JP4399042B2 - 生物学的に許容される低分子量ポリエチレンイミン - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は,低分子量ポリエチレンイミン,細胞へ核酸を挿入ための低分子量ポリエチレンイミンを含むベクター,ならびにこの低分子量ポリエチレンイミンおよびこのベクターの調製と使用に関するものである。
【0002】
【従来の技術】
従来、 in vivo における治療目的のDNA投与は,ヒトの臨床研究ではなんら有意に実を結ぶ治療結果には至らなかった。その理由は,特に、低い遺伝子伝達(transfer)効率,遺伝子情報の制約された発現 [Cottonら,Meth. Enzymol. 217: 618-644 (1993)] ,および採用されるカチオン担体材料の不十分な生物学的適合性(biocompatibility) [Choksakulnimitr ら,J. Control. Rel. 34: 233-241 (1995) ]に見いだされる。レトロウイルス[Miller, Nature 357: 455-460 (1992)] またはアデノウイルス [Mulligan, Science 260: 926-932 (1993)]等のウイルスベクターは in vitro では極めて見込のある結果を与えたが,これらの炎症性,免疫原的性質,ならびに突然変異誘発および細胞ゲノム中への組み込みの危険性が特に原因してこれらの in vitoにおける使用は制限された[Crystal, Science 270: 404-410 (1995)]。ウイルス系よりも取り扱いが簡単であるのみならず、細胞へDNAを確実に効率よく集中させることが可能な非ウイルスベクターにより,可能性のある代替物が提供された[Tomlinson および Rolland, J. Contr. Rel. 39: 357-372 (1996) ]。
【0003】
時が経つにつれて古典的形態のトランスフエクションの代替物として,ポリ−L−リシン(PLL)[Wu および Wu, Biotherapy 3: 87-95 (1991)],DEAE- デキストラン[Gopal, Mol, Cell, Biol. 5: 1183-93 (1985) ],デンドリマー(dendrimers)[Haenslerおよび Szoka, Bioconjugate Chem. 4:372-379(1993)]またはカチオン性メタクリル酸誘導体[Wolfert ら,Hum. Gene Ther. 7: 2123-2133 (1996) ]等の水溶性カチオンポリマーに準拠する合成ベクター,すなわちカチオン脂質を用いる”リポフエクション(lipofection )”[Gao および Huang, Gene therapy 2: 710-722 (1995)]および両親媒性物質 [Behr, Bioconjugate Chem. 5: 382-389 (1994)]が開発された。カチオンポリマーを用いる”ポリフエクション(polyfection )”の決定的有利性は,ポリマーの物理化学的および生物学的特性に影響し得る構造的変形の可能性が無限にあることであり,かつ好ましい態様におけるこれらのプラスミド/ポリマー複合体にある。実質的に、トランスフエリン[Wagnerら, Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 3410-3414 (1990)],アシアログリコタンパク[Wu および Wu, J. Bio. Chem. 262: 4429-4432 (1987) ],および各種抗体[Trubetskoyら,Bioconjugate Chem. 3: 323-327 (1992)]および炭水化物[Midouxら,Nucleic Acid Research 21: 871-878 (1993)]等の細胞特異的リガンドを追加的に結合することにより,これらベクターの効率を増加することができた。
【0004】
多数の異なった付着細胞および浮遊細胞ライン中では,3次元的分岐構造のカチオンポリマーであるポリエチレンイミン(PEI)は、ある場合には平均以上の大きさトランスフエクション率を引き起こす結果になった[Boussif ら, Gene Therapy 3: 1074-1080 (1996) ]。例えば,3T3繊維芽細胞の95%形質転換が in vitro で達成された。in vivo での遺伝子のマウス脳中へのPEI仲介伝達では,ニュ−ロンおよびグリア細胞中のリポーター遺伝子およびBcl2 遺伝子の長期発現が起きる結果になり,アデノウイルス遺伝子伝達の場合と同じ程度のものであった[Abdallahら,Hum. Gene Ther. 7 : 1947-1954 (1996)]。
【0005】
【発明が解決しようとする課題】
PLL[Zenke ら,Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 3655-3659 (1990)],メタクリレート誘導体[Cherngら,Pharm. Res. 13: 1038: 1042(1996)],またはDEAE−デキストラン[Gopal, Mol. Cell.Biol. 5: 1183-93 (1985)]等の文献で既知の他のポリカチオンとの比較で,ポリエチレンイミンはぬきん出た性質を有している。その架橋構造および高電荷密度の結果,プラスミドを高い程度で濃縮し(condense),複合体形成し得る。次いでDNAはこれら複合体の形態で細胞中に集中される。上記摂取に関与する機構,細胞内プロセシングおよびPEI/プラスミド複合体のリソトロピック活性(Iysotropic activity )はこれまでのところ最終的に解明されていない。
【0006】
PEIの決定的に有利な点は,その構造中のpH依存性電荷にあると考えられ,その結果としてエンドソーム/リソソーム区画の不安定化が起こり,これにより細胞質中への複合体の放出が容易になる。特に,異なったpKa値を有するこの分子のアミノ官能基が,際立った緩衝能力(”プロトンスポンジ”)を有するPEIに対して責任があり,この能力の結果としてエンドソームの酸性化に伴ってプロトン化(protonation )およびポリマーの結果的膨潤が起こり,これにより小胞膜の破壊が起きる。エンドソームATPaseにより仲介されるプロトン流入が,同時にアニオン塩化物の受動的流入の増加をもたらすと考えられ,PEIの存在下でこれが全イオン濃度の著しい増加と,エンドソームの結果的浸透性膨潤を引き起こすと思われる[Behr, Chimia 51: 34-36 (1997) ]。この理由で,例えばPLLをトランスフエクションするのに必須なクロロキン(chloroquine)等のリソソーム向性因子(lysosomotropic agent)はPEIがトランスフエクションされる率にはなんらの影響も与えない[Remy および Behr ,J. Lip. Res. 6: 535-544 (1996)]。
【0007】
細胞内へのDNAのトランスフエクションのための,分子量50kDaおよび800kDa(分子質量はそれぞれ50,000g/mol および800,000g/mol)の高分子量ポリエチレンイミンの使用はWO第 9602655号A1 公報に記載がある。
【0008】
メーカー(例えば Fluka, Neu Ulm )提供の情報によれば,市販のPEIの分子量は600−1000kDaである。かかる高分子量のPEI調製物(HMWPEI)は濃度0.01mg/ml以上,ならびに3時間の短時間保温後に著しい毒性を示す。加えて,このポリエチンイミン構造は酵素的にも加水分解的にも分解できず,結果として生物学的分解性がない。その上,HMW PEIは糞便または腎臓のいずれの経路でも排出できないと考えられる。
【0009】
結論として,例えば遺伝子治療の関連内ではこれまで使用されてきたHMW PEIの in-vivo での投与は実質的危険性を伴う。
【0010】
【課題を解決するための手段】
本発明は分子量50,000Da未満,好ましくは500Daから30,000Da(低分子量PEI:LMW PEI)のポリエチレンイミンに関し,このLMW PEIの調製方法(すなわちプロセス)に関し,および細胞へヌクレオチド配列を挿入するためにウイルスおよび非ウイルスヌクレオチド配列または核酸との複合体でのLMW PEIの使用に関し,疾病の予防または治療達成のための上記細胞の哺乳類への投与に関し,および疾病の予防または治療達成のためのLMW PEIのヌクレオチド配列との複合体での哺乳類への投与に関する。
【0011】
本発明は,低分子量ポリエチレンイミン(LMW PEI)および核酸(ヌクレオチド配列)を含むベクターに関し,この場合のLMW PEIは50,000Da未満の分子量を有する。特に本発明は,分子量50,000Da未満のポリチレンイミンおよび,好ましくは非ウイルスまたはウイルス性核酸構造物である核酸からなる複合体を含むベクタ−を用いて細胞へ核酸構造物(construct )を挿入するためのベクターに関する。
【0012】
好ましくは,このLMW PEIは500〜30,000Daの分子量を有する。本発明の好ましい実施態様では,このLMW PEIの分子量は1000から5000Daである。約2000Daの分子量が特に好ましい。
【0013】
本発明は,単量体エチレンイミンに関して好ましくは0.1%濃度から90%濃度および濃塩酸(37%濃度)に関して好ましくは0.1%濃度から10%濃度である水性溶液を用いて,水性溶液中の単量体エチレンイミンを塩酸を添加することにより重合させて調製した低分子量ポリチレンイミン(LMW PEI)と核酸とを含むベクターに関する。
【0014】
本発明は,pH4から10の異なったpH値の範囲における0.1Mリン酸緩衝液中で実施した膨潤の研究で濁りまたは沈殿を一切示さないLMW PEIを用いた,低分子量ポリエチレンイミンと核酸とを含むベクターに関する。
【0015】
本発明はこのベクターを用いた場合,1%を上回るトランスフエクション率,好ましくは5%またはそれ以上,および特別の態様では10%またはそれ以上のトランスフエクション率を達成する,低分子量ポリエチレンイミンと核酸とを含むベクターに関する。
【0016】
この核酸は例えばDNAまたはRNAであることができる。この核酸はオリゴヌクレオチドまたは核酸構造物であることができる。この核酸は好ましくはウイルスまたは非ウイルス核酸構造物である。この核酸構造物は遺伝子またはプラスミドであることが好ましい。この核酸構造物は導入遺伝子(transgene )を含んでもよい。この核酸構造物は一つまたは二つ以上のエフエクター遺伝子を含んでいてもよい。例えばエフエクター遺伝子は薬理学的活性化合物またはそのプロドラッグをコード,および/または酵素をコードできる。この核酸構造物は,その遺伝子(例えばエフェクター遺伝子または導入遺伝子)が具体的には例えば、ウイルス特異的に(すなわち例えばウイルス感染細胞においてのみ),具体的には代謝に関して(標的)細胞特異的に,具体的には発生(development )に関して細胞サイクル特異的,またはその他非特異的に発現されるように構成されるのが好ましい。最も単純な場合,この核酸は所望タンパクをコードする遺伝子,および特定プロモーター配列および,適切な場合,さらに調節配列を含む。例えばウイルスプロモーター配列および/またはエンハンサー配列は遺伝子発現を増加および/または延長の目的で存在できる。この種プロモーター配列および/またはエンハンサー配列については例えば Dillon, TiBTech 11, 167 (1993) 中に概説がある。これら配列の例は, Rous sarcoma ウイルスおよびレトロウイルスのLTR配列,CMVウイルスのプロモーターおよびエンハンサー領域,AAVウイルスのITR配列および/またはプロモーター配列p5,p19およびp40,アデノウイルスのITRおよび/またはプロモーター配列,ワクシニアウイルスのITRおよび/またはプロモーター配列,ヘルペスウイルスのITRおよび/またはプロモーター配列,パルボウイルスのプロモーター配列および乳頭腫ウイルスのプロモーター配列(上流調節領域)である。
【0017】
LMW PEIは二つの出発物質を混合することにより核酸と複合体を形成する。混合比を選択して中性またカチオン電荷を有する複合体とすることが好ましい。50%(重量%)を超えるLMW PEIを含む複合体からなるベクターとなるようにすることが好ましい。このベクターはLMW PEI対核酸が3:1またはそれを上回る,特に好ましくは5:1もしくはそれを上回るまたは8:1もしくはそれを上回る重量比を示すのが好ましい。
【0018】
このエフエクター遺伝子の配列以外にも,例えばもしこの核酸構造物がリガンドをコードする配列も含むと,融合タンパクとしてのリガンドと一緒にエフエクター遺伝子が発現され得る。
【0019】
極めて一般的態様では本発明は,LMW PEI,核酸および適切な場合にはリガンドを含むベクターに関する。このベクターの個々の成分は共有結合および/または吸着結合で連結されるのが好ましい。例えば,コードされたタンパクおよび/またはLMW PEIはリガンドに結合され得る。特に本発明は,低分子量ポリエチレンイミンが細胞特異的(または標的細胞特異的)リガンドに結合しているベクターに関する。
【0020】
このリガンドは細胞特異的または標的細胞特異的リガンドであることが好ましい。標的細胞特異的リガンドは標的細胞好ましくは動物またはヒト標的細胞の外膜に結合できる。標的細胞特異的リガンドは標的細胞に対する高い特異性を示す。標的細胞特異的リガンドを含むベクターは核酸の標的細胞特異的伝達(transfer)に使用できる。例えば標的細胞は,内皮細胞,筋細胞,マクロフアージ,リンパ球,グリア細胞,造血細胞,例えば白血病細胞等の腫瘍細胞,ウイルス感染細胞,気管支上皮細胞または肝細胞例えば肝臓のシヌソイド細胞であり得る。
【0021】
内皮細胞に特異的に結合するリガンドは,例えば内皮細胞に特異的なモノクローナル抗体もしくはそれらの断片,末端にマンノースを有する糖タンパク,糖脂質もしくは多糖類,サイトカイン,成長因子,接着分子(adhesion molecules)からなる群,または特に好ましい実施態様では内皮細胞に対して向性(tropism )を有するウイルスエンベロープ由来の糖タンパクからなる群から選択できる。平滑筋細胞に特異的に結合するリガンドは例えば,アクチンに特異的なモノクローナル抗体もしくはそれらの断片,細胞膜受容体および成長因子からなる群,または特に好ましい実施態様では平滑筋細胞に対して向性を有するウイルスエンベロープからの糖タンパクからなる群から選択できる。マクロフアージおよび/またはリンパ球に特異的に結合するリガンドは例えば,マクロフアージおよび/またはリンパ球上の膜抗原に特異的なモノクローナル抗体,マクロフアージおよび/またはリンパ球上の膜抗原に特異的なポリクローナルもしくはモノクローナル抗体の完全な(intact)免疫グロブリンもしくはFc断片,サイトカイン,成長因子,末端にマンノースを有するペプチド,タンパク,脂質もしくは多糖類からなる群,または特に好ましい実施態様ではウイルスのエンベロープ由来の糖タンパク,特にヌクレオチド位872中に変異があるインフルエンザCウイスHEFタンパクまたは触媒三つ組残基セリン71,ヒスチジン368もしくは369およびアスパラギン酸261を含むインフルエンザCウイルスHEF開裂産物からのグリコタンパクからなる群から選択できる。グリア細胞に特異的に結合するリガンドは例えば,グリア細胞の膜構造に特異的に結合する抗体および抗体断片,接着分子,末端にマンノースを有するペプチド,タンパク質,脂質もしくは多糖類,成長因子からなる群,または特に好ましい実施態様では,グリア細胞に対して向性を有するウイルスのエンベロープ由来の糖タンパクからなる群から選択され得る。造血細胞に特異的に結合するリガンドは例えば,幹細胞因子受容体に特異的な抗体もしくは抗体断片,IL−1(特に受容体タイプIまたはII),IL−3(特に受容体タイプaもしくはβ),IL−6もしくはGM−CSF,およびまた完全な免疫グロブリンもしくはこの特異性を示すFc断片ならびにSCF,IL−1,IL−3,IL−6もしくはGM−DSF等の成長因子および関連受容体に結合するこれらの断片からなる群から選択され得る。白血病細胞に特異的に結合するリガンドは例えば,抗体,抗体断片,免疫グロブリンもしくはCD13,CD14,CD15,CD33,CAMAL,シアロシル−Le,CD5,CD1e,CD23,M38,IL−2受容体,T細胞受容体,CALLAもしくはCD19等の白血病細胞上の膜構造に特異的に結合するFc断片,およびまた成長因子もしくはこれに由来する断片もしくはレチノイドからなる群から選択され得る。ウイルス感染細胞に特異的に結合するリンガンドは例えば,抗体,抗体断片,完全免疫グロブリン,もしくはウイルス感染後に感染細胞の細胞膜上に発現されるウイルス抗原に特異的なFc断片からなる群から選択され得る。気管支上皮細胞,肝臓のシヌソイド細胞または肝細胞に特異的に結合できるリガンドは例えば,トランスフエリン,アシアロオロソムコイド等のアシアログリコプロテイン,ネオグリコプロテインもしくはガラクトース、インスリン,末端にマンノースを有するペプチド,タンパク,脂質もしくは多糖類,完全免疫グロブリンもしくは標的細胞に特異的に結合するFc断片からなる群,ならびに特に好ましい実施態様では,標的細胞に特異的に結合するウイルスのエンベロープ由来の糖タンパクからなる群から選択され得る。他のリガンドの詳細な例については例えば欧州EP第 0790312号および欧州EP第 0846772号に開示がある。
【0022】
さらに本発明は,アジリジン(aziridine )(エチレンイミン単量体)の開環重合による低分子量カチオン性ポリエチレンイミン(PEI)に基ずくポリマーコンジュゲート(LMW PEI)の製造方法に関する。
【0023】
かかる状況下で上記エチレンイミンは, Wenker (JACS 57: 2328 (1935))の方法によりエタノールアミンから調製するのが好ましい。この沸点は好ましくは55.0−56.0℃である。
【0024】
ドイツ特許出願第 665,791号(1938) には酸または三フッ化ホウ素等の触媒を液状エチレンアミン単量体に添加することによるPEIの合成が記載されている。本発明によば, Dick ら,J. Macromol. Sci. A4: 1301-1314 (1970)に準拠して塩酸の添加・存在下に水溶液中でエチレンイミン単量体を重合できる。
【0025】
重合には,蒸留水中0.1%濃度から90%濃度のエチレンイミン(単量体)溶液を撹拌しながら調製し,触媒として0.1%から10%の濃塩酸(37%)を添加する。1−30日,好ましくは4日間30−70℃好ましくは50℃で重合する。
【0026】
ポリマーは例えば 13 C−NMR分光法,サイズ排除クロマトグラフイー,光散乱および/または粘度法の手段で特性化する。光散乱法を用いる分子量の測定法は,B. Vollmert (1962) "Grundriss der Makromolekularen Chemie (Outline of macromolecular chemistry -高分子化学の概況)”,Springer Verlag Berlin, 216-225 頁中に原理的な記載がある。この分子量の決定は光散乱法,特に例えば Wyatt Dawn DSP 分散光度計を用いてK5 測定セル中への直接注入に続いて633nmでレーザー散乱光測定法により実施するのが好ましい。分子量は例えばトルエン中で決定した較正定数および初期の既知試料重量を用いて測定できる。
【0027】
上記記載の方法は分子サイズが500Daから50,000Daの低分子量PEI(LMW PEI)の調製に使用できる。したがってこの低分子量PEI(LMW PEI)の分子量はHMW PEIの分子量よりも著しく低く,かつ腎臓排出の保証をすべきとする意味の50kDaという腎臓のしきい値(threshold )よりも著しく低い。
【0028】
意外なことに,核酸または核酸構造物を細胞へ挿入するためのベクターとしてのその有効性に関して,および生物学的許容性(tolerability)に関してはLMW PEIはHMW PEIよりも著しく優れていることが判った。分子サイズが1000Daから30,000DaのLMW PEIが最も好適であることが証明された。LMW PEIは正の性質のDNAと結合,濃縮(condense)およびこれを増加し得る。リポーター遺伝子を含むDNAと複合体形成すると,例えば約2000Da分子量のLMW PEIは[血清の存在下に]哺乳類細胞[例えばマウス繊維芽細胞(3T3)およびヒト内皮細胞ECV304)]中のリポーター遺伝子発現のレベルを,市販高分子量(HMW)PEIが達成するレベルよりも100倍も高いレベルに引き上げた。同時に繊維芽細胞の場合のLMW PEIの細胞毒性はHMW PEIの場合に比べて著しく低減した。
【0029】
従って,本発明は分子量50,000Da未満,好ましくは500Daから30,000Daのポリエチレンイミン(LMW PEI)に関し,このLMW PEIの調製方法に関し,かつ細胞ヘヌクレオチド配列を挿入するためのウイルスおよび非ウイルスヌクレオチド配列との複合体の形態でのLMW PEIの使用に関し,疾病の予防または治療達成の目的でこの細胞の哺乳類への投与に関し,および疾病の予防または治療達成の目的でヌクレオチド配列との複合体の形におけるLMW PEIの哺乳類への投与に関するものである。
【0030】
本発明は,分子量50,000Da未満の低分子量ポリエチレンイミン,好ましくは上記方法により調製されたLMW PEIに関する。
【0031】
本発明は,分子量50,000Da未満,好ましくは1000〜30,000Da特に約2000DaのLMW PEIの使用にも関する。このLMW PEIは例えば細胞へ核酸を挿入するために,細胞へ核酸を挿入するためのベクターを調製するために,または医薬の調整のために,および/または遺伝子治療において使用できる。
【0032】
その上,本発明は細胞へ核酸を挿入するためのベクターの調製方法に関する。例えばこのベクターはLMW PEIの適正量を適正量の核酸と混合して調製できる。このLMW PEIと核酸とは水溶液中で混合することが好ましい。
【0033】
その上,本発明はこのベクターの使用に関する。例えば,このベクターは細胞もしくは標的細胞への核酸の挿入のために(トランスフエクションまたはポリフエクション),または医薬の調製のために,および/または遺伝子治療に使用できる。好ましくは本発明は,非ウイルスもしくはウイルス核酸構造物を細胞へ挿入するためのベクターの使用および疾病の予防および治療達成の目的でのこの(トランスフエクションされた)細胞の患者への投与に関し,この場合の細胞は例えば内皮細胞,リンパ球,マクロフアージ,肝細胞,繊維芽細胞,筋細胞または上皮細胞であることができ,およびこの細胞は例えば皮膚上へ,皮下へ,筋肉内へ,傷内へ,体腔内へ,臓器(organ )もしくは血管内へ局所的に注射できる。他の好ましい態様での本発明は,疾病の予防または治療達成のためのこのベクターの使用に関し,この場合のベクターは例えば皮膚上へ,皮下へ,筋肉内へ,傷内へ,体腔内へ,臓器もしくは血管内へ局所的に注射できる。
【0034】
このLMW PEI,またはLMW PEIを含むベクターは例えば細胞/標的細胞へ核酸を挿入するのに使用できるが,この場合の細胞/標的細胞は内皮細胞,リンパ球,マクロフアージ,肝細胞,繊維芽細胞,筋細胞または上皮細胞である。
【0035】
さらに本発明は,トランスフエクションされた細胞または標的細胞の調製方法に関し,この場合,LMW PEIおよび/またはベクターはこの細胞と共に保温される。トランスフエクションは in vitro で実施するのが好ましい。また本発明はLMW PEIおよび/または新規ベクターを含むトランスフエクションされた細胞または標的細胞にも関する。その上,本発明は例えば医薬としてのトランスフエクションされた細胞の使用,または医薬調製用および/または遺伝子治療のためのトランスフエクションされた細胞の使用に関するものである。
【0036】
さらに本発明は,LMW PEIおよび/または新規ベクターおよび/またはトランスフエクションされた細胞を含む医薬に関する。また本発明は,医薬の調製方法に関し,この場合,核酸がLMW PEIと共に混合され,適切な場合さらに添加剤も混合される。
【0037】
この新規LMW PEIの分岐の程度はHMW PEIの場合よりもかなり少なく,したがってHMW PEIの場合よりも多くのアミノ基を含み,HMW PEIに比べてLMW PEIは細胞特異的リガンドに結合する機会がはるかに多い。従って本発明は,細胞特異的リガンドへのLMW PEIの結合に関し,かつウイルスまたは非ウイルス核酸配列との複合体での結合生成物の使用であって,このヌクレオチド配列を細胞へ挿入したり,または疾病の予防もしくは治療達成の目的でこの複合体を哺乳類へ投与するための結合生成物の使用に関するものである。既に特許出願欧州EP第 97101506.0 号および独国DE第 19649645.4 号には細胞特異的リガンドの調製および結合の可能性についての詳細がすでに記載されている。これらの特許出願をここに引用により包含する。
【0038】
LMW PEI適切な場合に細胞特異的リガンドに結合したLMW PEIとウイルスもしくは非ウイルス核酸構造物との間の複合体は遺伝子治療用ベクターを構成する。好ましい態様におけるこれらのベクターは、体腔へ,臓器中へ,血液循環系へ,呼吸経路へ,胃腸管へ,もしくは尿生殖器管へ,または筋肉内もしは皮下へ,外的もしくは内的に患者に局所投与される。
【0039】
この新規ベクターはエフエクター遺伝子を非細胞特異的もしくは細胞特異的態様で標的細胞へ集中するのに使用でき,この場合,このエフエクター遺伝子は活性化合物の不活性前駆体を活性化合物へと開裂する薬理学的活性化合物もしは酵素をコードする遺伝子であることが好ましい。このエフエクター遺伝子の選択により,薬理学的活性化合物または酵素を融合タンパクとしてのリガンドと一緒に発現させたり,このリガンドを例えば細胞表面に結合させて内皮細胞もしくは腫瘍細胞を増殖させることができる。
【0040】
本発明はまた,新規LMW PEIを用いて核酸構造物を挿入した酵母もしくは哺乳類細胞に関する。特に好ましい実施態様では,この新規LMW PEIは核酸構造物の細胞ラインへの導入に用いられ,次いでトランスフエクションされた後にこの導入遺伝子の発現に用いることができる。従ってこれらの細胞は患者用薬剤の調製用に使用することができる。核酸構造物との複合体での新規LMWPEIの好ましい使用は疾病治療の目的のものであり,この場合の薬剤の調製には標的細胞への核酸構造物の挿入,およびウイルス特異的または標的細胞特異的または代謝特異的または非特異的ならびに細胞サイクル特異的態様での構造物の発現が包含される。
【0041】
さらに本発明は疾病治療のための薬剤を調製するために,新規LMW PEIを用いて核酸構造物が挿入された哺乳類細胞の投与に関する。例えば,内皮細胞を血液から単離し, in vitro で新規ベクターで処理し,次いで例えば患者へ静脈注射することができる。
【0042】
in vitroでトランスフエクションされた,かかる細胞は新規ベクターとの組合わせで患者に投与することができる。この組み合わせは,細胞とベクターとを含み,それぞれは同時もしくは異なった時間に,および同一部位もしくは異なった部位に投与もしくは注射される。
【0043】
実施例:
1)方法
a)低分子量ポリエチレンイミン(LMW PEI)の調製
LMW PEIは酸触媒を用いて水性溶液中での開環重合によりアジリジン(aziridine )から得られる。この場合,10%濃度エチレンイミン単量体水溶液(エチレンイミン単量体5ml+蒸留水45ml,撹拌して溶解)を例えば触媒としての濃塩酸(37%)の1%(0.5ml)の添加存在下に50℃で4日間撹拌し,次いで回転蒸発にかけ,真空下に室温で乾燥した。分子量測定はレーザー散乱光測定(Wyatt Dawn DSP分散光度計)の手法でK5 測定セル中に直接注入の後633nmで実施した。分子質量はトルエン中で決定した補正定数および既知の試料初期重量に基づいて決める。
【0044】
分散分析の手法による分子量測定は2000Daの値を与えた。比較のため、市販(Fluka, Neu Ulm から入手) PEIの分散分析による分子量は791kDa(HMW PEI)であった。
【0045】
二つの調製品(LMW PEIおよびHMW PEI)を試験で比較した。
b)ポリヌクレオチド複合体の調製
Boussif ら[Boussif ら,Proc. Natl. Acad. Sci. 92; 7297-7301 (1995)]の方法に従ってプラスミドDNAをPEIを用いて複合体形成した。50%市販HMW PEI溶液9mgまたはLMW PEIの9mgを2重蒸留水9ml中に溶解し,この溶液を1N HClを用いてpH7.4に調製し,水で最終容量10.0mlに仕上げた。仕上がり溶液を濾過(0.2μm)により滅菌すると、4℃で比較的長時間の貯蔵ができた。
【0046】
複合体形成のために,プラスミド10μgおよび異なった量のPEIストック溶液を各場合に最終容量が250μlになるように150mMNaCl中に希釈し,ボルテックス(vortex)中で混合した。複合体の混合および当量比の一欄を表1に示す。室温で10分間保温(incubation)後,ポリマー溶液を複数回プラスミド溶液に滴下し,ボルテックス中で混合した。この複合体を細胞培地に添加するに先立ってさらに10分間保温した。
【0047】
c)アガロースシフト検定(assay )
異なったPEIのプラスミド結合能力を,アガロースゲルシフト検定で確認した。このために各場合,HMW PEIの1.35−27μgおよびLMW PEIの2.7−90μgをプラスミド10μgで複合体形成した(表1)。50μlのアリコットを厚さ約0.5cmの1%(w/v)アガロースゲル上に装填し,Tris-EDTA 緩衝液,pH 7.4中,80mVで2時間展開した。DNAの位置は臭化エチジウムとの反応後に254nmで可視化した。
【0048】
この複合体からプラスミドを置換する目的で,各場合に複合体の形成後30分でデキストラン硫酸溶液(Mw 5000, 10mg/ml, Sigma, Deisenhofen) 50μlまたは100μlをDNA複合体10μgに加えた。
【0049】
d)細胞培養
当業者には周知の標準条件下にL929マウス繊維芽細胞を培養した。これらの細胞を密度8000細胞/ウエルで96−ウエル細胞培養プレート中に接種し,次いで毒性実験に使用するのに先立ち24時間培養した。3T3繊維芽細胞も同様に標準条件下に培養した。
【0050】
外見上は正常の臍の緒から確立し,自然発生的に形質転換された粘着性ヒト内皮細胞ラインであるECV 304(ATCC, Rockville, MD USA)を、5%ウシ胎児血清(FCS),5%ウマ血清および1%N−アセチル−L−アラニル−グルタミン(全て Gibco, Eggensteinから)を含む Dulbecco's 修飾イーグルの培地(DMEM)(Gibco, Eggenstein )中で培養した。
【0051】
37℃、相対環境湿度95%および5%CO2 で保温した細胞を,集合(confluence)到達後にトリプシン/EGTA溶液(トリプシンの2.5%ストック溶液,エチレングリコール四酢酸の50mM溶液,PBS,pH7.4,比率1:1:8)を用いて1週2回継代接種した。この細胞は個々よりも寧ろ細胞集塊で基板(substratum)から離れるので,各場合に1/8継代を実施した。
【0052】
Bowmanら[19]および Mischekら[Mischek ら,Cell. Tiss. Res. 256: 221-226 (1989)] の方法に従って大脳毛細管内皮細胞を単離し培養した。トランスフエクション実験の場合,単離して約50%集合まで培養した直後、それらを6−ウエル細胞培養プレート中に接種した。
【0053】
e)毒性研究
Mosmann ら[Mosmann, J. Immunol.Methods 65: 55-63 (1983)] の方法に従ってMTT検定を用いてL929マウス繊維芽細胞に及ぼす上記ポリマーの毒性を測定した。10%FCSおよび2mMグルタミンを含むDMEM中でポリマーの希釈系列を調製し,濾過(0.2μm,Schleicher & Schuell, Dassel) により滅菌した。必要に応じて溶液のpHおよび浸透圧を補正した。24時間の予備保温後,このポリマー溶液で細胞を処理し,1,3,12および24時間保温した。細胞生存力をホルマザン濃度測定によりUV−測光で定量した。
【0054】
第2実験系列では,一般に1時間細胞をポリマーで処理しただけであり,次いで洗浄し,無PEI細胞培地中でさらに3,12および24時間培養した。評価は上記のように行った。
【0055】
f)トランスフエクション
3cm2 ペトリ皿中に接種したECV304細胞および3T3マウス繊維芽細胞,および6−ウエル培養プレート中に接種した一次(primary )内皮細胞を実験直前にPBS,pH7.4で洗浄し,新しく血清を補充した培地を供給した。3.33μgDNA/ウエルまたは皿に該当するHMW PEIおよびLMW PEI複合体を添加し,37℃で1時間保温した。この細胞を引き続き60時間保温し,ルシフエラーゼまたはβ−ガラクトシダ−ゼ活性をメーカー指示書に準拠して測定した。[このHMW PEIおよびLMW PEI複合体はその対応ベクターである;これらはHMW PEIおよびLMW PEIのそれぞれ,およびこの場合はプラスミドDNAである核酸を含む]
【0056】
実施例2: 結果
a)PEIの物理化学的性質
エンドソーム/リソソーム区画中での反応に関してこれらポリマーの挙動を,pH4−10範囲の異なったpH値で0.1Mリン酸緩衝液中で実施した膨潤研究によりで詳しく調べた。HMW PEIはpH9およびpH10で溶解して透明溶液を形成し残渣はなかったが,一方pH8およびそれ未満では著しい濁度が観察された。この濁りはpH7およびpH8では大いに安定していた。数時間(several hours )後に沈降のサインが現れただけである。対照的に,容易に再懸濁される沈降物が酸性範囲のpH値で30分以内に形成された。同一条件下では,LMW PEIは濁りや沈殿は生成せず,透明な溶液を形成した。
【0057】
b)細胞毒性研究
PEIの毒性を in vitro でL929マウス繊維芽細胞につき測定した。この細胞はポリマーの毒性および生物学的適合性を測定するための標準細胞培養モデルとして種々の標準組織体が推奨している細胞である。形成したホルマザンの吸収と1×103 および3×104 細胞数範囲との間の直線的正比例関係は先行実験で確立されていた。24時間成長期に続いて,8000細胞/ウエルをこのポリマー溶液で処理し,1,3,12および24時間保温した。0−1.0mg/ml範囲では,HMW PEIおよびLMW PEIの観察された毒性効果は24時間までの期間に亙って時間および濃度依存的であり,高分子量および低分子量PEIの毒性プロフイールは著しい差異を示した。このように,HMW PEIの場合には,IC50は0.06mg/ml(1時間保温)から0.04mg/ml(24時間保温)であったが,一方LMW PEI濃度0.1から1.0mg/mlでは12時間保温後にのみ毒性になり,24時間保温後には約0.1mg/mlのIC50値を測定し得るだけであった。
【0058】
c)アガロースゲルシフト検定
プラスミドとREIとの間の最適結合比率および量的比率を確認する目的で、一定量のプラスミド(10μ)を,異なった濃度のHMW PEIおよびLMWPEIを用いて指示された様に複合体形成化し,次いで電気泳動により分析した。研究した複合体の混合比,使用したストック溶液容量およびPEIの絶対量の概要を表1に示す。
【0059】
【0060】
プラスミドおよびこれら複合体の位置は臭化エチジウムによる染色で可視化された。このDNAはプラスミドのスーパーコイルの環状形に該当し,アノード方向に移動した二つの蛍光バンドを形成した。
【0061】
1+1の比率でHMW PEIと複合体形成するDNAは,積載(loading )部位で部分的だが依然としてプラスミドの不完全な遅延(retardation )を生じた。全積載の低減および/または直径の増加は生成複合体のゲルマトリックス中での移動を防止した。
【0062】
比率1+6から1+20の複合体は蛍光を示さなかったので検出できなかった;このことはこれらの構造が効果的に濃縮され,HMW PEIにより物理的に圧縮されるために,臭化エチジウムがプラスミドから締め出されることを示した。これらの複合体の場合,アニオン/カチオン比は1:1.2(1+6)から1:4(1+20)で変化する。その結果,この複合体は全体として正の電荷を有するべきである。
【0063】
2.7μgのLMW PEIが10μgのプラスミドを殆ど完全に結合し,かつ遅延し得た。しかし,この複合体は全体として依然として負電荷を有し,アノードを指向して移動した。しかし,このDNAの完全なカチオン化および濃縮は54μgおよびそれを上回るLMW PEIを用いた際にのみ観察された。
【0064】
高分子量および低分子量PEIによる濃縮の影響を実証する目的で,過剰のデキストラン硫酸を用いてこのDNAを完成複合体から置換させた。この硫酸デキストランはカチオンポリマーとの競合反応に加わる。HMW PEIおよびLMW PEI両方の場合,このDNAが複合体から再度放され,このDNAの全てもしくは一部はゲルマトリックス中へ移動するのが可能であった。臭化エチジウムの場合は挿入(intercalate )が再度可能であったので、このDNAを蛍光により検出できた。
【0065】
d)In-vitro でのトランスフエクション効率
このPEI複合体のトランスフエクション効率を細胞ライン(3T3マウス繊維芽細胞およびヒト内皮細胞ラインECV304)および一次培養物(ブタ脳毛細内皮細胞)の両方を用いて測定した。SV 40プロモーターおよびエンハンサーの制御下にルシフエラーゼ遺伝子を有する,Promega 市販のpGL3 対照ベクターをリポーター遺伝子として用いた。プラスミドとポリマーが複合体中で混合された比率は電気泳動に用いた場合と同じであった。
【0066】
HMW PEI(1.35μgから27μg)/DNA(10μg)濃度が試験された。HMW PEI(18μg)の場合に最高トランスフエクションが得られた。ポリマー濃度のさらなる増加はルシフェラーゼ発現の比較的僅かな減少が起きただけであった。
【0067】
LMW PEI(20−80μg)/DNA(10μg)濃度がLMW PEIの場合に試験された。HMW PEIの状況とは対照的に,LMW PEI濃度が増加するにつれてトランスフエクション効率の安定した増加がECV細胞中に検出された。LMW PEIの80μg/DNAの10μgでリポーター遺伝子活性を測定したが,それは,最大活性を示したHMW PEI(18μg)/DNA(10μg)の投与量を用いて得られた活性よりも約100倍も高かった。その上,高分子量PEIを用いた際に生起するようなルシフエラーゼ発現の低減は,LMW PEI最高濃度でさえも観察されなかった。ECV細胞および3T3細胞を用いた実験は同一結果を与えた。
【0068】
比較のために,リポーター遺伝子としてβガラクトシダーゼを用いたトランスフエクション研究を,内皮一次細胞培養物について,かつHMW PEIおよびLMW PEI複合体の最高許容可能,非毒性投与量(MTD)を用いても実施した。この in-vitro MTD値はHMW PEI(13.5μg)/DNA(10μg)およびLMW PEI(90μg)/DNA(10μg)であった。10μgのDNAおび13.5μgのHMW PEIからなる複合体と共に保温した培養ブタ脳毛細内皮細胞をほんのわずかトランスフエクションするのが可能なだけであった。細胞核の領域で特有の青色を示したのは培養ウエル当たり2−3細胞だけであった。うまくトランスフエクションされた処理細胞は1%未満であった。これとは対照的に,90μgのLMW PEIおよび10μgのDNAからなる複合体と保温すると,この内皮細胞中のマーカータンパクの有意の発現に至った。全細胞数に関して,培養ウエル当たりの青色染色細胞の%表示の割合,すなわちトランスフエクション成功率は5%から10%であった。ポリマー/DNA複合体が細胞に与える毒性の影響は,いずれの場合も光顕微鏡では観察できなった。
Claims (1)
- エチレンイミン単量体を水溶液中で塩酸の添加により重合することを特徴とする、約2,000Daの分子量を有する低分子量ポリエチレンイミン(LMW PEI)の調製方法であって、水溶液がエチレンイミン単量体約10%濃度でありかつ濃塩酸約1%濃度であり、重合が反応温度約50℃で実施され、反応時間が4日である、低分子量ポリエチレンイミンの調製方法。
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