JP4366523B2 - 電気泳動用チップ及びこれを用いた試料の分析方法 - Google Patents

Description

本発明は、極微量のタンパク質・ペプチド・アミノ酸・核酸等の生体成分や、ビタミン・ステロイド剤等の薬物や、光学異性体、無機化合物等の試料を、高解像度、低電圧で、かつ、再現性よく定量的に分離・検出することができる電気泳動用チップ及びこれを用いた試料の分析方法に関する。

近年、マイクロマシン技術を用いて微小な流路構造をもつマイクロチップを製作し、化学・バイオ関連装置の小型化・集積化を目指す研究が盛んに行われている。このような研究分野は、マイクロ化学分析システムなどと呼ばれ、試料分析精度の向上、試料・試薬・廃液の節減、処理の高速化・高効率化、システムの小型化・自動化などの効果が期待されており、これまで、電気泳動やＰＣＲなどの機能を持つマイクロチップが多数発表されている。

マイクロチップを応用した電気泳動法として、クロスインジェクション法が知られている（非特許文献１参照）。
クロスインジェクション法を利用した電気泳動用チップの一例を図１３に示す。この例の電気泳動チップ１１では、ガラス基板上に十字の溝を持つポリメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）チップを張り合わせることによりその十字の流路が形成されている。十字の流路の４つの端部には液体を導入するポートが設けられ、また、電極（図示略）が接続されている。この例では、ポート２４からポリマー溶液を十字の流路内に満たした後、液体試料をポート２１に注入し、ポート２２および２３は緩衝液で満たす。まず、試料導入のための十字の短辺の流路３１に電圧を加えることでこの短辺の流路３１内に試料を満たす。続いて、試料分離のための十字の長辺の流路３２に電圧を加え、短辺の流路３１と長辺の流路３２の交差部分ＩＳの微小試料片（プラグ）を十字の長辺の流路に導入する。その後、試料は混合した物質の分子量ごとのバンドとなって分離される。
Effenhauser, et.al.,"Integrated Capillary Electrophoresis on Flexible Silicone Microdevices: Analysis of DNA Resriction Fragments and Detection of Single DNA Molecules on Microchips,"Anal.Chem,1997,69,3451-3457

上記の技法においては、試料の分離・検出の解像度を上げるためには、十字の長辺の流路３２の両端に設けられたポート２２及び２４の両液面の高さが等しくなるように調整する必要がある。しかし、実際には、ポート２２及び２４の両液面の高さが等しくなるように調整することは難しい。そのため、ポート２２及び２４の両液面の高さに差が生じ、この両液面の高さの差に起因する長辺の流路３２の両端にかかる圧力の差によって、長辺の流路３２内の液体に内部流れが発生しやすくなる。この結果、この技法を用いた試料の分析方法では、試料の分離・検出の解像度が比較的低く、試料の分析の再現性が良くないという問題がある。
また、この技法においては、印加電圧の制御により電気的プラグを生成するが、導入時の電圧印加の時間によって、生成した試料プラグ内の構成成分の比が、ポート２１にある元の試料の構成成分の比とは異なるという問題がある。よって、この技法においては、試料導入の電圧印加の時間が十分でない場合には、定量性を補償することが困難である。
また、この技法においては、試料を導入する際の印加電圧及び試料を分離する際の印加電圧が１００ボルトから３００ボルト程度必要となり、大掛かりな装置が必要となる。

本発明は、かかる状況に鑑みてなされたものであり、極微量のタンパク質や核酸等の試料の分析において、１）試料の分離・検出の解像度が高く、２）試料の分析の再現性に優れ、３）試料の定量分析が可能であり、かつ、４）試料を分離する際の印加電圧を低く抑えることができる電気泳動用チップを提供することを課題とする。また、前記電気泳動用チップを用いた試料の分析方法を提供することを課題とする。

本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、流路に液体試料を導入する機構として、流路に気体透過部を２以上並べて接続し、それぞれの気体透過部を、この気体透過部に接続する気体通路を介して、気体ポートとつなぎ、この気体ポートから気体を導入・排出することにより、流路内に試料や緩衝液を導入する機構を組み込んだ電気泳動チップを用いれば、前記の課題が解決されることを見出した。ここに、気体透過部は、気体は透過させるが、液体等は透過させないようになっている。

この電気泳動チップにおいては、前記従来の技術のように、１）流路の両端にポートを設ける必要がないので、この電気泳動チップを用いた試料の分析においては、前記従来の技術におけるような、流路の両端に位置する２つのポートの液面差を調整する必要がなく、また、２）試料プラグを生成する際に電気的操作を伴わないため、元の試料と同一の成分の試料プラグを生成できることによるものである。
また、この電気泳動チップを用いた試料の検出方法によれば、前記課題を解決することができることを見出し、これらの知見に基づいて本発明を完成した。

即ち、本発明の第１の発明は、試料を導入するためのポートと、導入された試料の流路と、流路に接続された２以上の電極とを備えた電気泳動用チップであって、前記電極のいずれか１つの近傍には気体透過部が２以上並べて接続されており、それぞれの気体透過部は、気体通路を介して、前記気体通路に気体を導入・排出するための気体ポートと接続されていることを特徴とする電気泳動用チップである。

本発明の第２の発明は、前記気体透過部が複数の細管で構成される細管束、若しくは多数の細孔を有する細孔部であることを特徴とする第１の発明に記載の電気泳動用チップである。

本発明の第３の発明は、前記電極の前記流路に突出する端縁が、前記流路の長手方向に直交する直線状であることを特徴とする第１の発明又は第２の発明に記載の電気泳動用チップである。
この電気泳動用チップを用いれば、試料を分離するときに、分離した物質のバンドの形状が変形せず、矩形を保つので、試料の分離・検出の解像度がより向上し、好ましい。

本発明の第４の発明は、前記細管の壁面が、疎水性加工若しくは親水性加工されていることを特徴とする第２の発明又は第３の発明に記載の電気泳動用チップである。
この電気泳動用チップにおいて細管束の壁面が疎水性であれば、親水性の物質が細管束に浸入することが防止されるので、親水性の試料を分析するのに好適である。この電気泳動用チップにおいて細管束の壁面が親水性であれば、疎水性の物質が細管束に浸入することが防止されるので、疎水性の試料を分析するのに好適である。

本発明の第５の発明は、前記細管の断面形状が矩形であり、幅及び高さが０．１μｍ以上２０μｍ以下とすることを特徴とする第２の発明から第４の発明のいずれか１つに記載の電気泳動用チップである。

本発明の第６の発明は、前記流路が複数並列してなることを特徴とする第１の発明から第５の発明のいずれか１つに記載の電気泳動用チップである。
この電気泳動用チップを用いれば、流路毎に異なる気体ポートを設ける必要がなくなり、装置を簡略化できるという点で好ましい。さらに、この電気泳動用チップによれば、流路が複数備えられているので、そのうち１つの流路に分子量既知のマーカーを導入し、それ以外の流路に分子量を測定したい試料を導入し、同じ電源装置によって電気泳動を行うことにより、試料の分子量を測定することができる。

本発明の第７の発明は、前記電極が形成された上面を有するガラス基板と、予め溝加工された加工面を有する樹脂基板とを、前記ガラス基板の上面に、前記樹脂基板の加工面を対面させて貼り合せることにより、
前記樹脂基板の加工面の溝によって、前記流路と、前記気体透過部と、前記気体通路とが形成されていることを特徴とする第１の発明から第６の発明のいずれか１つに記載の電気泳動用チップである。

本発明の第８の発明は、前記流路の末端に設けられている電気泳動開始用電極の近傍に２以上の前記気体透過部が並べられており、
前記電気泳動開始用電極に最も近い気体透過部に通じた第１の気体ポートから気体を排出することにより、試料を前記流路の一部又は全体に導入した後、
前記電気泳動開始用電極に最も近い気体透過部以外のいずれか１つの気体透過部に通じた第２の気体ポートから気体を導入することにより、前記試料の一部を前記流路に計量して残し、前記試料のそれ以外の部分を流路から排出し、
次いで、前記第２の気体ポートから気体を排出することにより、前記流路に緩衝液を導入し、
電極に電圧を加えて試料を分離することを特徴とする第１の発明から第７の発明のいずれか１つに記載の電気泳動用チップである。

本発明の第９の発明は、第１の発明から第８の発明のいずれか１つに記載の電気泳動用チップを２以上並列してなる電気泳動用チップアレイである。
この電気泳動用チップアレイによれば、流路が複数備えられているので、そのうち１つの流路に分子量既知のマーカーを導入し、それ以外の流路に分子量を測定したい試料を導入し、同じ電源装置によって電気泳動を行うことにより、試料の分子量を測定することや、試料の成分量を定量することができる。

本発明の第１０の発明は、第１の発明から第８の発明のいずれか１つに記載の電気泳動用チップ若しくは請求項９記載の電気泳動用チップアレイを用いたことを特徴とする試料の分析方法である。

本発明の第１１の発明は、前記流路の末端に設けられている電気泳動開始用電極の近傍に３以上の前記気体透過部が並べられており、
前記電気泳動開始用電極に最も近い気体透過部に通じた第１の気体ポートから気体を排出することにより、第１の試料を前記流路の一部又は全体に導入した後、
前記電気泳動開始用電極に最も近い気体透過部以外のいずれか１つの気体透過部に通じた第２の気体ポートから気体を導入することにより、第１の試料の一部を前記流路に計量して残し、第１の試料のそれ以外の部分を前記流路から排出し、
次いで、前記第２の気体ポートから気体を排出することにより、第２の試料を前記流路に導入した後、
前記第２の気体ポートに通じた気体透過部を介して、前記電気泳動開始用電極とは反対の側に位置するいずれか１つの気体透過部に通じた第３の気体ポートから気体を導入することにより、第２の試料の一部を前記流路に計量して残し、第２の試料のそれ以外の部分を前記流路から排出し、
次いで、前記第３の気体ポートから気体を排出することにより、前記流路に緩衝液を導入し、
電極に電圧を加えて、第１の試料と第２の試料の反応を分析することを特徴とする第１０の発明に記載の試料の分析方法であるである。
この試料の分析方法によれば、２種の試料の反応、例えば、一本鎖ＤＮＡ同士の結合を検出したり、ＤＮＡと制限酵素との反応により、遺伝子の同定をおこなうことができる。

本発明の電気泳動チップを用いれば、極微量のタンパク質や核酸等の試料の分析において、試料の分離・検出の解像度が高く、再現性・定量性に優れた分析ができる。また、本発明の電気泳動チップでは、試料を分離するための印加電圧が低いので、大掛かりな電源装置を必要とせず、使い勝手がよい。そのため、さまざまな分野や場所において利用でき、有用である。
また、本発明の試料の分析方法は、上記と同様の効果を有し、有用である。

以下、図面を用いて本発明を詳細に説明する。
本発明に係る電気泳動用チップの１例の模式図を図１（ａ）及び図１（ｂ）に示す。図１（ｂ）は、図１（ａ）に示した電気泳動用チップ１２を真上から見たときの流路３の末端付近の拡大模式図である。この例の電気泳動用チップ１２は、ガラス基板１１と樹脂基板１３の２つを主要部とする。ガラス基板１１は５０ｍｍ×７６ｍｍ×１ｍｍの大きさとされる。樹脂基板１３は、大きさが２５ｍｍ×４０ｍｍ×３ｍｍの大きさとされ、ガラス基板１１上に貼り合わされている。ガラス基板１１の上面１１ａには２つの電極４が設けられている。

樹脂基板１３の端にはポート２が設けられ、ここから試料を導入できるようになっている。ポート２は略円柱状であり、直径は１ｍｍとされる。ポート２から流路３が直線状に設けられている。流路３の長手方向の長さは１５ｍｍとされ、断面が略矩形状で幅が９０μｍ、高さが２５μｍとされる。流路３はその末端３３において閉じている。ガラス基板１１の上面１１ａに設けられている２つの電極４のうちの１つは、流路３の末端３３に接続されている。この電極は電気泳動の開始地点に位置するので、以後適宜、電気泳動開始用電極４１という。もう一つの電極４の端部は末端３３から約３ｍｍの流路３に位置している。両電極ともその一部が流路３内に突出している。電極４は厚さが数十ｎｍとされる。

流路３の末端３３に接続した電気泳動開始用電極４１の近傍には気体透過部５６が２つ並んで流路３に接続されている。この気体透過部５６は、流路３と気体通路７を連通させており、気体は透過させるが、液体等は透過させないようになっている。この例では、気体透過部５６は複数の細管５で構成される細管束６からなっており、細管５は流路３と連通している。１つの細管束６には、細管５が１〜１００個並列しており、１つの細管５は断面形状が矩形とされ、幅が２μｍ、高さが３μｍとされる。また、細管同士の間隔は１２．５μｍとされる。この例では、２つの細管束６は流道３に対して直角に設けられている。各々の細管束６には気体通路７が接続されており、細管５は気体通路７と連通している。気体通路７の断面形状は矩形とされ、幅が６０μｍ、高さが２５μｍとされる。

図１（ａ）に示す電気泳動用チップ１２のＣＤ断面図を図３に示す。これによると流路３と細管５と気体通路７が連通していることがよく分かる。
気体通路７の細管と連通していない一端には気体ポート８が接続され、気体通路７と気体ポート８が連通している。気体ポートは略円柱状とされ、直径は１ｍｍとされる。気体ポート８には、気体チューブ９が挿入されている。気体チューブは空気圧制御装置（図略）とつながれており、装置を制御することにより、気体ポート８、気体通路７、細管束６、流路３に気体を導入したり、気体を排出できるようになっている。空気圧制御装置は自動化された機械を用いても良いし、注射器のような手動の器具を用いても良い。
なお、本発明の電気泳動用チップ１の各部材のサイズや形状、それに部材同士の位置関係はこの例に限るものではない。また、電極４を３つ以上設けることにより、電気泳動の測定の長さを２種以上設定することができる。

この例の電気泳動用チップ１２においては、流路３に接続した電極４の流路３に突出する端縁４ａを、図１（ｂ）に示すように、流路３の長手方向に直交する直線状とするのが好ましい。このようにすると、試料を分離するときに、分離した物質のバンドの形状が変形せず、矩形を保つので、試料の分離・検出の解像度がより向上する。これは、端縁４ａを流路３の長手方向に直交する直線状とすることにより、電気泳動時の電極間に生じる電気力線が流路３の長手方向をとりやすくなるためであると推定される。

この例の電気泳動用チップ１２に用いる樹脂基板１３には、シリコーンエラストマーの１種であるポリジメチルシロキサン（以下、「ＰＤＭＳ」という。）を用いている。また、電極４には、クロムと金を積層したものを用いている。気体チューブ９は通常のシリコーンチューブを用いている。

この例の電気泳動用チップの製作は、ガラス基板上１１の上面１１ａに電極４をエッチングする工程と、樹脂に溝１３ｂを型成形して樹脂基板１３を製作する工程と、ガラス基板１１の上面１１ａと、図４に示されるような、樹脂基板１３の加工面１３ａを対面させて貼り合せる工程から概略構成される。ガラス基板１１と樹脂基板１３を張り合わせると、型成形された溝によって、流路３と、細管５及び細管束６と、気体通路７が形成される。

ガラス基板の電極構造は、クロムおよび、金の蒸着、エッチング保護膜としてのフォトレジストのパターンニング、クロムのエッチングにより作成される。

樹脂に溝を型成形するためには、まず、樹脂を型成形するための反転型を製作する。反転型の製作は、例えば、「Hosokawa, et. Al., “Handling of Picoliter Liquid Samples in a Poly(dimethylsiloxane)-Based Microfluidic Device,”Anal. Chem. 1999, 71, 4781-4785」（参考文献１） に記載の方法を用いて行うことができる。この例では、流路３及び気体通路７のための溝を型成形するためのマスクと細管束６のための溝を型成形するための鋳型をフォトレジストのフォトリソグラフィ法により製作する。一方、樹脂に溝を型成形するのは、上記参考文献１記載の方法、即ち、レプリカ・モルディング法を用いて行うことができる。溝を型成形した樹脂基板は、必要な部位に金属ドリルで穴あけして、ポート２及び気体ポート８を作成する。

この製作方法においては、樹脂基板１３は、ガラス基板１１のようなフラットな表面に対して自己接着性を有するため、特別な接合過程を経ないで流路３と、細管５及び細管束６と、気体通路７が形成することができる。

気体ポート８には気体チューブ９を挿入し、必要に応じて、接着剤にて気体ポート８には気体チューブ９の接合部を塞ぎ、気体の漏れを防ぐようにする。

本発明においては、樹脂としてＰＤＭＳを用いれば、細管の壁面５ａは疎水性となるので、これにより作製した電気泳動用チップは、ＤＮＡやタンパク質などを含む水溶液中の試料を分析するのに都合がよい。一方、細管５及び流路３を形成させるための溝に、親水性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）などを塗布することや、樹脂基板１３の代わりに、それと同一形状のガラス製の基板を用いることにより、細管５及び流路３の壁面は親水性となり、これにより作製した電気泳動用チップは、脂質や有機物質などを含む疎水性溶液中の試料を分析することができる。なお、上記ガラス製の基板も、前記樹脂基板１３の製作と同様、ガラスを型成形するための反転型を製作することにより製作することができる。また、ウェットエッチングにより、ガラスに細管５及び流路３等を形成させて、上記ガラス製の基板を作製してもよい。

本発明においては、気体透過部５６を、前記細管束６の構造とする代わりに、多くの細孔を有する多孔質体５１の構造とすることもできる。
気体透過部５６を多孔質体５１の構造とした例を図５に示す。図５（ａ）は、この例の電気泳動用チップを真上から見たときの流路３の末端付近の拡大模式図であり、図５（ｂ）は、この例の電気泳動用チップを図１（ａ）に示したＣＤ断面で切断したときの断面図である。この図から明らかなように、この例の電気泳動用チップは、流路３と気体通路７をつなぐ部分を、前記細管管６の構造とする代わりに、多孔質体５１の構造とする以外は、図１に示す電気泳動用チップ１２と同じ構成を有する。

この例の電気泳動用チップは、前記と同様の方法で樹脂等を型成形し、インサート成形により多孔質体５１を形成することで、製作することができる。即ち、インサート成形においては、反転型にインサート品である多孔質物質を装填し、次いで、樹脂を注入して多孔質物質を溶融樹脂で包んで固化させ、樹脂と多孔質体５１が一体化した部材を製作する。
多孔質体５１に用いられる物質としては、１）不規則な細孔構造を有する、多孔質ガラス、多孔質シリコン、活性炭、セラミクスのほか、２）規則的な細孔構造を有する、ゼオライト、層状構造物、等がある。

この例の電気泳動用チップ１２の使用方法を図６を参照して説明する。この例では、気体透過部５６は細管束６１、６２からなっている。
ポート２（図略）に試料Ｓを注入する。気体制御装置（図略）により、気体ポート８１から気体を排出し、細管束６１及び気体通路７１の圧力を流路３に対して負圧にすると、流路３内の一部に試料Ｓが導入される（図６（ａ））。ここでは、試料Ｓは、その一端が末端３３（若しくは電気泳動開始用電極４１）付近に置かれ、もう一端は、細管束６２とポート２の間に置くようにする。図６（ｂ）に示すように、気体ポート８２から気体を導入し、細管束６２及び気体通路７２の圧力を流路３に対して正圧にしたときに、試料の一部ＳＰを残し、微小試料片（プラグ）を形成させるためである。このようにすれば、試料Ｓを流路３全体に導入する場合に比べて、より少ない試料で分析することができ、貴重なサンプルを有効利用できる。
次いで、気体制御装置により、気体ポート８２から気体を導入し、細管束６２及び気体通路７２の圧力を流路３に対して正圧にすると、試料の一部ＳＰが残り、微小試料片（プラグ）が形成される（図６（ｂ））。

次いで、ポート２に緩衝液Ｂを注入する。気体制御装置により、気体ポート８２から気体を排出し、細管束６２及び気体通路７２の圧力を流路３に対して負圧にすると、流路３内に緩衝液Ｂが導入される（図６（ｃ））。
その後、電極４に電圧を加えることにより、試料がポート２に向かって動くが、分子量の小さい物質は移動度が大きく、分子量の大きい物質は移動度が小さいので、試料を分離・検出することができる。ここで、電極は厚さが数十ｎｍとされているので、流路３の構造は長手方向にほぼ一様であり、試料の分析に与える影響は無視できる。また、試料の分離にかかる時間は、３分程度とされ、従来の技法と同等の性能を有するが、試料プラグ生成の際に、元の試料と構成成分比が変わらないので、試料を定量的に分析することができる。

この例の電気泳動用チップ１２を用いて試料を分離・検出するのに必要な印加電圧は、数Ｖ（５〜６Ｖ）でよいので，用いる電源としては、通常の直流電源装置でよく、乾電池を直列につないたものを用いてもよい。いずれにしても、従来の技法におけるように、大掛かりな装置は必要とされない。

試料の検出については、試料を蛍光色素で染色したものを蛍光顕微鏡等で検出する他、レーザ励起蛍光法等を用いたり、試料を放射性元素で標識したものを計数管で検出することができる。また、赤外分光法や表面プラズモン分析法によれば試料を染色・標識等する必要がないので、試料の本来の状態で検出することができる。その他にも、電気化学的検出、コンダクティビティ検出等が考えられる。

本発明に係る電気泳動用チップのもう１つの例の模式図を図２（ａ）に示す。この例では、気体透過部５６は、複数の細管５で構成される細管束６からなっており、細管５は流路３と連通している。図１において用いた部材と同じ部材は説明を省略する。この例の電気泳動用チップ１４においては、細管束６が４つ並んで流路３に接続されており、それに伴って、気体通路７及び気体ポート８が４つ設けられている以外は、電気泳動用チップ１２と同様の構成である。また、この例の電気泳動用チップ１４の製作は前記と同様の方法で行える。
なお、この例においては、前記と同様、気体透過部５６を、前記細管管６の構造とする代わりに、多孔質体５１の構造とすることもできる。

この例の電気泳動用チップ１４の使用方法を図７を参照して説明する。この例では、気体透過部５６は、細管束６１、６２，６３からなっている。
ポート２（図略）に第１の試料Ｓ１を注入する。気体制御装置（図略）により、気体ポート８１から気体を排出し、細管束６１及び気体通路７１の圧力を流路３に対して負圧にすると、流路３内全体に試料Ｓ１が導入される（図７（ａ））。ここでは、試料Ｓ１は、その一端が末端３３（若しくは電気泳動開始用電極４１）付近に置かれ、もう一端は、細管束６２とポート２の間に置くようにする。図７（ｂ）に示すように、気体ポート８２から気体を導入し、細管束６２及び気体通路７２の圧力を流路３に対して正圧にしたときに、試料の一部Ｓ１Ｐを残し、微小試料片（プラグ）を形成させるためである。このようにすれば、試料Ｓ１を流路３全体に導入する場合に比べて、より少ない試料で分析することができ、経済的である。
次いで、気体制御装置により、気体ポート８２から気体を導入し、細管束６２及び気体通路７２の圧力を流路３に対して正圧にすると、第１の試料の一部Ｓ１Ｐが残り、第１の試料の微小試料片（プラグ）が形成される（図７（ｂ））。

次いで、ポート２に第２の試料Ｓ２を注入する。気体制御装置により、気体ポート８２から気体を排出し、細管束６２及び気体通路７２の圧力を流路３に対して負圧にすると、流路３内に第２の試料Ｓ２が導入される（図６（ｃ））。ここでは、試料Ｓ２は、その一端が細管束６２付近に置かれ、もう一端は、細管束６３とポート２の間に置くようにする。図７（ｄ）に示すように、気体ポート８３から気体を導入し、細管束６３及び気体通路７３の圧力を流路３に対して正圧にしたときに、試料の一部Ｓ２Ｐを残し、微小試料片（プラグ）を形成させるためである。このようにすれば、試料Ｓ２を流路３全体に導入する場合に比べて、より少ない試料で分析することができ、経済的である。
次いで、気体制御装置により、気体ポート８３から気体を導入し、細管束６３及び気体通路７３の圧力を流路３に対して正圧にすると、第２の試料の一部Ｓ２Ｐが残り、第２の試料の微小試料片（プラグ）が形成される。こうして、第１の試料の微小試料片（プラグ）と、第２の試料の微小試料片（プラグ）同士を合一させて反応を行うことができる。

次いで、ポート２に第２の緩衝液Ｂを注入する。気体制御装置により、気体ポート８３から気体を排出し、細管束６３及び気体通路７３の圧力を流路３に対して負圧にすると、流路３内に緩衝液Ｂが導入される。
その後、電極４に電圧を加えることにより、試料がポート２に向かって動くが、分子量の小さい物質は移動度が大きく、分子量の大きい物質は移動度が小さいので、試料を分離・検出することができる。

このように、この電気泳動用チップ１４を用いれば、２種以上の試料を導入することにより、これらの試料を反応させ、その状態を調べることもできる。例えば、試料として一本鎖ＲＮＡと、その相補鎖の一本鎖ＲＮＡを用いれば、この２種が結合するので、分子量が増加して、単独のＲＮＡと別のバンドを形成するから、このバンドを検出することにより一本鎖ＲＮＡ同士が結合することが確かめられる。試料としてＤＮＡとＤＮＡ結合性タンパク質を用いても同様に２者の結合が確かめられる。

また、この電気泳動用チップ１４を用いれば、比較的低濃度の試料に対しては、ポート８１とポート８３或いはポート８１とポート８４を用いて試料片の液量を多くすることにより、試料の分析をすることができる。

本発明の電気泳動用チップにおいては、流路３の末端３３に接続した電気泳動開始用電極４１の近傍には複数の細管５で構成された細管束６の個数は２以上であればよく、また、個数を多く設けるほど分離・検出する試料の組み合わせの自由度が大きくなるが、実際には、７〜８個程度でよいとされる。

本発明の電気泳動用チップにおいては、図８及び図９に示すように、１つのチップに流路３を複数設けることもできる。この電気泳動用チップを用いれば、流路毎に異なる気体ポート８を設ける必要がなくなり、装置を簡略化できるという点で好ましい。さらに、この電気泳動用チップによれば、流路が複数備えられているので、そのうち１つの流路に分子量既知のマーカーを導入し、それ以外の流路に分子量を測定したい試料を導入し、同じ電源装置によって電気泳動を行うことにより、試料の分子量を測定することができる。

本発明の電気泳動用チップ１２又は１４を複数並列し、電気泳動用チップアレイ１０とすることもできる（図１０参照）。これによれば、流路３が複数備えられているので、そのうち１つの流路３に分子量既知のマーカーを導入し、それ以外の流路に分子量を測定したい試料を導入し、同じ電源装置によって電気泳動を行うことにより、試料の分子量を測定することができるといった利点がある。

本発明の電気泳動用チップを用いて、１００塩基から１０００塩基までの間で１００塩基ずつ長くした１０種類のＤＮＡを混合したＤＮＡマーカー（１００ｂｐ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｒ Ｒｕｌｅｒ；ＢＩＯ−ＲＡＤ，ＵＳＡ）の分離・検出を行った。このＤＮＡマーカーは蛍光標識（ＳＹＧＲＧｒｅｅｎ Ｉ；ＭｏｌｅｃｕｌｅｒＰｒｏｂｅｓ，ＵＳＡ）で染色した。また、ハイドロキシメチルセルロース（ＨＥＣ）溶液（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ，Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ ｅｔｈｅｒ（分子量９００００−１０５０００）；Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）（ＴＢＥ緩衝液中１．２％濃度）をＤＮＡ試料の分離用のふるいとして用いた。この実施例では、前記電気泳動用チップ１４を用いた。また、気体制御装置としては、自動式の空気圧制御装置を用い、それぞれのシリコーンチューブをこの自動式の空気圧制御装置につないで気体の制御を行った。

用いた試料は前記ＤＮＡマーカーの１種のみなので、試料の導入及び分離・検出方法は前記電気泳動用チップ１２において説明したのと同じである。即ち、ポート２に前記ＤＮＡマーカーを注入した。自動式の空気圧制御装置により、気体ポート８１から気体を排出し、細管束６１及び気体通路７１の圧力を流路３に対して負圧にして、流路３内全体にＤＮＡマーカーを導入した（図８（ｂ））。次いで、注射器により、気体ポート８２から気体を導入し、細管束６２及び気体通路７２の圧力を流路３に対して正圧にして、ＤＮＡマーカーの一部ＳＰを残し、微小試料片（プラグ）を形成させた。液量は約３１５ｐＬであった（図８（ｃ））。

次いで、ポート２に緩衝液としてＨＥＣ溶液を注入した。自動式の空気圧制御装置により、気体ポート８２から気体を排出し、細管束６２及び気体通路７２の圧力を流路３に対して負圧にして流路３内にしてＨＥＣ溶液を導入した（図８（ｄ））。その後、電極４に５Ｖの電圧を加えることにより、試料を分離・検出した。印加電圧は直流電源（ＰＡＫ２０−１８Ａ；Ｋｉｋｕｓｕｉ，Ｊａｐａｎ）により行った。ＤＮＡ試料の検出はＣＣＤカメラを接続した蛍光顕微鏡を用いた。検出器は、電気泳動開始電極から２．６４ｍｍの地点に設置した。

本発明の実施例を図８（ｅ）から（ｈ）に示す。（ｅ）は電気泳動開始から１秒後、（ｆ）は１０秒後、（ｇ）は２５秒後、（ｈ）は９０秒後の様子である。９０秒で分離は完了したことが分かる。また、個々のバンドは矩形を保っていることも分かる。
また、本実施例のＤＮＡマーカーの検出の結果を図９に示す。この例では、１０種のＤＮＡの好ましくないピーク同士の重なりは見られなかった。

このように、本実施例では、試料の分離・検出の解像度が高いことが確認された。また、本実施例の電気泳動用チップは印加電圧が低く、装置の小型化に好適である。またこの電気泳動用チップは、遺伝子のハイブリダイゼイションや制限酵素による遺伝子の切断の分析にも応用できる可能性がある。

本発明の電気泳動用チップの一例を示す模式図である。 本発明の電気泳動用チップの一例を示す模式図である。 本発明の電気泳動用チップの一例の断面図である。 本発明の電気泳動用チップの作製の状態を示す模式図である。 本発明の電気泳動用チップの一例の主要部分の拡大図と断面図である。 本発明の電気泳動用チップによる試料の導入方法の一例を示す模式図である。 本発明の電気泳動用チップによる試料の導入方法のもう１つの例を示す模式図である。 本発明の電気泳動用チップの一例を示す模式図である。 本発明の電気泳動用チップの一例を示す模式図である。 本発明の電気泳動用チップアレイの一例を示す模式図である。 本発明の電気泳動用チップによる試料の分析の一例を示す図である。 本発明の電気泳動用チップによる試料の分離・検出の一例を示す図である 従来の電気泳動用チップの一例を示す模式図である。

符号の説明

１・・電気泳動用チップ、２・・ポート、３・・流路、４・・電極、４ａ・・端縁、５・・細管、５ａ・・細管の壁面、６・・細管束、７・・気体通路、８・・気体ポート、１０・・電気泳動用チップアレイ、１１・・ガラス基板、１１ａ・・上面、１２・・電気泳動用チップ、１３・・樹脂基板、１３ａ・・加工面、１３ｂ・・溝、３３・・・末端、４１・・電気泳動開始用電極、５１・・多孔質体、５６・・気体透過部、８１・・第１の気体ポート、８２・・第２の気体ポート、８３・・第３の気体ポート

Claims (11)

1. 試料を導入するためのポートと、導入された試料の流路と、流路に接続された２以上の電極とを備えた電気泳動用チップであって、前記電極のいずれか１つの近傍には気体透過部が２以上並べて接続されており、それぞれの気体透過部は、気体通路を介して、前記気体通路に気体を導入・排出するための気体ポートと接続されていることを特徴とする電気泳動用チップ。
2. 前記気体透過部が複数の細管で構成される細管束、若しくは多孔質体であることを特徴とする請求項１記載の電気泳動用チップ。
3. 前記電極の前記流路に突出する端縁が、前記流路の長手方向に直交する直線状であることを特徴とする請求項１又は２記載の電気泳動用チップ。
4. 前記細管の壁面が、疎水性加工若しくは親水性加工されていることを特徴とする請求項２又は３記載の電気泳動用チップ。
5. 前記細管の断面形状が矩形であり、幅及び高さが０．１μｍ以上２０μｍ以下とすることを特徴とする請求項２から４のいずれか１項記載の電気泳動用チップ。
6. 前記流路が複数並列してなることを特徴とする請求項１から５のいずれか1項記載の電気泳動用チップ。
7. 前記電極が形成された上面を有するガラス基板と、予め溝加工された加工面を有する樹脂基板とを、前記ガラス基板の上面に、前記樹脂基板の加工面を対面させて貼り合せることにより、
   前記樹脂基板の加工面の溝によって、前記流路と、前記気体透過部と、前記気体通路とが形成されていることを特徴とする請求項１から６のいずれか１項記載の電気泳動用チップ。
8. 前記流路の末端に設けられている電気泳動開始用電極の近傍に２以上の前記気体透過部が並べられており、
   前記電気泳動開始用電極に最も近い気体透過部に通じた第１の気体ポートから気体を排出することにより、試料を前記流路の一部又は全体に導入した後、
   前記電気泳動開始用電極に最も近い気体透過部以外のいずれか１つの気体透過部に通じた第２の気体ポートから気体を導入することにより、前記試料の一部を前記流路に計量して残し、前記試料のそれ以外の部分を流路から排出し、
   次いで、前記第２の気体ポートから気体を排出することにより、前記流路に緩衝液を導入し、
   電極に電圧を加えて試料を分離することを特徴とする請求項１から７のいずれか１項記載の電気泳動用チップ。
9. 請求項１から８のいずれか１項記載の電気泳動用チップを２以上並列してなる電気泳動用チップアレイ。
10. 請求項１から８のいずれか１項記載の電気泳動用チップ若しくは請求項９記載の電気泳動用チップアレイを用いたことを特徴とする試料の分析方法。
11. 前記流路の末端に設けられている電気泳動開始用電極の近傍に３以上の前記気体透過部が並べられており、
    前記電気泳動開始用電極に最も近い気体透過部に通じた第１の気体ポートから気体を排出することにより、第１の試料を前記流路の一部又は全体に導入した後、
    前記電気泳動開始用電極に最も近い気体透過部以外のいずれか１つの気体透過部に通じた第２の気体ポートから気体を導入することにより、第１の試料の一部を前記流路に計量して残し、第１の試料のそれ以外の部分を前記流路から排出し、
    次いで、前記第２の気体ポートから気体を排出することにより、第２の試料を前記流路に導入した後、
    前記第２の気体ポートに通じた気体透過部を介して、前記電気泳動開始用電極とは反対の側に位置するいずれか１つの気体透過部に通じた第３の気体ポートから気体を導入することにより、第２の試料の一部を前記流路に計量して残し、第２の試料のそれ以外の部分を前記流路から排出し、
    次いで、前記第３の気体ポートから気体を排出することにより、前記流路に緩衝液を導入し、
    電極に電圧を加えて、第１の試料と第２の試料の反応を分析することを特徴とする請求項１０記載の試料の分析方法。

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