DE19956029A1 - Trägersysteme enthaltend Hüllsubstanzen mit enzymatisch abspaltbaren Seitengruppen - Google Patents

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf ein Trägersystem DOLLAR A (1) gegebenenfalls Mischung einer Komponente a2) mit einer Komponente a1) im molaren Verhältnis [a2) : a1)] von 1 : 1 bis 1000 : 1, vorzugsweise zwischen 10 : 1 und 100 : 1 DOLLAR A (2) Mischung des aus Schritt (1) resultierenden Komplexes oder der Komponente a1) alleine mit einer Komponente b1), bevorzugterweise im molaren Verhältnis b1) : a1) + ggf. a2) von 1 : 1 bis 1 : 1000, wobei das Mischungsverhältnis so eingestellt wird, daß die Nettobeladung des resultierenden Gesamtkomplexes vorzugsweise neutral oder anionisch ist, DOLLAR A wobei DOLLAR A - Komponente a1) DOLLAR A È einen Wirkstoff a1) DOLLAR A È eine Bindestruktur a1) für die Bindestrukturen b1) oder a2), DOLLAR A wobei der Wirkstoff a1) die Bindestruktur a1) enthalten kann; enthält, DOLLAR A - Komponente a2) DOLLAR A È eine Bindestruktur a2) für die Bindestruktur a1) DOLLAR A È einen Träger a2), welcher die Bindestruktur a2) enthalten kann; enthält, DOLLAR A und DOLLAR A - Komponente b1) DOLLAR A È eine Bindestruktur b1) für die Bindestruktur a1), für den Wirkstoff a1), für die Bindestruktur a2) oder für den Träger a2), DOLLAR A È eine Hüllsubstanz, welche die Bindestruktur b1) enthalten kann, DOLLAR A È einen enzymatisch spaltbaren Verbindungsteil, DOLLAR A È eine anionische Seitengruppe; DOLLAR A enthält, seine Herstellung und Verwendung.

Description

Zahlreiche Tägermaterialien für Wirkstoffe sind bislang entwickelt worden. Zu diesen Wirkstoffen zählen beispielsweise Nukleinsäuresequenzen, Peptide, Proteine, Glykoproteine und Glykolipide wie auch Arzneimittel. Ein wesentliches Ziel dieser Trägermaterialien ist es, den Wirkstoff vor dem Abbau im Körper und/oder vor seiner schnellen Ausscheidung zu schützen.

Ein weiteres Ziel dieser Trägermaterialien ist, den Kontakt des Wirkstoffes mit seiner Zielzelle, in welcher der Wirkstoff seine Wirkung entfalten soll, zu vermitteln.

Besondere Bedeutung haben diese Trägermaterialien in der Gentherapie. So sind virale wie auch nicht virale Vektoren bekannt. Während bei viralen Vektoren die Trägermaterialien die Virushüllproteine darstellen, sind für nicht virale Vektoren kationische Lipide und kationische Polymere als Trägermaterialien entwickelt worden. Mit Hilfe dieser kationischen Substanzen wurden Nukleinsäuresequenzen komplexiert und diese Komplexe als solche dem Organismus verabreicht.

Die bisherige Erfahrung mit solchen Vektoren bei der Gentherapie unterschiedlichster Erkrankungen, insbesondere jedoch von Tumorerkrankungen, zeigt, daß nach Verabreichung eines gentherapeutischen Vektors in den Kreislauf eines Organismusses dieser Vektor in kurzer Zeit aus dem Kreislauf eliminiert wird und für die Bindung an die Zielzellen und zur Transfektion dieser Zielzellen nicht mehr zur Verfügung steht (Ogris et al. Gene Ther. 6: 595, 1999; Dash et al., Gene Ther. 6: 643, 1999; Li et al., Gene Ther. 5: 930, 1998; Liu et al. Gene Ther. 4: 517, 1997).

Diese Elimination kann erfolgen durch Degradation der DNA oder durch schnelle Ablagerung der Vektoren in der Lunge, der Leber oder dem sogenannten retikuloendothelialen System (RES), besonders in der Milz und den Lymphknoten (Zhu et al., Science 261 : 209, 1993).

Die Ursachen der schnellen Elimination sind vielgestaltig. Sie können sein eine zu große negative oder positive Ladung, ein zu großes Volumen oder eine Opsonierung der Vektorpartikel durch Blutproteine. Bei viralen Vektoren können sie des weiteren sein die Bindung der Virushüllproteine an virusspezifische Rezeptoren in den Organen und/oder auch Antikörper oder Immunzellen, spezifisch für die Viren, welche an die Vektoren binden und diese hierdurch eliminieren.

Die bisherige Erfahrung zeigt des weiteren, daß die Kopplung oder Einfügung eines zielzellspezifischen Liganden in den Vektorkomplex dessen schnelle Elimination nach Verabreichung in den Blutkreislauf nicht wesentlich vermindert.

In Kenntnis dieser Probleme besteht die dringliche Notwendigkeit nach neuen Zubereitungen von Vektoren, die es ermöglichen, daß Vektoren möglichst lang im Kreislauf verbleiben und nicht vorzeitig aus dem Kreislauf eliminiert werden. Um die Elimination von kationischen Lipiden oder kationischen Polymeren im Komplex mit Nukleinsäuresequenzen aus dem Blutkreislauf zu vermindern, wurde Polyethylenglykol (Senior et al., Biochim. Biophys. Res. Acta 1062: 77, 1991; Mori et a1., FEBS Lett 284: 263, 1991; Ogris et al., Gene Ther. 6: 595, 1999), Vinylpolymere (Torchilin et al., Biochim. Biophys. Res. Acta 1195: 181, 1994) oder andere amphipatische Polymere (Woodle et al., Bioconjugat. Chem. 5: 493, 1994) an die kationischen Lipide oder kationischen Polymere gekoppelt oder mit Hilfe negativ geladener Lipide anionische Liposomen hergestellt, in welche die Nukleinsäuresequenzen im Komplex mit kationischen Lipiden oder kationischen Polymeren eingeschlossen waren (US Patent Nr. 4,946,787; US Patent Nr. 4,245,737; US Patent Nr. 5,480,463; Heywood und Eanes, Calc. Tissue Int. 40: 149, 1992; Lee und Huang, J. Biol. Chem. 271: 8481, 1996; Balicki und Beutler, Blood 88: 3884, 1996; Lucie et al., J. Lip. Res. 8: 57, 1998; Lakkaraju et al., J. Lip. Res. 8: 74, 1998; Turner et al., J. Lip. Res. 8: 114, 1998; Schoen et al., J. Lip. Res. 8: 485, 1998).

Derartige Modifikationen führten beispielsweise zu einer Stabilisierung der Vektorpartikelgröße, inhibierten die Aggregation der Vektoren mit sich selbst oder mit Blutzellen, reduzierten die Opsonierung von Vektoren durch Bindung von Immunglobulinen, Complementfaktoren, Fibrinogen oder Fibronektin, schützten (adeno-)virale Vektoren vor der Elimination durch Antikörper (Chillon et al., Gene Ther. 5: 995, 1998) und bewirkten eine Verlängerung der Blutverweilzeit von Vektoren, eine deutlich stärkere Anreicherung in subkutan wachsende Tumoren und eine Transduktion der Tumorzellen (Ogris et al., Gene Ther. 6: 595, 1999).

Zugleich konnte jedoch auch in der Lunge, der Milz und der Leber eine beträchtliche Anreicherung der Vektoren und Transduktion der Gewebezellen in diesen Organen festgestellt werden (Ogris et al., Gene Ther. 6: 595, 1999), so daß gefolgert werden kann, daß beispielsweise die Kopplung von PEG zwar eine Verbesserung, aber noch längst keine Optimierung der Verteilung von Vektoren bewirkt.

Um z. B. vor einer schnellen Elimination aus dem Körper zu schützen, wurden auch Arzneimittel in Liposomen eingepackt. Bevorzugt wurden hierfür anionische Liposomen verwendet, da diese nur gering an Zellen binden und nur mit geringer Geschwindigkeit aus dem Körper eliminiert werden.

Anionische Liposomen werden in verschiedener Weise hergestellt, so beispielsweise durch Verwendung von Substanzen, welche Retroviren in ihre Virushülle einbauen (Schreier et al. 1992, 1993, 1995) oder durch Einfügung von Dicarbonsäuren oder durch Bindung von Schwefelsäure (Ahl et al. 1995; Li und Wu 1999), Glucuronsäure oder Phosphorsäure (Oku et al., Biochem. Biophys. Res. Acta 1280, 149 (1990); Namba et al., Chemical and Pharmaceut. Bullet. 38, 1663 (1990); Hu et al., Biochem. Biophys. Res. Acta 1299, 252 (1996)).

Liposomen, die beispielsweise durch Glucuronsäure oder durch die Daicetylphosphat (CDP), Phosphatidylglycerol oder Phosphatidylserin modifiziert wurden, zeigten eine deutlich verminderte Bindung an Serumproteinen und eine verlängerte Blutverweilzeit als nicht modifizierte neutrale oder kationische Liposomen (Oku et al., Biochem. Biophys. Res. Acta 1280, 149 (1996); Nurahashi et al., Biol. Pharmac. Bill. 18, 82 81995); Namba et al., Chem. Pharmac. Bull. 38, 1663 (1990)).

Schon früh wurde versucht, durch Einbau von Glycolipiden oder Glycopeptiden in die Lipidschicht von Nanopartikeln solche Trägersysteme herzustellen, welche aktivierbar waren durch Enzyme. Ein ausgewähltes Enzym, z. B. β-Glucuronidase, beispielsweise freigesetzt in Tumoren oder eingebracht in Tumoren über die Verabreichung eines Antitumorantikörper-β-Glucuronidase-Fusionsproteins, sollte hierbei den Zucker (z. B. Glucuronsäure) von den eingebauten Glykoüpiden bzw. Glykopeptiden abspalten und hierdurch zu einer Erhöhung des pH-Wertes (Kationisierung) und der Lipophilie des Nanopartikels führen. Durch diese Veränderung sollte das Nanopartikel den Träger an die benachbarten Zellen binden und mit der Zellmembran verschmelzen oder zerfallen. In dem Nanopartikel eingeschlossene Wirkstoffe, z. B. Zytostatika, sollten so am Ort der Expression des aktivierten Enzyms freigeseigt werden (Sedlacek et al., Contributions to Oncology 43, 132 (1992)).

Zwar konnte das Wirkprinzip am Beispiel von Glucuronsäurekonjugaten spaltbar durch β-Glucuronidase belegt werden (Sedlacek et al., Contributions to Oncology 43, 132 (1992)), jedoch zeigten Nanopartikel, in deren Lipidschicht Glucuronsäurekonjugate eingefügt worden waren, eine beträchtliche strukturelle Instabilität.

Ähnliches war bei Einbau von Orosomucoid (α1-saures Glykoprotein), einem neuraminsäurehaltigen, anionischen Plasmaprotein, in die Lipidschicht von Liposomen zu beobachten. Dieser Einbau führt zu einer beträchtlichen osmotischen Sensitivität der Liposomen für Wasser und Alkali wie auch Erdalkaliionen und zur Zerstörung dieser Liposomen (Neitchev et al., Mol. Biol. Reports 11, 87 (1986); Int. J. Biochem. Cell Biol. 29, 689 (1997)).

Bislang liegen somit noch keine Wirksubstanzen enthaltende stabile Trägersysteme vor, deren wesentliche Komponenten Hüllsubstanzen sind, die enzymatisch abspaltbare anionische Seitengruppen tragen, welche für die Stabilität des Trägersystems entscheidend sind, so daß nach Abspaltung dieser anionischen Seitengruppen das Trägersystem zerfällt und die Wirksubstanzen freigegeben werden.

Allgemeine Beschreibung der Erfindung

Gemäß der vorliegenden Erfindung besteht das Trägersystem aus den in den Fig. 1, 2 und 3 dargestellten Komponenten.

Ein Gegenstand der Erfindung ist ein Trägersystem enthaltend folgende Komponenten:

• - eine Komponente a1), enthaltend
  • - einen Wirkstoff a1),
  • - eine Bindestruktur a1) für die Bindestrukturen b1) oder a2),
    wobei der Wirkstoff a1) die Bindestruktur a1) enthalten kann;
• - optional eine Komponente a2), enthaltend
  • - eine Bindestruktur a2) für die Bindestruktur a1)
  • - einen Träger a2), welcher die Bindestruktur a2) enthalten kann; und
• - eine Komponente b1), enthaltend
  • - eine Bindestruktur b1) für die Bindestruktur a1), für den Wirkstoff a1), für die Bindestruktur a2) oder für den Träger a2),
  • - eine Hüllsubstanz, welche die Bindestruktur b1) enthalten kann,
  • - einen enzymatisch spaltbaren Verbindungsteil,
  • - eine anionische Seitengruppe.

Demgemäß ist die Komponente a2) im Trägersystem entweder enthalten oder nicht enthalten.

Gemäß der Erfindung ist die Gesamtladung des aus den Komponenten a1), ggf. a2) und b1) bestehenden Trägersystems neutral oder anionisch. Durch diese Gesamtladung ist gewährleistet, daß nach Verabreichung des Trägersystems in einen Organismus, vorzugsweise in den Blutkreislauf, die Verweilzeit des Trägersystems im Blut möglichst lange ist.

Nach Abspaltung der diese anionische bis neutrale Gesamtladung gewährleistenden Seitengruppen durch Enzyme, beispielsweise freigesetzt von Tumoren oder im Rahmen von Entzündungen, der Blutgerinnung oder der Fibrinolyse oder exprimiert von Zellen nach Transfektion mit Genen, die diese Enzyme kodieren, wird das Trägersystem kationisch, verbindet sich mit benachbarten negativ geladenen Zellen und/oder zerfällt und setzt hierdurch die Komponente a) frei, die, je nach Wirkstoff (Komponente a1) entweder in die Zelle eindringt und dort ihre Wirkung entfalten kann oder aber in der Blutflüssigkeit wirkt.

Im Nachfolgenden sind die einzelnen Komponenten des erfindungsgemäßen Trägersystems und ihre Anwendungen näher beschrieben.

Komponente a1)

Komponente a1) kann eine nicht modifizierte oder modifizierte DNA-Sequenz oder eine nicht modifizierte oder modifizierte RNA-Sequenz sein. Die Nukleotidsequenz kann eine anti-DNA (Triplex) oder anti-RNA (antisense; Ribozym) Funktion ausüben oder für eine derartig wirkende RNA-Sequenz oder für ein Protein kodieren. Die Nukleotidsequenzen und ihre Modifikation kann dergestalt sein, daß die Nukleotidsequenz weitgehend resistent ist gegen den Abbau durch DNAsen oder RNAsen. Beispiele für derartige Nukleotidsequenzen und ihre Modifikationen sind in Breaker, Nature Biotechnol. 15: 427, 1997; Gerwik, Critical Reviews in Oncogenesis 8: 93, 1997; Mukhopadhyay et al., Crit. Rev. Oncogen. 7: 151, 1996; Mercola et al., Cancer Gene Ther. 2: 47, 1995; Frank-Kamenetski, Annu. Rev. Biochem. 64: 65, 1995 und Fraser et al., Exp. Opin. Invest. Drugs 4: 637, 1995 dargestellt. Die DNA- Sequenz kann linear oder zirkulär, beispielsweise in Form eines Plasmids vorliegen.

Komponente a1) kann des weiteren ein Virus darstellen, bevorzugt ein Virus, in welches mit den dem Fachmann bekannten Methoden eine für das Virus fremde Nukleinsäuresequenz eingefügt wurde. Beispiele für derartige Viren sind RTV, AV, AAV, HSV, Vaccinia Viren, Influenzaviren. Derartige und weitere Beispiele sind von Vile, Nature Biotechnol. 15: 840, 1997; McKeon et al., Human Gene Ther. 7: 1615, 1996; Flotte et al., Gene Ther. 2: 357, 1995; Jolly, Cancer Gene Ther. 1: 51, 1994; Dubensky et al., J. Virol. 70: 508, 1996 beschrieben worden.

Komponente a1) kann des weiteren darstellen ein Peptid, ein Protein, ein Glykopeptid, ein Glykolipid, ein natürliches oder synthetisches Arzneimittel oder ein für den in vivo oder ex vivo Nachweis geeigneter Stoff, wie beispielsweise ein Enzym oder eine radioaktive Substanz.

In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung ist Komponente a1) ein Antikörper, ein Fragment eines Antikörpers enthaltend die Antigenbindestelle oder ein einzelkettiges monospezifisch, bispezifisch oder multispezifisch antigenbindendes Molekül, beispielsweise hergestellt wie in der europäischen Patentanmeldung EP-A 0 952 218 beschrieben.

Zur Bindung der Komponente a1) an die Komponente a2) oder an die Komponente b1) besitzt die Komponente a1) gemäß der Erfindung Bindegruppen. Diese Bindegruppen können beispielsweise sein

• - anionische Ladungen, beispielsweise eingefügt durch Nukleinsäuren, Aminosäuren oder durch Bindung von anorganischen Säuren
• - kationische Ladungen, beispielsweise eingefügt durch basische Aminosäuren, durch Aminogruppen oder durch Bindung von anorganischen Basen
• - lipophile Gruppen, beispielsweise eingefügt durch aromatische Aminosäuren oder Fettsäuren
• - Epitope für Antikörper
• - antigenbindende Teile von Antikörpern
• - SH-Gruppen
• - Fos Leucin Zipper als Wildtyp oder mutiert wie beschrieben in der deutschen Patentanmeldung Nr. 199 00 743.8 (unveröffentlicht)
• - Jun Leucin Zipper als Wildtyp oder mutiert wie beschrieben in der deutschen Patentanmeldung Nr. 199 00 743.8.

Komponente a2)

Komponente a2) besteht entsprechend dieser Erfindung aus einem Träger, welcher mit der Komponente a1) Komplexe bilden kann und welcher zugleich Bindegruppen aufweist für die Komponente b1).

Die Komplexbildung der Komponente a2) mit der Komponente a1) und/oder die Bindung der Komponente a2) an die Komponente b1) kann beispielsweise erfolgen durch

• - kationische Ladungen
• - anionische Ladungen
• - lipophile Gruppen
• - Epitope
• - antigenbindende Teile von Antikörpern
• - Fos oder Jun Leucin Zipper als Wildtyp oder mutiert wie in der deutschen Patentanmeldung Nr. 19900743.8 beschrieben.

Die Wahl der Komponente a2) richtet sich demnach nach der Auswahl der Komponente a1) wie auch nach der Wahl der Komponente b1).

In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung stellt die Komponente a2) mindestens ein kationisches Lipid und/oder mindestens ein kationisches Polymer dar zum Beispiel

• - kationische Lipide, beispielsweise beschrieben von Kao et al., Oncology Reports 5: 625 (1998), Liu et al., J. Biol. Chem. 270, 24864 (1995), Felgner, Human Gene Ther. 7, 1791 (1996), Ledley, Human Gene Ther. 6, 1129 (1995), Goyal et al., J. Liposom. Res. 5, 49 (1995), Thierry et al., Gene Ther. 4, 226 (1997), Schofield et a1., Br. Med. Bull. 51, 56 (1995), Behr, Bioconj. Chem. 5, 382 (1994), Cotten et a1., Curr. Opin. Biotechnol. 4, 705 (1993), San et al., Human Gene Ther. 4, 781 (1993) oder
• - kationische Polymere, beispielsweise beschrieben von Boussifet al., PNAS USA 92, 7292 (1995), Kaneda et al., Science 243, 375 (1989), Keown et al., Methods in Enzymology 185, 527 (1990), Baker et al., Gene Ther. 4, 773 (1997), Fritz et al., Human Gene Ther. 7, 1395 (1996), Wolfert et al., Human Gene Ther. 7, 2123 (1996) und Solodin et al., Biochem. 34, 13537 (1995).

Zu den kationischen Polymeren gehört beispielsweise auch kationisiertes Albumin. Herstellung und Verwendung von kationisiertem Albumin wurde in der Patentanmeldung EP-A 0 790 312 beschrieben.

In einer besonderen Ausführungsform dieser Erfindung stellt die Komponente a2) ein Polyethylenimin (PEI) dar, in einer weiteren besonderen Ausführungsform dieser Erfindung besitzt des Polyethylenimin ein Molekulargewicht in einem Bereich von 500-20.000 Da und in einer weiteren Ausführungsform ein Molekulargewicht von durchschnittlich etwa 2000 Da und wurde hergestellt, wie in der Patentanmeldung EP-A 0 905 254 beschrieben.

In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung stellt die Komponente a2) Liposomen dar, hergestellt wie beispielsweise in den US-Patenten 5,252,348, 5,753,258 und 5,766,625 beschrieben. In einer weiteren besonderen Ausführungsform der Erfindung sind diese Liposomen kationisch geladen.

Komponente b1)

Komponente b1) stellt eine Hüllsubstanz dar, welche sich mit der Komponente a1) oder mit der Komponente a2) über eine Bindestruktur verbindet und welche mindestens eine über einen enzymatisch spaltbaren Verbindungsteil verbundene anionische Seitengruppe trägt. Derartige Seitengruppen können beispielsweise sein:

• - Karbonsäuren
• - Aminosäuren
• - Zucker, wie beispielsweise Glucuronsäure oder Neuraminsäure
• - gebundene anorganische Säuren, wie beispielsweise Phosphorsäuren oder Schwefelsäuren,

welche durch Enzyme, wie beispielsweise Phospholipasen, Peptidasen, Glycosidasen, Phosphatasen oder Sulfatasen abgespalten werden.

Ein besonderer Gegenstand der Erfindung sind Substanzen, die Glucuronsäuren als anionische Seitengruppen tragen, welche durch β-Glucuronidasen von dem Restkörper der Komponente b1) abgespalten werden können.

Ein weiterer besonderer Gegenstand der Erfindung sind Substanzen, die Neuraminsäure als anionische Seitengruppen tragen, welche durch Neuraminidasen von dem Restkörper der Komponente b1) abgespalten werden. Zu diesen erfindungsgemäßen Substanzen gehören beispielsweise

• - das Orosomucoid (α1-saures Glycoprotein), dessen Struktur und Isolierung aus dem Blut im Detail von Schmidt in: The Plasma Proteins, Ed. Frank Putnam, Academic Press 1975, 183-228 beschrieben wurde.
• - weitere neuraminsäurehaltige Plasmaproteine, wie von Clamp in: The Plasma Proteins, Ed. Frank Putnam, Academic Press 1975,1 63-206 beschrieben, insbesondere solche Plasmaproteine, welche mehr als 4% ihres Molekulargewichtes an Neuraminsäure tragen, wie beispielsweise das Corticosteroid-bindende Protein, Haptoglobin, Hemopexin, a1-Antichymotrysin, α-HS-Glycoprotein, ß2-Glycoprotein I und ß2-Glycoprotein III (Clamp 1975)
• - neuraminsäurehaltige Glycosphingolipide, wie beispielsweise GM1, GM2, GM3, GD3 und GT3, insbesondere jedoch solche Ganglioside und deren Derivate, deren Neuraminsäuren durch Neuraminidase leicht abspaltbar sind wie beispielsweise GM3, GD3, 0-acetyl GD3 und 0-acetyl GT3 (Rodriguez et al., J. Lipd Res. 37, 382 (1996)).

Der enzymatisch spaltbare Verbindungsteil zur anionischen Seitengruppe der Komponente b1) kann eine beliebige in der Natur vorkommende, enzymatisch spaltbare Verbindung, wie beispielsweise eine Esterbindung, glykosidische Bindung oder Peptidbindung, darstellen.

In einer besonderen Ausführungsform dieser Erfindung ist der enzymatisch spaltbare Verbindungsteil so ausgewählt, daß er weitgehend spezifisch durch Plasminogenaktivator, Plasmin, Prostataspezifisches Antigen, Cathepsine, Stromelysine oder Collagenase gespalten werden kann.

Für folgende Enzyme können beispielsweise folgende enzymatisch spaltbare Verbindungsteile eingesetzt werden (Barrett et al., Mammalian Proteases, Academic Press, London (1980), Panchal et al., Nature Biotechnol. 14, 852 (1996); Pigott et a1., Ayad et al., The extracellular Matrix, Academic Press (1994); Yoshida et al., Int. J. Cancer 63, 863 (1995), Petersen et al., J. Biol. Chem. 265, 6104 (1990); Cramer et al., J. Urology 156, 526 (1995); Forsgen et al., FEBS Lett. 213, 254 (1987)):

Die Definition der Aminopositionen (S1-S6 und S-1, S-2) erfolgte nach Schechter und Berger, Biochem. Biophys. Res. Commun. 27, 157 (1967).

In einer weiteren besonderen Ausführungsform ist das Enzym, welches den erfindungsgemäßen enzymatisch spaltbaren Verbindungsteil spaltet, ein intrazelluläres Enzym.

Dieses intrazelluläre Enzym kann ein lysosomales Enzym aber auch ein zytoplasmatisches Enzym sein. Lysosomale Enzyme wie auch zytoplasmatische Enzyme werden bei der Entzündung oder einem anderen Krankheitsprozeß, in welchem Zellen aktiviert werden und/oder absterben und zerfallen, freigesetzt.

In einer besonderen Ausführungsform ist das zytoplasmatische Enzym eine Caspase. Spaltsequenzen für Caspasen sind von Cryns und Yuan, Genes and Developm. 12, 1551 (1998) und Gross et al., EMBO J. 17, 3878 (1998) beschrieben worden.

Für folgende intrazelluläre Enzyme können beispielsweise folgende Aminosäuresequenzen als enzymatisch spaltbare Verbindungsteile eingesetzt werden:

In einer weiteren besonderen Ausführungsform ist das intrazelluläre Enzym eine virusspezifische Protease. Beispielsweise exprimieren Retroviren eine Aspartylprotease, die notwendig ist für die Produktion infektiöser Viren. Derartige virusspezifische Proteasen werden beim Tod und Zerfall von virusinfizierten Zellen freigesetzt.

Für folgende virale Enzyme können beispielsweise folgende Aminosäuresequenzen (Menendez et al., Virol. 196, 557 (1993))als enzymatisch spaltbarer Verbindungsteil eingesetzt werden:

Analog können als enzymatisch spaltbarer Verbindungsteil eingefügt werden Spaltsequenzen für Proteasen exprimiert von beispielsweise

• - Poliovirus
  (Hellen et al., J. Virol. 66, 3330 (1992), Mirzayan et al., J. Gen. Virol. 72, 1159 (1991), Pallai et al., J. Biol. Chem. 264, 9738 (1989), Kean et al., J. Gen. Virol. 71, 2553 (1990))
• - Influenzaviren
  (Klenk et al., Mol. Recognition in Host Parasite Interactions Vol. 61, Proc. No. 55662 (1991), Hosoga et al., Antiviral Res. 26, A348 (1995))
• - Epstein Barr Virus
• - Herpes simplex Viren
  (Steffy et al., J. Gen. Virol. 76, 1069 (1995), Robertson et al., J. Virol. 70, 4317 (1996), DiJanni et al., J. Biol. Chem. 268, 2048 (1993), Matusick-Kumar et al., J. Virol. 69, 4347 (1995))
• - Hepatitis Viren wie
  - HBV (Hwang et al., Chinese J. Microbiol. Immunol. 24, 71 (1991))
  - HAV (Probst et al., J. Virol. 71, 3288 (1997), Martin et al., Virol. 213, 213 (1995), Schultheiss et al., J. Viol. 69, 1727 (1995))
  - HCV (Ingallinella et al., Biochem. 37, 8906 (1998), Suzuki et al., J. Gen. Viol. 76, 3021 (1995), Reed et aL, J. Virol. 69, 4127 (1995), Shimizu et al., J. Virol. 70, 127 (1996))
• - Pockenvirus
• - Cytomegalievirus
  (Qiu et al., Nature 383, 275 (1996), La Femina et al., J. Virol. 70, 4819 (1996), Jones et al., J. Virol. 68, 3742 (1994))
• - Dengue-Virus
  (Biedrzycka et al., J. Gen. Virol. 68, 1317 (1987))

Ein weiterer besonderer Gegenstand der Erfindung sind enzymatisch spaltbare Verbindungsteile, welche über einen Spacer mit der Hüllsubstanz verbunden sind.

Vorzugsweise ist der Spacer derart beschaffen, daß er nach Abspaltung der anionischen Seitengruppe zerfällt. Derartige Spacer sind beispielsweise in der Patentanmeldung Jacquesy et al, EP-A 0 511 917 beschrieben, auf welche ausdrücklich Bezug genommen wird. Dieser Spacer ist beispielsweise über einen durch β-Glucuronidase spaltbaren Verbindungsteil mit β-Glucuronsäure und an seinem entgegengesetzten Ende mit einer lipophilen Substanz verbunden.

Die Bindestruktur der Hüllsubstanz vermittelt die Bindung der Komponente b1) an die Komponente a1) oder a2).

Die Bindestruktur der Hüllsubstanz kann darstellen:

• - eine anionische Ladung, falls die Komponente a), a1) oder a2) kationische Ladung aufweist
• - eine kationische Ladung, falls die Komponente a), a1) oder a2) anionische Ladung aufweist eine Lipophilie, falls die Komponente a), a1) oder a2) lipophile Gruppen trägt
• - Epitope, falls die Komponente a), a1) oder a2) antigenbindende Teile eines Antikörpers enthält
• - antigenbindenden Teile eines Antikörpers, falls die Komponente a), a1) oder a2) die korrespondierenden Epitope trägt
• - Fos Leucin Zipper-Anteil vom Wildtyp oder mutiert, falls die Komponente a), a1) oder a2) den korrespondierenden Jun Zipper besitzt
• - Jun Leucin Zipper-Anteil vom Wildtyp oder mutiert, falls die Komponente a) den korrespondierenden Fos Zipper besitzt.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Bindestruktur identisch mit der anionischen, durch einen enzymatisch spaltbaren Verbindungsteil mit der Hüllsubstanz verbundenen Seitengruppe.

Die Hüllsubstanz kann ein beliebiges Peptid, Protein, Lipid, Glycolipid, Glycoprotein oder eine beliebige synthetische Substanz sein, welche die gewählte Eigenschaft der Bindestruktur besitzt.

Vorzugsweise werden derartige Stoffe verwendet, welche sich durch eine gute Verträglichkeit nach Verabreichung an den Menschen auszeichnen. Hüllsubstanzen gemäß der Erfindung sind beispielsweise Peptide mit 4-20 Aminosäuren, welche polar oder endständig

• - mindestens 3 anionische Aminosäuren, wie beispielsweise Asparaginsäure und/oder Glutaminsäure, enthalten
• - mindestens 3 kationische Aminosäuren, wie beispielsweise Lysin und/oder Arginin enthalten oder
• - mindestens 3 lipophile Aminosäuren, wie beispielsweise Tryptophan, Tyrosin und/oder Phenylalanin, enthalten.

Hüllsubstanzen gemäß der Erfindung können auch sein anionische neutrale oder kationische Liposomen hergestellt wie bei Komponente a2) bereits beschrieben.

Gegenstand der Erfindung ist des weiteren die Ergänzung des erfindungsgemäßen Trägersystems durch Hinzufügung eines Liganden.

Dieser erfindungsgemäße Ligand bindet mit der Komponente a1) oder der Komponente a2) oder der Komponente b1) und hat zugleich eine Bindungsstelle für die Zielzelle. Bevorzugt im Sinne der Erfindung sind Liganden, welche an die Komponente b1) binden.

Liganden im Sinne der Erfindung können sein:

• - mehrfach funktionelle Ligandensysteme zur zielzellspezifischen Übertragung von Nukleotidsequenzen, beschrieben in EP-A 0 846 772
• - einzelkettige, zweifach-antigenbindende Moleküle beschrieben in EP-A 0 952 218
• - spezifisch Zellmembran-penetrierende Moleküle beschrieben in DE 198 50 987.1, noch unveröffentlicht oder
• - zielzellspezifische, multivalente Proteine beschrieben in DE 199 10 419.0, noch unveröffentlicht.

Auf die hier aufgeführten Patentanmeldungen wird ausdrücklich Bezug genommen.

Der Ligand wird vorzugsweise an eine lipophile Struktur im erfindungsgemäßen Trägersystem gebunden. Diese lipophile Struktur kann Bestandteil der Komponente a1) oder a2) oder b1) sein.

Hierzu ist der Ligand ausgewählt aus einer der zuvor erwähnten Gruppen seinerseits mit einer lipophilen Gruppe zu versehen. Diese lipophilen Gruppen können aromatische Aminosäuren sein, welche mit der Methode der Rekombination von DNA an den Liganden gekoppelt werden. Der Ligand kann jedoch auch an ein Lipid als lipophile Gruppe konjugiert werden, beispielsweise wie im US Patent Nr. 5,662,930 beschrieben. In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung ist der Ligand mit einem fusiogenen Peptid verbunden und dieses wiederum mit einer lipophilen Gruppe. Beispiel für fusiogene Peptide sind in den Patentanmeldungen EP-A 0 846 772 und DE 198 50 987.1 (noch unveröffentlicht) ausführlich beschrieben. Die Konjugation des zielzellspezifischen Proteins oder Peptids mit einem fusiogenen Peptid erfolgt vorzugsweise durch die Expression als rekombinantes Fusionsprotein mit den dem Fachmann bekannten Methoden.

Die Herstellung des erfindungsgemäßen Vektors bestehend beispielsweise aus den Komponenten a1), a2), b1) und dem Liganden erfolgt beispielsweise derartig, daß

• - im 1. Schritt ggf. Komponente a2) mit Komponente a1) im molaren Verhältnis [a2): a1)] von 1 : 1 bis 1000 : 1, vorzugsweise zwischen 10 : 1 und 100 : 1 vermischt wird, nachfolgend
• - im 2. Schritt Komponente a1) im Komplex mit Komponente a2) oder Komponente a1) alleine mit Komponente b1) [im Komplex mit dem Liganden oder alleine] vermischt wird und zwar bevorzugterweise im molaren Verhältnis b1) : a1) + ggf. a2) von 1 : 1 bis 1 : 1000, wobei das Mischungsverhältnis so eingestellt werden soll, daß die Nettoladung des resultierenden Gesamtkomplexes vorzugsweise neutral oder anionisch ist.

Derartige erfindungsgemäße Trägersysteme für Wirkstoffe sind durch ihre Komponente b1) weitgehend abgeschirmt, d. h. ihre Bindung und Transfektion und Transduktion von Zellen ist weitgehend vermindert.

Infolgedessen ist nach Verabreichung des erfindungsgemäßen Trägersystems in einen Organismus entweder lokal, auf die Haut, in ein Organ, eine Körperhöhle, in ein Binde- oder Stützgewebe oder in den Blutkreislauf, die Verweilzeit deutlich verlängert, nach Verabreichung in den Blutkreislauf beispielsweise bis auf mehrere Stunden bis zu einigen Tagen.

Über diese lange Verweilzeit hinweg reichern sich die erfindungsgemäßen Trägersysteme beispielsweise im Tumorgefäßbett an aufgrund des sogenannten "passiven Targetings" (Unezaki et al., Int. J. Pharmaceutics 114, 11 (1996); Sadzuka et al., Cancer Lett. 127, 99 (1998) und Wunder et al., Int. J. Oncol. 11, 497 (1997)).

Des weiteren und auch unabhängig vom passiven Targeting binden die erfindungsgemäßen Trägersysteme, welche einen zielzellspezifischen Liganden enthalten, an die Zielzelle. In Bereichen, in denen Enzyme freigesetzt worden sind (durch Zellausscheidung, durch Zelltod oder durch Expression eines in die Zelle eingeführten Genes), wird von dem Trägersystem die anionische Seitengruppe abgespalten. Hierdurch wird das Trägersystem kationisch und bindet an eine Zelle und/oder zerfällt und setzt den Wirkstoff frei. Dieser Wirkstoff kann beispielsweise eine Nukleinsäure im Komplex mit einem kationischen Träger oder ein Zytostatikum sein.

Diese Nukleinsäuresequenz kann mit Hilfe des kationischen Trägers in die Zelle eindringen und dort, je nach Zusammensetzung, ihre Wirkung entfalten, d. h. beispielsweise die Transkription oder Translation eines bestimmten Genes oder einer bestimmten RNA hemmen, oder die Zelle transduzieren zur Expression der RNA oder des Proteins kodiert von dieser Nukleinsäuresequenz.

Die erfindungsgemäßen Trägersysteme sind somit bevorzugt geeignet für die in vivo Verabreichung mit dem Ziel der Diagnose, Prophylaxe oder Therapie von Erkrankungen.

Die Herstellung und Verwendung des erfindungsgemäßen Trägersystems wird an folgenden Beispielen verdeutlicht.

Beispiele zur Verdeutlichung des Erfindungsgedankens

Die folgenden Beispiele erläutern, wie man die vorliegende Erfindung ausführen könnte.

Beispiel 1 Herstellung eines Vektorkomplexes mit einem Plasmid, einem kationischen Polymer und einer Hüllsubstanz enthaltend enzymatisch abspaltbare Seitengruppen Herstellung von Komponente a1)

Als Komponente a1) wird das Plasmid Expressionssystem "pGL3" von Promega verwendet, welches folgende Nukleotidsequenzen enthält:

• - SV40 Promoter und Enhancer (Genbank SV40 zirkuläres Genom; NIDg 965480: Nukleotide 5172-294)
• - der cDNA für Luciferase
• - SV40-Poly A-Signal

Mit den dem Fachmann bekannten Methoden wird das Plasmid in E. ccli Bakterien eingeführt, die Bakterien in Kulturmedium vermehrt und dis Plasmid isoliert.

Herstellung von Komponten a2)

Niedrigmolekulares Polyethylenimin (PEI-2000) wird hergestellt wie in der Patentanmeldung EP-A 0 905 254 beschrieben. Hierzu wird eine 10%ige Ethyleniminmonomer-Lösung in Wasser (5 ml Ethyleniminmonomer + 45 ml detilliertes Wasser, Auflösung unter Rühren) unter Zusatz von 1% (0,5 ml) konzentrierter Salzsäure (37°C) als Katalysator 4 Tage lang bei 50°C gerührt, einrotiert und unter Vakuum bei Raumtemperatur getrocknet. Die Molekulargewichtsbestimmungen wird mittels Laserstreulichtmessung (Lichtstruphotometer Wyatt Dwan DSP) bei 633 nm nach Direktinjektion in eine K5- Meßzelle durchgeführt. Die Molmassen werden aufgrund der in Toluol bestimmten Kalibrierkonstanten und der bekannten Probeineinwaage bestimmt.

Die Molekulargewichtsbestimmung mit Hilfe der Lichtstreuanalyse ergibt 2000 Da. Vergleichsweise hat das kommerziell (Fa. Fluka, Neu Ulm) erhaltene PEI ein Molekulargewicht entsprechend der Lichtstreuanalyse von 791 kDa (HMW-PEI).

Herstellung von Komponente b1)

Als Hüllsubstanz wird Orosomucoid verwendet gereinigt aus menschlichem Blutserum, wie von Schmidt in: The Plasma Proteins, ed. Fran Putnam, Academic Press 1975, 183-228 beschrieben, verwendet.

Herstellung des Vektorkomplexes

Plasmide (Komponente a1) werden in einer Konzentration von 10⁹ Plasmide/ml physiologischer Kochsalzlösung suspendiert. Der Komponente a1) wird anschließend (Komponente b2) PEI-2000 (1 mg/ml phys. Kochsalzlösung mit 1 N HCl auf pH 7,4 eingestellt) portionsweise hinzugegeben, bis eine vollständige Kationisierung der entstehenden Komplexe (Komponente a1+a2) erreicht ist (pH- Wert zwischen 7,5 und 12, vorzugsweise 10).

Die Kationisierung wird im Agarose-Shift-Assay bestimmt, bei welchem 50 µl Aliquots auf ein ca. 0,5 cm dickes Gel aus 1% (w/v) Agarose aufgetragen und in Tris-EDTA-Puffer pH 7,5 ei 80 mv 2 h lang entwickelt wird. Die Lokalisation der DNA wurde bei 254 nm nach Reaktion mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht.

Die kationischen Komplexe aus den Komponenten a1)+a2) werden anschließen in einem Überschuß von Komponente b1) suspendiert und für mindestens 48 Stunden bei 4°C inkubiert. In diesem Überschuß bilden sich Komplexe aus den Komponenten a1)+a2)+b1), welche eine neutrale bis leicht anionische Ladung haben. Diese Ladung wird im Agarose-Shift-Assay kontrolliert und sollte im Bereich zwischen pH 4 und 7 liegen.

Anschließend ist der erfindungsgemäße Vektorkomplex [Komponente a1)+a2)+b1)] verwendungsfähig. Als Kontrolle gilt der Vektorkomplex Komponente a)+b1).

Untersuchung der Blutverweilzeit in Mäusen

Mäusen (NMRI) werden in die Schwanzvene die erfindungsgemäßen Komplexe [Komponente a1)+a2)+b1)] oder zur Kontrolle Komplexe mit den Komponenten a1)+a2) injiziert. Die Dosis ist 50 µg der Komponente a1) in den jeweiligen Komplexen pro Maus, das Suspensionsmedium physiologische Kochsalzlösung, das Applikationsvolumen 250 µl.

30 Minuten und 2 Stunden nach der Injektion werden die Tiere narkotisiert und entblutet. Das aufgefangene Blut wird mit Natriumzitrat (Endkonzentration 25 mM) versetzt und das Blutplasma von den Blutzellen durch Zentrifugation (10 min. 1000 g) abgetrennt. Die DNA wird aus dem Vollblut bzw. aus dem Blutplasma mittels des QIAamp Tissue Kits (Qiagen, Hilden) isoliert.

Hierzu werden zu 100 µl von Blut oder Plasma jeweils 10111 Heparin (1000 IU7MI Novo Nordisk) während der Erstinkubation bei 70% hinzugegeben, um die Plasmid DNA quantitativ zu isolieren. Proben der isolierten DNA wurden auf 0,8% Agarosegel aufgetragen und per Southern Blut analysiert, wie im Detail bei Obris et al. 1999 beschrieben.

Ergebnisse

Während nach Verabreichung der Kontrollpräparation nach 0,5 Stunden nur noch Spuren von Plasmid DNA im Blutplasma nachweisbar sind, kann im Blutplasma der Tier verabreicht mit den erfindungsgemäßen Komplexen nach 0,5 und auch noch nach 2 Stunden beträchtliche Mengen an DNA nachgewiesen werden.

Diese Ergebnisse zeigen, daß sich die erfindungsgemäßen Vektorkomplexe, wie erwünscht, durch eine bedeutende Verlängerung der Blutverweilzeit auszeichnen.

Figurenlegende:

Fig. 1: Erfindungsgemäße Komponenten a1) und b1)

Fig. 2: Wechselwirkung der Komponenten a1) und b1)

Fig. 3: Erfindungsgemäße Komponenten a1), a2) und b1).

Claims (18)

1. Trägersystem, erhältlich durch

• 1. gegebenenfalls Mischung einer Komponente a2) mit einer Komponente a1) im molaren Verhältnis [a2) : a1)] von 1 : 1 bis 1000 : 1, vorzugsweise zwischen 10 : 1 und 100 : 1
• 2. Mischung des aus Schritt (1) resultierenden Komplexes oder der Komponente a1) alleine mit einer Komponente b1), bevorzugterweise im molaren Verhältnis b1) : a1) + ggf. a2) von 1 : 1 bis 1 : 1000, wobei das Mischungsverhältnis so eingestellt wird, daß die Nettoladung des resultierenden Gesamtkomplexes vorzugsweise neutral oder anionisch ist,
  wobei

• - Komponente a1)
  • - einen Wirkstoff a1),
  • - eine Bindestruktur a1) für die Bindestrukturen b1) oder a2), wobei der Wirkstoff a1) die Bindestruktur a1) enthalten kann; enthält,
• - Komponente a2),
  • - eine Bindestruktur a2) für die Bindestruktur a1)
  • - einen Träger a2), welcher die Bindestruktur a2) enthalten kann; enthält, und
• - Komponente b1),
  • - eine Bindestruktur b1) für die Bindestruktur a1), für den Wirkstoff a1), für die Bindestruktur a2) oder für den Träger a2),
  • - eine Hüllsubstanz, welche die Bindestruktur b1) enthalten kann,
  • - einen enzymatisch spaltbaren Verbindungsteil,
  • - eine anionische Seitengruppe;
  enthält.

2. Trägersystem nach Anspruch 1, in welchem die Komponente a2) zwingend enthalten ist.

3. Trägersystem nach einem der Ansprüche 1 oder 2, bei welchem die Bindungen zwischen den Komponenten a1) und a2), a1) und b1) sowie a2) und b1)

• - durch kationische und anionische Ladungen
• - durch lipophile Gruppen
• - durch Epitop-Antikörperbindungen
• - durch Leucin-Zipper Interaktionen und/oder
• - durch S-S Brücken

erfolgt.

4. Trägersystem nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei welchem die Komponente a1) ausgewählt ist aus einer Gruppe umfassend eine DNA Sequenz, eine RNA Sequenz, ein Plasmid, ein Virus, ein Peptid, ein Protein, ein Glykopeptid, ein Glykolipid, ein beliebiges Arzneimittel, ein Enzym, eine radioaktive Substanz, ein Antikörper, ein Fragment eine Antikörpers enthaltend die Antigenbindestelle des Antikörpers, ein einzelkettiges, monospezifisch, bispezifisch oder multispezifisch antigenbindendes Molekül.

5. Trägersystem nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei welchem die Komponente a2) ausgewählt ist aus einer Gruppe umfassend ein kationisches Lipid, ein kationisches Polymer und ein kationisches Polypeptid und bei welcher die Komponente a1) eine negative Ladung aufweist.

6. Trägersystem nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei welchem die Komponente a2) ein kationisches Liposom darstellt, in welchem die Komponente a1) eingeschlossen ist.

7. Trägersystem nach einem der Ansprüche 1 bis 6, bei welchem der enzymatisch spaltbare Verbindungsteil der Komponente b1) durch Phospholipasen, Peptidasen, Glykosidasen, Phosphatasen, Sulfatasen oder Esterasen abgespalten wird.

8. Trägersystem nach einem der Ansprüche 1 bis 7, bei welchem der enzymatisch spaltbare Verbindungsteil der Komponente b1) durch β-Glucuronidase, Neuraminidase, β-Galactosidase, Plasminogenaktivator, Plasmin, Prostata­ spezifisches Antigen, Cathepsin, Stromelysin, Collagenase oder Caspasen abgespalten wird.

9. Trägersystem nach einem der Ansprüche 1 bis 8, bei welchem der enzymatisch spaltbare Verbindungsteil der Komponente b1) mit der Hüllsubstanz über einen Spacer verbunden ist, der nach Spaltung des Verbindungsteils zerfällt.

10. Trägersystem nach einem der Ansprüche 1 bis 8 oder nach Anspruch 9, bei welchem die anionische Seitengruppe der Komponente b1) mindestens eine Karbonsäure, mindestens eine Aminosäure, vorzugsweise Asparaginsäure und Glutaminsäure, mindestens einen Zucker, vorzugsweise Glucuronsäure oder Neuraminsäure und/oder mindesfiens eine anorganische Säure, vorzugsweise als Sulfat oder Phosphat enthält.

11. Trägersystem nach einem der Ansprüche 1 bis 10, bei welchem die Komponente b1) darstellt ein natürliches Polypeptid, welches mindestens eine über einen enzymatisch spaltbaren Verbindungsteil verbundene anionische Seitengruppe trägt.

12. Trägersystem nach Anspruch 11, bei welchem das natürliche Polypeptid ausgewählt ist aus einer Gruppe umfassend Orosomucoid, Corticosteroid­ bindendes Protein, Haptoglobin, Hemopexin, α1-Antichymotrypsin, α-HS- Glykoprotein, ß2-Glykoprotein I, ß2-Glykoprotein II.

13. Trägersystem nach einem der Ansprüche 1 bis 10, bei welchem die Komponente b1) ein neuraminsäurehaltiges Glycosphingolipid darstellt.

14. Trägersystem nach Anspruch 13, bei welchem die Komponente b1) ausgewählt ist aus einer Gruppe umfassend GM1, GM2, GM3, GD3, GT3, O-acetyl-GD3 und O-acetyl-GT3.

15. Verwendung eines Trägersystems nach einem der Ansprüche 1 bis 14 für die gentherapeutische Behandlung von Krankheiten.

17. Verwendung eines Trägersystems nach Anspruch 15, wobei die Krankheit ausgewählt wird aus der Gruppe enthaltend Krebs und Entzündungen.

18. Verfahren zur Herstellung eines Trägersystems nach einem der Ansprüche 1 bis 14, durch

• 1. ggf. Mischung von Komponente a2) mit Komponente a1) im molaren Verhältnis [a2) : a1)] von 1 : 1 bis 1000 : 1, vorzugsweise zwischen 10 : 1 und 100 : 1
• 2. Mischung des aus Schritt (1) resultierenden Komplexes oder der Komponente a1) alleine mit Komponente b1), bevorzugterweise im molaren Verhältnis b1) : a1)+ ggf. a2) von 1 : 1 bis 1 : 1000, wobei das Mischungsverhältnis so eingestellt wird, daß die Nettoladung des resultierenden Gesamtkomplexes vorzugsweise neutral oder anionisch ist.

19. Arzneimittel, enthaltend ein Trägersystem nach einem der Ansprüche 1 bis 14 zur Behandlung von Krebs und/oder Entzündungen.