CZ310598A3

CZ310598A3 - Nízkomolekulární polyetylenimin s dobrou biologickou snášenlivostí, způsob jeho přípravy a použití

Info

Publication number: CZ310598A3
Application number: CZ983105A
Authority: CZ
Inventors: Thomas Prof. Dr. Kissel; Dagmar Dr. Fischer; Hans-Peter Dr. Elsässer; Thorsten Bieber
Original assignee: Hoechst Marion Roussel Deutschland Gmbh
Priority date: 1997-09-30
Filing date: 1998-09-28
Publication date: 1999-04-14
Also published as: HUP9802157A3; CY1105109T1; AU758239B2; KR19990030290A; CA2249058A1; EP0905254A2; DE19743135A1; AR015726A1; ATE324397T1; PL328910A1; DE59813507D1; EP0905254A3; AU8714898A; US20110306656A1; JPH11187874A; ES2264180T3; TR199801933A2; JP4399042B2; EP0905254B1; HUP9802157A2

Description

Nízkomolekulární polyetylenimin s dobrou biologickou snášenlivostí, způsob jeho přípravy a použití

Oblast techniky

Vynález se týká nízkomolekulárních polyetyleniminů, vektorů pro vnesení nukleových kyselin do buněk, které obsahují nízkomolekulární polyetyleniminy, a dále se týká výroby a použití nízkomolekulárních polyetyleniminů a vektorů.

Dosavadní stav techniky

Při terapeutické aplikaci DNA in vivo nebylo dosud v klinických studiích na člověku dosaženo podstatného úspěchu. Příčinami jsou především nízká účinnost přenosu genů, omezená exprese genetické informace (Cotton et al., Meth. Enzymol. 217: 618-644, 1993) a nedostatečná biokompatibilita (Choksakulnimitr et al., J. Control. Rel. 34: 233-241, 1995) používaných kationtových nosičových materiálů. Ačkoliv virové vektory, jako např. retroviry (Miller, Nátuře 357: 455460, 1992) nebo adenoviry (Mulligan, Science 260: 926-932,

1993) dávají velmi úspěšné výsledky in vitro, bylo jejich použití in vivo omezeno zejména z důvodu jejich zánětlivých a imunogenních vlastností a také z důvodu nebezpečí mutageneze a integrace do vlastního buněčného genomu (Crystal, Science 270: 404-410, 1995). Jako možná alternativa se nabízejí nevirové vektory, se kterými se nejenom snadněji zachází než s virovými vektory, ale jsou také bezpečnější a účinnější v přenosu DNA do buňky (Tomlinson a Rolland, J. Contr. Rel. 39: 357-372, 1996).

Syntetické vektory, založené na kationtových polymerech rozpustných ve vodě jako je poly-L-lysin (PLL)(Wu a WU, Bio• ·

- 2 therapy 3: 87-95, 1991), DEAE-dextran (Gopal, Moll. Cell Biol. 5: 1183-93, 1985), dendrimeren (Haensler a Szoka, Bioconjugate Chem. 4: 372-379, 1993) nebo kationtové deriváty metakrylové kyseliny (Wolfert et al., Hum. Gene Ther. 7: 2123-2133, 1996) se v průběhu času vyvinuly jako alternativa ke klasickému způsobu transfekce, tzv. „lipofekci pomocí kationtových lipidů (Gao a Huang, Gene Therapy 2: 710-722, 1995) a amfifilních lipidů (Behr, Bioconjugate Chem. 5: 382389, 1993) . Rozhodující výhoda „polyfekce pomocí kationtových polymerů spočívá v nekonečném počtu možných strukturních variací, které mohou požadovaným způsobem ovlivnit fyzikálně-chemické a biologické vlastnosti polymeru a komplexu plazmid-polymer. Dodatečným navázáním buněčně specifických ligandů jako je transferin (Wagner et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 87: 3410-3414, 1990), asialoglykoprotein (Wu a Wu, J. Biol. Chem. 262. 4429-4432, 1987), stejně tak jako různých protilátek (Trubetskoy et al. , Bioconjugate Chem. 3: 323-327, 1992) a cukrů (Midoux et al. , Nucl. Acid Res. 21; 871-878, 1993), se dá účinnost těchto vektorů významně zvýšit.

Polyetylenimin (PEI), kationtový polymer s rozvětvenou trojrozměrnou strukturou, vedl u mnohých adherentních nebo suspenzních buněčných linií k mírně nadprůměrné míře transfekce (Boussif et al., Gene Therapy 3: 1074-1080, 1996). Tak např. fibroblasty 3T3 mohly být in vitro transformovány z 95 %. Genový transfer zprostředkovaný PEI in vivo do mozku myší způsobil v neuronech a gliových buňkách dlouhodobou expresi reportérového genu a genu Bcl2, která byla stejného řádu jako exprese při genovém transferu pomocí adenovirů (Abdallah et al., Hum. Gene Ther. 7: 1947-1954, 1996).

Polyetylenimin má vynikající vlastnosti ve srovnání s jinými z literatury známými polykationty jako jsou PLL • · • ·

- 3 (Zenke et al. , Proč. Nati. Acad. Sci. USA 87: 3655-3659, 1990), deriváty metakrylátu (Cheng et al. , Pharm. Res. 13: 1038-1042, 1996) nebo DEAE-dextran (Gopal, Mol. Cell Biol. 5: 1183-1193, 1985). Vzhledem k příčně zesítěné struktuře a vysoké hustotě náboje je ve stavu, že může kondenzovat plazmidy s velkou hmotností nebo vytvářet komplexy. DNA pak ve formě takových komplexů může být vnesena do buňky. Mechanismus příjmu, intracelulárního opracování a lyzotropní aktivity komplexů PEI-plazmid nebyl dodnes s konečnou platností vysvětlen. Rozhodnou výhodou PEI se zdá změna jejich struktury závislá na pH, která vede k destabilizaci endozomového-lyzozomověho kompartmentu a tím usnadňuje uvolnění komplexu do cytoplazmy. Zvláště aminoskupiny s rozdílnými hodnotami pKa molekul jsou zodpovědné za výraznou pufrovací kapacitu PEI („protonová houba), která při acidifikaci endozomú vede k protonaci polymeru při bobtnání a tím k rozrušení membrány vezikulů. Tok protonů zprostředkovaný endozomovou ATPázou je podle všeho předpokladem pro současný pasivní přítok chloridových aniontů, což v přítomnosti PEI vede k významnému zvýšení celkové koncentrace iontů a tím k osmotickému bobtnání endozomů (Behr, Chimia 51: 34-36, 1997). Lyzozomotropní činidla jako je např. chlorokin, která jsou např. nutná pro transfekci pomocí PLL, nemají proto žádný vliv na míru transfekce s PEI (Remy a Behr, J. Lip. Res. 6: 535-544, 1996) .

V mezinárodní patentové přihlášce WO 9602655 Al se popisuje použití vysokomolekulárních polyetyleniminů s molekulovou hmotností od 50 kDa do 800 kDa (tj . molární hmotnost 50 000 g/mol až 80 000 g/mol) pro transfekci DNA do buněk.

Komerčně dostupné PEI mají podle údajů výrobce (např. Fluka, Neu Ulm) moelekulovou hmotnost 600 až 1000 kDa. Takové přípravky PEI s vysokou molekulovou hmotností („high mo- 4 lecular weight PEI: HMW-PEI) vykazují již od koncentrace 0,01 mg/ml a po krátké 3hodnové inkubaci, výraznou cytotoxicitu. Navíc nejsou polyetyleniminové struktury ani enzymaticky ani hydrolyticky štěpitelné a tudíž nejsou biologicky odbouratelné. HMW-PEI nejsou tudíž vyloučitelné ani ve stolici ani ledvinami.

V důsledku toho je podání dosud používaných HMW-PEI v rámci genové terapie zatíženo značným rizikem.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je polyetylenimin s nízkou molekulovou hmotností pod 50 000 Da, výhodně mezi 500 Da a 30 000 Da („Low molecular weight PEI: LMW-PEI), způsob přípravy takových LMW-PEI a použití LMW-PEI v komplexu s virovými i nevirovým nukleotidovými sekvencemi případně nukleovými kyselinami pro vnesení nukleotidových sekvencí do buňky, podání takové buňky savci za účelem profylaxe nebo léčení nemoci a také podání LMW-PEI v komplexu s nukleotidovou sekvencí savci za účelem profylaxe nebo léčení nemoci.

Předmětem vynálezu je také vektor, který obsahuje nízkomolekulární polyetylenimin (LMW-PEI) a nukleovou kyselinu (nukleotidovou sekvenci), přičemž LMW-PEI má molekulovou hmotnost pod 50 000 Da. Vynález se zvláště týká vektorů pro vnesení konstruktu nukleové kyseliny do buňky, přičemž vektory obsahují komplexy polyetyleniminu o molekulové hmotnosti pod 50 000 Da s nukleovou kyselinou, výhodně s virovým nebo nevirovým konstruktem nukleové kyseliny.

Výhodně má LMW-PEI molekulovou hmotnost od 500 do 30 000 Da. Ve výhodném provedení vynálezu má LMW-PEi molekulovou hmotnost 1000 až 5000 Da. Zvláště výhodná je molekulová hmotnost přibližně 2000 Da.

• ·

- 5 Předmětem vynálezu je vektor, který obsahuje nízkomolekulární polyetylenimin a nukleovou kyselinu, přičemž LMW-PEI se připraví polymerizací monomerního polyetyleniminu ve vodném roztoku přidáním kyseliny chlorovodíkové, kde vodný roztok je je výhodně 0,1% až 90% roztok momomerního etyleniminu a 0,1% až 10% roztok koncentrované kyseliny chlorovodíkové (37%) .

Předmětem vynálezu je vektor, který obsahuje nízkomolekulárni polyetylenimin a nukleovou kyselinu, přičemž LMW-PEI při studiích bobtnání v různých hodnotách pH v rozmezí pH 4 až pH 10 v 0,1M fosforečnanovém pufru neukázal žádný zákal nebo sraženinu.

Předmětem vynálezu je vektor, který obsahuje nízkomolekulární polyetylenimin a nukleovou kyselinu, přičemž tímto vektorem lze dosáhnout míry transfekce vyšší než 1 %, výhodně míry transfekce 5 % nebo vyšší, a ve zvláště výhodném provedení lze dosáhnou míry transfekce vyšší než 10 %.

Nukleová kyselina může být např. DNA nebo RNA. Nukleová kyselina může být oligonukleotid nebo konstrukt nukleové kyseliny. Nukleová kyselina je výhodně virový nebo nevirový konstrukt nukleové kyseliny. Výhodně je konstrukt nukleové kyseliny gen nebo plazmid. Konstrukt nukleové kyseliny může obsahovat transgen. Konstrukt nukleové kyseliny může obsahovat jeden nebo více efektorových genů. Efektorový gen může kódovat např. farmakologický účinnou látku nebo její prekurzor a/nebo enzym. Konstrukt nukleové kyseliny je výhodně uspořádán tak, že gen (efektorový gen nebo transgen) je exprimován specificky, např. virově specificky (tj. jen v buňkách infikovaných virem), specificky pro cílovou buňku, metabolicky specificky, specificky pro buněčný cyklus, vývojově specificky nebo také nespecificky. V nejjednodušším případě nukleová kyselina obsahuje gen, který kóduje požadovaný pro• ·

- 6 • · ♦ • · · ft · · · · tein, a specifickou promotorovou sekvenci, a případně ještě další regulační sekvence. Pro zesílení a/nebo prodloužení exprese genu může např. obsahovat virový promotor a/nebo enhancerovou (zesilovací) sekvenci. Takové promotorové a/nebo enhancerové sekvence jsou přehledně popsány v publikaci Dillona (TiBTech 11, 167, 1993). Jako příklady se zde uvádějí sekvence LTR viru Rousova sarkomu a retrovirů, promotorovy a enhancerový úsek viru CMV, sekvence ITR a/nebo promotorové sekvence p5, pl9 a p40 z virů AAV, sekvence ITR a/nebo promotorové sekvence adenovirů, sekvence ITR a/nebo promotorové sekvence viru Vaccinia, sekvence ITR a/nebo promotorové sekvence herpetických virů, promotorové sekvence parvovirů a promotorové sekvence („upstream regulační úsek, tj. proti směru transkripce) papillomových virů. LMW-PEI vytvoří komplex s nukleovou kyselinou tím, že se smíchají obě výchozí látky. Výhodně je poměr ve směsi zvolen tak, že vede ke komplexům s neutrálním nebo kladným nábojem. Výhodně se vektor skládá z komplexů, které obsahují více než 50 % (hmotnostních) LMW-PEI. Vektor má výhodně poměr hmotností LMW-PEI k nukleové kyselině 3:1 nebo vyšší, zvláště výhodný je poměr 5:1 nebo vyšší, např. 8:1 nebo vyšší.

Efektorový gen může být exprimován jako fúzní protein s ligandem, např. pokud konstrukt nukleové kyseliny obsahuje vedle sekvence efektorového genu sekvenci, která kóduje ligand.

Vynález se zcela obecně týká vektoru, který obsahuje LMW-PEI, nukleovou kyselinu a případně ligand. Výhodně jsou jednotlivé složky vektoru spojeny kovalentními vazbami a/nebo adsorpčními vazbami. Např. může být kódovaný protein a/nebo LMW-PEI spojen s ligandem. Vynález se zvláště týká vektorů, ve kterých je nízkomolekulární polyetylenimin spo- 7 ··· · • · ·· <

jen s buněčně specifickým (případně specifickým pro cílovou buňku) ligandem.

Ligand je výhodně ligand specifický pro buňku případně specifický pro cílovou buňku. Buněčně specifický ligand se může vázat na vnější membránu cílové buňky, výhodně živočišné anebo lidské buňky. Ligand specifický pro cílovou buňku má vysokou specifičnost pro cílovou buňku. Vektor, který obsahuje ligand specifický pro cílovou buňku, se může použít pro přenos nukleové kyseliny specificky do cílové buňky. Příkladem cílové buňky může být endotelová buňka, svalová buňka, makrofág, lymfocyt, gliová buňka, krvetvorná buňka, nádorová buňka, leukemická buňka, buňka infikovaná virem, buňka bronchiálního epitelu nebo jaterní buňka, např. buňka jaterního sinusu.

Ligand, který se specificky váže na endotelovou buňku, se může vybrat např. ze skupiny obsahující monoklonální protilátky nebo jejich fragmenty, které jsou specifické pro endotelovou buňku, glykoproteiny, glykolipidy nebo polysacharidy nesoucí manózu, cytokiny, růstové faktory, adhezivní molekuly, nebo ve výhodném provedení vynálezu ze skupiny obsahující glykoproteiny virových obalů, které projevují tropismus pro endotelové buňky. Ligand, který se specificky váže na buňky hladkého svalstva se může vybrat např. ze skupiny obsahující monoklonální protilátky nebo jejich fragmenty specifické pro aktin, receptory buněčné membrány a také růstové faktory, nebo ve zvláště výhodném provedení vynálezu ze skupiny obsahující glykoproteiny virových obalů, které projevují tropismus pro buňky hladkého svalstva. Ligand, který se specificky váže na makrofágy a/nebo lymfocyty se může vybrat např. ze skupiny obsahující monoklonální protilátky, specifické pro membránové antigeny makrofágú a/nebo lymfocytů, intaktní imunoglobuliny nebo Fc-fragmenty polyklonálních • ·

- 8 nebo monoklonálních protilátek, specifických pro membránové antigeny makrofágů a/nebo lymfocytů, cytokiny, růstové faktory, peptidy, proteiny, lipidy nebo polysacharidy nesoucí manózu, nebo ve zvláště výhodném provední vynálezu obsahuje obalové glykoproteiny virů, zvláště pak protein HEF z C-viru chřipky s mutací v nukleotidové poloze 872 nebo štěpné produkty HEF C-viru chřipky obsahující katalytickou triádu šeřin 71, histidin 368 nebo 369 a asparagin 261. Ligand, který se specificky váže na gliové buňky, se může vybrat ze skupiny obsahující protilátky a fragmenty protilátek, které se specificky váží na membránové struktury gliovych buněk, adhezivní molelkuly, peptidy, proteiny, lipidy a polysacharidy nesoucí manózu, růstové faktory, nebo ve zvláště výhodném provední vynálezu obsahuje obalové glykoproteiny virů, které projevují tropismus ke gliovým buňkám. Ligand, který se specificky váže buňky krvetvorby, může se vybrat ze skupiny obsahující protilátky a fragmenty protilátek, které jsou specifické pro receptory faktorů kmenových buněk, IL-1 (zvláště receptory typu I nebo II) , IL-3 (zvláště receptory typu α a β) , IL-6 nebo GM-CSF, a také intaktní imunoglobuliny nebo Fc-fragmenty, které mají tuto specifičnost, a dále růstové faktory jako SCF, IL-1, IL-3, IL-6 nebo GM-CSF a jejich fragmenty, které se váží na příslušné receptory. Ligand, který se specificky váže na leukemické buňky se může vybrat např. ze skupiny obsahující protilátky, fragmenty protilátek, imunoglobuliny nebo Fc-fragmenty, které se specificky váží na membránové struktury leukemických buněk, jako např. CD13, CD14, CD15, CD33, CAMAL, Sialosyl-Le, CD5, CDle, CD23, M38, receptory IL-2, receptory T-buněk, CALLA nebo CD19, a také růstové faktory nebo z nich pocházející fragmenty nebo retinoidy. Ligand, který se specificky váže na buňky infikované virem se může vybrat např. ze skupiny obsahující • ·

- 9 protilátky, fragmenty protilátek, imunoglobuliny nebo Fcfragmenty, které jsou specifické pro virový antigen, který se exprimuje diky virové infekci na buněčné membráně infikované buňky. Ligand, který se specificky váže na buňky bronchiálniho epitelu, sinusové jaterní buňky nebo jaterní buňky, se může vybrat např. ze skupiny obsahující transferrin, asialoglykoprotein jako např. asialoorosomukoid, neoglykoprotein nebo galaktózu, inzulín, peptidy, proteiny, lipidy nebo polysacharidy nesoucí manózu, intaktní imunoglobuliny nebo Fc-fragmenty, které se speficificky váží na cílovou buňku, a ve zvláště výhodném provedení ze skupiny obsahující glykoproteiny virových obalů, které se specificky váží na cílovou buňku. Další podrobné příklady ligandů jsou např. uvedeny v patentových přihláškách EP 0 790 312 a EP 0 846 772 .

Předmětem vynález dále je způsob přípravy nízkomolekulárního kationtového polymerního konjugátu (LMW-PEI) na bázi polyetyleniminu (PEI) prostřednictvím kruh otevírající polymerace aziridinu (monomerního etyleiminu).

Výhodně se přitom následuje postup výroby etyleniminu z etanolaminu způsobem podle Wenkera (JACS 57, 2328, 1935). Bod varu přitom výhodně leží mezi 55,0 a 56,0 °C.

V patentové přihlášce Německa č. 665 791 (1938) se popisuje syntéza PEI tím, že se přidá katalyzátor, jako např. kyselina nebo bortrifluorid ke kapalnému monomernímu etyleniminu. Monomerní etylenimin se podle vynálezu polymerizuje ve vodném roztoku přidáním kyseliny chlorovodíkové analogicky ke způsobu popsanému Dickem et al. (J. Macromol. Sci A4 : 1301-1314, 1970) .

Pro polymerizaci se připraví 0,1% až 90% roztok etyleniminu (monomeru) rozmícháním v destilované vodě a přidá se 0,1% až 10% koncentrovaná kyselina chlorovodíková (37%) jako

katalyzátor. Polymerizace následuje po 1 až 30 dnech, výhodně po 4 dnech při teplotě 3é až 70°C, výhodně 50 °C.

Následuje charakterizace polymeru pomocí ¹³C-NMR spektroskopie, „size-exclusion chromatografie, rozptylem světla a/nebo viskozimetrií. Způsob stanovení molekulové hmotnosti pomocí rozptylu světla je v podstatě popsán v publikaci: B. Vollmert (1962) Grundriss der Makromolekularen Chemie, Springer Verlag, Berlin, S. 216-225. Výhodně se použije ke stanovení molekulové hmotnosti metoda rozptylu světla, zvláště měření rozptylu laserového záření, např. pomocí rozptylového fotometru, např. typu Wyatt Dawn DSP při 633 nm po přímém vstřiku do měřicí buňky K5. Molekulová hmotnost se může určit např. pomocí kalibrační konstanty stanovené pomocí toluolu a známé navážky.

Způsobem podle vynálezu se může připravit nízkomolekulární PEI (LMW-PEI) o velikosti mezi 500 Da a 50 000 Da. Molekulová hmotnost nízkomolekulárního PEI (LMW-PEI) leží zřetelně pod hodnotou, kterou mají HMW-PEI, a zřetelně pod velikostí 50 kDa, kterou propouštějí ledviny, což zaručuje eliminaci ledvinami.

Překvapivě bylo zjištěno, že LMW-PEI, pokud se týká jejich účinnosti jako vektorů pro přenos nukleové kyseliny do buňky a jejich biologické snášenlivosti, zřetelně předčí HMW-PEI. Jako nej lepší se ukazuje LMW-PEI s velikostí molekul mezi 1000 Da a 30 000 Da, který je schopen DNA vázat, kondenzovat a také opatřovat kladným nábojem. LMW-PEI s molekulovou hmotností asi 2000 Da vedl v komplexu s DNA obsahující reportérový gen (v přítomnosti séra) ke lOOx vyšší expresi reportérového genu v savčích buňkách (např. myších fibroblastech (3T3) a lidských endotelových buňkách (ECV304)) ve srovnání s komerčně dostupným vysokomolekulár• to

PEI pro fibros molekulovou

-líním (HMW) PEI. Současně byla cytotoxicita LMW blasty ve srovnání s HMW-PEI výrazeně snížena.

Předmětem vynálezu je polyetylenimin hmotností pod 50 000 Da, výhodně mezi 500 Da a 30 000 Da (LMW-PEI) , způsob přípravy takového LMW-PEI a použiti LMWPEI v komplexu s virovou nebo nevirovou nukleotidovou sekvencí pro vnesení nukleotidové sekvence do buňky, podání takové buňky savci za účelem profylaxe nebo léčení nemoci a podáni LMW-PEI v komplexu s nukleotidovou sekvenci savci za účelem profylaxe nebo léčení nemoci.

Předmětem vynálezu je polyetylenimin s molekulovou hmotností pod 50 000 Da, výhodně takový LMW-PEI, který je připraven způsobem podle předkládaného vynálezu.

Předmětem vynálezu je použití polyetyleniminu s molekulovou hmotností pod 5 0 0 00 Da, výhodně 1000 až 30 000 Da, zvláště výhodně přibližně 2000 Da. LMW-PEI se např. mohou použít pro vnesení nukleové kyseliny do buňky, pro přípravu vektoru pro vnesení nukleové kyseliny do buňky, pro přípravu léčiva a/nebo pro genovou terapii.

Předmětem vynálezu je způsob přípravy vektoru pro vnesení nukleové kyseliny do buňky. Může se např. připravit vektor, ve kterém se smíchá odpovídajíc množství LMW-PEI s odpovídajícím množstvím nukleové kyseliny. Výhodně se provede smíchání LMW-PEI a nukleové kyseliny ve vodném roztoku.

Předmětem vynálezu je dále použití vektoru. Vektor se může např. použít pro vnesení nukleové kyseliny do buňky, případně cílové buňky (tj . transfekcí případně polyfekcí) , pro přípravu léčiva a/nebo pro genovou terapii. Výhodně se použití podle předkládaného vynálezu týká použití vektoru pro vnesení konstruktu virové nebo nevirové nukleové kyseliny do buňky a podání této (transfekované) buňky pacientovi za účelem profylaxe nebo léčení nemoci, přičemž buňka může

- 12 •000 0· být např. endotelová buňka, lymfocyt, makrofág, jaterní buňka, fibroblast, svalová buňka nebo epitelová buňka, a tato buňka se může injikovat lokálně do kůže, subkutánně, intramuskulárně, do rány, do tělní dutiny, do orgánu nebo do krevního oběhu. Další výhodné provedení předkládaného vynálezu se týká použití vektoru pro profylaxi nebo léčení nemoci, přičemž vektor se může injikovat lokálně do kůže, subkutánně, intramuskulárně, do rány, do tělní dutiny, do orgánu nebo do krevního oběhu.

LMW-PEI popřípadě vektor obsahující LMW-PEI, se může použít např. pro vnesení nukleové kyseliny do buňky/cílové buňky, přičemž buňka/cílová buňka je endotelová buňka, lymfocyt, makrofág, jaterní buňka, fibroblast, svalová buňka nebo epitelová buňka.

Předmětem vynálezu dále je způsob přípravy transfekované buňky popřípadě cílové buňky, přičemž LMW-PEI a/nebo vektor se inkubují s touto buňkou. Výhodně se provede transfekce in vitro. Předmětem vynálezu je dále transfekovaná buňka případně cílová buňka, která obsahuje LMW-PEI a/nebo vektor podle předkládaného vynálezu. Vynález se dále týká použití transfekované buňky, např. jako léčiva popřípadě pro přípravu léčiva a/nebo pro genovou terapii.

Předmětem vynálezu je dále léčivo, které obsahuje LMWPEI a/nebo vektor podle předkládaného vynálezu a/nebo transfekovanou buňku. Předmětem vynálezu je také způsob přípravy léčiva, přičemž se nukleová kyselina smíchá s LMW-PEI a případně s dalšími aditivy.

LMW-PEI podle předkládaného vynálezu je slaběji zesítěn než HMW-PEI a proto obsahuje více aminoskupin než HMW-PEI, tudíž LMW-PEI nabízí mnohem lepší možnosti navázání s buněčně specifickým ligandem. Předmětem vynálezu je proto také spojení LMW-PEI s buněčně specifickým ligandem a použití • · « *

- 13 *· ·· « ♦ 9 ·

9 9 9

9 9 9 9 «

takto spojeného produktu v komplexu s virovou nebo nevirovou nukleotidovou sekvencí pro vnesení nukleotidové sekvence do buňky nebo pro podání komplexu savci za účelem profylaxe nebo léčení nemoci. Možnost přípravy a spojení s buněčně specifickými ligandy je podrobně popsána v patentové přihlášce EP 97101506.0 a DE 1964964.5. Na tuto přihlášku se tímto odkazuj eme.

Komplexy složené z LMW-PEI, případně LMW-PEI spojeného s buněčně specifickým ligandem, a z konstruktu virové nebo nevirové nukleové kyseliny, představují vektor pro genovou terapii. Ve výhodném provedení předkládaného vynálezu se tyto vektory podávají pacientovi vnějšně nebo vnitřně, lokálně, do tělní dutiny, do orgánu, do krevního oběhu, do dýchacích cest, do zažívacího a trávicího traktu, do urogenitálního traktu, intramuskulárně anebo subkutánně.

Pomocí vektoru podle předkládaného vynálezu se může efektorový gen nespecificky nebo buněčně specificky vložit (integrovat) do cílové buňky, přičemž se v případě efektorového genu jedná především o gen, který kóduje farmakologicky aktivní účinnou látku nebo enzym, který štěpí neaktivní prekurzor účinné látky na účinnou látku. Efektorový gen se může vybrat tak, že farmakologicky aktivní látka nebo enzym jsou exprimovány jako fúzní protein s ligandem a tento ligand se váže na povrch buňky, např. proliferující endotelové buňky nebo nádorové buňky.

Předmětem předkládaného vynálezu jsou také buňky kvasinek nebo savčí buňky, do nichž byl vnesen konstrukt nukleové kyseliny pomocí LMW-PEI podle předkládaného vynálezu. Ve zvláště výhodném provedení vynálezu byly konstrukty nukleové kyseliny vloženy pomocí LMW-PEI podle předkládaného vynálezu do buněčné linie, které se může po transfekci použít pro expresi transgenu. Tyto buňky se mohou použít pro přípravu

• toto »· ·· • · · · ·· • to • « ·· ·« • · • · to··· ·· • · · « to ·· «· · to • to léčivého přípravku pro pacienty. Zvláště výhodné provedení komplexu LMW-PEI s konstruktem nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu spočívá v léčení nemoci, přičemž příprava léčivého přípravku obsahuje vnesení konstruktu nukleové kyseliny do buňky a jeho expresi, a to virově specifickou, specifickou pro cílovou buňku, metabolicky specifickou nebo nespecifickou nebo specifickou pro buněčný cyklus.

Předmětem vynálezu je dále podání savčí buňky, do které byl vložen konstrukt nukleové kyseliny pomocí LMW-PEI podle předkládaného vynálezu, pro vytvoření léčebného přípravku pro léčení nemoci. Např. se mohou získat endotelové buňky z krve, na které se působí vektorem podle předkládaného vynálezu a pak se mohou např. intravenózně injikovat pacientovi. Takové in vitro transfekované buňky se mohou také v kombinaci s vektorem podle předkládaného vynálezu podat pacientovi. Touto kombinací se rozumí, že buňky a vektory se podají nebo injikují bud' současně nebo v různých okamžicích a na stejné místo nebo na různá místa.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

1. Metody

a) Příprava nízkomolekulárního polyetyleniminu (LMW-PEI)

LMW-PEI se získal z aziridinu plymerizací otevřením kruhu ve vodném roztoku za kyselé katalýzy. K tomu se např. 10% roztok monomérního etyleniminu ve vodě (5 ml monomeru etyleniminu + 45 ml destilované vody, rozpustit mícháním) po 4 dny při teplotě 50 °C s přídavkem 1% (0,5ml) kocentrované kyseliny chlorovodíkové (37%) jako katalyzátoru míchal a rotoval a nakonec při teplotě místnosti vakuově usušil. Stáno15 ·· ·· • · · • ·· • · • · ···· »« ·· • · · • · · • · · • · ·· ·· ··· · ·« • c • · ··· · • · ·· «· «· vení molekulové hmotnost se provedlo pomoci měření rozptylu laserového světla (fotometr rozptýleného světla Wyatt Dawn DSP) při 663 nm po přímém vstřiku do měřící buňky K5. Molární hmotnost se stanovila na základě kalibrační konstanty určené pomocí toluolu a známé zkušební navážky.

Stanovení molekulové hmotnosti pomocí analýzy rozptylu světla poskytlo hodnotu 2000 Da. Pro srovnání komerčně dostupný PEI (Fluka, Neu Ulm) měl v odpovídající analýze rozptylu světla hodnotu 791 kDa (HMW-PEI).

Oba preparáty (LMW-PEI a HMW-PEI) byly srovnatelně testovány .

b) Příprava polynukleotidového komplexu

Příprava komplexu plazmidové DNA s PEI probíhala podle postupu, který popsali Poussif et al. (Proč. Nati. Acad. Sci. USA 92: 7297-7301). 9 mg 50% roztoku komerčně dostupného HMW-PEI, případně 9 mg LMW-PEI se rozpustilo v 9 ml bidestilované vody, pH se nastavilo pomocí IN HCl na 7,4 a objem se doplnil vodou na celkový objem 10 ml. Hotový roztok se sterilizoval filtrací (0,2 pm) a mohl se při 4 °C skladovat delší čas.

Pro vytvoření komplexu se 10 pg plazmidu s různým množstvím základního roztoku PEI naředilo 150mM NaCl ne celkový objem 250 pl a na vortexu promíchalo. Přehled poměrů navážek a ekvivalentů komplexu uvádí tabulka 1. Po lOminutové inkubaci při teplotě místnosti se roztok postupně přikapával k roztoku plazmidu a rozmíchal na vortexu. Komplexy se ještě jednou po 10 minut inkubovaly než se přidaly do média buněčných kultur.

- 16 c) Posunový test v agaróze („agarose shift assay)

Vazebná kapacita různých PEI pro plazmid se kontrolovala pomocí posunového testu v agaróze („agarose shift assay) . K tomu se vytvořily komplexy z 1,35 μα až 27 pg HMWPEI a 2,7 pg až 90 pg LMW-PEI a vždy 10 pg plazmidu (tab. 1) . 50μ1 alikvoty se nanesly na asi 5,5 cm silný gel z 1% (hmotnost/objem) agarózy a dělily se v Tris-EDTA pufru o hodnotě pH 7,4 při 80 mV po 2 hodiny. Poloha DNA byla zviditelněna reakcí s etidiumbromidem při 254 nm.

Pro uvolnění plazmidu z komplexu se přidalo k 10 μg DNA-komplexu 50 μΐ, popřípadě 100 μΐ, roztoku dextransulfátu (m. h. 5000, 10 mg/ml, Sigma, Deisenhofen) 30 minut po vytvoření komplexu.

d) Buněčné kultury

Myší fibroblasty L929 byly kultivovány za standardních podmínek odborníkovi dobře známých. Buňky se nasadily v hustotě 8000 buněk/jamka na 96-jamkovou kultivační misku a pak se dalších 24 hodin kultivovaly, než se přikročilo k testování cytotoxicity.

Kultivace fibroblastů 3T3 probíhala zrovna tak za standardních podmínek.

Buňky ECV 304 (ATCC, Rockville, MD), což je linie spontánně transformovaných, adherentních lidských endotelových buněk, která byla založena ze zdánlivě normálních buněk z corda umbilicalis, se kultivovaly v médiu DMEM (Eagle, modifikoval Dulbecco)(Gibco, Eggenstein) s 5% fetálním telecím sérem (FKS), 5% koňským sérem a 1% N-acetyl-L-alanyl-Lglutaminem (vše Gibco, Eggenstein).

Buňky se kultivovaly při 37 °C, 95% relativní vdušné vlhkosti a 5% koncentraci C0₂ a 2x týdně se po dosažení konfluence pasážovaly pomocí roztoku trypsin/EGTA (2,5% zásobní • ·

- 17 roztok trypsinu, 50mM kyselina etylenglykoltetraoctová, PBS pH 7,4, v poměru 1:1:8). Tam, kde se buňky neoddělily jednotlivě od podkladu, ale vytvářely shluky buněk, se provedla 1/8 pasáž.

Endotelové buňky mozkových kapilár se izolovaly a kultivovaly způsobem, který popsali Bowman et al. (Ann. Neurol. 14: 396-402, 1983) a Mischek et al.(Cell Tissue Res. 256: 221-226, 1989). Pro pokusy s transfekcí se buňky bezprostředně po izolaci nasadily do 6-jamkových kultivačních misek a kultivovaly až do dosažení přibližně 50% konfluence.

e) Studie cytotoxicity

Toxicita polymeru se stanovila MTT-testem na myších fibroblastech L92 9 způsobem, který popsal Mosmann et al. (J. Immunol. Methods 65: 55-63, 1983) . Připravila se ředicí řada polymeru v DMEM s 10% FKS a 2mM glutaminem a sterilizovala se filtrací (0,2 pm, Schleicher und Schuell, Dassel). Pokud to bylo zapotřebí, byla upravena pH a osmolarita roztoku. Po 24hodinové pre-inkubaci se buňky umístily do roztoků polymeru a inkubovaly 1, 3, 12 a 24 hodin. Životaschopnost buněk se kvantifikovala fotometricky v UV-oblasti měřením koncentrace formazanu.

Ve druhé sérii experimentů se obecně na buňky působilo polymerem jen 1 hodinu, pak se buňky opláchly a dále se kultivovaly v médiu pro buněčné kultury bez PEI po dobu 3, 12 a 24 hodin. Vyhodnocení se provedlo stejným způsobem jako je popsáno výše.

f) Transfekce

Myší fibroblasty 3T3 nasazené na Petriho miskách o velikosti 3cm², buňky ECV304 a primární endotelové buňky nasazené na 6jamkových kultivačních miskách, se bezprostředně • ·

- 18 • ·· »

před pokusem opláchly PBS pH 7,4 a doplnilo se čerstvé médium se sérem. Komplexy HMW-PEI a LMW-PEI, odpovídající množství 3,3 pg na každou jamku nebo misku, byly přidány a dále při 37 °C inkubovány. Buňky se po té ještě celkem inkubovaly následujících 60 hodin a pak se stanovila aktivita luciferázy, popřípadě β-galaktosidázy, podle kapitoly 9 a podle údajů výrobce. (Komplexy HMW-PEI, popřípadě LMW-PEI, jsou odpovídající vektory, neboť, obsahují HMW-PEI, popřípadě LMW-PEI, a nukleovou kyselinu, v tomto případě plazmidovou DNA. )

Příklad 2

Výsledky

a) Fyzikálně-chemické vlastnosti PEI

Chování polymeru s ohledem na jeho reakci v endozomolyzozomovém kompartmentu se určovalo studiemi bobtnání při různých hodnotách pH v rozmezí 4 až 10 v 0,1M fosforečnanovém pufru. Zatímco se HMW-PEI rozpouštěl při pH 9 a 10 za vzniku jasného roztoku a bez zbytků, při pH 8 byl pozorován intenzivní zákal. Tento zákal byl při pH 7 a 8 velmi stabilní. Sedimentace se objevila až po několika hodinách. Při hodnotách pH v kyselé oblasti došlo během 30 minut k tvorbě sedimentu, který mohl být snadno resuspendován. LMW-PEI za stejných podmínek nejevily žádný zákal ani sraženinu, ale dávaly čirý roztok.

b) Studie cytotoxicity

Toxicita PEI se stanovila in vitro na myších fibroblastech L929, které jsou různými organizacemi doporučovány jako standardní model buněčné kultury pro testování cytotoxicity a biokompatibility. V předchozích pokusech byla stanovena • · · ·

- 19 přímá, lineární závislost (přímá úměra) mezi měřenou absorpcí vytvořeného formazanu a počtem buněk v rozmezí lxlO³ až 3x10⁴ buněk. K buňkám v koncentraci 8000 buněk/jamka se po 24hodinvé růstové pauze přidal roztok polymeru a dále se kultivovaly po 1, 3, 12 a 24 hodin. Pozorované toxické působení HMW-PEI a LMW-PEI v rozmezí 0-0,1 mg/ml bylo v časovém úseku 24 hodin závislé na koncentraci a čase, přičemž profily cytotoxicity pro HMW-PEI a LMW-PEI jsou výrazně odlišné. Takže hodnota IC₅₀ pro HMW-PEI leží mezi 0,06 mg/ml (inkubace 1 hodinu) a 0,04 mg/ml (inkubace 24 hodin), zatímco pro LMWPEI koncentrace od 0,1 do 1,0 mg/ml byla toxická teprve po 12hodinové inkubaci a IC₅₀ hodnota, stanovitelná teprve po 24 hodinách inkubace, byla přibližně 0,1 mg/ml.

c) Posunový test v agaróze („agarose shift assay)

Aby se stanovily optimální vazebné poměry a také poměry množství mezi plazmidem a PEI, vytvořily se komplexy z konstantního množství plazmidu (10 gg) a různých koncentrací HMW-PEI a LMW-PEI podle rozpisu a pak se analyzovaly elektroforézou. Tabulka 1 ukazuje přehled poměrů navážek zkoumaných komplexů, objemů a použitých základních roztoků a absolutního množství PEI.

a)

Poměr navážek	Objem základního	Absolutní množství
plazmid/HMW-PEI	roztoku	PEI
(ekvivalenty)	(μΐ)	(μ9)
1 + 1	3	1,35
1+6,67	20	9
1 + 10	30	13?5
1+13,33	40	18
1+20	60	27

- 20 • · «

b)

Poměr navážek	Objem základního	Absolutní množství
plazmid/HMW-PEI	roztoku	PEI
(ekvivalenty)	(μΐ)	(μ9)
1+2	3	2,7
1+13,33	20	18
1+20	30	27
1+26,67	.40	36
1+40	60	54
1+53,33	80	72
1+66,66	100	90

Tab.l.: Přehled poměrů navážek komplexů použitých pro elektroforézu a transfekce s a) HMW-PEI b) LMW-PEI

Lokalizace plazmidů a jejich komplexů se zviditelnila pomocí obarvení etidiumbromidem. DNA tvořila dva fluroeskující pásy, které odpovídají nadšroubovicové („supercoiled) a cirkulární formě plazmidů, a které se pohybovaly směrem k anodě. HMW-PEI a LMW-PEI se nedaly pomocí etidiumbromidu detekovat.

Tvorba komplexů DNA s HMW-PEI v poměru 1+1 vedla k částečné, neúplné retardaci plazmidů v místě nanesení. Menší celkový náboj a/nebo větší průměr zhoršovaly putování vznikajícíchch komplexů v gelové matrici.

Komplexy s poměrem 1+6 až 1+ 20 nebyly vůbec detekovatelné, nebot neprojevovaly žádnou fluorescenci, což poukazuje na to, že připojení etidiumbromidu k plazmidů je podmíněno účinnou kondenzací a fyzikální kompresí struktury plazmidu v důsledku HMW-PEI. Poměry anion/kation zde leží v rozmezí 1:1,2 (1+6) až 1:4 (1+20). Komplexy proto mají celkový pozitivní náboj.

• ·

- 21 2,7 μg LMW-PEI se mohlo téměř úplně vázat na 10 gg plazmidů a retardovat ho. Přesto komplex měl ještě celkový negativní náboj a orientoval se směrem k anodě. Plná kationizace a kondenzace DNA se dala pozorovat teprve při 54 gg LMW-PEI.

Pro potvrzení účinku vysokomolekulárních a nízkomolekulárních PEI, DNA byla uvolněna z hotových komplexů v nadbytku dextransulfátu, který vstupuje s kationtovým polymerem do konkurenční reakce. Jak v případě HMW-PEI tak i v případě LMW-PEI se dala DNA z komplexů zase plně nebo alespoň částečně uvolnit a mohla se pohybovat v gelové matrix. Interkalace etidiumbromidu byla zase možná a tudíž byla DNA detekovatelná pomocí fluorescence.

d) Účinnost transfekce in vitro

Účinnost transfekce komplexů PEI se stanovila jak pomocí buněčných linií (myší fibroblasty 3T3 a linie lidských endotelových buněk ECV304) tak i primárních kultur (endotelové buňky kapilár z prasečího mozku). Jako reportérovy gen zde byl použit komerčně dostupný kontrolní vektor pGL3 firmy Promega, který nese luciferázový gen řízený promotorem a enhancerem SV40. Poměry navážek komplexu týkající se plazmidů a polymeru odpovídaly těm, které byly použity při elektroforéze.

Testovala se koncentrace v rozmezí od 1,35 gg do 27 gg HMW-PEI/10 gg DNA. K maximální transfekci došlo při 18 pg HMW-PEI. Další zvýšení koncentrace polymeru vedlo k mírnému relativnímu snížení exprese luciferázy.

Pro LMW-PEI se testovala koncentrace v rozmezí 20 až 80 LMW-PEI/10 pg DNA. Proti HMW-PEI se mohla při rostoucí koncentraci LMW-PEI detekovat zvyšující se účinnost transfekce buněk ECV. Při 80 pg LMW-PEI/10 pg DNA se naměřila lOOx vyš• » • · ·· • ·· · · · • · · ·· ·· * · · · · • · · · ·· ·· ·*

- 22 š£ aktivita reportérového genu než při použiti maximálně účinné dávky HMW-PEI 18 gg/10 gg. Ani při nejvyšší použité koncentraci LMW-PEI nebyl pozorován pokles exprese luciferázy jako tomu bylo při použití HMW-PEI. Pokusy s buňkami ECV i s buňkami 3T3 poskytly zcela shodné výsledky.

Pro srovnání byly provedeny transfekční studie s β-galaktosidázou jako reportérovým genem také na primárních kulturách endotelových buněk, a sice s maximálními netoxickými dávkami (MTD) LMW-PEI a HMW-PEI komplexů. Hodnoty MTD in vitro byly 13,5 pg HMW-PEI/10 pg DNA a 90 gg/10 pg LMW-PEI. Kultivované endotelové buňky z kapilár prasečího mozku, které byly inkubovány s komplexy složenými z 10 gg DNA a 13,5 gg HMW-PEI se daly sotva transfekovat. Pouze 2 až 3 buňky v každé kultivační misce (případně jamce) ukázaly charakteristické modré zabarvení v oblasti buněčného jádra. Míra úspěšnosti transfekce byla pod 1 % všech ošetřených buněk. Naopak inkubace s komplexem složeným z 90 pg LMW-PEI a 10 gg DNA vedla k výrazné expresi markerového proteinu v endotelových buňkách. Podíl modře zbarvených buněk v kultivačních miskách/jamkách vzhledem k celkovému počtu, tj . míra úspěšnosti transfekce, byla mezi 5 až 10 %. V žádném případě nebyly světelným mikroskopem pozorovatelné toxické účinky komplexů polymer/DNA na buňku.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Vektor pro vnesení nukleové kyseliny do buňky, který obsahuje nízkomolekulární polyetylenimin (LMW-PEI) a nukleovou kyselinu, přičemž LMW-PEI má molekulovou hmotnost pod 50 000 Da.
2. Vektor podle nároku 1, kde LMW-PEI má molekulovou hmotnost od 500 do 30 000 Da.
3. Vektor podle jednoho nebo několika z nároků 1 a 2, kde LMW-PEI má molekulovou hmotnost od 1000 do 5 000 Da.
4. Vektor podle jednoho nebo několika z nároků 1 a 3, kde LMW-PEI má molekulovou hmotnost 2000 Da.
5. Vektor podle jednoho nebo několika z nároků 1 a 4, kde nukleová kyselina je konstrukt virové nebo nevirové nukleové kyseliny.
6. Vektor podle jednoho nebo několika z nároků 1 a 5, kde konstrukt nukleové kyseliny obsahuje jeden nebo více efektorových genů.
7. Vektor podle jednoho nebo několika z nároků 1 a 6, kde alespoň jeden efektorový gen kóduje farmakologický účinnou látku nebo její předlékovou formu.
8. Vektor podle jednoho nebo několika z nároků 1 a 7, kde alespoň jeden efektorový gen kóduje enzym.

- 24
9. Vektor podle jednoho nebo několika z nároků 1 a 8, kde alespoň jeden efektorový gen je exprimován jako fúzní protein s buněčně specifickým ligandem.
10. Vektor podle jednoho nebo několika z nároků 1 až 9, kde LMW-PEI je spojen s buněčně specifickým ligandem.
11. Vektor podle jednoho nebo několika z nároků 1 až 10, kde buněčně specifický ligand se váže na vnější membránu cílové buňky.
12. Vektor podle jednoho nebo několika z nároků 1 až 11, kde cílová buňka je endotelová buňka, svalová buňka, makrofág, lymfocyt, gliová buňka, krvetorná buňka, nádorová buňka, buňka infikovaná virem, buňka bronchiálního epitelu nebo jaterní buňka.
13. Vektor podle jednoho nebo několika z nároků 1 až 12, kde poměr hmotností LMW-PEI a nukleové kyseliny je 3:1 nebo vyšší .
14. Vektor podle jednoho nebo několika z nároků 1 až 13, kde poměr hmotností LMW-PEI a nukleové kyseliny je 8:1 nebo vyšší .
15. Způsob přípravy nízkomolekulárního polyetyleniminu (LMW-PEI) s molekulovou hmotností pod 50 000 Da, vyznačující se tím, že monomerní etylenimin se polymerizuje ve vodném roztoku přidáním kyseliny chlorovodíkové .

- 25
16. Způsob podle nároku 15, vyznačující se tím, že vodný roztok je 0,1% až 90% roztok monomerního etyleniminu a 0,1% až 10% roztok koncentrované kyseliny chlorovodíkové.
17. Způsob podle jednoho nebo několika z nároků 15 a 16, vyznačující se tím, že polymerizace se provádí při reakční teplotě od 30 °C do 70 °C.
18. Způsob podle jednoho nebo několika z nároků 15 až 17, vyznačující se tím, že reakční čas je 1 den až 30 dní.
19. Nízkomolekulární polyetylenimin s molekulovou hmotností pod 50 000 Da, který byl připraven způsobem podle jednoho nebo několika z nároků 15 až 18.
20. Použití nízkomolekulárního polyetyleniminu s molekulovou hmotností pod 50 000 Da pro přípravu vektoru podle jednoho nebo několika z nároků 1 až 14.
21. Způsob přípravy vektoru podle jednoho nebo několika nároků 1 až 14, vyznačující se tím, že se smíchá odpovídající množství LMW-PEI s odpovídajícím množstvím nukleové kyseliny ve vodném roztoku.
22. Použití vektoru podle jednoho nebo několika z nároků 1 až 14 pro vnesení DNA do buňky.
23. Použití vektoru podle nároku 22, kde buňka je endotelová buňka, lymfocyt, makrofág, jaterní buňka, fibroblast, svalová buňka nebo epitelová buňka.

• · « ·
24. Způsob přípravy transfekovaná buňky vyznačující se tím, že se vektor podle jednoho nebo několika z nároků 1 až 14 inkubuje in vitro s takovou buňkou.
25. Transfekovaná buňka, která obsahuje vektor podle jednoho nebo několika z nároků 1 až 14.
26. Použití transfekované buňky podle nároku 25 pro přípravu léčiva.
27. Použití nízkomolekulárního polyetyleniminu podle nároku 19 pro přípravu léčiva.

28 . Použití vektoru podle j ednoho nebo několika z nároků 1 až 14 pro přípravu léčiva. 29 . Použití vektoru podle j ednoho nebo několika z nároků 1 až 14 pro přípravu léčiva pro genovou terapii. 30 . Způsob přípravy léčiva, v y z n a č u j í c í s e

tím, že nukleová kyselina se smíchá s LMW-PEI.
31. Léčivo vyznačující se tím, že obsahuje vektor podle jednoho nebo několika z nároků 1 až 14.
32. Léčivo vyznačující se tím, že obsahuje

LMW-PEI podle nároku 19.
33. Léčivo vyznačuj ící se t í m, že obsahuje transfekovanou buňku podle nároku 25.