによって増幅された。これによって翻訳開始部位の直ぐ上流にＨｉｎｄIII部位を創った。３′末端にＫｐｎ１部位を含有する該フラグメント、およびＧｌｙ Ｔ−２のコードする配列の残部を含有するＫｐｎ１−ＰｖｕIIフラグメントは、３つの部位を連結して、ＨｉｎｄIII及びＳｍａ１を用いて予め切断したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ＋中にクローン化された。このクローンから得られたＨｉｎｄIII−Ｘｂａ１フラグメントを次いでｐＲｃ／ＲＳＶベクター中にサブクローン化した。この結果得られた構造はγＧｌｙ Ｔ−２核酸の２０８から２７２０のヌクレオチドをｐＲｃ／ＲＳＶ発現ベクター中に含有するものであった。
用いられたヒトＧｌｙ Ｔ−１ａ（ｈＧｌｙ Ｔ−１ａ）クローンは、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，４５，６０８−６１７，１９９４に記載されたＨｉｎｄIII−ＸｂａｌフラグメントとしてｐＲｃ／ＣＭＶベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）中にクローン化されたヌクレオチド１８３から２１０８位のｈＧｌｙ Ｔ−１ａの配列を含有する。このＧｌｙ Ｔ−１ａをコードするｃＤＮＡはラットからのＧｌｙ Ｔ−１ａ配列の最初の１７ヌクレオチド（最初の６アミノ酸に相当する）を含有した。ヒトＧｌｙ Ｔ−１ａの配列がこの領域で相違するかどうかを決定するために、ヌクレオチド１から２１２までのｈＧｌｙ Ｔ−１ａの５′の領域をＧｉｂｃｏ ＢＲＬ（Gaitherberg，MD）から供給された５′ＲＡＣＥシステムを用いるｃＤＮＡ末端の急速な増幅により得た。遺伝子特定プライマー：ｈＧｌｙ Ｔ−１ａ配列のヌクレオチド５５８から５３９に相当する５′ＣＣＡＣＡＴＴＧＴＡＧＴＡＧＡＴＧＣＣＧ３′はヒトの脳ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ合成を活性化するために用いられた。遺伝子特定プライマー：ｈＧｌｙ Ｔ−１ａ配列のヌクレオチド４５４から４３１に相当する５′ＧＣＡＡＡＣＴＧＧＣＣＧＡＡＧＧＡＧＡＧＣＴＣＣ３′がＰＣＲ増幅用に用いられた。Ｇｌｙ Ｔ−１ａの５′領域の配列決定によりコードする配列の１７ヌクレオチドがヒト及びラットＧｌｙ Ｔ−１ａとにおいて同一であることが確認された。
用いられたヒトＧｌｙ Ｔ−１ｂ（ｈＧｌｙ Ｔ−１ｂ）クローンは、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，４５，６０８−６１７，１９９４に記載のように、ＨｉｎｄIII−ＸｂａｌフラグメントとしてｐＲｃ／ＣＭＶベクター中でクローン化されたヌクレオチド部位２１３から２２７４からのｈＧｌｙ Ｔ−１ｂの配列を含有する。
用いられたヒトＧｌｙ Ｔ−１ｃ（ｈＧｌｙ Ｔ−１ｃ）は、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，４５，６０８−６１７，１９９４に記載されているＨｉｎｄIII−ＸｂａｌフラグメントとしてｐＲｃ／ＣＭＶベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローンされたヌクレオチド部位２１３から２３３６からのｈＧｌｙ Ｔ−１ｃの配列を含有する。ＨｉｎｄIII−ＸｂａフラグメントはついでｐＲｃ／ＲＳＶベクター中にサブクローンされた。形質移入実験はｐＲｃ／ＲＳＶ及びｐＲｃ／ＣＭＶ発現ベクターの両者中でＧｌｙ Ｔ−１ｃを用いて行なわれた。
形質移入のため次の４日間方式の操作が用いられた。
第１日目、ＱＴ−６細胞を、１００ｍｍの皿に入れられた完全ＱＴ−６培地１０ｍｌ中に１×１０⁶細胞の密度で加えた（plate）された。
第２日目、該培地を吸引し、該細胞をＰＢＳ １０ｍｌ、ついでＴＢＳ １０ｍｌで洗浄した。該ＴＢＳを吸引し、ついでＤＥＡＥ／ＤＮＡ混合物の１ｍｌを該プレートに加えた。該プレートをフード中で５分毎に渦巻き撹拌した。３０分後、８０μＭクロロキン８ｍｌをＱＴ−６培地中に加え、該培養物を３７℃、５％ＣＯ₂中で２．５時間インキュベートした。ついで該培地を吸引し、該細胞を完全ＱＴ−６培地を用いて２回洗浄し、ついで完全ＱＴ−６培地１００ｍｌを加え、該細胞をインキュベーターにもどした。
第３日目、該細胞を上記したようにしてトリプシン／ＥＤＴＡと共に除去し、ほぼ２×１０⁵細胞／ウェルで９６−ウェルアッセイプレートのウェル中に加えた。
第４日目、グリシン運搬は実施例８に記載のようにしてアッセイされた。
実施例８ Ｇｌｙ Ｔ−１又はＧｌｙ Ｔ−２運搬体を経由する運搬アッセイ
この実施例は形質移入された培養細胞により取り込まれたグリシンの測定方法を説明する。
実施例７により増殖された一過性Ｇｌｙ Ｔ−形質移入された細胞をＨＥＰＥＳ緩衝食塩水（ＨＢＳ）で３回洗浄した。ついで該細胞を３７℃で１０分間インキュベートし、その後、５０ｍＭ［³Ｈ］グリシン（１７．５Ｃｉ／ｍｍｏｌ）及び（ａ）潜在的に競合体のないもの、（ｂ）１０ｍＭ非放射性グリシン又は（ｃ）候補となっている薬の濃度のいずれかを含有する溶液が加えられた。候補となっている薬の濃度範囲は、その効果の５０％（例えばＩＣ₅₀Ｓ、これはグリシンの取り込みを５０％抑制する薬の濃度である）になる濃度を計算するためのデータを作るのに用いられた。該細胞はついで３７℃で更に１０分インキュベートし、その後、該細胞を吸引し、氷−冷却ＨＢＳで３回洗浄した。該細胞を採取し、シンチラント（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｎｔ）を該細胞に加え、該細胞を３０分間振盪し、該細胞の放射能をシンチレーションカウンターを用いて測定した。行なわれたアッセイにより、候補となる薬と接触したか又は接触していない細胞間、及びＧｌｙ Ｔ−２活性を有する細胞に対するＧｌｙ Ｔ−１活性を有する細胞間でのデータを比較した。
実施例９ ＮＭＤＡ受容体への結合のアッセイ
この実施例はＮＭＤＡ受容体上のグリシン部位を有する化合物の相互作用を測定するための結合アッセイを説明する。
ＮＭＤＡ−グリシン部位への［³Ｈ］グリシンの直接結合がＧｒｉｍｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，４１，９２３−９３０（１９９２）；Ｙｏｎｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，６２，１０２−１１２（１９９４）の方法により行なわれた。
結合テストのための膜の調製は一連の標準方法の適用を必要とした。特に記載しない限り、組織及びホモジネートは氷上に保存し、遠心分離は４℃で行なわれた。均質化（ホモジネーション）は組織／ホモジネート温度の上昇が最小で済むように行なわれた。該膜の調製は次の工程を含有する。
１．４匹のラットを殺し、断頭、皮質（ｃｏｒｔｉｃｅｓ）及び海馬（ｈｉｐｐｏａｍｐｉ）を除去する。
２．２０ストロークのグラス／テフロンホモジナイザーを用いて０．３２Ｍシュークロース／５ｍＭトリスアセテート（ｐＨ７．４）の２０容量部中で組織を均質化する。
３．１０００×ｇで１０分間組織を遠心分離し、上清液を蓄える。少量の緩衝液中にペレットを再懸濁し、再び均質化する。均質化したペレットを遠心分離し、上清液を前の上清液と一緒にする。
４．一緒にされた上清液を４０，０００×ｇで３０分遠心分離し、上清液を捨てる。
５．５ｍＭトリスアセテート（ｐＨ７．４）２０容量中で該ペレットを再懸濁し、該懸濁液を１時間氷上でかきまぜ、４０，０００×ｇで３０分、該懸濁液を遠心分離する。該上清液を捨て、該ペレットを少なくとも２４時間凍結する。
６．蛋白質濃度１ｍｇ／ｍｌに対して０．１％サポニン（ｗ／ｒ；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）を含有するトリスアセテート緩衝液中に上記工程５からのペレットを再懸濁する。２０分間氷上に置く。該懸濁液を４０，０００×ｇで３０分間遠心分離し、サポニンを含有しない緩衝液中に該ペレットを再懸濁し、再び遠心分離する。１０ｍｇ／ｍｌの濃度で該ペレットをトリスアセテート緩衝液中に再懸濁し、一定量の標本中で凍結する。
７．３日目に、膜の標本を取り出し、氷上で解かす。該懸濁液をトリスアセテート緩衝液１０ｍｌ中で希釈し、４０，０００×ｇで３０分間遠心分離する。この洗浄工程を更に２回繰り返し、全体で３回洗浄を行なう。最終のペレットをグリシンのないトリスアセテート緩衝液中に１ｍｇ／ｍｌの濃度で再懸濁する。
該結合テストは０．５ｍｌの容量中に膜蛋白質１５０μｇ及び５０ｍＭ［³Ｈ］グリシンを含有するエッペンドルフチューブ中で行なわれた。非特定結合が１ｍＭグリシンを用いて測定された。薬剤類はアッセイ緩衝液（５ｍＭトリスアセテート、ｐＨ７．４）又はＤＭＳＯ（最終濃度０．１％）中に溶解された。膜は氷上で３０分間インキュベートされ、結合放射リガンドがＷｈａｔｍａｎＧＦ／Ｂガラス繊維フィルターでの濾過或いは遠心分離（１８，０００×ｇ、２０分）により遊離の放射リガンドより分離された。濾過物或いはペレットは氷冷却５ｍＭトリスアセテート緩衝液で素早く３回洗浄された。フィルターを乾燥し、シンチレーションチューブ中に置き、そして計量した。ペレットをデオキシコレート／ＮａＯＨ（０．１Ｎ）中に一晩溶解し、中和し、放射活性がシンチレーションチューブで測定された。
ＮＭＤＡ−グリシン部位の第２の結合テストは［³Ｈ］ジクロロキヌレン酸（ＤＣＫＡ）を用い、膜は上記のように調製した。Ｙｏｎｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，６０，６３４−６４５（１９９３）参照。結合アッセイは、［³Ｈ］ＤＣＫＡをグリシン部位のラベルとして用いる以外は、上記［³Ｈ］グリシン用に記載されているように行なわれた。［³Ｈ］ＤＣＫＡの最終濃度は１０ｎＭであり、該アッセイは氷上で１０分間行なわれた。
ＮＭＤＡ−グリシン部位用に用いられた第３の結合テストは、［³Ｈ］ＭＫ−８０１（ｄｉｚｏｃｉｌｐｉｎｅ）の結合を測定することによるこの部位に対するリガンドの親和力の間接的評価を用いた。Ｐａｌｍｅｒ及びＢｕｒｎｏ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，６２，１８９−１９６（１９９４）参照。テスト用膜の調製は上記と同様であった。該結合アッセイはアンタゴニストとアゴニストのそれぞれを別個に検出可能とした。
第３の結合テストは次のようにしてアンタゴニストを同定するために操作された。膜１００μｇをグルタメート（１０μＭ）及びグリシン（２００ｎＭ）およびテストされるべき種々の濃度のリガンドと共に９６−ウェルプレートのウェルに加えた。該アッセイは５ｎＭ［³Ｈ］ＭＫ−８０１（２３．９Ｃｉ／ｍｍｏｌ）の添加により開始され、それがＮＭＤＡ受容体と結合するイオンチャンネルに結合する。該アッセイの最終容量は２００μｌであった。該アッセイは室温で１時間行なわれた。結合放射活性はＴＯＭＴＥＣコンバイン（harvester）を用いて濾過により遊離のものから分離された。アンタゴニスト活性はテストされるリガンドの濃度を増加させた際のＮＭＤＡと結合している放射活性の減少により表示された。
第３の結合テストは、グリシンの濃度が２００ｎＭである以外は上記と同様のテストを行なうことにより、アゴニストの同定を行なうために操作された。
アゴニストの活性はテストされるリガンドの濃度を増加させた際のＮＭＤＡ受容体と結合した放射活性の増加により表示された。
実施例１０ カルシウム束密度（Calcium Flux）のアッセイ
この実施例は原発性神経細胞におけるカルシウム束密度を測定するためのプロトコールを説明する。
該カルシウム束密度は原発性神経細胞培養物中で行なわれ、それは無菌の解剖器具、マイクロスコープ及び特定の培地を必要とする標準操作及び技術を用いて妊娠したラットから切り出したラットの胎児の皮質から調製される。用いられた該プロトコールはLu et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，88，6289−6292（1991）を改変して用いた。定義された培地は次の調製法に基いてあらかじめ調製される。

解剖を開始する前に、組織培養物はポリリシンで処理され（１００μg/ml、３７℃で少なくとも３０分間）、蒸留水で洗浄された。又、無菌の簡単な解剖器具（はさみ及びピンセット）２セット及び数セットの精巧な解剖器具を含む金属トレイを高圧滅菌した。一対のはさみ及びピンセットを７０％アルコールの入った無菌ビーカー中に入れ、解剖テーブルに持ち込んだ。冷却燐酸塩緩衝食塩液（ＰＢＳ）の入ったペトリ皿を解剖の行われる場所に、次いで氷上に置いた。
妊娠したラット（Hilltop Lab Animals（Scottdale,PA））から到着したＥ１５又は１６、解剖におけるＥ１７又は１８）が気絶するまでＣＯ₂／ドライアイス室に置かれた。該ラットを取り出し、裏返して（backing）ピン留めし、解剖領域を７０％アルコール含有綿棒でふき、皮膚を切り出し、その領域から取り出した。第２の一対のはさみで切り開き、それらの嚢（sac）中の胎児を取り出した。嚢のひもを冷却ＰＢＳ中に置き、無菌のフードに運んだ。
胎児を該嚢から取り出し、その首を切断した。頭蓋骨を次いで除去し、脳を注意深く移動し、冷却ＰＢＳを入れてある汚れていないペトリ皿中に入れた。この時点では解剖マイクロスコープで操作を進めることが必要であった。該脳は皮質が該プレートと接触するように回転され、解剖器具と皮質（線条及び他の脳部分）との間の組織がすくい出された。海馬及び嗅球が該皮質から切り落とされた。次いで該組織はひっくり返され、髄膜が鉗子で取り除かれた。残った組織（皮質）を前記特定の培養液の入ったペトリ皿に置いた。
該組織は外科用メスで切られ、次いで磨かれたガラスピペットですりつぶされた。切断されすりつぶされた組織は次いで滅菌されたプラスチックチューブに移され、細い開口を有するガラスピペットでのすりつぶしが続けられた。細胞が適当な計数室中で計測された。細胞は、９６ウェル プレートでは１００μｌの特定培地中におおよそ４０，０００細胞／ウェルの割合で、２４ウェル プレートでは５００μｌの特定培地中におおよそ２００，０００細胞／ウェルの割合で、１２ウェル プレートでは１ｍｌの特定培地中におおよそ４００，０００細胞／ウェルの割合で、１．５ｍｌ中に１．５×１０⁸細胞／３５ｍｍディッシュの割合、１０ｍｌ中に１０×１０⁸細胞／１００ｍｍディッシュの割合で加えられた。グリア増殖を抑制するために、培養物を１００μＭの５−フルオロ−２−デオキシウリジン（ＦＤＵＲ，Ｓｉｇｍａ（Ｆ−０５０３））もしくは５０／μＭウリジン（Ｓｉｇｍａ（Ｕ−３００３））および５０μＭのＦＤＵＲで処理した。
標準カルシウム束密度測定のための皮質培養物を上記特定の培地中の２４ウェルプレートで７日間増殖させ、途中で１回該培地の半分を交換することにより培地（１０％熱不活性化牛胎児血清、０．６％グルコースのＭＥＭ溶液）を含有する血清を供給した。培養物はインビトロでの１２日間のインキュベーション後に使用した。この培養物をＨＣＳＳ（即ち、ＨＥＰＥＳ緩衝調節塩溶液で、１２０ｍＭのＮａＣｌ、５．４ｍＭのＫＣｌ、１．８ｍＭのＣａＣｌ₂、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、および１５ｍＭのグルコースをＨＰＬＣ水中に入れ、同様にＨＰＬＣ水中で作られたＮａＯＨでｐＨ７．４に調整）で３回洗浄した。第３回目の洗浄において、培養物を３７℃で２０〜３０分間インキュベートした。
⁴⁵Ｃａ⁺⁺含有溶液（５０００ｄｐｍ／ｍｌ）およびテストもしくは調節のための薬剤をＨＣＳＳ中で調製した。上記⁴⁵Ｃａ⁺⁺溶液を添加する直前に、培養物をＨＣＳＳで２回洗浄し、次いで１ウェルにつき２５０μｌの⁴⁵Ｃａ⁺⁺溶液を１プレートにつき同時に加えた。この培養液を１０分間室温でインキュベートし、ＨＣＳＳで３回洗浄し、次いで１ウェルにつき１ｍｌのシンチレーション液を添加し、次いで少なくとも１５分間の振盪を行なった。残っている放射活性をシンチレーションカウンターでカウントした。
この発明は好ましい実施態様について特に述べているが、ここで具体的に述べられていないが当業者にとって自明の他の種々の好ましい態様も当然使用し得るものである。従って、本発明は次に示す特許請求の範囲及びその思想の範囲内に包含される全ての改変を包含するものである。

Claims (6)

1. 以下に示すＣ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ５、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、及びＣ１５の化合物またはそれらの薬学的に許容し得る塩。
   

   
2. 以下に示すＣ４、Ｃ６、Ｃ１３及びＣ１４の化合物またはそれらの薬学的に許容し得る塩。
   

   
3. 下記化合物（１），（２），（３），（４），（５），（６），（７），（８）または（９）を
   求核置換解離基Ｌを有するＬＣＨ₂ＣＯＯＲ
   式中のＲは芳香族基で置換し得るアルキル基である
   と反応させるものである化合物Ｃ５，Ｃ３，Ｃ４，Ｃ６，Ｃ１０，Ｃ１４，Ｃ１５，Ｃ１またはＣ８の製造方法。
   

   

   
4. 化合物Ｃ１またはＣ８を水素化するものである化合物Ｃ２またはＣ７の製造方法。
   

   
5. 化合物Ｃ１４を水素化するものである化合物Ｃ１３の製造方法。
   

   
6. 化合物Ｃ１０，Ｃ２またはＣ１を加水分解するものである化合物Ｃ９，Ｃ１１またはＣ１２の製造方法。
   

   

Images