MXPA02004532A - Sistemas portadores que contienen substancias de revestimiento con grupos laterales removibles enzimaticamente. - Google Patents

Abstract

La invencion describe un sistema portador, que se obtiene opcionalmente al (1) mezclar un componente a2) con un componente a l) en una proporcion molar [a2):al)] de 1:1 a 1000:1, preferiblemente entre 10:1 y 100:1, (2) mezclar el complejo que resulta de la etapa (1) o el complejo al) solo con un componente bl), preferiblemente en una proporcion molar bl):al)° opcionalmente a2) de 1:1 a 1:1000, la proporcion de mezclado se ajusta de tal manera que la carga neta del complejo total que resulta preferiblemente es neutral o anionica. El componente al) comprende una substancia activa al), una estructura de union al) para las estructuras de union bl) o a2), en donde la substancia activa al) puede comprender la estructura de union al). El componente a2) comprende una estructura de union a2) para la estructura de union al) y un portador a2), el cual puede comprender la estructura de union a2). El componente bl) puede comprender una estructura de union bl) para la estructura de union al), para la substancia activa al), para la estructura de union a2) o para el portador a2), una substancia de revestimiento, que puede comprender la estructura de union bl), un enlazador enzimaticamente removible, y un grupo lateral anionico. La invencion ademas describe la produccion y uso del sistema portador inventivo.

Description

SISTEMAS PORTADORES QUE CONTIENEN SUBSTANCIAS DE REVESTIMIENTO CON GRUPOS LATERALES REMOVIBLES ENZIMÁTICAMENTE Introducción Hasta ahora se han desarrollado numerosos materiales portadores para ingredientes activos. Estos ingredientes activos incluyen, por ejemplo, secuencias de ácido nucleico, péptidos, proteínas, glicoproteínas y glicolípidos y también medicamentos. Un objetivo importante de estos materiales portadores es el de proteger el ingrediente activo de la degradación en el cuerpo y/o de su rápida eliminación. Un objetivo adicional de estos materiales portadores es el mediar el contacto entre el ingrediente activo y su célula que se tiene como objetivo en donde el ingrediente activo genera su acción. Estos materiales portadores son de particular importancia en la terapia genética. De esta manera los portadores o vectores virales y también los no virales se conocen. En los portadores virales los materiales portadores son las proteínas de capa viral, mientras los lípidos catiónicos y los polímeros catiónicos se han desarrollado como los materiales portadores para los portadores o vectores no virales. Las secuencias de ácidos nucleico son complicadas con la ayuda de estas sustancias catiónicas y estos complejos fueron administrados al organismo en esta forma.

La experiencia previa con tales vectores en la terapia genética de un amplio rango de enfermedades diferentes, pero en particular de padecimientos neoplásticos, muestran que, después de la administración del vector o portador de la terapia genética dentro de la circulación de un organismo, este vector se elimina de la circulación dentro de un periodo de tiempo corto y no esta disponible por mucho tiempo para unirse a las células que se tienen como objetivo y para la transfectación de estas células objetivo (Ogris et al. Gene Ther. 6:595, 1999; Dash et al., Gene Ther. 6:643, 1999; Li et al., Gene Ther. 5:930, 1998; Liu et al. Gene Ther. 4:517, 1997) . Esta eliminación puede ocurrir por medio de la degradación del ADN o por la deposición rápida de los vectores en el pulmón, el hígado o el llamado sistema reticuloendotelial (RES) , en particular en él bazo y los nodos linfáticos (Zhu et al., Science 261:209, 1993). Las causas de la rápida eliminación son diversas. Pueden ser de una carga negativa o positiva muy grande, de un volumen muy grande u opsonización de las partículas del vector por las proteínas de la sangre. Para los vectores virales también se pueden unir de las proteínas de capa viral a los receptores específicos de virus en los órganos y/o anticuerpos o células inmunes, que son específicos para los virus y que se unen a los vectores y con lo cual se eliminan. La experiencia anterior muestra además gue al acoplar o insertar un ligando especifico de la célula que se tiene como objetivo en el complejo del vector reduce insignificantemente la eliminación rápida de este ultimo después de la administración en la circulación. En el conocimiento de estos problemas existe una necesidad urgente de las preparaciones novedosas de los vectores los cuales hacen posible gue los vectores permanezcan en la circulación tanto como sea posible y que no se eliminen de la circulación en forma prematura. A fin de reducir la eliminación de la circulación sanguínea de los lípidos catiónicos o de los polímeros catiónicos complejos con secuencias de ácidos nucleicos, se han preparado a partir del polietilenglicol (Sénior et al., Biochim. Biophys. Acta 1062:77, 1991; Morí et al., FEBS Lett 284:263, 1991; Ogris et al., Gene Ther. 6:595, 1999), polímeros de vinilo (Torchilin et al., Biochim. Biophys. Acta 1195:181, 1994) u otros polímeros anfifáticos ( oodle et al., Bioconjugat. Chem. 5: 493, 1994) acoplados a los lípidos catiónicos o polímetros catiónicos, o con la ayuda de lípidos cargados negativamente, de liposomas aniónicos los cuales incluyen las secuencias de ácidos nucleicos complejas con lípidos catiónicos de polímetros catiónicos (US 4,946,787; US 4,245,737; US 5,480,463; Heywood y Eanes, Cale. Tissue Int. 40: 149, 1992; Lee y Huang, J. Biol. Chem. 271:8481, 1996; Balicki y Beutler, Blood 88:3884, 1996; Lucie et al., J. Lip. Res. 8:57, 1998; Lakkaraju et al., J. Lip. Res. 8:74, 1998; Turner et al., J. Lip. Res. 8:114, 1998; Schoen et al., J. Lip. Res. 8:485, 1998) . Tales modificaciones conducen, por ejemplo, a una estabilización del tamaño de partícula del vector, a la agregación inhibida de los vectores con ellos mismos o con las células de la sangre, reduciendo la opsonización de los vectores de unión de inmunoglobulinos, factores complementarios, fibrinogenos o fibronectina, vectores virales (adeno) protegidos de la eliminación por anticuerpos (Chillón et al., Gene Ther. 5:995, 1998) y provocando una extensión del tiempo de residencia de la sangre de los vectores, una acumulación distintamente más alta en los tumores de crecimiento subcutáneo y una transducción de las células de tumor (Ogris et al., Gene Ther. 6:595, 1999). Simultáneamente sin embargo, también es posible detectar una acumulación considerable de los vectores en el pulmón, el bazo y el hígado y la transducción de las células del tejido en estos órganos (Ogris et, al., Gene Ther. 6:595, 1999) de manera que se puede concluir que, por ejemplo, el acoplamiento PEG provoca un mejoramiento en, aunque no significa una optimización, de la distribución de los vectores . A fin de prevenir la rápida eliminación del cuerpo, por ejemplo, los medicamentos también son encapsulados en los liposomas. Por esto el uso de liposomas iónicos se prefiere, debido a que esta unión a las células solo es débilmente y son eliminados del cuerpo solo en una proporción baja. Los liposomas aniónicos se preparan de varias formas, por ejemplo al usar substancias las cuales incorporan los retrovirus se incorporan en su cubierta viral (Schreier et al. 1992, 1993, 1995) o al insertar ácidos dicarboxílicos o al insertar ácidos dicarboxílicos o al unir ácidos sulfúricos (Ahí et al. 1995; Li and Wu 1999), el ácido glucurónico o ácido fosfórico (Oku et al., Biochem. Biophys. Acta 1280, 149 (1990); Namba et al., Chemical and Pharmaceut. Bullet. 38, 1663 (1990); Hu et al., Biochem. Biophys. Acta 1299, 252 (19969) ) . Los liposomas modificados por, por ejemplo, el ácido glucurónico o por el dicetil fosfato (DCP) , fosfatidilglicerol o fosfatidilserina muestran una unión disminuida significantemente a las proteínas de suero y un tiempo de residencia de la sangre extendido en comparación con neutral sin modificación o liposomas catiónicos. (Oku et al., Biochem. Biophys. Acta 1280, 149 (1996); Purahashi et al., Biol. Pharmac. Bull. 18,82/1995); Namba et al., Chem. Pharmac. Bull. 38, 1663 (1990)). Se ha intentado justamente al inicio preparar por medio de la incorporación de glicolípidos o glicopéptidos dentro de la capa del lípido de nanopartículas, los sistemas portadores los cuales se podrían activar por enzimas. Una enzima seleccionada, por ejemplo la ß-glucoronidasa, liberada, por ejemplo, dentro de los tumores o introducida dentro de los tumores por la administración de un anticuerpo anti tumor/ proteína de fusión de ß-glucorinidasa, en este caso se debería eliminar el azúcar (por ejemplo el ácido glucurónico) de los glicolípidos o glicopéptidos incorporados y con esto llevar a un incremento en el pH (cationización) y la lipofilicidad de la nanopartícula . Esta modificación puede provocar que la nanopartícula provoque la unión del portador a las células vecinas y la fusión con la membrana celular o el desintegrado. De este modo, los ingredientes activos incluidos en la nanoparticula, por ejemplo los citostaticos, se deben liberar en el sitio de expresión de la enzima activada (Sedlacek et al., Contributions to Oncology 43, 132 (1992) ) . Aunque el principio de la acción se puede demostrar por el ejemplo de conjugados del ácido glucurónico separables por la ß-glucuronidasa (Sedlacek et al., Contributions to Oncology 43, 132 (1992) ) , nanopartículas, en cuyos conjugados del ácido glucurónico de la capa del lípido que se han insertado muestran una inestabilidad estructural considerable. Se ha realizado una observación similar para incorporar orosomucoide (al-glicoproteina acida) , una proteína de plasma anionica que contiene ácido neuramínico, en la capa del lípido de los liposomas. Esta incorporación lleva a una sensibilidad osmótica considerable de los liposomas al agua y al metal alcalino y a los iones del metal alcalinotérreo y a la destrucción de estos liposomas (Neitchev et al., Mol. Biol. Reports 11,87 (1986); Int. J. Biochem. Cell Biol. 29,689 (1997)). De esta manera, hasta ahora no han existido sistemas portadores no estables que contienen substancias activas disponibles cuyos componentes principales son substancias de revestimiento que portan grupos laterales aniónicos enzimáticamente removibles los cuales son cruciales para la estabilidad del sistema portador de manera que después de la eliminación de estos grupos laterales aniónicos el sistema portador se desintegra y las substancias activas son liberadas .

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN De acuerdo con la presente invención el sistema portador comprende los componentes representados en las figuras 1, 2 y 3. La invención describe a un sistema portador que comprende los siguientes componentes: un componente al), comprende un ingrediente activo al) , una estructura de unión al) para las estructuras de unión bl) o a2) , siendo posible para el ingrediente activo al) para comprender la estructura de unión al) ; opcionalmente un componente a2), comprende una estructura de unión a2) para la estructura de unión al) un portador a2) el cual puede comprender la estructura de unión a2); y un componente bl) , comprende una estructura de unión bl), para la estructura de unión al) , para el ingrediente activo al) , para la estructura de unión a2) o para el portador a2) , una substancia de revestimiento la cual puede comprender la estructura de unión bl), un enlazador enzimáticamente divisible, un grupo lateral aniónico. De acuerdo con esto, el componente a2) es también incluido o no en el sistema portador. De acuerdo con la invención la carga total del sistema portador que comprende los componentes al), donde a2) y bl) apropiado es neutral o aniónico. Esta carga total garantiza que, después que se administre el sistema portador a un organismo, preferiblemente en la circulación, el tiempo de residencia del sistema portador en la sangre es tan grande como sea posible. Después de remover los grupos laterales, lo cual garantiza una carga aniónica a una carga total neutral, por enzimas, liberadas, por ejemplo, por tumores o durante el curso de inflamaciones, la coagulación de la sangre o la fibrinolisis o expresad por las células después de la transfección con la codificación de genes para estas enzimas, el sistema portador que llega a ser catiónico, se une a las células vecinas negativamente cargadas y/o se desintegra y de este modo libera el componente a) , el cual dependiendo del ingrediente activo (componente al), ya sea que entre a la célula y sea capaz de mostrar su acción o bien actúe en el plasma sanguíneo. En lo siguiente los componentes individuales del sistema portador de acuerdo con la invención y sus aplicaciones se describen con más detalle. Componente al) El componente al) puede ser una secuencia de ADN modificada o no modificada, o una secuencia de ARN modificada o no modificada. La secuencia del nucleótido puede exhibir una función o código anti-ADN (triple) o anti-ARN (antisensible; ribozima) para una secuencia de ARN que actúa en esta forma o para una proteína. Las secuencias del nucleótido y su modificación puede ser tal que la secuencia del nucleótido es altamente resistente a la degradación por DNasas o RNasas. Ejemplos de tales secuencias del nucleótido y sus modificaciones están presentes en Breaker, Nature Biotechnol. 15:427, 1997; Gerwik, Critical Reviews in Oncogenesis 8:93, 1997; Mukhopadhyay et al., Crit. Rev. Oncogen. 7:151, 1996; Mercóla et al., Cáncer Gene Ther. 2:47, 1995; Frank-Kamemestski, Annu. Rev. Biochem. 64:65, 1995 and Fraser et al., Exp. Opin. Invest. Drugs 4:637, 1995. La secuencia de ADN puede estar presente en forma lineal o circular, por ejemplo en la forma de una plasmida. El componente al) puede representar además un virus, preferentemente un virus dentro del cual una secuencia del ácido nucleico foránea para el virus se inserte usando los métodos conocidos para aquellos con experiencia. Ejemplos de tales virus son RTV, AV, AAV, HSV, virus vaccinia, virus de influenza. Estos y otros ejemplos se han descrito por Vile, (Nature Biotechnol. 15:840, 1997); McKeon et al., (Human Gene Ther. 7:1615, 1996); Flotte et al., (Gene Ther. 2:357,1995); Jolly, (Cáncer Gene Ther. 1:51, 1994) and Dubensky et al.,(J. Virol. 70:508, 1996) . El componente al) puede representar además un péptido, una proteína, un glicopéptido, un glicolípido, un medicamento natural o sintético o un agente adecuado para una detección in vivo o ex vivo tal como, por ejemplo, una enzima o una substancia radioactiva. En una modalidad particular de la invención el componente al) es un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo que comprende el sitio de unión de antígeno o una molécula de unión de antígeno mono-especifica, bi-especifica o multi-especifica de una cadena, preparada por ejemplo, como se describe en la solicitud de la patente Europea EP-A 0 952 218. Para unir el componente al) al componente a2) o al componente bl), el componente al) de acuerdo con la invención tiene grupos de unión. Estos grupos de unión pueden ser, por ejemplo, - cargas aniónicas, por ejemplo introducidas por ácidos nucleicos, amino ácidos o por la unión de ácidos inorgánicos - cargas catiónicas, por ejemplo introducidos por amino ácidos básicos, por grupos amino o por la unión de bases inorgánicas grupos lipofílicos, por ejemplo introducidos por amino ácidos aromáticos o epitopes de ácidos grasos para anticuerpos - partes de unión de antígeno de anticuerpos - grupos SH - zíper de leucina fos como el tipo natural o mutado como se describe en la solicitud de la patente Alemana No. 19900743.8 (no publicada) - zíper de leucina como el tipo natural o mutado como se describe en la solicitud de la patente Alemana No. 19900743.8. Componente a2) De acuerdo a esta invención, el componente a2) comprende un portador el cual puede formar complejos con el componente al) y el cual simultáneamente tiene grupos de unión para el componente bl) . La formación del complejo entre el componente a2) y el componente al) y/o la unión del componente a2) con el componente bl) puede tomar lugar, por ejemplo, por - cargas catiónicas - cargas aniónicas - grupos lipofílicos - epitopes - partes de unión de antígeno - zíper de leucina fos como el tipo natural o mutado como se describe en la solicitud de la patente Alemana No. 19900743.8. Como resultado, la elección del componente a2) depende de la selección del componente al) y también de la elección del componente bl) . En una modalidad particular de la invención, el componente a2) , representa al menos un lípido catiónico y/o al menos un polímero catiónico, por ejemplo - lípidos catiónicos, por ejemplo como se describe por Kao et al., Oncology Reports 5:625 (1998), Liu et al., J. Biol. Chem. 270, 24864 (1995), Felgner, Human Gene Ther. 7, 1791 (1996), Ledley, Human Gene Ther. 6, 1129 (1995), Goyal et al., J. Liposom. Res. 5, 49 (1995), Thierry et al., Gene Ther. 4, 226 (1997), Schofield et al., Br. Med. Bull. 51, 56 (1995), Behr, Biocon . Chem. 5, 382 (1994), Cotten et al., Curr. Opin. Biotechnol. 4, 705 (1993), San et al., Human Gene Ther. 4, 781 (1993) - polímeros catiónicos, por ejemplo como se describe por Boussif et al., PNAS USA 92, 7292 (1995), Kaneda et al., Science 243, 375 (1989), Keown et al., Methods in Enzymology 185, 527 (1990), Baker et al., Gene Ther. 4, 773 (1997), Fritz et al., Human Gene Ther. 7, 1395 (1996), Wolfert et al., Human Gene Ther. 7, 2123 (1996) und solodin et al., Biochem. 34, 13537 (1995) . Los polímeros catiónicos también incluyen por ejemplo la albúmina cationizada. La preparación y uso de la albúmina cationizada se ha descrito en la solicitud de la patente EP-A 0 790 312. En una modalidad particular de esta invención, el componente a2) presenta una polietilenimina (PEÍ), en una modalidad particular adicional de esta invención la polietilenimina tiene un peso molecular en la región de 500-20,000 Da y en una modalidad adicional tiene un peso molecular de cerca de 2000 Da en promedio y se prepara como se describe en la solicitud de la patente EP-A 0 905 254. En una modalidad particular de la invención, el componente a2) , representa liposomas preparadas como se describe, por ejemplo, en US 5,252,348, 5,753,258 y 5,766,625. En una modalidad particular adicional de la invención de la partícula, estos liposomas son cargados en forma catiónica. Componente bl) El componente bl) representa una sustancia de revestimiento la cual se une al componente al) o al componente a2) por medio de una estructura de unión y la cual lleva al menos un grupo lateral aniónico unido por medio de un enlazador enzimáticamente divisible. Tales grupos laterales pueden ser, por ejemplo: - ácido carboxílicos - amino ácidos - azucares tales como, por ejemplo, el ácido glucurónico o el ácido neuramínico - ácidos inorgánicos unidos tales como, por ejemplo, los ácidos fosfóricos o los ácidos sulfúricos, los cuales se eliminan por enzimas tales como, por ejemplo, fosfolipasas, peptidasas, glicosidasas, fosfatasas o sulfotasas . La invención particularmente describe substancias que llevan ácidos glucurónicos como grupos laterales aniónicos los cuales se pueden eliminar del resto del componente bl) por las ß-glucuronidasas . La invención además particularmente describe substancias que llevan ácidos neuramínicos como grupos laterales aniónicos los cuales se pueden eliminar del resto del componente Ib) por las neuraminidasas . Estas substancias de acuerdo a la invención incluyen por ejemplo: - orosomucoide (glicoproteína a 1-ácida) , cuya estructura y aislamiento de la sangre se ha descrito en detalle por Schmidt en: las Proteínas de Plasma, Ed. Frank Putnam, Academic Press 1975, 183-228, - las proteínas de plasma que contienen ácido neuramínico adicionales como se describe por Clamp en: las Proteínas de Plasma, Ed. Frank Putnam, Academic Press 1975, 163-206, en particular aquellas proteínas de plasma las cuales llevan ua cantidad de ácido neuramínico de mas del 4% de su peso molecular tal como, por ejemplo, proteína de unión de corticosteroide, haptoglobina, hemopexina, al-antiquimotrisina, a-HS-glicoproteína, ß2-glicoproteína I und D 2-glicoproteína II (Clamp 1975) - glicosfingolípidos que contienen ácido neuramínico tales como, por ejemplo, GM2, GM3, GD3 y GT3, en particular, sin embargo las gangliosidas y los derivados de estos, cuyos ácidos neuramínicos son fácilmente removidos por la neuraminidasa, tales como, por ejemplo, GM3, GD3, GD3 0-acetilo y GT3 O-acetilo (Rodríguez et al., J. Lipid Res. 37, 382 (1996) ) . El enlazador enzimáticamente divisible para el grupo aniónico lateral del componente bl) puede representar cualquier enlazador divisible enzimáticamente, de origen natural tal como, por ejemplo, un enlace de éster, un enlace glicosidico o un enlace de péptido. En una modalidad particular de esta invención el enlazador enzimáticamente divisible se selecciona de tal modo que este puede ser especifica y sustancialmente divisible por el activador plasminogeno, plasmina, antígeno especifico de próstata, catepsinas, estromelisinas o colagenasa. Los siguiente enlazadores enzimáticamente divisibles pueden, por ejemplo, emplearse para las siguientes enzimas (Barrett et al., Mammalian Proteases, Academic Press, Londres (1980), Panchal et al., Nature Biotechnol. 14, 852 (1996); Pigott et al., Ayad et al., The extracellular Matrix, Academic press (1996); Yoshida et al., Int. J. Cáncer 63, 863 (1995), Petersen et al., J. Biol. Chem. 265, 6104 (1990); Cramer et al., J. Urology 156, 526 (1995); Forsgen et al., FEBS Lett. 213, 254 (1987)) Enzima Estructura parte C División S6 S5 S4 S3 S2 SI S-l (S-2) SEQ ID NO.

Activador Cys Pro Gly Arg Val (Val) 1 Del Gin Gly Arg (lie) 2 Plasminógeno Gly Gly Arg Pro Gly Ly Arg Arg Phe Lys .Antigeno Pro Arg Phe Lys lie (lie) 4 Especifico Tyr (Val) -de próstata Arg Arg Phe Phe Leu (His) 5 Enzima Estructura parte C División S6 S5 S4 S3 S2 SI - S-l (S-2) SEQ ID NO. (lie) (Val) Tyr (lie) Val Ser Phe Ser lie Gin Tyr lie Vel 6 Gly Ser Gin Gin Leu Leu lie Val 7 Gly lie Ser Ser Gin Tyr lie Val Catepsinas Pro Erg Phe Lys lie (He) Tyr (Val) Lys Ser .Arg Met 10 (He) Lys Met .Arg Arg 11 (He) Lie .Arg Arg Arg 12 (He) Arg Ala Arg Leu 13 (He) Gín Ala Arg Phe 14 (He) Lys Leu Arg Leu 15 (He) Lys Arg Val (He) Lys Phe Arg Stromelisins Gly Gly Gly Ala Gin (Leu) 16 Enzima Estructura parte C División S6 S5 S4 S3 S2 SI S-l (S-2) SEQ ID NO. GIn Leu Gly Val Met (Gin) 17 Ala Ala Ala Ser Leu (Lys) 18 Val Ala Val Ser Ala (Lys) 19 Leu Ala Ala Asn Leu (Arg) 20 Colagenasa Gly Pro Gin Gly lie (Ala) 21 I Gly Pro Gin Gly Leu (Leu) 22 Gly Pro Gin Gly Leu (Ala) 23 Gly Lie Ala Gly lie (Thr) 24 II Gly Leu Pro Gly lie (Gly) 25 Gly Phe Pro Gly lie (Gly) 26 III Gly Pro Ala Gly lie (ser) 27 Gly Pro Ala Gly lie (Ala) 28 VIII XI Plasminogeno Ser Gly Thr Glu lie (Val) 29 La definición de las posiciones de los amino ácidos (Sl-S6 y S-l, S-2) seguida por schechter y Berger, (Biochem. Bíophys. Res. Commun. 27, 157 (1967)). En una modalidad particular de la invención, la enzima que divide el enlazador enzimáticamente divisible de acuerdo a la invención es enzimáticamente intracelular.

Esta enzima intracelular puede ser una enzima lisosomal pero también una enzima citoplásmica. Las enzimas lisosomal y también las enzimas citoplásmicas se liberan durante la inflamación u otro proceso de la enfermedad en donde las células son activadas y/o destruidas y exterminadas . En una modalidad particular la enzima citoplásmica es una caspasa. Las secuencias de segmentación para las caspasas se han descrito por Cryns y Yuan, (Genes y Developm. 12, 1551 (1998)) y Gross et al., (EMBO J. 17, 3878 (1998)). Las siguientes secuencias de amino ácidos, por ejemplo, se pueden emplear como enlazadores enzimáticamente divisibles para las siguientes enzimas intracelulares.

SI S-l SEQ ID NO.

Caspasas Caspasas 1,4,5 WEX D 30 Caspasas 2,3,7 DEX D 31 Caspasas 6,8,9 L/VEX D 32 Caspasas 3,9 DEV D 33 LEH D 34 En una modalidad particular adicional, la enzima intracelular es un proteasa especifica de virus. Por ejemplo, los retrovirus expresan una proteasa de aspartilo la cual es esencial para la producción de virus infeccioso. Tales proteasas especificas de virus se liberan en la muerte y descomposición de las células infectadas por virus. Las siguientes secuencias de amino ácidos, por ejemplo, (Menendez et al., Virol. 196, 557 (1993)) se pueden emplear como los enlazadores enzimáticamente divisibles por las siguientes enzimas virales: Es posible en forma análoga introducir como el enlazador enzimáticamente divisible las secuencias de segmentación para las proteasas expresadas por, por ejemplo: -Virus de la polio (Hellen et al., J. Virol. 66, 3330 (1992), Mirzayan et al., J. Gen. Virol. 72, 1159 (1991), Pallai et al., J. Biol. Chem. 264, 9738 (1989), Kean et al., J. Gen. Virol. 71, 2553 (1990) -Virus de influenza (Klenk et al., Mol. Recognitíon in Host Parasite Interactions Vol. 61, Proc. No. 55662 (1991), Hosoga et al., Antiviral Res. 26, A348 (1995)) - Virus de Epstein Barr - Virus del Herpes Simple (Steffy et al., Gen. Virol. 76, 1069 (1995), Robertson et al., J. Virol. 70, 4317 (1996), DiJanni et al., J. Biol. Chem. 268, 2048 (1993), Matusick-Kumar et al., J. Virol. 69, 4347 (1995)) - Virus de la Hepatitis, tales como HBV (Hwang et al., Chínese J. Microbiol. Immunol. 24, 71(1991) ) HAV (Probst et al., J. Virol. 71, 3288 (1997), Martin et al., virol. 213, 213 (1995), Schultheiss et al., J. Viol.69, 1727 (1995)) HCV (Ingallinella et al., Biochem. 37, 8906 (1998), Suzuki et al., J. Gen. Viol. 76, 3021 (1995), Reed et al., J. Virol. 69, 4127 (1995), Shimizu et al., J. Virol. 70, 127 (1996) ) - Virus de la Viruela - Citomegalovirus (Quí et al., Nature 383, 275 (1996), La Femina et al., J. Virol. 70, 4819 (1996), Jones et al., J. Virol. 68, 3742 (1994) ) - Denguevirus (Biedrzycka et al., J. Gen. Virol. 68, 1317 (1987)) La invención además describe particularmente los enlazadores enzimáticamente divisibles los cuales están unidos a las substancias de revestimiento vía un espaciador. Preferiblemente el espaciador es tal que este se desintegra después de la remoción del grupo lateral aniónico. Tales espaciadores se han descrito por ejemplo, en la solicitud de la patente Jacquesy et al., EP-A 0 511 917, la cual expresamente se incorpora para referencia. Este espaciador es unido, por ejemplo, a un ácido ß-glucuronico vía un enlazador divisible de ß-glucuronidasa y en su extremo opuesto a una sustancia lipofilica. La estructura de unión de la sustancia de revestimiento actúa como mediadora de la unión del componente bl) al componente al) a a2) . La estructura de unión de la sustancia de revestimiento puede representar: - una carga, sí el componente a) , al) o a2) tiene una carga catiónica - una carga catiónica, si el componente a), al) o a2) tiene una carga aniónica - lipofilicidad, si el componente a), al) o a2) lleva grupos lipofilicos - epitopes, si el componente a), al) o a2) contiene partes de anticuerpos de unión de antígeno - partes de anticuerpos de unión de antígeno, sí el componente a), al) o a2) llevan las epitopes correspondientes - Zíper de leucina fos del tipo natural o mutado, si el componente a), al) o a2) contiene el zíper jun correspondiente - zíper de leucina jun del tipo natural o mutado, si el componente a), al) o a2) contiene el zíper fos correspondiente. En una modalidad preferida de la invención la estructura de unión es idéntica al grupo aniónico lateral unido a la substancia de revestimiento por un enlazador enzimáticamente divisible.

Las substancias de revestimiento pueden ser cualquier péptido, proteína, lípido, glicolípido, glicoproteína o cualquier sustancia sintética la cual tenga la propiedad seleccionada de la estructura de unión. El uso de esos agentes se prefiere cuando se distinguen por la buena tolerabilidad después de la administración a los humanos . Las substancias de revestimiento de acuerdo a la invención son, por ejemplo, péptidos que tienen de 4-20 amino ácidos las cuales comprenden polar o terminalmente - al menos 3 amino ácidos aniónicos tales como, por ejemplo, el ácido aspártico y/o el ácido glutámico - al menos 3 amino ácidos catiónicos tales como por ejemplo, la lisina y/o argina - al menos 3 amino ácidos lipofilicos tales como por ejemplo, el triptofano, tirosina y/o la fenilalanina. Las sustancias de revestimiento de acuerdo a la invención también pueden ser liposomas aniónicos, neutrales o catiónicos preparados como ya se describió para el componente a2) . La invención describe además para suplementar el sistema portador de acuerdo a la invención la adición de un ligando.

Este ligando de acuerdo a la invención se une al componente al) o al componente a2) o al componente bl) y simultáneamente tiene un sitio de unión para la célula que se tiene como objetivo. Los ligandos preferidos de acuerdo con la invención son aquellos que se unen al componente bl) . Los ligandos de acuerdo con la invención pueden ser: - sistemas de ligando multifuncional para la transferencia especifica de la célula objetivo de las secuencias del ácido nucleico, descritos en EP-A 0 846 772 - moléculas de unión de antígeno doble, de cadena simple, descritas en EP-A 0 952 218 - moléculas de penetración de membranas de la célula especifica descritas en DE 19850987.1, no publicadas aun o proteínas multivalentes, especificas de la célula objetivo descritas en DE 19910419.0, no publicadas aun. Las solicitudes de las patentes enlistadas aquí son expresamente incorporadas aquí para referencia. El ligando se une preferiblemente a una estructura lipofilica en el sistema portador de acuerdo a la invención. Esta estructura lipofilica puede ser parte del componente al) o a2) o bl) . Para esto, el ligando seleccionado de uno de los grupos previamente mencionados tiene que ser proporcionado con un grupo lipofilico. Estos grupos lipofilicos pueden ser amino ácidos aromáticos los cuales pueden ser acoplados al ligando por el método de recombinación de ADN. El ligando también puede, sin embargo, ser conjugado con un lípido como un grupo lipofilico, como se describe por ejemplo en la patente Norteamericana No. 5,662,930. En una modalidad particular de la invención en particular el ligando se une a un péptido fusogenico y este péptido a su vez está unido a un grupo lipofilico. Ejemplos de péptidos fusogenicos se describen extensamente en las solicitudes de la patente EP-A 0 846 772 y DE 19850987.1 (no publicada aun) . La conjugación de la proteína especifica de la célula que se tienen como objetivo o péptido con un péptido fusogenico se lleva acabo preferiblemente por la expresión como proteína de fusión usando los métodos conocidos por aquellos con la experiencia en el ámbito. La preparación del vector o portador de acuerdo a la invención comprende, por ejemplo, los componentes al), a2) , bl) y el ligando se lleva a cabo, por ejemplo, de tal modo que - en el componente a2) de la primera etapa, donde sea apropiado, se mezcla con el componente al) en una proporción molar [a2):al)] de 1:1 a 1000:1, preferiblemente entre 10:1 y 100:1, subsecuentemente - en la segunda etapa, el componente al) como un complejo con el componente a2) o el componente al) se mezcla con el componente bl) [como un complejo con el ligando o consigo si mismo] , para ser preferentemente especifico en una proporción molar bl):al)±a2) de 1:1 a 1:1000, donde la proporción de mezclado debe ser ajustada tal manera que la carga neta del complejo total resultante preferiblemente es neutral o aniónica. Tales sistemas portadores de acuerdo a la invención para los ingredientes activos son substancialmente protegidos por el componente bl) , es decir, su unión y transfección y transducción de las células son sustancialmente reducidos . Consecuentemente, el tiempo de residencia es significativamente incrementado después de la administración del sistema portador de acuerdo a la invención a un organismo ya sea localmente, en la piel, en un órgano, una cavidad corporal, en el tejido conectivo o sustentador o en la circulación de la sangre, por ejemplo, de hasta varias horas a unos pocos días después de la administración en la circulación de la sangre. En el curso de este largo tiempo de residencia, los sistemas portadores de acuerdo a la invención, acumulan por ejemplo en el lecho vascular del tumor debido al llamado tener como objetivo en forma pasiva (Unezaki et al., Int. J. Pharmaceutics 114, 11 (1996); sadzuka et al., Cáncer Lett. 127, 99 (1998) und Wunder et al., Int. J. Oncol. 11, 497 (1997) ) .

Además y también independiente del tener como objetivo en forma pasiva, los sistemas portadores de acuerdo a la invención los cuales incluyen un ligando especifico de la célula objetivo unido a la célula objetivo. En áreas donde las enzimas se han liberado (por secreción celular, muerte celular o por la expresión de un gen introducido en la célula) el grupo lateral aniónico es removido del sistema portador. Esto causa que el sistema portador llegue a ser catiónico y se una a la célula y/o se desintegre y libere el ingrediente activo. Este ingrediente activo pude ser, por ejemplo, un ácido nucleico compuesto con un portador catiónico o un agente citostático. Esta secuencia de ácido nucleico puede penetrar la célula con la ayuda del portador catiónico y mostrar su acción ahí dependiendo en la composición, es decir por ejemplo, inhibe la transcripción o translación de un gen particular o un ARN particular o transduce la célula a fin de expresar el ARN o la proteína codificada por esta secuencia de ácido nucleico. Los sistemas portadores de acuerdo a la invención por lo tanto preferiblemente son adecuadas para la administración in vivo con el propósito de diagnosis, profilaxis o terapia de padecimientos . La preparación y uso del sistema portador de acuerdo a la invención se ilustra por los siguientes ejemplos. 3. Ejemplos para ilustrar el concepto de la invención Los siguientes ejemplos explican como la presente invención se puede llevar acabo. Ejemplo 1: Preparación de un complejo portador o vector que tiene una plasmida, un polímero catiónico y una substancia de revestimiento que comprende grupos laterales enzimáticamente removibles. Preparación del componente al) Como el componente al), el sistema pGL3 de expresión de plasmida de Promega se usa, el cual contiene las siguientes secuencias de nucleótido: - promotor SV40 y mejorador (genoma circular Genbank SV40; NIDg 965480: nucleótidos 5172-294) - ADNc para luciferasa - señal A SV40-poly Usando los métodos conocidos por aquellas personas capacitadas, la plasmida se inserta en la bacteria E. coli, la bacteria es desarrollada en un medio de cultivo y las plasmidas se aislan. Preparación del componente a2) Se prepara la polietilenimina (PEÍ 2000) de bajo peso molecular como se describe en la solicitud de la patente EP-A 0 905 254. Para esto, se agita una solución del monómero etilenimina 10% de concentración a una temperatura de 50 °C por 4 días en agua (5 ml del monómero etilenoimina + 45 ml de agua destilada, disolución con agitación) con adición de 1% (0.5 ml) de ácido clorhídrico concentrado (37 °C) como un catalizador, concentrado en un evaporador rotatorio y se seca a temperatura ambiente en vacío. Las determinaciones del peso molecular se llevan acabo por medio de las mediciones de la dispersión de luz lasérica (fotómetro de dispersión de luz Wyatt Dwan DSP) a 633 nm después de la inyección directa en una célula de medición K5. Las masas molares son determinadas en la base de las constantes de calibración determinadas en tolueno y el peso de la muestra inicial conocido. La determinación del peso molecular con la ayuda del análisis de dispersión de luz proporciona 2000 Da. En comparación, el PEÍ comercialmente (Fluka, Neu Ulm, Alemania) obtenido tiene un peso molecular de acuerdo al análisis de dispersión de luz de 791 Kda (HMW PEÍ) . Preparación del componente bl) El orosomucoide purificado del suero de sangre humana como se describe por Schmidt en: Las Proteínas de Plasma, ed. Frank Putnam, Academic Press 1975, 183-228 se usa como substancia de revestimiento. Preparación del complejo portador o vector Plasmidas (componente al) se suspenden en solución salina fisiológica en una concentración de 109 plasmidas/ml . (componente a2) PEÍ 2000 (1 mg/ml de solución salina fisiológica ajustada a 7.4 de pH usando HCl 1N) después se añaden en porciones al componente al) hasta que la cationización completa del complejo resultante (componente al)+a2)) se lleve a cabo (pH entre 7.5 y 12, preferiblemente 10) . La cationización se determina en el ensayo de desplazamiento de la agarosa, en donde se aplican alícuotas de 50 Ql a un gel de aproximadamente 0.5 cm de grosor de agarosa al 1% (p/v) y se desarrollan en un amortiguador tris-EDTA, pH 7.5 a 80 mV por 2 horas. La ubicación del ADN es visualizada a 254 nm después de la reacción con el bromuro de etidio. Los complejos catiónicos de los componentes al)+a2) después se suspenden en un exceso del componente bl) y se incuban a una temperatura de 4°C por al menos 48 horas. En este exceso, los complejos que tienen una carga neutral a ligeramente aniónica son formados de los componentes al)+a2)+bl) . Esta carga se verifica en el ensayo de desplazamiento de la agarosa y debe estar en el rango de pH entre 4 y 7. El complejo portador de acuerdo a la invención [componente al) +a2) -t-bl) ] después se utiliza. El componente del complejo vector a)+bl) sirve como un control. La investigación del tiempo de residencia de la sangre en los ratones Los complejos de acuerdo a la invención [componente al)+a2)+bl)] o, para el control, los complejos que contienen los componentes al)+a2) son inyectados en la vena de la cola de los ratones (NMRI) . La dosis es de 50 µg del componente al) en los complejos respectivos por cada ratón, el medio de suspensión es una solución salina fisiológica y el volumen de administración es de 250 µl . Después de 2 horas y 30 minutos de la inyección, los animales son anestesiados y desangrados. La sangre recolectada se mezcla con citrato de sodio (concentración final de 25 mM) y el plasma de sangre se separa de las células de la sangre por centrifugación (10 minutos, 1000 g) . El ADN es aislado de toda la sangre o del plasma de la sangre por medio del Conjunto de Tejidos QIAamp (Qiagen, Hilden) . Por esto, se añaden en cada caso 10 µl de heparina (1000 IU/ l Novo Nordisk) a 100 µl de plasma sanguíneo durante la primera incubación al 70% para aislar el ADN de plasmida cuantitativamente. Las muestras de ADN aislado se aplican al gel de agarosa al 0.8% y analizadas por la mancha Meridional como se describe en detalle en Obris et al. 1999. Resultados Mientras que, después de la administración de la preparación del control, después de 0.5 horas solo se detectan trazas de ADN en el plasma de la sangre, cantidades considerables de ADN se pueden detectar después de 0.5, y también después de 2 horas en el plasma sanguíneo de los animales, administrando los complejos de acuerdo a la invención. Estos resultados muestran que estos complejos vectores de acuerdo a la invención son, como se desee, distinguidos por una extensión significante del tiempo de residencia de la sangre . Leyendas de las figuras: Figura 1: Componentes al) y bl) de acuerdo la invención Figura 2: Interacción de los componentes al) y bl) Figura 3: Componentes al), a2) y bl) de acuerdo a la invención.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES . 1. Un sistema portador, caracterizado porque se obtiene al: (1) mezclar, donde sea apropiado, un componente a2) con un componente al) en una proporción molar [a2) :al)] de 1:1 a 1000.1, preferiblemente entre 10:1 y 100:1 (2) mezclar el complejo que resulta de la etapa (1) o él componente al) en si mismo con un componente bl), preferiblemente en una proporción molar bl) :al)±a2) de 1:1 a 1:1000, la proporción de mezclado se ajusta de tal manera que la carga neta del complejo total resultante preferiblemente es neutral o aniónica, donde - el componente al) comprende un ingrediente activo al) , una estructura de unión al) para las estructuras de unión bl) o a2) , es posible para el ingrediente activo al) que comprende la estructura de unión al) ; - el componente a2) comprende una estructura de unión a2) para la estructura de unión al), un portador a2), el cual puede comprender la estructura de unión a2) ; y - el componente bl) comprende una estructura de unión bl) para la estructura de unión al) , para el ingrediente activo al) , para la estructura de unión a2) o para el portador a2), una sustancia de revestimiento, la cual puede comprender la estructura de unión bl) , un enlazador enzimáticamente divisible, un grupo secundario aniónico. 2. Un sistema portador de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque debe comprender el componente a2) . 3. Un sistema portador de conformidad con una de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado porque la unión entre los componentes al) y a2) , al) y bl)y a2) y bl) ocurre - por cargas catiónicas y aniónicas - por grupos lipofilicos - por la unión epitope/anticuerpo - por interacciones zíper leucina y/o - por puentes S-S. 4. Un sistema portador de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el componente al) se selecciona de un grupo que comprende una secuencia de ADN, una secuencia de ARN, una plasmida, un virus, un péptido, una proteína, un glicopéptido, un glicolípido, cualquier medicamento, una enzima, una substancia radioactiva, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo que comprende él sitio de unión antígeno del anticuerpo, una molécula de unión antígeno, mono-especifica, bi-especifica o multi-esoecifica, de una cadena. 5. Un sistema portador de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el componente a2) se selecciona de un grupo que comprende un lípido catiónico, un polímero catiónico y un polipéptido catiónico y en donde el componente al) tiene una carga negativa. 6. Un sistema portador de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el componente a2) es un liposoma catiónico el cual incluye el componente al) . 7. Un sistema portador de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el enlazador enzimáticamente divisible del componente bl) es removido por fosfolipasas, peptidasas, glucosidasas, fosfatasas, estearasas oder sulfatasas. 8. Un sistema portador de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el enlazado enzimáticamente divisible del componente bl) es removido por la ß-glucuronidasa, neuraminidasa, D-galactosidasa, activador de plasminogeno, plasmina, antígeno especifico prostético, catepsina, estromelisina, colagenasa o caspasas. 9. Un sistema portador de conformidad con una de las reivindicaciones l a 8, caracterizado porque el enlazador enzimáticamente divisible del componente bl) se une a la substancia de revestimiento vía un espaciador el cual se desintegra después de la división del enlazador. 10. Un sistema portador de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 8 o de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el grupo lateral aniónico del componente bl) comprende al menos un ácido carboxílico, al menos un amino ácido, preferiblemente el ácido aspártico y el ácido glutámico, al menos un azúcar, preferiblemente el ácido glucurónico o el ácido neuramínico y/o al menos un ácido inorgánico, preferiblemente como el sulfato o fosfato. 11. Un sistema portador de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque el componente bl) es un polipéptido natural el cual lleva al menos un grupo lateral aniónico unido vía un enlazador enzimáticamente divisible. 12. Un sistema portador de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el polipéptido natural es seleccionado de un grupo que comprende orosomucoide, proteína de unión corticosteroide, haptoglobina, hemopexina, al-antiquimotripsina, glicoproteína a-HS, ß2-glicoproteina I, ß2-glicoproteina II. 13. Un sistema portador de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque el componente bl) es un glicofingolípido que contiene ácido neuramínico. 14. Un sistema portador de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el componente bl) es seleccionado de un grupo que comprende GM1, GM2, GD3, GD3, GT3, 0-acetil-GD3 y 0-acetil-GT3. 15. El uso de un sistema portador de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 14 para el tratamiento terapéutico del gen de padecimientos. 17. El uso de un sistema portador de conformidad con la reivindicación 15, en donde el padecimiento es seleccionado del grupo que comprende cáncer e inflamaciones. 18. Un proceso para la preparación de un sistema portador de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 14 caracterizado porque (1) se mezcla, donde sea apropiado, el componente a2) con el componente al) en un proporción molar [a2 ): al) ] de 1:1 a 1000.1, preferentemente entre 10:1 y 100:1 (2) se mezcla el complejo que resulta de la etapa (1) o el componente al) en si mismo con el componente bl) , preferiblemente en una proporción molar bl):al)±a2) de 1:1 a 1:1000, la proporción de mezclado se ajusta de tal manera que la carga neta del complejo total que resulta es preferiblemente neutral o aniónica. 19. Un medicamento, que comprende un sistema portador de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 14 para el tratamiento de cáncer y/o inflamaciones.