JP7253045B2 - 生体ポリマ分析装置及び生体ポリマ分析方法 - Google Patents

生体ポリマ分析装置及び生体ポリマ分析方法 Download PDF

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Description

本開示は、生体ポリマ分析デバイス、生体ポリマ分析装置及び生体ポリマ分析方法に関する。
ナノポアデバイスは、厚み数Å～数十ｎｍの薄膜に直径数Å～数ｎｍの細孔（以下、ナノポアと呼ぶ）を設けてなり、薄膜の両側に電解質溶液を接液して薄膜の両端間に電位差を発生させることにより、ナノポアに電解質溶液を通過させることができる。このとき、電解質溶液中の測定対象物がナノポアを通過すると、ナノポア周辺部の電気的特性、特に抵抗値が変化するため、その電気的特性の変化を検出することによって、測定対象物を検出することが可能である。測定対象物が生体ポリマである場合、生体ポリマのモノマ配列パターンに応じて、ナノポア周辺部の電気的特性がパターン状に変化する。これを利用して生体ポリマのモノマ配列解析を行う方法が近年盛んに研究されている。
中でも、生体ポリマがナノポアを通過した時に観測されるイオン電流の変化量がモノマ種によって異なることを原理としたモノマ配列の解析が有望視されている。モノマ配列の解析精度は上記イオン電流の変化量によって決定されるため、モノマ間のイオン電流量差は大きいほど望ましい。このような解析手法は、従来とは異なり生体ポリマの断片化を伴う化学操作を必要とせずに、生体ポリマを直接読取することが可能である。ナノポアデバイスは、生体ポリマがＤＮＡの場合はＤＮＡ塩基配列解析システム（ＤＮＡシーケンサ）として、生体ポリマがタンパク質の場合はアミノ酸配列解析システム（アミノ酸シーケンサ）として用いられ、それぞれ従来よりも遥かに長い配列長を解読可能なシステムとして期待されている。
特に、封鎖電流方式を用いて、ナノポアをＤＮＡシーケンサとして実用化する研究開発が盛んである。封鎖電流とは、生体ポリマがナノポアを通過する際に生体ポリマがナノポアを封鎖し、イオンが通過できる有効断面積が減少することによるイオン電流の減少量である。
ナノポアデバイスとしては、脂質二重膜に埋め込まれた中心に細孔を有するタンパク質を用いたバイオナノポアと、半導体加工プロセスにて形成した絶縁薄膜に細孔を加工したソリッドナノポアの２種類が存在する。バイオナノポアにおいては、脂質二重膜に埋め込まれた改変タンパク質（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ ｐｏｒｉｎ Ａ（ＭｓｐＡ）等）の細孔（直径１．２ｎｍ、厚さ０．６ｎｍ）を生体ポリマ検出部としてイオン電流の変化量を測定する。
一方、ソリッドナノポアにおいては、半導体材料である窒化ケイ素（ＳｉＮ）の薄膜や、グラフェンや二硫化モリブデンのような単分子層からなる薄膜にナノポアを形成した構造体がナノポアデバイスとして用いられる。ソリッドナノポアを使用した生体ポリマ解析手法において、これまでにホモポリマのアデニン塩基、シトシン塩基、チミン塩基、グアニン塩基の封鎖電流量を測定した報告が為されている（非特許文献１及び非特許文献２）。
ナノポアデバイスを用いた計測において、以下の３つの課題がある。１つ目の課題は、アレイ化された並列チャンネルを有する集積化ナノポアデバイスを実現するにあたって、個々の独立チャンネル間で電流がリークすることなく互いに絶縁されている必要がある。絶縁がなされていないと、個々の独立チャンネルが互いに干渉して正確な計測ができなくなり、各チャンネルの独立計測が困難となってしまう。
２つ目の課題として、計測中にサンプルが枯渇して計測のスループットが低下してしまった場合や、あるサンプルを十分に計測し終わった後に別のサンプルを計測したい場合に、スムーズなサンプル供給あるいはサンプル交換が為される事により、有効な連続計測時間が延長されることが求められる。
３つ目の課題として、ＤＮＡに代表される生体分子を計測する際には、生体から採取されるサンプルは貴重であり少量のみ採取することが望ましいため、少ない溶液量（少ないＤＮＡインプット量）でも計測ができることが必要である。
特許文献１において、脂質二重膜とバイオナノポアを利用した集積化ナノポアデバイスを実現するため、以下の方法が試みられている。複数の並列ウェルを要する樹脂フローセルに対して、撥水液（オイル）と脂質二重膜を構成する材料を有する水溶液を交互に流し込むことで、各並列ウェルの底部に個別液滴部を自発的に形成させ、ウェル天井部には共通溶液部を自発的に形成させる。各個別液滴部と共通溶液部の界面に脂質二重膜を自発形成させ、この膜にバイオナノポアを電気的に埋め込むことで、集積化を実現している。
ソリッドナノポアデバイスにおいては、バイオナノポアの自己組織化を利用した脂質二重膜と異なり、無機材料で予め形成された固体無機薄膜を利用するため、特許文献１のような方法を適用できず、集積化を実現するためには別のアプローチが必要となる。非特許文献３においては、マイクロ流路を用いることで１つの無機薄膜を別々のセクションに分割することで５個の並列チャンネルを形成する方法が試みられている。
また、非特許文献４においては、１６個の独立薄膜を有するデバイスに対して、絶縁ゴムのＯ－リングと樹脂フローセルを組み合わせることで並列化を実現する方法が試みられている。
高い集積度を有する並列化ソリッドナノポアデバイスの実現にあたって、特許文献２においては、撥水液（オイル）を各独立チャンネル間の絶縁体として使用する方法が試みられている。このような撥水液は流路を用いた送液機構で実現されている。特許文献３には、感光性樹脂のような絶縁膜を各独立チャンネル間の絶縁隔壁として設ける方法が記載されている。このような絶縁膜は圧着法を用いた送液機構で実現されている。
上述のように、集積化ナノポアデバイスにおいて共通していることは、薄膜の片側には共通溶液槽が設けられ、もう一方の側には複数の独立な個別溶液槽が設けられていることである。このような構成は、集積化ナノポアデバイスにおける基本構造である。
国際公開第２０１４／０６４４４３号 特許第６０６２５６９号 特開２０１８－９６６８８号公報
Feng J., et al., Identification of single nucleotides in MoS2 nanopores. Nat. Nanotechnol. 10, 1070-1076 (2015). Goto Y., et al., Identification of four single-stranded DNA homopolymers with a solid-state nanopore in alkaline CsCl solution. Nanoscale 10, 20844-20850 (2018). Tahvildari R., et al., Integrating nanopore sensors within microfluidic channel arrays using controlled breakdown. Lab on a Chip 15, 1407-1411 (2015). Yanagi I., et al, Multichannel detection of ionic currents through two nanopores fabricated on integrated Si3N4membranes. Lab on a Chip 16, 3340-3350 (2016).
しかしながら、従来の集積化されたソリッドナノポアシステムにおいては、各チャンネル間の絶縁性を保ちながら、複数の独立な個別溶液槽への溶液の一括注入と個別溶液槽の溶液（サンプル）交換を両立することが困難である。フローセルなどの流路を用いることで溶液交換は容易であるものの、一括して個別溶液槽へ溶液を注入するには特殊な冶具やポンプのような送液装置が必要となり、装置が煩雑となってしまう。この課題は集積度が大きくなり、流路が微小になった際に顕著となる。
特許文献３のように圧着法により作られた個別溶液槽は閉鎖空間となっているため、そもそも溶液の交換が困難である。
また、従来の方法では、個別溶液槽へ溶液を配置するために個別溶液槽の溶液体積よりも大きい溶液体積量を必要とするため、少ない溶液量でのサンプル計測が困難であるという課題も存在する。
そこで、本開示は、並列チャンネル間の絶縁性を保ちながら、複数の個別溶液槽への溶液の自動一括注入と個別溶液槽の溶液の自動交換を両立する技術を提供する。
上記課題を解決するために、本開示の生体ポリマ分析デバイスは、無機材質から形成される絶縁性の薄膜と、前記薄膜により隔てられる第１の液槽及び第２の液槽と、前記第１の液槽に配置される複数の第１の電極と、前記第２の液槽に配置される第２の電極と、を備え、前記第１の液槽には、撥水液及び複数の液滴が導入され、前記複数の第１の電極は、所定の電圧が印加されることにより、前記第１の液槽に導入された前記複数の液滴を誘電体上エレクトロウェッティングにより搬送可能に構成され、前記複数の液滴は、前記複数の第１の電極に接触する箇所に搬送され、前記撥水液により互いに絶縁される。
本開示に関連する更なる特徴は、本明細書の記述、添付図面から明らかになるものである。また、本開示の態様は、要素及び多様な要素の組み合わせ及び以降の詳細な記述と添付される特許請求の範囲の様態により達成され実現される。
本明細書の記述は典型的な例示に過ぎず、本開示の特許請求の範囲又は適用例を如何なる意味に於いても限定するものではない。
本開示によれば、並列チャンネル間の絶縁性を保ちながら、複数の個別溶液槽への溶液の自動一括注入と個別溶液槽の溶液の自動交換を両立することが可能となる。
前述した以外の課題、構成及び効果は、以下の実施の形態の説明により明らかにされる。
参考例に係る単一チャンネルの生体ポリマ分析デバイスを示す模式図。 参考例に係る並列チャンネルの生体ポリマ分析デバイスを示す模式図。 第１の実施形態に係る生体ポリマ分析デバイスを示す模式図。 ナノポア開孔後の生体ポリマ分析デバイスを示す模式図。 第１の実施形態に係る他の生体ポリマ分析デバイスを示す模式図。 第１の実施形態に係る他の生体ポリマ分析デバイスを示す模式図。 第１の実施形態に係る生体ポリマ分析方法を示すフローチャート。 第２の実施形態に係る生体ポリマ分析デバイスを示す模式図。 第２の実施形態に係る生体ポリマ分析デバイスの第１の液槽の上面図。 液滴が搬送される様子を示した上面図。 液滴が所望の位置へ全て配置された状態を示す上面図。 第３の実施形態に係る生体ポリマ分析デバイスを示す模式図。 薄膜表面に撥水液が残留した状態を表す模式図。 第４の実施形態の犠牲層の構造を示す模式図。 第４の実施形態の他の生体ポリマ分析デバイスを示す模式図。 第５の実施形態に係る生体ポリマ分析デバイスを示す模式図。 第５の実施形態に係る他の生体ポリマ分析デバイスを示す模式図。 第６の実施形態に係る生体ポリマ分析デバイスを示す模式図。 第７の実施形態に係る生体ポリマ分析デバイスを示す模式図。 第７の実施形態に係る生体ポリマ分析デバイスを示す模式図。 第８の実施形態に係る生体ポリマ分析装置を示す模式図。
以下、図面に基づいて、本開示の実施形態を説明する。なお、添付の図面は、本開示の原理に則った具体的な実施形態を示しているが、それらは本開示の理解のためのものであり、決して本開示を限定的に解釈するために用いられるものではない。
生体ポリマ分析用デバイスは、生体ポリマのナノポアへの導入法により構成が異なるが、本明細書においては一例として、電気泳動によりナノポアへ生体ポリマを導入する方式に関して記述する。ここで、生体ポリマとは、核酸をモノマとするＤＮＡ又はＲＮＡ、あるいはアミノ酸をモノマとするタンパク質又はポリペプチドを示す。
［参考例］
図１は、参考例に係る単一ナノポアチャンネルを有する生体ポリマ分析デバイス１００を示す模式図である。図１に示すように、生体ポリマ分析デバイス１００は、ナノポア１０１を有する薄膜１０２、電解質溶液１０３を収容する第１の液槽１０４Ａ及び第２の液槽１０４Ｂ、並びに電極１０５Ａ及び１０５Ｂを備える。
電極１０５Ａ及び１０５Ｂは、電流計１０６及び電源１０７に接続され、電源１０７によって電極１０５Ａ及び電極１０５Ｂに電圧が印加される。電源１０７による電圧の印加は、コンピュータ１０８により制御される。
電流計１０６は、電極１０５Ａ及び電極１０５Ｂ間に流れるイオン電流（封鎖電流）を測定する。図示は省略しているが、電流計１０６は、電極１０５Ａ及び１０５Ｂ間に流れる電流を増幅するアンプと、アナログ／デジタル変換器とを有する。電流計１０６はコンピュータ１０８に接続されており、アナログ／デジタル変換器は検出したイオン電流の値をデジタル信号としてコンピュータ１０８に出力する。
コンピュータ１０８は、イオン電流（封鎖電流）の値に基づいて、生体ポリマ１のモノマ配列情報を取得する。
図２は、参考例に係る並列ナノポアチャンネルを有するアレイデバイスとしての生体ポリマ分析デバイス２００を示す模式図である。アレイデバイスとは、隔壁によって仕切られる個別溶液槽を複数個備えるデバイスのことを指す。図２に示すように、生体ポリマ分析デバイス２００は、隔壁としてのテーパー層１０２Ｂにより電気的に絶縁された複数の第２の液槽１０４Ｂを有し、複数の第２の液槽１０４Ｂのそれぞれに電極１０５Ｂが１つずつ設けられている点で、図１の生体ポリマ分析デバイス１００と異なっている。
このように、第１の液槽１０４Ａが共通溶液槽、第２の液槽１０４Ｂが複数の個別溶液槽となっており、複数の独立したチャンネルが形成されている。また、電極１０５Ａが共通電極となっており、電極１０５Ｂが個別電極となっている。
［第１の実施形態］
＜生体ポリマ分析デバイスの構成例＞
図３Ａは、第１の実施形態に係る生体ポリマ分析デバイス３００を示す模式図である。図３Ａに示すように、生体ポリマ分析デバイス３００は、ソリッド式のナノポアデバイスであり、無機材質の薄膜１０２、第１の液槽１０４Ａ、第２の液槽１０４Ｂ、共通電極１０５（第２の電極）、複数の個別電極１１２（複数の第１の電極）を有する基板１１３を備える。
薄膜１０２の材質は、半導体微細加工技術で形成できる絶縁性の無機材質である。薄膜１０２の材質としては、例えば窒化ケイ素（ＳｉＮ）、酸化ケイ素（ＳｉＯ２）、酸窒化ケイ素（ＳｉＯＮ）、酸化ハフニウム（ＨｆＯ２）、二硫化モリブデン（ＭｏＳ２）、グラフェンなどが挙げられる。薄膜１０２の厚さは、例えば１Å～２００ｎｍとすることができ、場合に応じて１Å～１００ｎｍ又は１Å～５０ｎｍとすることができ、例として約５ｎｍとすることができる。
図示は省略しているが、共通電極１０５は配線を通して、複数の個別電極１１２は基板１１３内部の配線を通して、それぞれ図１及び図２に示した電流計１０６、電源１０７及びコンピュータ１０８（制御部）と接続することができる。
後述するように、コンピュータ１０８は、電源１０７による複数の個別電極１１２及び共通電極１０５への電圧の印加を制御する。また、コンピュータ１０８は、複数の個別電極１１２間、あるいは個別電極１１２と共通電極１０５との間に電圧を印加させ、計測された電流値などの電気的特性に基づいて、液滴１１０の位置や、液滴１１０間にリークが生じているかどうか、薄膜１０２にナノポアが形成されているかどうかを判断する。コンピュータ１０８は記憶部（不図示）を備え、計測された電流値や、上記判断の結果を記憶部に記憶する。
複数の個別電極１１２は、基板１１３に埋め込まれており、基板１１３は、第１の液槽１０４Ａの一部を構成する。基板１１３の材質としては、回路配線を実装することができればよく、例えばガラスエポキシ樹脂のようなＰＷＢ基板又はＰＣＢ基板などが用いられる。あるいは、基板１１３はガラス基板のような透明基板であってもよい。
第１の液槽１０４Ａには、複数の液滴１１０と、撥水液１１１とが導入されている。各液滴１１０は、撥水液１１１により隣接する液滴１１０と電気的に絶縁され、互いに独立している。また、複数の液滴１１０はそれぞれ個別電極１１２と接触しており、これにより各液滴１１０に対し電圧の印加などの電気的操作を行うことができる。
個別電極１１２は、隣接する個別電極１１２間に所定の電圧が印加されることで、誘電体上エレクトロウェッティング（ＥＷＯＤ：Ｅｌｅｃｔｒｏ Ｗｅｔｔｉｎｇ ｏｎ Ｄｉｅｌｅｃｔｒｉｃ）により液滴１１０を所望の位置へ搬送する。図３Ａにおいては、液滴１１０がそれぞれ個別電極１１２に接触する位置に搬送された状態が示されており、液滴１１０同士が撥水液１１１により分離され、互いに絶縁されている。これにより、複数の個別溶液槽（複数のチャンネル）が形成されている。
個別電極１１２をＥＷＯＤ電極として動作させるためのＥＷＯＤ搬送用電圧（所定の電圧）の印加は、コンピュータ１０８により制御される。ＥＷＯＤ搬送用電圧は例えば０～１００Ｖに設定することができ、典型的には１０～５０Ｖの範囲で行なわれる。この電圧値は、液滴１１０の径や粘度、液滴１１０と撥水液１１１と個別電極１１２とが為す接触角又は電極サイズ等に応じて都度変化するため、適宜調整が行われる。
また、個別電極１１２は、個別電極１１２及び共通電極１０５の間に電圧が印加されることによりナノポア１０１を開孔したり、イオン電流を計測したりするためにも用いられる。
第２の液槽１０４Ｂには共通溶液としての電解質溶液１０３が導入されており、電解質溶液１０３に接触するように共通電極１０５が配置されている。ここで、複数の液滴１１０及び電解質溶液１０３は、電解質を含む水溶液であり、分析対象の生体ポリマを含んでいてもよい。
電解質溶液１０３の容量は、マイクロリットルオーダー又はミリリットルオーダーとすることができる。液滴１１０の容量は、ナノリットルオーダー又はマイクロリットルオーダーとすることができる。
薄膜１０２に接触する測定溶液を収納する第１の液槽１０４Ａ及び第２の液槽１０４Ｂは、イオン電流の測定に影響を及ぼさない材質、形状及び大きさで、適宜設けることができる。
個別電極１１２及び共通電極１０５の材質は、液滴１１０及び電解質溶液１０３中の電解質と電子授受反応（ファラデー反応）を行うことが可能な材質とすることができ、例えばハロゲン化銀、ハロゲン化アルカリ銀が挙げられる。電位安定性及び信頼性の観点からは、特に銀又は銀／塩化銀を使用することができる。
個別電極１１２及び共通電極１０５の材質は、分極電極となる材質であってもよく、例えば金又は白金などを用いることができる。その場合、安定的なイオン電流を確保するために、例えばフェリシアン化カリウム又はフェロシアン化カリウムなど、測定溶液に電子授受反応を補助することができる物質を添加することができる。あるいは、例えばフェロセン類などの電子授受反応を行うことが可能な物質を分極電極表面に固定化することもできる。
個別電極１１２及び共通電極１０５は、全てが前記材質で構成されていてもよく、あるいは前記材質が下地材（銅、アルミニウムなど）の表面に被覆されていてもよい。個別電極１１２及び共通電極１０５の形状は特に限定されるものではないが、測定溶液と接液する表面積が大きくなる形状とすることができる。個別電極１１２及び共通電極１０５は配線と接合されて、測定回路へ電気的信号が送られる。
撥水液１１１は、絶縁性かつ水と相分離する液体であり、場合に応じて生体ポリマと親和性が高いものを用いることができる。撥水液１１１としては、例えばシリコーンオイル、フッ素系オイル、ミネラルオイルなどが挙げられる。このような液体は、例えばＰＣＲやデジタルＰＣＲなどの技術においてもしばしば用いられている。さらに、撥水液１１１はＥＷＯＤによる液滴１１０の搬送に用いられることから、粘性が低く流動性の高い液体を撥水液１１１として用いることができる。
図示は省略しているが、第１の液槽１０４Ａ及び第２の液槽１０４Ｂには、それぞれ内部に液体を注入するための注入口と、内部の液体を排出するための排出口とを有する。
＜ナノポア形成方法＞
図３Ｂは、薄膜１０２にナノポア１０１が形成された状態の生体ポリマ分析デバイス３００を示す模式図である。図３Ａの構成のままでは、ナノポア１０１が設けられていないため、生体ポリマを分析することができない。そこで、複数の個別電極１１２と共通電極１０５の間に薄膜１０２の絶縁破壊電圧以上の電圧値を印加することで、ナノポア１０１を形成することができる。
薄膜１０２にナノポア１０１を形成する方法は、特に限定されるものではなく、例えば透過型電子顕微鏡などによる電子ビーム照射や電圧印加による絶縁破壊などを用いることができる。ナノポア１０１を形成する方法は、例えば“Itaru Yanagi et al., Sci. Rep. 4, 5000 (2014)”に記載されている方法を使用することができる。
薄膜１０２がＳｉ３Ｎ４で構成される場合の電圧印加によるナノポア１０１の形成は、例えば以下の手順で行うことができる。まず、Ａｒ／Ｏ２ ｐｌａｓｍａ（サムコ株式会社製）により、１０ＷＷ、２０ｓｃｃｍ、２０Ｐａ、４５ｓｅｃの条件で、Ｓｉ３Ｎ４で構成された薄膜１０２を親水化する。次に、フローセルに薄膜１０２を備えた生体ポリマ分析デバイス３００をセットする。その後、第１の液槽１０４Ａ及び第２の液槽１０４Ｂのそれぞれに個別電極１１２及び共通電極１０５を導入し、１ＭのＣａＣｌ２及び１ｍＭ Ｔｒｉｓ－１０ｍＭ ＥＤＴＡを含むｐＨ７．５の電解質溶液である液滴１１０を第１の液槽１０４Ａに搬送し、第２の液槽１０４Ｂを当該電解質溶液で満たす。
電圧の印加は、ナノポア１０１の形成時だけでなく、ナノポア１０１が形成された後にナノポア１０１を介して流れるイオン電流の計測時にも行われる。ここで、ＧＮＤ電極側に位置する第１の液槽１０４Ａをｃｉｓ槽と呼び、可変電圧側に位置する第２の液槽１０４Ｂをｔｒａｎｓ槽と呼ぶ。ｃｉｓ槽側の電極に印加する電圧Ｖｃｉｓを０Ｖに設定し、ｔｒａｎｓ槽側の電極に電圧Ｖｔｒａｎｓを印加する。電圧Ｖｔｒａｎｓは、例えばパルス発生器（41501B SMU AND Pulse Generator Expander、アジレントテクノロジーズ社製）により発生させる。
パルス印加後の電流値は、電流計１０６（4156B PRECISION SEMICONDUCTOR ANALYZER、アジレントテクノロジーズ社製）で読み取ることができる。ナノポア１０１の形成のために電圧を印加するプロセス及びイオン電流値を読み取るプロセスは、例えば、コンピュータ１０８の記憶部に格納された自作プログラム（Excel VBA、Visual Basic (登録商標) for Applications）で制御する。パルス電圧の印加前に形成されたナノポア１０１の直径に応じて電流値条件（閾値電流）を選択し、順次、ナノポア１０１の直径を大きくしつつ、目的とする直径を得る。
ナノポア１０１の直径は、イオン電流値から見積もることができる。条件選択の基準は、例えば薄膜１０２の材質がＳｉ３Ｎ４であり、かつ薄膜１０２の厚さが５ｎｍの場合、表１の通りである。ここで、ｎ番目のパルス電圧印加時間ｔｎ（ただし、ｎ＞２の整数。）は、次式で決定される。
Figure 0007253045000001
Figure 0007253045000002
ナノポア１０１の形成は、パルス電圧を印加する方法以外に、ＴＥＭによる電子線照射によっても可能である（A. J. Storm et al., Nat. Mat. 2 (2003)）。
ナノポア１０１の寸法は、分析対象の生体ポリマの種類に応じて選択することができ、例えば０．９ｎｍ～１００ｎｍとすることができ、場合に応じて０．９ｎｍ～５０ｎｍとすることができる。具体的には、ナノポア１０１の寸法は０．９ｎｍ以上１０ｎｍ以下などである。例えば直径が約１．４ｎｍである一本鎖ＤＮＡの分析に用いるナノポア１０１の径は、例えば０．８ｎｍ～１０ｎｍ又は０．８ｎｍ～１．６ｎｍとすることができる。また、例えば直径が約２．６ｎｍである二本鎖ＤＮＡの分析に用いるナノポア１０１の径は、３ｎｍ～１０ｎｍ又は３ｎｍ～５ｎｍとすることができる。
ナノポア１０１の深さは、薄膜１０２の厚さを調整することにより調整することができる。ナノポア１０１の深さは、生体ポリマを構成するモノマ単位の２倍以上とすることができ、場合に応じて３倍以上又は５倍以上の大きさとすることができる。例えば生体ポリマが核酸である場合には、ナノポア１０１の深さは、塩基３個以上の大きさ、例えば約１ｎｍ以上とする。これにより、生体ポリマをその形状と移動速度を制御しながらナノポア１０１に進入させることができ、高感度及び高精度な解析が可能となる。また、ナノポア１０１の形状は、基本的には円形であるが、楕円形や多角形とすることも可能である。
ユーザーが生体ポリマ分析デバイス３００を使用して生体ポリマの分析を行う直前に、図３Ｂに示すように各液滴１１０を個別電極１１２に接触する位置に搬送し、撥水液１１１により互いに絶縁された状態として、電気的操作により薄膜１０２にナノポア１０１を設けることで、常に品質の良いナノポア１０１を提供することが可能となる。
なお、生体ポリマ分析デバイス３００は、液滴１１０及び撥水液１１１が図３Ａに示す位置に搬送された状態でユーザーに提供されてもよいし、撥水液１１１のみが第１の液槽１０４Ａに導入された状態でユーザーに提供され、ユーザーの操作により個別電極１１２にＥＷＯＤ搬送用電圧を印加させて液滴１１０を図３Ａに示す位置に搬送するようにしてもよい。また、第１の液槽１０４Ａ及び第２の液槽１０４Ｂがいずれも空の状態で生体ポリマ分析デバイス３００がユーザーに提供されてもよい。この場合、ユーザーの操作により第１の液槽１０４Ａに撥水液１１１を充填した後、個別電極１１２にＥＷＯＤ搬送用電圧を印加させて液滴１１０を搬送し、第２の液槽１０４Ｂに電解質溶液１０３を導入して、図３Ａに示す状態とする。
＜生体ポリマ分析デバイスの他の構成例＞
図４は、第１の実施形態に係る他の生体ポリマ分析デバイス４００を示す模式図である。生体ポリマ分析デバイス４００は、封鎖電流方式での生体ポリマの分析に用いられる典型的なソリッド式のナノポアデバイスに対して、本実施形態の構成（図３）を採用した構成を有する。図４に示すように、生体ポリマ分析デバイス４００は、無機材質の薄膜１０２Ａと、薄膜１０２Ａの片側に配置されたテーパー層１０２Ｂと、薄膜１０２Ａのもう一方の側に配置された犠牲層１０２Ｃとを有する。なお、薄膜１０２Ａ、テーパー層１０２Ｂ及び犠牲層１０２Ｃをまとめて「薄膜」という場合がある。
テーパー層１０２Ｂ及び犠牲層１０２Ｃの材質として、一般には量産性を考慮してシリコン（Ｓｉ）が採用される。テーパー層１０２Ｂは、例えばシリコンウェハの異方性エッチングにより形成される。犠牲層１０２Ｃは、複数の個別電極１１２と対向する位置において、例えばシリコンウェハのエッチングにより形成された複数（図４においては３つ）のエッチングホール（凸部）を有し、これにより薄膜１０２Ａが複数箇所において露出しており、アレイ化されている。また、犠牲層１０２Ｃは、薄膜１０２Ａを応力により支持する。このようなソリッド式のナノポアデバイスの構成は、例えば米国特許第５７９５７８２号、“Yanagi, et al., Scientific Reports 4, 5000, 2014”、“Akahori, et al., Nanotechnology 25(27):275501, 2014”、及び“Yanagi, et al., Scientific Reports, 5, 14656, 2015”等に記載されている。
液滴１１０に露出する薄膜１０２Ａの寸法は、電圧の印加によるナノポア１０１の形成の際に２個以上のナノポア１０１が形成され難い面積であり、かつ、強度上許容される面積である必要がある。当該面積は、例えば１００～５００ｎｍ程度、ＤＮＡ一塩基分解能を達成するためには、一塩基相当の実効膜厚を有するナノポア１０１を形成可能な膜厚３～７ｎｍ程度が適当である。
図４に示すように、複数の個別溶液槽がアレイ化された構成の場合、ナノポア１０１が形成される薄膜１０２の露出箇所を規則的に配列することができる。薄膜１０２Ａの複数の露出箇所の間隔は、使用する電極及び電気測定系の能力に応じて、例えば０．１ｍｍ～１０ｍｍ又は０．５ｍｍ～４ｍｍとすることができる。
図５は、第１の実施形態に係る他の生体ポリマ分析デバイス５００を示す模式図である。図５に示すように、生体ポリマ分析デバイス５００においては、テーパー層１０２Ｂが複数設けられている点で、図４に示した生体ポリマ分析デバイス４００と異なっている。このような構成は、例えば“Yanagi, et al., Lab on a Chip, 16, 3340-3350, 2016.”に記載されている。
＜生体ポリマ分析方法＞
以下、ナノポア形成前の生体ポリマ分析デバイスを用いて、ナノポアの形成と生体ポリマの分析とを連続して行う方法について説明する。本実施形態の生体ポリマ分析方法においては、図３Ａ、図４及び図５に示した生体ポリマ分析デバイス３００～５００のいずれを用いてもよく、共通電極１０５及び複数の個別電極１１２が図１及び図２に示した電流計１０６、電源１０７及びコンピュータ１０８と接続されることとする。また、第１の液槽１０４Ａ及び第２の液槽１０４Ｂが空の状態の生体ポリマ分析デバイスを用いることとする。
図６は、本実施形態に係る生体ポリマ分析デバイスを用いた生体ポリマ分析方法を示すフローチャートである。まず、ステップＳ１において、ユーザーは、第１の液槽１０４Ａ（個別電極１１２側）の注入口（不図示）から撥水液１１１を導入し、第１の液槽１０４Ａに撥水液１１１を充填する。
ステップＳ２において、ユーザーは、コンピュータ１０８に動作開始の指示を入力し、第１の液槽１０４Ａの注入口（不図示）に複数の液滴１１０を順次注入する。ここで、複数の液滴１１０はそれぞれナノポア開孔用の電解質溶液とする。
コンピュータ１０８は、動作開始の指示を受信すると、電源１０７により個別電極１１２にＥＷＯＤ搬送用電圧を印加して、各液滴１１０が１つの個別電極１１２に接する位置に配置されるように、複数の液滴１１０を搬送する。このとき、撥水液１１１は、液滴１１０同士の接触を防止し、各液滴１１０を互いに電気的に絶縁する。これにより、それぞれ１つの個別電極１１２と１つの液滴１１０を有する複数の独立した個別溶液槽（複数のチャンネル）が形成される。
ステップＳ３において、コンピュータ１０８は、複数の液滴１１０が搬送された位置を検知する。次に、ステップＳ４において、コンピュータ１０８は、液滴１１０が所望の位置へ移動したかどうかを判定する。液滴１１０の位置の判定方法については後述する。液滴１１０が所望の位置に到達していない場合（Ｎｏ）はステップＳ２に戻り、コンピュータ１０８は、所望の位置に到達するまで液滴１１０の搬送を繰り返す。
液滴１１０が所望の位置に到達した後（ステップＳ４においてＹｅｓ）、ステップＳ５において、コンピュータ１０８は、隣接するチャンネルの個別電極１１２間にリーク電流読取用の電圧を印加し、リーク電流値を測定する。
ステップＳ６において、コンピュータ１０８は、測定したリーク電流値が予め設定された閾値未満であるかどうかを判定する。
リーク電流値が閾値以上であった場合（ステップＳ６においてＮｏ）、そのチャンネルは電気的独立性を保っていないため、ステップＳ２に戻り、コンピュータ１０８は、リーク電流値が閾値未満となるまで液滴１１０の搬送からリーク電流の計測までを再度試みる。あるいは、コンピュータ１０８は、ステップＳ２に戻る代わりに当該チャンネルが不良であると判断して当該チャンネルの使用を放棄する。このとき、コンピュータ１０８は、不良と判断されたチャンネルの位置を記憶部に記憶する。
リーク電流値が閾値未満である場合（ステップＳ６においてＹｅｓ）、良好なチャンネルであると判定できるため、ステップＳ７に移行する。
全てのチャンネルに液滴１１０が移動され、かつ電気的独立が確認された後、ステップＳ７において、ユーザーは、第２の液槽１０４Ｂに電解質溶液１０３を導入する。
ステップＳ８において、コンピュータ１０８は、各個別電極１１２と共通電極１０５との間に薄膜１０２の絶縁破壊耐圧以上の電圧を印加して、電気的にナノポア１０１を開孔する。コンピュータ１０８は、そのまま独立な個別電極１１２のそれぞれと共通電極１０５との間にナノポア特性判定用の電圧を印加し、ナノポア１０１の電流電圧特性を計測する。ここで、計測された電流値が所望の電流値の範囲内、すなわち所望のナノポア直径範囲内に入った場合は、良好なナノポア１０１が得られたと判定する。
計測された電流値が所望の範囲外であった場合は、コンピュータ１０８は、そのチャンネルは不良箇所であると判断し、当該チャンネルの使用を放棄する。この場合、コンピュータ１０８は、放棄したチャンネルへサンプルを含んだ液滴を移動しないように、放棄されたチャンネルの位置情報を記憶部に記憶する。これにより、サンプルの損失を防止することができる。
以上の操作で個別電極側に搬送されてきた液滴１１０はナノポア開孔用の電解質溶液であるため、サンプル計測用の溶液へと交換を行う必要がある。ステップＳ９において、コンピュータ１０８は、個別電極１１２にＥＷＯＤ搬送用電圧を印加して、各ナノポア開孔溶液である液滴１１０を第１の液槽１０４Ａの排出口へ搬送し、排出口に接続された廃液槽（不図示）へと移動させる。
その後、ユーザーは、生体ポリマを含むサンプル計測用の液滴（サンプル溶液）を第１の液槽１０４Ａの注入口から注入し、コンピュータ１０８は、個別電極１１２にＥＷＯＤ搬送用電圧を印加して、良好なナノポア１０１が形成された箇所にサンプル溶液を移動させる。
全てのサンプル溶液を搬送し終わった後、ステップＳ１０において、コンピュータ１０８は、各個別電極１１２と共通電極１０５との間にサンプル計測用電圧を印加し、サンプルの計測を行う。
さらに、サンプル交換を行う場合には、ステップＳ９と同様の動作を実行する。具体的には、コンピュータ１０８は、個別電極１１２にＥＷＯＤ搬送用電圧を印加して、計測が終了したサンプル溶液を第１の液槽１０４Ａの排出口へ搬送し、排出口に接続された廃液槽へと移動させる。その後、ユーザーは新たなサンプル溶液を第１の液槽１０４Ａの注入口から導入し、コンピュータ１０８は、個別電極１１２にＥＷＯＤ搬送用電圧を印加して、新たなサンプル溶液を搬送する。このように、ＥＷＯＤにより各個別溶液槽の溶液の交換をスムーズに行うことができる。
＜液滴の位置の判定方法＞
次に、上述のステップＳ３及びＳ４における液滴１１０の位置の検知方法について説明する。液滴１１０が所望の位置へ到達したかどうかは様々な方法により検知することが可能である。例えば、個別電極１１２及び基板１１３として透明な基板及び透明な電極を用いて、個別電極１１２及び基板１１３の上方に顕微鏡などの観察装置（複数の液滴が所望の位置に搬送されたかどうかを判定する機構）を設けることにより、第１の液槽１０４Ａの内部を光学的に画像観察することが可能である。観察装置は、観察箇所を撮像した画像データをコンピュータ１０８に送信可能に構成され、コンピュータ１０８は、画像データに基づいて液滴１１０の位置を判定することができる。
一方、個別電極１１２及び基板１１３に不透明な材質を用いる場合は、液滴１１０は画像観察することはできない。その場合は、上述のような光学的手法でなく、電気的手法を用いることで液滴１１０の位置を判定することができる。本実施形態の生体ポリマ分析デバイスで搬送する液滴１１０は電解質を含んでいるため、電気的に導通している。そのため、各個別電極１１２間あるいは各個別電極１１２と共通電極１０５との間に電気的操作を加え、電気的反応変化の有無を調べることにより、液滴１１０が個別電極１１２と触れているか（当該個別電極１１２の位置にいるか）を判定することができる。
また、例えば個別電極１１２に電解質を含んだ撥水液１１１が触れているか、電解質溶液が触れているかによって、交流印加時のインピーダンス特性は異なる。したがって、個別電極１１２に交流電流を印加してインピーダンスを計測することにより、液滴１１０が個別電極１１２に触れているかどうかがわかる。
あるいは、個別電極１１２と共通電極１０５間の電流値を計測して抵抗特性を調べることによっても、液滴１１０の位置を判定することができる。例えば、撥水液１１１が個別電極１１２及び薄膜１０２に触れている状態では、個別電極１１２と共通電極１０５間は撥水液１１１の高い絶縁性によって完全に絶縁されているため、観測される電流値は１０－１３～１０－１４Ａ以下となる。一方、液滴１１０などの電解質溶液が個別電極１１２及び薄膜１０２に触れている状態では、電解質溶液は低い抵抗体であるため、ナノポア１０１が開孔される前であっても、個別電極１１２と共通電極１０５間には１０－１１～１０－１２Ａの電流値が観測される。このような電流値が観測されることは、例えば”Scientific Reports, 5, 14656, 2015，Yanagi, et al.”に報告されている。このように、電流値の差分を検知することにより、液滴１１０が個別電極１１２及び薄膜１０２に触れているかどうかがわかるため、液滴１１０の位置を判定することが可能となる。
＜技術的効果＞
以上のように、第１の実施形態においては、個別電極１１２にＥＷＯＤ搬送用電圧を印加して複数の液滴１１０を自動で所望の位置へと移動させることにより、複数の独立な個別溶液槽への溶液の一括注入が可能となる。このとき、液滴１１０間は撥水液１１１の存在により、互いに電気的に絶縁されており、電気的な独立性が保たれている。また、溶液交換を行う場合は、ＥＷＯＤにより液滴１１０を搬送して廃棄し、新たな液滴１１０を同様に所望の位置に搬送するだけでよいため、溶液交換をスムーズに行うことができる。したがって、各並列チャンネル間の絶縁性を保ちながら、複数の独立な個別溶液槽への溶液の一括注入と個別溶液槽の溶液交換を両立することが可能となる。さらに、溶液の搬送や交換のための送液装置が不要であるため、装置の大型化や設置コストの増大が避けられる。
ＥＷＯＤは、集積度が高くなった場合、すなわち部品寸法が微小となった場合にも効果を発揮する。特に、ＥＷＯＤは、数μＬから数ｎＬの微小液滴であっても搬送することが可能であるため、少ない液滴量でのサンプル計測が可能となる。
さらに、本実施形態の生体ポリマ分析デバイスは、独立した個別溶液槽を集積化することができる。したがって、種類の異なるサンプルについて同時に計測することが可能となる。例えば、ある液滴をサンプルＡの溶液とし、別の液滴をサンプルＢの溶液として準備し、それぞれ適切な位置に搬送することにより、種類の異なるサンプルを同時に計測することができる。また、本実施形態の生体ポリマ分析デバイスを例えばＤＮＡシーケンサとして用いる場合、遺伝子変異Ａを有するサンプルＡと遺伝子変異Ｂを有するサンプルＢを１つのデバイス上で別々に同時に計測することができる。プローブを固定したハイブリダイゼーションを原理とした遺伝子検出方法においても同様である。あるいはＤＮＡシーケンシングと、上述したハイブリダイゼーション検出法等を同時に実施することも可能となる。このように、個別溶液槽を集積化することにより計測のスループットを向上することができる。
［第２の実施形態］
一般に、ＥＷＯＤによる液滴の搬送を行う場合には、液滴の表面から電荷を引き抜いて分極させることで電極表面への濡れ性を高めるために、電極表面に絶縁体（誘電体）が設置されることがある。しかし、第１の実施形態の個別電極１１２の表面に絶縁体が設置された場合、高い絶縁抵抗によって電流計測を行うことが困難となり、個別電極１１２を用いて生体ポリマを分析することができなくなってしまう。
このような課題を解決するため、第２の実施形態においては、個別電極として、電流計測用の電極とＥＷＯＤ用の電極の２種類を各液滴に対して、それぞれ１つ以上別々に設置する。
＜生体ポリマ分析デバイスの構成例＞
図７は、第２の実施形態に係る生体ポリマ分析デバイス７００を示す模式図である。生体ポリマ分析デバイス７００は、基板１１３の構成が図４に示した生体ポリマ分析デバイス４００と異なっている。したがって、基板１１３以外の構成については説明を省略する。
図７に示すように、基板１１３には、電流計測用の複数の個別電極１１２（複数の第３の電極）と複数のＥＷＯＤ用電極１１４（複数の第１の電極）が埋め込まれている。複数の個別電極１１２は、それぞれ、薄膜１０２Ａの露出箇所と対向する位置に配置されている。ＥＷＯＤ用電極１１４の内側の表面には絶縁体１１５が設けられている。複数のＥＷＯＤ用電極１１４は、後述するように、各個別電極１１２に接する位置に各液滴１１０を搬送するためのレーンを形成するように配置される。
図７は、液滴１１０が所望の位置へ搬送された状態を示しており、各液滴１１０は、１つの個別電極１１２と、それを取り囲む複数のＥＷＯＤ用電極１１４に少なくとも接触している。このように、別々の用途として電流計測用の電極とＥＷＯＤ用電極とを設けることで、ＥＷＯＤ搬送と電流計測を問題なく行うことができる。
＜生体ポリマ分析方法＞
本実施形態の生体ポリマ分析方法は、第１の実施形態（図６）とほぼ同様であるが、ステップＳ２及びＳ９における液滴の搬送において、個別電極１１２ではなくＥＷＯＤ用電極１１４に対しＥＷＯＤ搬送用電圧が印加される点で、第１の実施形態と異なっている。
図８Ａは、生体ポリマ分析デバイス７００の上面図である。図８Ａに示すように、基板１１３には、電流計測用の個別電極１１２が４列×４行の計１６個配置され、各個別電極１１２の周囲に複数のＥＷＯＤ用電極１１４が配置されている。このように、複数のＥＷＯＤ用電極１１４は、液滴１１０を搬送するためのレーンを構成し、スムーズに液滴１１０を搬送することができる。各個別電極１１２は、薄膜１０２の露出箇所の上方に配置されている。各個別電極１１２が透明電極である場合、図８Ａに示すように、個別電極１１２の上方から薄膜１０２を観察することができる。なお、図８Ａに示す状態は、第１の実施形態において説明したステップＳ１（図６）において撥水液１１１を導入した後の状態である。
図８Ｂ及び８Ｃは、液滴１１０が搬送される様子を示した生体ポリマ分析デバイス７００の上面図である。上述のように、液滴１１０の搬送は、ＥＷＯＤ用電極１１４にＥＷＯＤ搬送用電圧を印加することにより行われる。図８Ｂに示すように、例えばフローセルの流路を経由して運ばれてきた液滴１１０が第１の液槽１０４Ａに導入され、ＥＷＯＤ搬送用電圧が印加されているＥＷＯＤ用電極１１４に接触すると、液滴１１０を１電極分ずつ離散的に輸送することができる。最終的に、１つの液滴１１０は薄膜１０２と個別電極１１２との間に配置される。この動作を同様に繰り返すことにより、図８Ｃに示したように、全ての薄膜１０２の露出部分と個別電極１１２の間に液滴１１０を配置することが可能となる。
なお、個別電極１１２及びＥＷＯＤ用電極１１４の数及び配置のレイアウトは、図８Ａ～８Ｃに示したものに限定されず、適宜変更可能である。例えば、チャンネルを高集積化する場合には、個別電極１１２を数百個～数千個、あるいはそれ以上の単位で設けてもよい。
＜技術的効果＞
以上のように、本実施形態においては、第１の液槽１０４Ａに電流計測用の個別電極１１２とＥＷＯＤ用電極１１４とを設けた構成を採用している。これにより、ＥＷＯＤ用電極１１４の表面に絶縁体１１５を設けても、個別電極１１２を用いて問題なくナノポアの形成及び電流の計測を行うことができる。
［第３の実施形態］
上述のように、第１の実施形態の個別電極１１２の表面に絶縁体（誘電体）が設置された場合、高い絶縁抵抗によって電流計測を行うことが困難となり、個別電極１１２を用いて生体ポリマを分析することができなくなってしまう。
このような課題を解決するため、第３の実施形態においては、各個別電極１１２に対し、ＥＷＯＤ搬送用の回路、ナノポア開孔用の回路及び電流計測用の回路を接続し、これらの回路を切り替えることによって、個別電極１１２に印加する電圧を制御する。
＜生体ポリマ分析デバイスの構成例＞
図９は、第３の実施形態に係る生体ポリマ分析デバイス８００を示す模式図である。生体ポリマ分析デバイス８００の構成は、第１の実施形態において説明した図４の生体ポリマ分析デバイス４００とほぼ同様であるが、各個別電極１１２（複数の第１の電極）に配線を通して制御回路１２１（制御部）が接続されている。図９に示すように、制御回路１２１は、ＥＷＯＤ搬送用回路１１６、ナノポア開孔用回路１１７、電流計測用回路１１８及びこれらの回路を切り替える複数のスイッチ１２２が設けられる。制御回路１２１は、コンピュータ１０８（制御部）に接続され、スイッチ１２２の切り替え及び各回路１１６～１１８を用いた電圧の印加がコンピュータ１０８により制御される。
ＥＷＯＤ搬送用回路１１６と個別電極１１２の間には、例えばコンデンサ１２３（絶縁体）のように液滴から適切に電荷を引き抜くような構成の回路を設けることにより、絶縁体を個別電極１１２の表面に設置しなくともＥＷＯＤ搬送を適切に行うことが可能となる。なお、全ての個別電極１１２に共通の１つのＥＷＯＤ搬送用回路１１６が設けられていてもよい。
＜生体ポリマ分析方法＞
本実施形態の生体ポリマ分析方法は、第１の実施形態（図６）とほぼ同様であるが、コンピュータ１０８がスイッチ１２２を切り替えることにより、個別電極１１２に印加する電圧を変更する点で、第１の実施形態と異なっている。したがって、第１の実施形態との相違点のみを説明する。
ステップＳ２において、コンピュータ１０８は、スイッチ１２２を切り替え、ＥＷＯＤ搬送用回路１１６と各個別電極１１２とを接続し、各個別電極１１２にＥＷＯＤ搬送用電圧を印加する。
ステップＳ５において、コンピュータ１０８は、スイッチ１２２を切り替え、電流計測用回路１１８と各個別電極１１２とを接続し、隣接するチャンネルの個別電極１１２間にリーク電流読取用の電圧を印加し、リーク電流値を測定する。
ステップＳ８において、コンピュータ１０８は、スイッチ１２２を切り替え、ナノポア開孔用回路１１７と各個別電極１１２とを接続し、各個別電極１１２と共通電極１０５との間に薄膜１０２の絶縁破壊耐圧以上の電圧を印加し、電気的にナノポア１０１を開孔する。
ステップＳ９において、コンピュータ１０８は、スイッチ１２２を切り替え、ＥＷＯＤ搬送用回路１１６と各個別電極１１２とを接続する。次に、個別電極１１２にＥＷＯＤ搬送用電圧を印加して、各ナノポア開孔溶液である液滴１１０を第１の液槽１０４Ａの排出口へ搬送し、排出口に接続された廃液槽（不図示）へと移動させる。
ステップＳ１０において、コンピュータ１０８は、スイッチ１２２を切り替え、電流計測用回路１１８と各個別電極１１２とを接続し、各個別電極１１２と共通電極１０５との間に、サンプル計測用電圧を印加し、サンプルの計測を行う。
＜技術的効果＞
以上のように、本実施形態においては、複数の個別電極１１２にＥＷＯＤ搬送用回路１１６、ナノポア開孔用回路１１７及び電流計測用回路１１８を接続し、スイッチ１２２により個別電極１１２に接続される回路を切り替える構成を採用している。これにより、ＥＷＯＤ用電極を別途設けることなく、個別電極１１２及び共通電極１０５のみで液滴１１０の搬送、ナノポアの形成及び電流値の計測を行うことができるため、第２の実施形態と比較して、生体ポリマ分析デバイスの単位面積当たりのチャンネル数を増加させることができる。
［第４の実施形態］
図４及び図５に示したように、ソリッド式のナノポアデバイスは、薄膜１０２Ａの片側にフラット面である犠牲層１０２Ｃを有し、もう一方側にテーパー面であるテーパー層１０２Ｂを有する構造であることが多い。しかしながら、犠牲層１０２Ｃは、薄膜１０２Ａを露出させるために、ケミカルエッチング又はドライエッチングによって特定の領域のみが削られた構造（エッチングホール）を有する。
生体ポリマ分析デバイスの構造によっては、エッチングホールに撥水液１１１が残存し、エッチングホール内に液滴１１０が侵入することができず、不良チャンネルとなってしまう課題が発生する。
図１０Ａは、犠牲層１０２Ｃのエッチングホール１０２Ｄに撥水液１１１が残存した状態を示す模式図である。図１０Ａに示すように、エッチングホール１０２Ｄが例えば円筒形状の場合、撥水液１１１が先に入ることによりこの空間は流体力学的に不動域となるため、液滴１１０がエッチングホール１０２Ｄ上に搬送された場合に流体的に速やかに置換が行われず、エッチングホール１０２Ｄに撥水液１１１が残存してしまう。このような現象は、ＥＷＯＤでしばしば用いられる撥水液で発生しやすい。すなわち、撥水液は粘性が低く、かつ表面張力が低いという化学的性質を有するために、円筒形状のエッチングホール１０２Ｄのように不動域を有する構造であると置換がなされないという現象が発生する。特に撥水液１１１の密度が液滴の密度よりも重い場合、浮力は置換と逆に作用するため、より置換が困難となる。
そこで、以下、犠牲層１０２Ｃのエッチングホール１０２Ｄにおける撥水液１１１の残存を防止する構成について説明する。
図１０Ｂは、本実施形態の犠牲層１０２Ｃの構造を示す模式図である。図１０Ｂに示すように、本実施形態の犠牲層１０２Ｃは、エッチングホール１０２Ｄ（凹部）の断面形状がテーパー状に形成されている。このように、エッチングホール１０２Ｄの断面形状をテーパー形状のような流体的に不動域を持たない構造とすることにより、電解質溶液である液滴により、撥水液１１１を流体的に容易に置換することができる。
また、エッチングホール１０２Ｄが円筒形状の場合、第１の液槽１０４Ａに撥水液１１１を充填する前に、予め円筒形状のエッチングホール１０２Ｄに電解質溶液を封入しておくことで、撥水液１１１の残存を防止することもできる。円筒形状のエッチングホール１０２Ｄ内の液体は流体的に置換しにくいため、撥水液１１１がその後移動してきた場合に撥水液１１１がエッチングホール１０２Ｄに入り込まない。この場合は、撥水液１１１として比重が水よりも低い流体を使用することによって、より撥水液１１１がエッチングホール１０２Ｄ内へ入りにくくなる。
図１０Ｃは、本実施形態の他の生体ポリマ分析デバイス９００を示す模式図である。図１０Ｃに示すように、生体ポリマ分析デバイス９００の薄膜１０２Ａ、テーパー層１０２Ｂ及び犠牲層１０２Ｃの構造は、第１の実施形態の生体ポリマ分析デバイス５００（図５）と同様であるが、複数の個別電極１１２が設けられた基板１１３が、第２の液槽１０４Ｂに配置され、共通電極１０５が第１の液槽１０４Ａに配置されている。さらに、複数の液滴１１０及び撥水液１１１が第２の液槽１０４Ｂに導入され、電解質溶液１０３が第１の液槽１０４Ａに導入されている。
このように、テーパー層１０２Ｂ側（第２の液槽１０４Ｂ）に撥水液１１１を充填し、その後液滴１１０を搬送することにより、流体的に容易に撥水液１１１を液滴１１０で置換することができる。
＜技術的効果＞
以上のように、本実施形態においては、犠牲層１０２Ｃに形成されるエッチングホール１０２Ｄの断面形状をテーパー状とする構成を採用する。あるいは、円筒形状のエッチングホール１０２Ｄに予め電解質溶液を充填しておく構成を採用する。さらに、テーパー層１０２Ｂ側（第２の液槽１０４Ｂ）に複数の個別電極１１２を設けて撥水液１１１及び液滴１１０を導入する構成を採用することもできる。これにより、犠牲層１０２Ｃに形成されたエッチングホール１０２Ｄに撥水液１１１が残存し、不良チャンネルとなることを防止することができる。
［第５の実施形態］
＜生体ポリマ分析デバイスの構成例＞
図１１は、第５の実施形態に係る生体ポリマ分析デバイス１０００を示す模式図である。図１１に示すように、本実施形態の生体ポリマ分析デバイス１０００は、犠牲層１０２Ｃ（薄膜）の上面にＥＷＯＤ用電極１１４が形成されている点で、第１の実施形態（図４）及び第２の実施形態（図７）と異なっている。ＥＷＯＤ用電極１１４の表面には、絶縁体１１５が配置されている。各ＥＷＯＤ用電極１１４は、犠牲層１０２Ｃ内部に設けられた配線（不図示）を通して外部回路に接続されている。液滴１１０は、それぞれ１つの個別電極１１２に接し、隣接する少なくとも２つのＥＷＯＤ用電極１１４に接する位置に搬送されている。
図１２は、第５の実施形態に係る他の生体ポリマ分析デバイス１１００を示す模式図である。図１１に示すように、本実施形態の生体ポリマ分析デバイス１１００は、犠牲層１０２Ｃ（薄膜）の上面に電流計測用の複数の個別電極１１２（複数の第３の電極）が形成され、基板１１３にはＥＷＯＤ用電極１１４（複数の第１の電極）のみが形成されている点で、第１の実施形態（図４）及び第２の実施形態（図７）と異なっている。各個別電極１１２は、犠牲層１０２Ｃ内部に設けられた配線（不図示）を通して外部回路に接続されている。液滴１１０は、それぞれ１つの個別電極１１２に接し、隣接する少なくとも２つのＥＷＯＤ用電極１１４に接する位置に搬送されている。換言すれば、個別電極１１２は、それぞれ、１つの液滴１１０に接するように配置されている。
＜技術的効果＞
以上のように、本実施形態の生体ポリマ分析デバイス１０００及び１１００は、電流計測用の個別電極１１２と、ＥＷＯＤ用電極１１４とを有し、個別電極１１２又はＥＷＯＤ用電極１１４のいずれかを薄膜１０２Ａ上の犠牲層１０２Ｃと一体化させた構成を採用している。これにより、第２の実施形態のように、基板１１３に電流計測用の個別電極１１２及びＥＷＯＤ用電極１１４のいずれも設ける場合と比較して、チャンネルをより集積化することができ、より微小な容量の液滴を用いた計測を行うことができる。
［第６の実施形態］
第１の実施形態においては、図３Ａに示したように、薄膜１０２の片側（第１の液槽１０４Ａ）に複数の個別電極１１２を有する基板１１３を配置し、液滴１１０が導入される構成について説明した。一方、第６の実施形態においては、薄膜１０２の両側（第１の液槽１０４Ａ及び第２の液槽１０４Ｂ）に複数の個別電極１１２を有する基板１１３を配置し、それぞれ液滴１１０が導入される。
＜生体ポリマ分析デバイスの構成例＞
図１３は、第６の実施形態に係る生体ポリマ分析デバイス１２００を示す模式図である。図１３に示すように、本実施形態の生体ポリマ分析デバイス１２００は、薄膜１０２、第１の液槽１０４Ａ、第２の液槽１０４Ｂ、複数の個別電極１１２Ａ（複数の第１の電極）を有する基板１１３Ａ及び複数の個別電極１１２Ｂ（複数の第２の電極）を有する基板１１３Ｂを備える。基板１１３Ａは第１の液槽１０４Ａに設けられており、基板１１３Ｂは第２の液槽１０４Ｂに設けられている。複数の個別電極１１２Ａ及び複数の個別電極１１２Ｂは、薄膜１０２を介して対向する位置に配置されている。
第１の液槽１０４Ａ及び第２の液槽１０４Ｂには、それぞれ複数の液滴１１０（測定溶液）と、撥水液１１１とが導入されている。各液滴１１０は、撥水液１１１により隣接する液滴１１０と電気的に絶縁され、互いに独立している。また、複数の液滴１１０はそれぞれ個別電極１１２と接触しており、これにより各液滴１１０に対し電圧の印加などの電気的操作を行うことができる。その他の構成については、第１の実施形態の生体ポリマ分析デバイス３００（図３）と同様であるため、説明を省略する。
＜生体ポリマ分析方法＞
本実施形態の生体ポリマ分析方法は、第１の実施形態とほぼ同様であるため、図６を参照して本実施形態の生体ポリマ分析方法を説明する。なお、第１の実施形態と同様のステップについては説明を省略する。
まず、第１の実施形態のステップＳ１～Ｓ６を実施して第１の液槽１０４Ａに撥水液１１１及び液滴１１０を導入し、複数の個別溶液槽を形成する。その後、ステップＳ７の代わりに、第２の液槽１０４ＢについてもステップＳ１～Ｓ６と同様にして、撥水液１１１及び液滴１１０を導入し、複数の個別溶液槽を形成する。
次に、ステップＳ８において、コンピュータ１０８は、対向する個別電極１１２Ａと個別電極１１２Ｂとの間に薄膜１０２の絶縁破壊耐圧以上の電圧を印加して、電気的にナノポア１０１を開孔する。
ステップＳ９及びＳ１０において、個別電極１１２ＡにＥＷＯＤ搬送用電圧を印加して第１の液槽１０４Ａからナノポア開孔用の液滴１１０を廃棄し、サンプル溶液を導入してサンプル計測をした後、第２の液槽１０４Ｂについても同様に、個別電極１１２ＢにＥＷＯＤ搬送用電圧を印加して、ナノポア開孔用の液滴１１０をサンプル溶液で置換する。その後、対向する個別電極１１２Ａと個別電極１１２Ｂとの間に印加する電圧を逆転させることにより、第２の液槽１０４Ｂに導入されたサンプル溶液についてのサンプル計測を行うことができる。
＜技術的効果＞
以上のように、本実施形態においては、第１の液槽１０４Ａ及び第２の液槽１０４Ｂのいずれにも複数の個別電極１１２を有する基板１１３を設け、ＥＷＯＤにより液滴１１０を搬送する構成を採用している。これにより、１つの液槽（第１の液槽１０４Ａ）のみにサンプル溶液が導入される第１の実施形態と比較して、サンプル溶液の交換を行うことなく、２倍のサンプル数の計測を行うことができる。
［第７の実施形態］
第１の実施形態においては、第１の液槽１０４Ａが一層である構成について説明したが、第１の液槽１０４Ａの内部には、液滴１１０を搬送するための層と、サンプルを計測する層との２層構造であってもよい。
＜生体ポリマ分析デバイスの構成例＞
図１４Ａは、第７の実施形態に係る生体ポリマ分析デバイス１３００を示す模式図である。図１４Ａに示すように、本実施形態の生体ポリマ分析デバイス１３００において、第１の液槽１０４Ａの上面を構成する基板１１３が配置され、第１の液槽１０４Ａの内部に、基板１１３と略平行に基板１１９が配置されており、第１の液槽１０４Ａが２層構造となっている。基板１１３には、複数のＥＷＯＤ用電極１１４（複数の第１の電極）が設けられ、複数のＥＷＯＤ用電極１１４はそれぞれ絶縁体１１５により覆われている。基板１１９には、複数の個別電極１１２（複数の第３の電極）と、基板１１３と基板１１９との間に搬送された液滴１１０が通過可能な複数の開口１２０が設けられる。
第１の液槽１０４Ａに撥水液１１１が充填された後、第１の液槽１０４Ａの上層（基板１１３と基板１１９との間）に複数の液滴１１０が導入され、隣接するＥＷＯＤ用電極１１４間にＥＷＯＤ搬送用電圧を印加することにより、液滴１１０が搬送される。各液滴１１０が開口１２０の位置まで搬送されると、液滴１１０は、開口１２０を経由して下層（基板１１９と薄膜１０２との間）に移動する。液滴１１０は、重力や浮力、又は基板表面の水に対する表面張力差を利用して、第１の液槽１０４Ａの上層から下層へ移動することができる。
基板１１９は、開口１２０の壁面において親水化処理がなされていてもよい。これにより、液滴１１０をより下層へ移動させやすくすることができる。
図１４Ｂは、複数の液滴１１０が第１の液槽１０４Ａの下層に配置された状態を示す模式図である。図１４Ｂに示すように、各個別電極１１２は、各液滴１１０が開口１２０を通過して下層に移動した際に、１つの液滴１１０に接触するように配置されている。これにより、１つの液滴１１０に１つの個別電極１１２が接触した個別溶液槽が形成され、個別電極１１２と共通電極１０５との間に絶縁破壊電圧や電流計測用電圧を印加することにより、薄膜１０２に対するナノポア開孔や、サンプルの計測を行うことができる。
＜技術的効果＞
以上のように、本実施形態の生体ポリマ分析デバイスは、第１の液槽１０４Ａに複数のＥＷＯＤ用電極１１４を有する基板１１３と複数の個別電極１１２を有する基板１１９とを設け、２層構造とした構成を採用している。これにより、基板１１３に複数のＥＷＯＤ用電極１１４及び複数の個別電極１１２をいずれも設ける構成を採用している第２の実施形態と比較して、各基板１１３及び１１９に複数のＥＷＯＤ用電極１１４及び複数の個別電極１１２をより高密度で配置することができる。
［第８の実施形態］
第１の実施形態～第７の実施形態においては、主に生体ポリマ分析デバイスの構成について説明した。以下、本実施形態においては、生体ポリマ分析用デバイスを用いた生体ポリマ分析装置について説明する。生体ポリマ分析装置が備える生体ポリマ分析用デバイスとしては、第１の実施形態～第７の実施形態の生体ポリマ分析用デバイスのいずれを用いてもよい。
＜生体ポリマ分析装置の構成例＞
図１５は、生体ポリマ分析装置１８００の構成例を示す模式図である。生体ポリマ分析装置１８００は、一例として第２の実施形態の生体ポリマ分析デバイス７００（図７参照）、制御回路１２１及びコンピュータ１０８（制御部）を備える。
図１５に示すように、第１の液槽１０４Ａには、生体ポリマ１を含む複数の液滴１１０（サンプル溶液）が搬送されており、薄膜１０２Ａには、ナノポアが形成されていない。第２の液槽１０４Ｂには、電解質溶液１０３が導入されている。このように、生体ポリマ１を含む液滴１１０を用いて薄膜１０２Ａにナノポアを形成し、そのまま生体ポリマ１の分析を行うことができる。この場合、ナノポア開孔用の溶液とサンプル溶液とを置換する必要がないため、計測時間を短縮することができる。
図示は省略しているが、制御回路１２１内部には、ＥＷＯＤ搬送用回路、ナノポア開孔用回路、電流計測用回路及びこれらの回路を切り替えるスイッチが設けられている。各個別電極１１２及び共通電極１０５は、配線を介してナノポア開孔用回路及び電流計測用回路と接続される。ＥＷＯＤ用電極１１４は、配線を介してＥＷＯＤ搬送用回路に接続されている。
電流計測用回路には、各個別電極１１２及び共通電極１０５間に流れるイオン電流（封鎖電流）を測定する電流計が設けられている。電流計は、個別電極１１２及び共通電極１０５間に流れる電流を増幅するアンプと、アナログ／デジタル変換器とを有する。電流計はコンピュータ１０８に接続されており、アナログ／デジタル変換器は検出したイオン電流の値をデジタル信号としてコンピュータ１０８に出力する。
コンピュータ１０８は、例えばパーソナルコンピュータ、スマートフォン、タブレットなどの端末であり、各種データを処理するデータ処理部と、電流計の出力値や、データ処理部により算出されるデータ等を記憶する記憶部とを有する。データ処理部は、電流計から出力されたイオン電流（封鎖電流）の電流値に基づいて、生体ポリマ１を計数したり、生体ポリマ１のモノマ配列情報を取得したりする。また、データ処理部は、計測された電流値などの電気的特性に基づいて、液滴１１０の位置や、液滴１１０間にリークが生じているかどうか、薄膜１０２にナノポアが形成されているかどうかを判断する。
また、コンピュータ１０８は、制御回路１２１のスイッチの切り替え、共通電極１０５、各個別電極１１２及び各ＥＷＯＤ用電極１１４に対する電圧の印加を制御する。
なお、図１５に示すように、制御回路１２１とコンピュータ１０８を生体ポリマ分析用デバイス７００に対して別部材とするのではなく、制御回路１２１及びコンピュータ１０８を生体ポリマ分析用デバイスと一体構成としても良い。
＜生体ポリマの分析＞
図１５に示す状態において、各個別電極１１２と共通電極１０５の間にナノポア開孔用電圧を印加すると、ナノポアが薄膜１０２Ａ内に形成される。その後、続いて個別電極１１２と共通電極１０５の間に電流計測用電圧を印加すると、薄膜１０２Ａの両面の間に電位差が生じ、液滴１１０に溶解している生体ポリマ１が共通電極１０５の方向に泳動される。生体ポリマ１がＤＮＡである場合、液滴１１０中で負に帯電しているため、共通電極１０５を正極とすることにより、生体ポリマ１を共通電極１０５の方向に泳動させることができる。生体ポリマ１がナノポアを通過すると、封鎖電流が流れる。
生体ポリマ分析デバイスを用いた封鎖電流計測では、生体ポリマ１の非存在下で計測される電流値を基準（ポア電流）とし、ナノポアが生体ポリマ１を封入した際に観測される電流の減少（ナノポアの生体ポリマ１による封鎖）を計測し、分子の通過速度や状態を観測する。生体ポリマ１がナノポアを通過し終わると、取得電流値は、ポア電流に戻る。この封鎖時間から、生体ポリマ１のナノポア通過速度を解析し、封鎖量から生体ポリマ１の特性を解析することができる。
電気的信号、特にイオン電流の信号変化により生体ポリマを分析するナノポア手法においては、電解質溶液の電気伝導度が高いほど、イオン電流の信号変化量が増大するため、高いＳＮ比での計測が可能となる。イオン種の輸率等にも依存するが、一般的にはイオン強度すなわち塩濃度を増加することによって、電解質溶液の電気伝導度を高めることが可能となる。したがって、ナノポア分析においては、ＳＮ比の観点から、可能な限りの高塩濃度下での計測を行う。特にナノポア分析においては、１Ｍ濃度の塩化カリウム水溶液が用いられることが多く、場合に応じて３Ｍ以上のイオン強度を有する高い塩濃度条件が用いられる。最大の塩濃度は電解質が溶解可能な上限値である飽和濃度である。
具体的には、例えば、個別電極１１２及び共通電極１０５が銀／塩化銀電極である場合、液滴１１０及び電解質溶液１０３として３Ｍ濃度の塩化カリウム水溶液を用いることができる。その理由は、塩化物イオンが銀／塩化銀電極と電子授受反応が可能であり、カリウムイオンが塩化物イオンと電気移動度が等しいために電気伝導度が十分確保できるからである。他にもイオン種としては、塩化カリウム以外にもアルカリ金属類の１価カチオンである、リチウムイオン、ナトリウムイオン、ルビジウムイオン、セシウムイオン又はアンモニウムイオン等であってもよい。
＜生体ポリマの搬送制御＞
生体ポリマ分析装置１８００を用いてＤＮＡシーケンシングやＲＮＡシーケンシングを行う場合、ＤＮＡあるいはＲＮＡがナノポアを通過する際に搬送制御を行う必要がある。生体ポリマの搬送制御は主に酵素を用いた分子モータにより行うことができる。分子モータによる搬送制御はナノポア近傍でのみ開始される必要がある。特に、読取り対象である生体ポリマに対し、制御鎖を結合することによって、ナノポア近傍での分子モータによる搬送開始を制御することができる。このような構成は、例えば特願２０１８－１５９４８１やＰＣＴ／ＪＰ２０１８／０３９４６６に記載されている。これらの文献の開示内容は、本明細書の一部を構成するものとして援用される。
ここで、分子モータとして用いられる酵素としては、生体ポリマと結合能を有する酵素全般を指す。生体ポリマがＤＮＡの場合、例えばＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡヘリカーゼ、ＤＮＡエクソヌクレアーゼ、ＤＮＡトランスポザーゼ等が挙げられる。生体ポリマがＲＮＡの場合、例えばＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡヘリカーゼ、ＲＮＡエクソヌクレアーゼ、ＲＮＡトランスポザーゼ等が挙げられる。
上述のように、電解質溶液中に配置されたナノポアの両端に電圧が印加されると、ナノポア１０１近傍において電界が発生し、その力により生体ポリマがナノポアを通過する。一方で、分子モータは一般にナノポア直径よりも大きいためにナノポアを通過することができない。この制限を実現するために、ナノポア直径は一本鎖ＤＮＡあるいは一本鎖ＲＮＡが通過可能な下限値である０．８ｎｍから分子モータである酵素が通過しない上限値である３ｎｍの範囲にあることが望ましい。この条件下において、ナノポア近傍に滞在する分子モータに対して制御鎖中のプライマが近づくことで、伸長・乖離反応が開始される。その結果、分子モータが相補鎖を伸張・乖離する際の力により生体ポリマがナノポアから引き上げ、又は引き下げられ、その際に取得されるイオン電流の変化から生体ポリマの分析が行われる。
以上、生体ポリマ１中のモノマ配列情報を電気的信号に基づいて取得する構成について説明したが、ナノポアの内部に電極を設けることでトンネル電流を取得する方法や、トランジスタ特性変化を検出する方法によっても、生体ポリマ１のモノマ配列情報を得ることが可能である。また、光学的信号に基づいて生体ポリマ１のモノマ配列情報を取得する構成であってもよい。すなわち、モノマごとに特徴的な蛍光波長を有する標識が為されており、その蛍光信号を計測することによって、各モノマ配列を決定する方法であってもよい。
生体ポリマを分析するための生体ポリマ分析デバイス（ナノポアデバイス）及びそれを備える生体ポリマ分析装置は、上述した構成を要素として含む。生体ポリマ分析デバイス及び生体ポリマ分析装置は、使用手順や使用量などを記載した説明書と共に提供され得る。また、生体ポリマ分析デバイスは、即時使用可能な状態でナノポアが形成されている状態で提供されてもよいし、提供先で形成される状態で提供されてもよい。
［変形例］
本開示は、上述した実施形態に限定されるものでなく、様々な変形例を含んでいる。例えば、上述した実施形態は、本開示を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備える必要はない。また、ある実施形態の一部を他の実施形態の構成に置き換えることができる。また、ある実施形態の構成に他の実施形態の構成を加えることもできる。また、各実施形態の構成の一部について、他の実施形態の構成の一部を追加、削除又は置換することもできる。
本明細書で引用した全ての刊行物及び特許文献はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
１…生体ポリマ
１０１…ナノポア
１０２…薄膜
１０３…電解質溶液
１０４Ａ…第１の液槽
１０４Ｂ…第２の液槽
１０５…共通電極
１０６…電流計
１０７…電源
１０８…コンピュータ
１１０…液滴
１１１…撥水液
１１２…個別電極
１１３…基板
１１４…ＥＷＯＤ用電極
１１５…絶縁体
１１６…ＥＷＯＤ搬送用回路
１１７…ナノポア開孔用回路
１１８…電流計測用回路
１１９…基板
１２０…開口
１２１…制御回路
１２２…スイッチ
１２３…コンデンサ

Claims (19)

  1. 無機材質から形成される絶縁性の薄膜と、
    前記薄膜により隔てられる第１の液槽及び第２の液槽と、
    前記第１の液槽に配置される複数の第１の電極と、
    前記第２の液槽に配置される第２の電極と、
    前記複数の第１の電極及び前記第２の電極に印加される電圧を制御する制御部と、
    前記所定の電圧を前記複数の第１の電極に印加するＥＷＯＤ電圧印加用回路と、
    前記複数の第１の電極及び前記第２の電極間に前記薄膜の絶縁破壊電圧を印加してナノポアを形成するためのナノポア開孔用回路と、
    前記複数の第１の電極及び前記第２の電極間に流れる電流を測定するための電流計測用回路と、を備え、
    前記第１の液槽には、撥水液及び複数の液滴が導入され、
    前記制御部は、前記ＥＷＯＤ電圧印加用回路を制御して前記複数の第１の電極に所定の電圧を印加することにより、前記第１の液槽に導入された前記複数の液滴を誘電体上エレクトロウェッティングにより前記複数の第１の電極に接触する箇所に搬送し、前記複数の液滴を前記撥水液により互いに絶縁するように構成される、生体ポリマ分析装置。
  2. 前記第１の液槽は、複数の第３の電極をさらに備え、
    前記複数の液滴は、それぞれ前記複数の第１の電極及び前記複数の第３の電極に接する箇所に搬送され、
    前記複数の第３の電極は、各前記複数の液滴から前記薄膜を通って前記第２の液槽に流れる電流を測定可能に構成される請求項１記載の生体ポリマ分析装置。
  3. 前記複数の第１の電極は、表面に絶縁膜を備えることを特徴とする請求項１に記載の生体ポリマ分析装置。
  4. 前記複数の第１の電極は、さらに、各前記複数の液滴から前記薄膜を通って前記第２の液槽に流れる電流を測定可能に構成される請求項１記載の生体ポリマ分析装置。
  5. 前記薄膜は、前記複数の第３の電極及び前記第２の電極間に前記薄膜の絶縁破壊電圧が印加されることにより、ナノポアが形成される請求項２に記載の生体ポリマ分析装置。
  6. 前記薄膜は、前記複数の第１の電極及び前記第２の電極間に前記薄膜の絶縁破壊電圧が印加されることにより、ナノポアが形成される請求項４に記載の生体ポリマ分析装置。
  7. 前記複数の第１の電極は、前記複数の第３の電極の周囲に配置され、前記複数の液滴が搬送されるレーンを形成する請求項２に記載の生体ポリマ分析装置。
  8. 前記複数の液滴が所望の位置に搬送されたかどうかを判定する機構をさらに備える請求項１に記載の生体ポリマ分析装置。
  9. 前記薄膜は、前記液滴が搬送される箇所において、断面形状がテーパー状の凹部を有する請求項１に記載の生体ポリマ分析装置。
  10. 前記複数の第１の電極又は前記複数の第３の電極のいずれか一方は、前記薄膜上に設けられている請求項２に記載の生体ポリマ分析装置。
  11. 前記第２の液槽には、複数の前記第２の電極が設けられ、前記撥水液及び前記複数の液滴が導入され、
    前記制御部は、前記ＥＷＯＤ電圧印加用回路を制御して前記複数の第２の電極に前記所定の電圧が印加することにより、前記第２の液槽に導入された前記複数の液滴を誘電体上エレクトロウェッティングにより前記複数の第２の電極に接触する箇所に搬送し、前記複数の液滴を前記撥水液により互いに絶縁するように構成される、請求項１に記載の生体ポリマ分析装置。
  12. さらに、前記ＥＷＯＤ電圧印加用回路、前記ナノポア開孔用回路又は前記電流計測用回路と前記複数の第１の電極との接続を切り替えるスイッチと、を備え、
    前記制御部は、前記スイッチの切り替えを制御する、請求項１に記載の生体ポリマ分析装置。
  13. 前記ＥＷＯＤ電圧印加用回路と、前記複数の第１の電極との間に絶縁体が配置される請求項１２に記載の生体ポリマ分析装置。
  14. 無機材質から形成される絶縁性の薄膜と、前記薄膜により隔てられる第１の液槽及び第２の液槽と、前記第１の液槽に配置される複数の第１の電極と、前記第２の液槽に配置される第２の電極と、を備え、前記複数の第１の電極が、所定の電圧が印加されることにより、前記第１の液槽に導入された複数の液滴を誘電体上エレクトロウェッティングにより搬送可能に構成される生体ポリマ分析デバイスを準備することと、
    前記第１の液槽に撥水液を導入することと、
    前記第１の液槽に前記複数の液滴を導入することと、
    前記複数の第１の電極に前記所定の電圧を印加することにより、前記複数の第１の電極に接触する箇所に前記複数の液滴を搬送し、前記撥水液により前記複数の液滴を互いに絶縁することと、
    前記第２の液槽に電解質溶液を導入することと、を含む生体ポリマ分析方法。
  15. 前記第１の液槽は、複数の第３の電極をさらに備え、
    前記複数の液滴は、それぞれ前記複数の第１の電極及び前記複数の第３の電極に接する箇所に搬送され、
    各前記複数の第３の電極と前記第２の電極との間に流れる電流を測定することをさらに含む請求項１４に記載の生体ポリマ分析方法。
  16. 各前記複数の第３の電極と前記第２の電極との間に前記薄膜の絶縁破壊電圧を印加して、前記薄膜にナノポアを形成することをさらに含む請求項１５に記載の生体ポリマ分析方法。
  17. 前記複数の第１の電極及び前記第２の電極は、これらに印加される電圧を制御する制御部と接続され、
    前記制御部は、
    前記所定の電圧を前記複数の第１の電極に印加するＥＷＯＤ電圧印加用回路と、
    前記複数の第１の電極及び前記第２の電極間に前記薄膜の絶縁破壊電圧を印加してナノポアを形成するためのナノポア開孔用回路と、
    前記複数の第１の電極及び前記第２の電極間の前記薄膜に流れる電流を測定するための電流計測用回路と、
    前記ＥＷＯＤ電圧印加用回路、前記ナノポア開孔用回路又は前記電流計測用回路と前記複数の第１の電極との接続を切り替えるスイッチと、を備える請求項１４に記載の生体ポリマ分析方法。
  18. 前記複数の液滴が生体ポリマを含む液滴であり、
    前記複数の第１の電極及び前記第２の電極間に前記薄膜の絶縁破壊電圧を印加することでナノポアを形成することと、
    前記複数の第１の電極及び前記第２の電極間に前記生体ポリマが電気泳動可能な電圧を印加することと、
    前記生体ポリマが前記ナノポアを通過した際の前記複数の第１の電極及び前記第２の電極間に流れる電流値に基づいて、前記生体ポリマの分析を行うことと、をさらに含む請求項１４に記載の生体ポリマ分析方法。
  19. 前記複数の液滴が所望の位置に搬送されたかどうかを判定することをさらに含む、請求項１４に記載の生体ポリマ分析方法。
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022176049A1 (ja) * 2021-02-17 2022-08-25 株式会社日立ハイテク 液柱分離デバイス、システム、及び方法
CN113426499B (zh) * 2021-07-08 2022-10-14 成都齐碳科技有限公司 微结构、生物芯片、成膜方法、基因测序装置及其应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006300946A (ja) 2005-04-19 2006-11-02 Commissariat A L'energie Atomique マイクロ流体の方法および質量を二種の不混和性相間で移送する装置
JP2013042681A (ja) 2011-08-23 2013-03-04 Kyocer Slc Technologies Corp 遺伝子解析用配線基板
JP2017219327A (ja) 2016-06-03 2017-12-14 株式会社日立ハイテクノロジーズ 生体分子計測装置
US20180238824A1 (en) 2017-02-21 2018-08-23 Qualcomm Incorporated Noise improvement in dna sequencing circuit by finfet-like nanopore formation

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20100029633A (ko) * 2008-09-08 2010-03-17 삼성전자주식회사 능동형 반투과 소자를 구비하는 디스플레이 장치
CN102671724B (zh) * 2011-02-17 2015-03-11 王崇智 微电极阵列结构
WO2012165400A1 (ja) * 2011-06-03 2012-12-06 株式会社日立ハイテクノロジーズ 生体ポリマーの光学的解析装置及び方法
AU2014312043A1 (en) * 2013-08-30 2016-02-25 Illumina France Manipulation of droplets on hydrophilic or variegated-hydrophilic surfaces
JP6259741B2 (ja) * 2014-09-12 2018-01-10 株式会社日立ハイテクノロジーズ 生体ポリマ分析デバイス及び分析システム
GB2533953A (en) * 2015-01-08 2016-07-13 Sharp Kk Active matrix device and method of driving
US10369570B2 (en) * 2017-07-27 2019-08-06 Sharp Life Science (Eu) Limited Microfluidic device with droplet pre-charge on input
GB2569630B (en) * 2017-12-21 2022-10-12 Sharp Life Science Eu Ltd Droplet Interfaces in Electro-wetting Devices

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006300946A (ja) 2005-04-19 2006-11-02 Commissariat A L'energie Atomique マイクロ流体の方法および質量を二種の不混和性相間で移送する装置
JP2013042681A (ja) 2011-08-23 2013-03-04 Kyocer Slc Technologies Corp 遺伝子解析用配線基板
JP2017219327A (ja) 2016-06-03 2017-12-14 株式会社日立ハイテクノロジーズ 生体分子計測装置
US20180238824A1 (en) 2017-02-21 2018-08-23 Qualcomm Incorporated Noise improvement in dna sequencing circuit by finfet-like nanopore formation

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