JP4397743B2

JP4397743B2 - 抗酸化剤

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Publication number: JP4397743B2
Application number: JP2004185656A
Authority: JP
Inventors: 茂則熊澤; 勉中山; 勉新垣; 修一福本
Original assignee: 株式会社ポッカコーポレーション
Priority date: 2004-06-23
Filing date: 2004-06-23
Publication date: 2010-01-13
Anticipated expiration: 2024-06-23
Also published as: JP2006008783A

Description

本発明は抗酸化剤に関するものである。

従来より、特許文献１には、溶媒抽出物からなる抗酸化剤として、プロポリスのエタノール水溶液抽出物からなる抗酸化剤が開示されている。
特開２００２−３０６０９２号公報

本発明は、本研究者らによる鋭意研究の結果、オオバギの溶媒抽出物に高い抗酸化作用があることを見出したことによりなされたものである。その目的とするところは、高い抗酸化作用を発揮する抗酸化剤を提供することにある。

上記の目的を達成するために、請求項１に記載の発明の抗酸化剤は、オオバギの溶媒抽出物からなることを要旨とする。
請求項２に記載の発明の抗酸化剤は、請求項１に記載の発明において、前記溶媒抽出物がオオバギの葉身又は茎の先端部を含む原料から溶媒抽出することにより得られることを要旨とする。

請求項３に記載の発明の抗酸化剤は、請求項１又は請求項２に記載の発明において、前記溶媒がエタノールであることを要旨とする。

本発明の抗酸化剤によれば、高い抗酸化作用を発揮することができる。

実施形態の抗酸化剤は、オオバギを溶媒抽出することにより得られる溶媒抽出物からなる。溶媒抽出物は高い抗酸化作用を有している。抗酸化剤は、前記溶媒抽出物に起因して、油脂の酸化劣化、香料の劣化、色素の分解、色素の退色等の様々な製品の劣化（主に酸化劣化）を効果的に抑えるための劣化防止剤として飲食品（飲料品又は食品）中に添加して利用され得る。また、抗酸化剤は、健康食品等の飲食品中に含有されることにより、経口摂取された生体内で活性酸素を消去して、肝機能の増強作用、アセトアルデヒドの毒性の低減、低密度コレステロール（ＬＤＬ）の抗酸化作用等の健康増進作用を発揮する。さらに、抗酸化剤は、化粧品、医薬品又は医薬部外品中に含有されることにより、皮膚等の美白効果や老化の防止等に役立つ。

オオバギはマカランガタナリウス（Macaranga tanarius）とも呼ばれ、トウダイグサ科オオバギ属に属する常緑広葉樹（雌雄異株）である。オオバギは沖縄、台湾、中国南部、マレー半島、フィリピン、マレーシア、インドネシア、タイ等の東南アジア、オーストラリア北部等に生育している。オオバギは、各器官やそれらの構成成分が溶媒抽出物の原料として用いられる。原料は、単独の器官又は構成成分から構成されてもよいし、二種以上の器官や構成成分から構成されてもよい。原料は、得られる溶媒抽出物の抗酸化作用が高いために、葉身又は茎の先端部を含むのが好ましい。茎の先端部は茎の成長点及び葉芽を含んでおり、葉身に比べて柔らかい。原料の形態は、採取された状態、採取された後に粉砕、破砕又はすり潰された状態等が挙げられるが、溶媒抽出物の抽出効率が高いために、採取された後にすり潰された状態が好ましい。

溶媒抽出物は、前記原料を溶媒に浸漬させた後に撹拌又は放置する抽出工程により得られる。溶媒としてはメタノール、エタノール、イソプロパノール等の低級アルコール、アセトニトリル、酢酸エチル、ヘキサン等の有機溶媒、水等が挙げられる。これらは単独で用いられてもよいし、二種以上が組み合わされて用いられてもよい。これらの中でも、溶媒抽出物の抽出効率が高いためにエタノールが好ましい。抽出工程では、前記浸漬により溶媒抽出物を溶媒中に抽出した後、原料と溶媒とを分離する固液分離が行われる。この固液分離により、溶媒抽出物は溶媒に溶解された状態、即ち溶媒抽出液として得られる。固液分離は膜分離や遠心分離等により行われるのが好ましい。さらに、固液分離によって溶媒から分離された原料は、溶媒によって再抽出されるのが、溶媒抽出物の抽出効率を高めることができるために好ましい。固液分離後、必要に応じて溶媒抽出液を濃縮及び乾燥することにより、固体状の溶媒抽出物が得られる。溶媒抽出液の濃縮及び乾燥は、溶媒抽出液を減圧下で加熱することにより行ってもよいし、真空凍結乾燥機を用いることにより溶媒抽出液を加熱することなく行ってもよい。

実施形態の飲食品は前記溶媒抽出物を含有するものであり、前記抗酸化剤を含有するものであってもよい。飲食品は、前記溶媒抽出物が有する抗酸化作用を十分に引き出すことにより、生体内で活性酸素を消去して様々な健康増進作用を発揮する健康食品として利用され得る。また、飲食品は、前記溶媒抽出物が有する劣化防止作用を十分に引き出すことにより劣化を防止して保存性を高め、長期間に渡って安定した品質を保持することが可能である。飲食品において、前記溶媒抽出物の摂取量は、成人１日当り好ましくは０．０１〜１０ｇ、より好ましくは０．２〜５ｇである。溶媒抽出物の１日当りの摂取量が０．０１ｇ未満の場合には抗酸化作用を効果的に発揮させることができないおそれがあり、逆に１０ｇを超える場合には不経済である。また、小人の場合は、前記成人の場合の半量が目安となる。

従って、実施形態の抗酸化剤は、高い抗酸化作用を有する前記溶媒抽出物を有効成分として含有していることから、飲食品等の劣化を防止して保存性を高めたり、経口摂取又は経皮投与することにより健康増進効果や老化防止効果を発揮することができる。また、実施形態の飲食品は、抗酸化作用を発揮する前記溶媒抽出物を含有していることから、飲食品自体の劣化防止や健康増進効果を発揮させることができる。

次に、実施例を挙げて前記実施形態をさらに具体的に説明する。
＜溶媒抽出物の製造＞
沖縄県那覇市首里金城町内において４月にオオバギの葉、茎、幹及び実を採取した後、それらを一つにまとめて細かく刻むとともに乳鉢ですり潰して原料を得た。次いで、原料０．１ｇに対して１ｍｌの割合で溶媒としてのエタノールを加えた後、約１週間室温（２５℃）暗所で放置して抽出工程を行った。続いて、ろ過により固液分離を行い溶媒抽出液を得た後、該溶媒抽出液を乾固させてオオバギの溶媒抽出物を得た。一方、前記オオバギの代わりとしてシロバナセンダンソウ（Bidens pilosa L. var. minor Scheff）、シークワーサー（Citrus depressa Hay）又は沖縄産プロポリス原体を用い、前記と同様にして各植物又は沖縄産プロポリス原体の溶媒抽出物を得た。ここで、前記沖縄産プロポリス原体としては、沖縄県那覇市を産地とするものを用いた。尚、以下の説明において、オオバギの溶媒抽出物をＯＥＰといい、沖縄産プロポリス原体の溶媒抽出物をＰＥＰという。

＜溶媒抽出物に関するＤＰＰＨラジカル捕捉活性試験＞
ＤＰＰＨ（α,α-diphenyl-β-picrylhydradil）は５１７ｎｍに極大吸収を持つ紫色の安定ラジカルであり、水素を得ることにより無色のヒドラジンになる。この呈色反応を利用して以下の方法にてラジカル捕捉活性を測定した。即ち、試料としてのＯＥＰをエタノールに溶解して試料溶液を調製した。続いて、試料溶液１２５０μｌに０．５ｍＭのＤＰＰＨ溶液（溶媒はエタノール）を２５０μｌ加えて反応液を調製し、該反応液を撹拌し暗所にて１時間反応させた後に５１７ｎｍにおける吸光度を測定した。一方、比較対照としては、前記ＯＥＰの代わりの試料として前記シロバナセンダンソウ若しくはシークワーサーの溶媒抽出物、ＰＥＰ又はＢＨＴ（butylated hydroxytoluene）を用い同様に試験を実施した。ここで、反応液中の試料の最終濃度は、ＯＥＰ及びＢＨＴのときには１０μｇ／ｍｌとし、シロバナセンダンソウ及びシークワーサーの溶媒抽出物のときには２０μｇ／ｍｌとし、ＰＥＰのときには１０μｇ／ｍｌ又は２０μｇ／ｍｌとした。また、前記試料を加えていないものをコントロールとして用い、同様に試験を実施した。次いで、ラジカル捕捉活性（％）を下記数１にて算出した。その結果を図１（ａ）に示す。尚、全ての試験は３回行い、その標準偏差も図１（ａ）に示す。

この結果、図１（ａ）に示すように、ＯＥＰは、他の植物の溶媒抽出物、ＰＥＰ及びＢＨＴに比べて、抗酸化作用の指標となるラジカル捕捉活性が高いことが明らかとなった。

＜溶媒抽出物の成分分析＞
前記ＰＥＰを以下の条件のカラムクロマトグラフィーにて（１）〜（１１）の画分に分画した。

カラム管：ガラスカラム５．０×４５ｃｍ
充填材：シリカゲル約５９０ｃｍ³
溶出溶媒：（１）ヘキサン：酢酸エチル＝90：10（ 350ml）
（２）ヘキサン：酢酸エチル＝80：20（ 220ml）
（３）ヘキサン：酢酸エチル＝70：30（ 250ml）
（４）ヘキサン：酢酸エチル＝60：40（1000ml）
（５）ヘキサン：酢酸エチル＝50：50（ 200ml）
（６）ヘキサン：酢酸エチル＝40：60（ 100ml）
（７）ヘキサン：酢酸エチル＝30：70（ 100ml）
（８）ヘキサン：酢酸エチル＝20：80（ 100ml）
（９）ヘキサン：酢酸エチル＝10：90（ 100ml）
（10）酢酸エチル（200ml）
（11）メタノール（700ml）
次に、各画分を下記ＨＰＬＣ条件１で分析したところ、（４）及び（６）〜（９）の画分に合計９つの主要成分が含まれていることが確認された。

ＨＰＬＣ条件１
カラム： Shiseido Capcell Pak ODS UG-120 (4.6×150mm)
溶媒：Ａ：水（２％酢酸）、Ｂ：アセトニトリル（２％酢酸）
溶出条件： 0-60min（グラジエント溶出；A:B＝80:20 → A:B＝20:80）
流速：１ml/min
検出：ＵＶ２８０ｎｍ
次に、（６）〜（９）の各画分を用いて下記ＨＰＬＣ条件２にて分取を行い、化合物１、２、３及び４を単離した。さらに、化合物１及び２については下記ＨＰＬＣ条件３にて精製を行い、化合物３及び４については下記ＨＰＬＣ条件４にて精製を行った。

ＨＰＬＣ条件２
カラム： YMC-Pack R&D ODS (20×250mm)
溶媒：水（0.1%TFA）：アセトニトリル（0.1％TFA）＝45：55
流速：９ml/min
検出：ＵＶ２８０ｎｍ
ＨＰＬＣ条件３（ＨＰＬＣ条件２と異なる条件のみを示す。）
溶媒：水（0.1%TFA）：アセトニトリル（0.1％TFA）＝50：50
流速：８ml/min
ＨＰＬＣ条件４（ＨＰＬＣ条件２と異なる条件のみを示す。）
溶媒：水（0.1%TFA）：アセトニトリル（0.1％TFA）＝40：60
また、画分（４）を用いて下記ＨＰＬＣ条件５にて分取を行い、化合物５、６、７、８及び９を単離した。さらに、化合物５及び６については下記ＨＰＬＣ条件６にて精製を行い、化合物７及び８については下記ＨＰＬＣ条件７にて精製を行い、化合物９については下記ＨＰＬＣ条件８にて精製を行った。

ＨＰＬＣ条件５
カラム： YMC-Pack R&D ODS (20×250mm)
溶媒：水（0.1%TFA）：アセトニトリル（0.1％TFA）＝40：60
流速：９ml/min
検出：ＵＶ２８０ｎｍ
ＨＰＬＣ条件６（ＨＰＬＣ条件５と異なる条件のみを示す。）
溶媒：水（0.1%TFA）：アセトニトリル（0.1％TFA）＝35：65
ＨＰＬＣ条件７（ＨＰＬＣ条件５と異なる条件のみを示す。）
溶媒：水（0.1%TFA）：アセトニトリル（0.1％TFA）＝35：65
流速：８ml/min
ＨＰＬＣ条件８（ＨＰＬＣ条件５と異なる条件のみを示す。）
溶媒：水（0.1%TFA）：アセトニトリル（0.1％TFA）＝20：80
前記化合物１〜９のそれぞれについて、¹Ｈ−ＮＭＲ、¹³Ｃ−ＮＭＲ、ＭＳ、ＩＲ、ＵＶスペクトル等を測定することにより構造解析を行った。その結果、化合物１はプロポリンＡ（propolin A；5,7,3',4'-tetrahydroxy-2'-(7''-hydroxy-3'',7''-dimethyl-oct-2''-enyl)-flavanone）であり、化合物２は5,7,3',4'-tetrahydroxy-5'-(7''-hydroxy-3'',7''-dimethyl-oct-2''-enyl)-flavanoneであり、化合物３は5,7,3',4'-tetrahydroxy-6-(7''-hydroxy-3'',7''-dimethyl-oct-2''-enyl)-flavanoneであることが判明した。さらに、化合物４は5,7,4'-trihydroxy-3'-(7''-hydroxy-3'',7''-dimetyl-oct-2''-enyl)-flavanoneであり、化合物５はニムフェオール−Ｂ（nymphaeol-B；5,7,3',4'-tetrahydroxy-2'-geranylflavanone）であり、化合物６はイソニムフェオール−Ｂ（isonymphaeol-B；5,7,3',4'-tetrahydroxy-5'-geranylflavanone）であることが判明した。加えて、化合物７はニムフェオール−Ａ（nymphaeol-A；5,7,3',4'-tetrahydroxy-6-geranylflavanone）であり、化合物８は5,7,4'-trihydroxy-3'-geranylflavanoneであり、化合物９はニムフェオール−Ｃ（nymphaeol-C；5,7,3',4'-tetrahydroxy-6-(3''',3'''-dimethylallyl)-2'-geranylflavanone）であることが判明した。

次いで、ＯＥＰにエタノールを加えて試料溶液（ＯＥＰの濃度：２０ｍｇ／ｍｌ）を調製した。次に、試料溶液をフィルターろ過（フィルターの孔径：０．４５μｍ）して残留物を取除いた後、下記Photo Diode Array-HPLC（ＰＤＡ−ＨＰＬＣ）条件で分析した。一方、前記ＯＥＰの代わりとして、シロバナセンダンソウ若しくはシークワーサーの溶媒抽出物又はＰＥＰを用い前記と同様にして分析を行った。各ＨＰＬＣクロマトグラムを図２に示す。また、前記各試料溶液について、ＵＶスペクトル及び下記ＬＣ／ＭＳ条件によるＭＳの測定を行った。

ＰＤＡ−ＨＰＬＣ条件
カラム： Shiseido Capcell Pak ODS UG-120 (4.6×250mm)
溶媒：Ａ：水（２％酢酸）、Ｂ：アセトニトリル（２％酢酸）
溶出条件： 0-60min（グラジエント溶出；A:B=80:20→A:B=20:80）
流速：１ml/min
検出：ＵＶ２８０ｎｍ
注入量：１０μｌ
温度：３０℃
ＬＣ／ＭＳ条件
・ＬＣ条件
カラム： Shiseido Capcell Pak C18 UG-120 (4.6×250mm)
溶媒：Ａ：水（２％酢酸）、Ｂ：アセトニトリル（２％酢酸）
溶出条件： 0-60min（グラジエント溶出；A:B=80:20→A:B=20:80）
流速：２００μl/min
検出：ＵＶ２８０ｎｍ
注入量：５μｌ
温度：３０℃
・ＭＳ条件
走査方式：ＭＳ
イオン源：ＥＳＩ
極性：負
シースガス（sheath gas）：７０ａｒｂ（Ｎ₂）
スプレー電圧（spray voltage）：５ｋＶ
キャピラリー温度：２６０℃
キャピラリー電圧：−１０Ｖ
この結果、ＵＶスペクトル及びＭＳのデータは示さないが、図２に示すように、ＯＥＰには化合物１及び５〜９が含有され、シロバナセンダンソウ及びシークワーサーの溶媒抽出物には各化合物が含有されていないことが明らかとなった。さらに、ＯＥＰには、化合物１〜９に比べて保持時間が短い化合物群が含有されていることが明らかとなった。

＜溶媒抽出物の製造＞
沖縄県那覇市首里金城町内において１０月にオオバギの葉身、茎の先端部、葉柄、茎（先端部以外の部分）及び幹を採取した。次いで、茎及び幹を一つにまとめた以外は各構成成分を別々に分けた状態で各々を細かく刻むとともに乳鉢ですり潰し、特定の器官又は構成成分からなる原料を得た。続いて、各原料について、実施例１の＜溶媒抽出物の製造＞と同様にしてそれぞれ溶媒抽出物を得た。

＜溶媒抽出物に関するＤＰＰＨラジカル捕捉活性試験＞
前記ＯＥＰの代わりの試料として前記特定の器官又は構成成分の溶媒抽出物を用い、実施例１の＜溶媒抽出物に関するＤＰＰＨラジカル捕捉活性試験＞と同様の試験を行いラジカル捕捉活性を算出した。一方、前記ＯＥＰ又は比較対照として前記ＰＥＰを用い、同様に試験を行いラジカル捕捉活性を算出した。ここで、反応液中の試料の最終濃度はそれぞれ１０μｇ／ｍｌとした。その結果を図１（ｂ）に示す。尚、全ての試験は３回行い、その標準偏差も図１（ｂ）に示す。

この結果、図１（ｂ）に示すように、特定の器官又は構成成分の溶媒抽出物は全て、ＰＥＰに比べてラジカル捕捉活性が高いことが明らかとなった。特に、葉身又は茎の先端部の溶媒抽出物は、ＰＥＰだけでなくＢＨＴよりもラジカル捕捉活性が高いことが明らかとなった。このため、葉身又は茎の先端部の溶媒抽出物は、高い抗酸化作用を発揮することを確認した。

＜溶媒抽出物の成分分析＞
前記特定の器官又は構成成分の溶媒抽出物について、実施例１の＜溶媒抽出物の成分分析＞と同様にして分析、ＵＶスペクトル及びＭＳの測定を行った。各ＨＰＬＣクロマトグラムを図３及び図４に示す。尚、図３及び図４における各数字は図２と同じ凡例を示す。この結果、ＵＶスペクトル及びＭＳのデータは示さないが、図３及び図４に示すように、葉身の溶媒抽出物には化合物５〜９が含有され、茎の先端部の溶媒抽出物には化合物１、５、７及び９が含有され、葉柄の溶媒抽出物には化合物１、５及び７〜９が含有されていることが明らかとなった。さらに、各溶媒抽出物には、化合物１〜９に比べて保持時間が短い化合物群が含有されていることが明らかとなった。

なお、本実施形態は、次のように変更して具体化することも可能である。
・前記溶媒抽出物を、抗アレルギー剤、抗菌剤又は抗腫瘍剤の有効成分として用いてもよい。ここで、溶媒抽出物は、抗酸化作用以外にも高い抗アレルギー作用、抗菌作用及び抗腫瘍作用を有している。このため、各製剤は、溶媒抽出物に起因して高い抗アレルギー作用、抗菌作用又は抗腫瘍作用をそれぞれ発揮する。

・前記溶媒抽出物を、化粧品、医薬品又は医薬部外品に含有させてもよい。このように構成した場合には、溶媒抽出物に起因する高い抗酸化作用を様々な用途に利用することができる。

さらに、前記実施形態より把握できる技術的思想について以下に記載する。
・請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の抗酸化剤の製造方法であって、オオバギを原料とし、該原料を溶媒抽出する抽出工程を備えていることを特徴とする抗酸化剤の製造方法。この構成によれば、抗酸化剤の製造が容易である。

・オオバギの溶媒抽出物を含有することを特徴とする飲食品。この構成によれば、高い抗酸化作用を発揮することができる。

（ａ）は実施例１のＤＰＰＨラジカル捕捉活性試験結果を示すグラフ、（ｂ）は実施例２のＤＰＰＨラジカル捕捉活性試験結果を示すグラフ。実施例１の各溶媒抽出物のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。実施例２の各溶媒抽出物のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。実施例２の各溶媒抽出物のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。

Claims

オオバギの溶媒抽出物からなることを特徴とする抗酸化剤。
前記溶媒抽出物がオオバギの葉身又は茎の先端部を含む原料から溶媒抽出することにより得られることを特徴とする請求項１に記載の抗酸化剤。
前記溶媒がエタノールであることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の抗酸化剤。