WO2022176049A1 - 液柱分離デバイス、システム、及び方法 - Google Patents

液柱分離デバイス、システム、及び方法 Download PDF

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若棋 徐
啓 竹中
満 藤岡
修大 塚田
洋平 花崎
伸朗 吉岡
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    • B01D2325/38—Hydrophobic membranes

Definitions

  • the present invention relates to a liquid column generation method, particularly a liquid column separation device, system, and method, which are technologies related to biomeasurement.
  • the nanopore DNA sequencer consists of a membrane with pores and a chamber with electrodes placed above and below the membrane. Nanopores, which are pores on the membrane, are the only channels that connect the two chambers separated by the membrane. When a voltage is applied by the electrodes in this configuration, an electric field is generated within the chamber such that electric lines of force pass through the pore, and the biomolecules are forced through the nanopore by the force of the electric field. When the biomolecules pass through the nanopore, the impedance changes due to the structure of the biomolecules. Therefore, the structure of the biomolecules can be identified by measuring the change in the current flowing between the two electrodes.
  • the inventors instead of a chamber, the inventors opposed a membrane with nanopores to a substrate with electrodes, and formed columnar droplets (hereinafter referred to as liquid columns) between the nanopores and the electrodes.
  • liquid columns formed columnar droplets (hereinafter referred to as liquid columns) between the nanopores and the electrodes.
  • Patent Document 1 discloses a method for arraying a plurality of minute droplets in a device for biomolecular analysis.
  • the device of Patent Document 1 is a device for single-molecule observation of a fluorescent dye.
  • This device has a structure in which a first substrate having a plurality of minute hydrophilic wells in a hydrophobic surface faces a second substrate in parallel.
  • an oil-based sealing liquid is sent between the substrates and then an oil-based sealing liquid is sent, the space between the substrates is filled with the oil-based sealing liquid, but the sample remains in the plurality of wells.
  • the upper well becomes an independent reaction chamber.
  • Patent Document 2 discloses a device capable of operating droplets sandwiched between two substrates using electrowetting, which is a phenomenon in which the surface wettability changes when an electric potential is applied to an electrode. ing.
  • the substrate side with the electrodes has a water-repellent film, but the facing substrate has a hydrophilic film, and droplets can be retained at the position of the hydrophilic film.
  • the inventors are studying a device that electrically isolates each nanopore by forming a liquid column between the nanopore and the electrode.
  • the methods that have been reported so far do not sufficiently examine the conditions for generating a liquid column within the device. Since the object of Patent Document 1 is to observe a single molecule of a fluorescent dye, it is necessary to prevent sample liquid containing the fluorescent dye from remaining outside the reaction chamber, which is the observation area. If the sample liquid remains outside the reaction chamber, the fluorescence from the sample liquid remaining outside the reaction chamber becomes background light when observing a single molecule of the fluorescent dye in the reaction chamber. is inhibited. Therefore, it is not preferable for the sample liquid to form a liquid column in contact with the substrate including the wells and the opposing substrate.
  • Patent Document 1 does not mention such conditions.
  • a device in which the sample solution remains only in the well cannot be used for a nanopore DNA sequencer because the droplet cannot contact the nanopore or the electrode.
  • Patent Document 2 requires a complicated process because it is necessary to provide a large number of electrodes and wiring. Furthermore, it is considered unsuitable for a nanopore DNA sequencer that measures minute changes in electric current because it is necessary to apply an electric potential to the electrodes in the device to move the droplet.
  • An object of the present invention is to solve the above-mentioned problems and to provide a liquid column separation device, system, and method for producing a high-density liquid column array.
  • the present invention provides a liquid column separation device comprising a first substrate and a second substrate arranged to face the first substrate with a predetermined gap therebetween. and a liquid feeding means for supplying two or more fluids between the first substrate and the second substrate, wherein the surface of the first substrate facing the second substrate is a hydrophobic hydrophobic region has a pattern in which a plurality of hydrophilic hydrophilic regions are arranged, the representative length of the hydrophilic region is greater than the predetermined interval, and the transfer is performed between the first substrate and the second substrate
  • a liquid column separation device is provided that creates a liquid column in contact with a first substrate and a second substrate by flowing two or more immiscible fluids by liquid means.
  • a liquid column in contact with the first base material and the second base material is produced by flowing the immiscible fluid, the first base material has an electrically independent first electrode in the hydrophilic region, and the second base material has an electrically independent first electrode.
  • the material comprises a liquid column separation device having a membrane with nanopores in contact with the liquid column, a chamber containing an electrolyte solution in contact with the membrane, a second electrode in contact with the chamber, a measuring unit connected to the second electrode, and a measuring unit. and a control unit that controls the voltage applied to both electrodes according to the measurement result of, biomolecules are introduced into the liquid column, passed through the nanopore, and the time change of the ion current flowing between the electrodes is measured.
  • This provides a liquid column separation system that detects the passage of biomolecules and analyzes the structural features of the biomolecules.
  • the present invention provides a liquid column separation method, comprising: a first substrate; A base material and a liquid delivery means for supplying two or more fluids between a first base material and a second base material, wherein the surface of the first base material facing the second base material is hydrophobic A first base material and a second base material of a liquid column separation device having a pattern in which a plurality of hydrophilic regions are arranged in a hydrophobic region, and the representative length of the hydrophilic region is greater than a predetermined interval.
  • a liquid column separation method for producing a liquid column in contact with a first substrate and a second substrate by flowing two or more immiscible fluids between them by means of a liquid feeding means.
  • FIG. 2 is an explanatory diagram showing one configuration example of the liquid column separation device of Example 1;
  • FIG. 4 is an explanatory diagram showing the process of generating a liquid column according to Example 1;
  • FIG. 10 is a graph showing analysis results of droplets and liquid column generation conditions according to Example 1;
  • FIG. 4 is a diagram showing droplets and a liquid column according to Example 1;
  • FIG. 5 is a diagram showing a modification of the liquid column separation device of Example 1;
  • FIG. 5 is a diagram showing a modification of the liquid column separation device of Example 1;
  • FIG. 10 is a diagram showing a modified example of the liquid column separation device of Example 1, which has a structure in which a resistor is inserted in the hydrophilic region.
  • FIG. 10 illustrates a process for creating hydrophobic regions on top of hydrophilic regions of a first substrate, according to a variant. It is a figure which shows the process of producing a pillar in the 2nd base material which concerns on a modification.
  • Resist is a mixture mainly composed of resin (polymer), photosensitizer, additive, and solvent.
  • 2 is a schematic diagram showing the configuration of a nanopore device according to Example 2.
  • FIG. FIG. 10 is a schematic diagram showing the configuration of a nanopore device according to Example 3.
  • Example 1 is an example of a liquid column separation device, system, and method for separating the liquid column connecting the first substrate and the second substrate.
  • the configuration of the liquid column separation device 100 will be described with reference to FIG.
  • FIG. 1(a) is a perspective view of the liquid column separation device 100
  • FIG. 1(b) is a cross-sectional view taken along line A-A' of the perspective view.
  • the liquid column separation device 100 is configured such that a peripheral edge member 105 is sandwiched between a first base material 101 and a second base material 102, and has an inlet 106 for injecting liquid into the liquid column separation device 100 and a liquid discharge port. It has an outlet 107 for
  • the first base material 101 has a hydrophilic region 103 and a hydrophobic region 104 .
  • the first substrate 101 has a film of the hydrophobic region 104 on the surface of the hydrophilic region 103 .
  • the hydrophilic region 103 is a hydrophilic solid material such as glass or silicon oxide.
  • Hydrophobic region 104 is composed of a hydrophobic substance. Examples include silane compounds, fluororesins, and hydrocarbon compounds. Examples of fluoropolymer resins include amorphous fluororesins. Amorphous fluororesin has advantages of high hydrophobicity and low toxicity to biological samples.
  • a portion of the first base material 101 that is not covered with the hydrophobic region 104 becomes hydrophilic because the hydrophilic region 103 is exposed.
  • the shape of the hydrophilic region 103 that is not covered with the hydrophobic region 104 may be circular, polygonal, or the like, for example.
  • the hydrophobic region 104 is formed on the hydrophilic region 103, but conversely, the hydrophilic region may be formed on the hydrophobic region.
  • a hydrophilic base material was used for the second base material 102 .
  • glass, a silicon wafer having an oxide film, a hydrophobic material subjected to a hydrophilic surface treatment, or a resin laminated with a hydrophilic sheet may be used.
  • a gap between the first base material 101 and the second base material 102 is supported by a peripheral edge member 105 .
  • the material of the peripheral member 105 is not particularly limited, but examples thereof include a Teflon (registered trademark) sheet, a silicon sheet, a double-sided adhesive tape, dimethylpolysiloxane (PDMS), and the like.
  • Fig. 1 (c) shows an example of how the liquid column separation device is used.
  • a tube 108 is used to connect the injection port 106 and the solution sending means 109 , and the solution is sent from the solution sending means 109 .
  • the liquid sending means may be a pump such as a syringe pump or a diaphragm pump, or may be manually sent using a syringe or a pipettor.
  • FIG. 2 shows the process of producing the liquid column 112 with the liquid column separation device 100 of this embodiment.
  • the hydrophilic first solution 110 is the dispersed phase
  • the hydrophobic second solution 111 is the continuous phase.
  • the hydrophilic first solution 110 is flowed into the liquid column separation device 100 from the inlet 106 . Excess first solution 110 flows out from outlet 107 .
  • the hydrophobic second solution 111 is allowed to flow through the inlet 106 into the liquid column separation device 100 .
  • a liquid column 112 is generated on the hydrophilic region 103 that is not covered with the hydrophobic region 104 .
  • the hydrophilic liquid used in this embodiment is an electrolyte solution containing the biomolecules to be detected. From the viewpoint of the formation of the liquid column, the hydrophilic liquid must be hydrophilic regardless of the presence or absence of the biomolecules. is important.
  • the hydrophilic liquid may contain a surfactant or the like. For example, Tween 20 and Triron-X100, which are nonionic surfactants that do not destroy the structure of biomolecules, are preferable.
  • the hydrophobic liquid used in this embodiment is preferably silicone oil, mineral oil, or fluorine oil.
  • Novec registered trademark
  • a polymer having a perfluorocarbon structure for example, Novec (registered trademark), a polymer having a perfluorocarbon structure, Fluorinert (registered trademark) FC-40, Fluorinert (registered trademark) FC-43, and the like are used as the fluorine-based liquid.
  • FIG. 3 shows the liquid column generation when D is the representative length of the hydrophilic region, and H is the distance between the hydrophilic surface of the first substrate and the second substrate, that is, the height of the peripheral member 105 in this embodiment.
  • D is the representative length of the hydrophilic region
  • H is the distance between the hydrophilic surface of the first substrate and the second substrate, that is, the height of the peripheral member 105 in this embodiment.
  • It is a graph showing conditions, and fluid analysis was used for creation.
  • the Y-axis is the ratio between the liquid flow rate and the center distance (pitch) of the hydrophilic region.
  • a cross-sectional aspect ratio A of less than 1 is a condition in which a liquid column does not come into contact with the substrate.
  • the condition where the cross-sectional aspect ratio A is 1 or more and less than 2 is a condition under which the formation of the liquid column is unstable.
  • FIG. 4(a) and (b) are image diagrams of the generated liquid column 112 or droplet 113.
  • FIG. 5 is another example of the shape of the liquid column separation device of this embodiment.
  • the hydrophilic surface 103 of the second substrate 102 shown in FIG. 1 may not be separated from the adjacent liquid column because the liquid spreads over the surface. Therefore, as shown in FIG. 5, in order to constrain the range of the liquid column in contact with the surface of the second base material 102, the surface of the second base material 102 is also provided with a hydrophobic region 104' like the first base material 101. .
  • the shape of this hydrophobic area is not necessarily the same as the hydrophobic area of the first substrate.
  • the distance between the two substrates becomes narrower, so the pressure loss increases when the first solution and the second solution flow, making it difficult for the liquids to flow.
  • the device structure shown in FIG. That is, it has a structure in which the portion of the convex structure 103' on the surface of the base material is a hydrophilic region.
  • the distance between the surface of the hydrophilic region of the convex structure 103′ and the opposing substrate is narrowed, the distance between the surface of the hydrophilic region other than the convex structure and the substrate facing the substrate can be increased. increase can be suppressed.
  • the method for producing the hydrophilic region of the protruding structure 103' is, for example, to heat-treat a silicon wafer to generate a hydrophilic silicon oxide layer, and use the above microfabrication techniques such as photolithography and etching to make it hydrophilic. A sexual region can be created. The etched portion of the hydrophilic silicon oxide layer becomes hydrophobic because the silicon is exposed.
  • silicon rubber such as polydimethylsiloxane (PDMS), rubber materials such as natural rubber and fluororubber, and various plastics can be used.
  • transparent materials such as quartz glass, float glass, calcium fluoride, silicon carbide, polymethyl methacrylate resin, and diamond, or opaque hard materials including metals such as ceramics, aluminum, and stainless steel can be used.
  • FIGS. 8 and 9 show an example of the process of forming a hydrophobic region on the hydrophilic region of the first base material and the process of forming pillars on the second base material according to this modified example.
  • the process of creating hydrophobic regions on the hydrophilic regions of the first substrate 101 includes silane coupling coating, hydrophobic coating , surface treatment, resist coating, exposure, development, dry etching, and resist removal to form a hydrophilic region.
  • the second substrate 102 is coated with a resist (FIGS. 9A and 9B), and after exposure (FIG. 9C), the resist is By removing ((d) in the same figure) to form a resistor 114 and combining it with the first substrate 101 in FIG. 8 ((e) in the same figure), the resistor is placed in the hydrophilic region shown in FIG. be able to.
  • the resist is a mixture containing resin (polymer), photosensitive agent, additive, and solvent as main components.
  • the first substrate having a function for measuring a specific substance on the surface and the second substrate having a hydrophilic/hydrophobic pattern on the surface are opposed to each other.
  • It is a column separation device, and has a supply hole for supplying fluid between substrates and a discharge port for discharging fluid, a function for measuring a specific substance on the first substrate, and a function for measuring a specific substance on the second substrate.
  • the hydrophilic pattern is at a facing position, and the representative length of the hydrophilic region is larger than the distance between the first substrate and the second substrate, so that the hydrophilic region of the first substrate is opposed to the second substrate. can generate an independent liquid column in contact with
  • Example 2 is an example of the measurement process using a nanopore DNA sequencer that combines a nanopore device and a liquid column separation device.
  • An outline of the second embodiment will be described with reference to FIG.
  • FIG. 10 is a schematic diagram showing the configurations of the liquid column separation device 100 and the nanopore device 200. As shown in FIG.
  • the liquid column separation device 100 in this example used the same device as in Example 1, and as the second base material, the nanopore device 200 was used instead of the glass substrate.
  • a nanopore device 200 includes a membrane 201 and a membrane-attached substrate 202 .
  • the membrane 201 must have properties as an insulator, and although a silicon nitride film is used in this embodiment, a silicon oxide film, an organic substance, a polymer material, or the like may be used. Silver-silver chloride was used for the electrodes, but platinum, gold, or the like may also be used.
  • the chamber 203 is configured so that the electrolyte solution 204 can be filled therein.
  • the first electrode 205b is provided independently in each hydrophilic region of the first substrate at a position facing the second electrode 205a and the nanopore device 200, and the wiring 206, power supply and control/ It has a detection data acquisition unit 207 .
  • the power supply and control/detection data acquisition unit 207 includes a high-output power supply, a processor, a memory, and a storage unit (not shown).
  • the measurement process consists of two steps: nanopore formation and sample analysis.
  • the formation of nanopores is performed in the following flow.
  • the chamber 203 is filled with an electrolyte solution 204 .
  • a liquid column of the aqueous solution is generated in contact with the membrane 201 and the first electrode 205b by the procedure shown in the first embodiment.
  • a KCl aqueous solution was used as the first solution 110 and the electrolyte solution 204 in the chamber used to generate the liquid column.
  • an aqueous solution of LiCl, NaCl, CaCl 2 , MgCl 2 , CsCl, or the like may be used.
  • the first electrode 205 b contacts the first solution 110 and the second electrode 205 a contacts the electrolyte solution 204 .
  • Nanometer-sized pores (nanopores) 208 are formed in the membrane 201 when a voltage is applied to the electrodes 205a and 205b.
  • Example 2 Before creating a liquid column in the liquid column separation device 100 again, the inside of the liquid column separation device 100 is cleaned with a cleaning liquid and filled with the electrolyte solution together with the chamber 203 .
  • a liquid column of an electrolyte solution containing biomolecules (such as DNA strands) is produced.
  • a voltage is applied between the second electrode 205a in the chamber 203 and the independent first electrode 205b in contact with the liquid column.
  • an electric field is generated around the nanopore, and the biomolecules are subjected to an electrostatic force by the electric field. Biomolecules pass through the nanopore due to electrostatic forces.
  • biomolecules When the biomolecules pass through the nanopores, the biomolecules partially block the nanopores and change the resistance value of the nanopores, so that the current value detected between the two electrodes 205a and 205b changes.
  • the structure of biomolecules is analyzed from the amount of change in current value.
  • FIG. 11(a) shows a device based on the device of Example 2, in which a temperature control mechanism 209 capable of controlling the temperature cycle such as a Peltier element or a heat block is provided outside the first substrate.
  • a temperature control mechanism 209 capable of controlling the temperature cycle such as a Peltier element or a heat block is provided outside the first substrate.
  • the temperature of the liquid column containing biomolecules generated by the liquid column separation device 100 can be controlled, and the three temperature ranges required for PCR reaction (Polymerase Chain Reaction) can be quickly heated. • Allows cooling, holding a given temperature, and repeating up to a given number of iterations.
  • temperature control may be performed for each liquid column by dividing the temperature control mechanism 209' for each hydrophilic well of the first substrate.
  • Each cycle of DNA synthesis by PCR consists of three steps: denaturation, annealing, and extension.
  • the target DNA sequence is synthesized by repeating this three-step PCR cycle several times.
  • the properties of the DNA polymerase, the type of PCR buffer, and the complexity of the template DNA all influence the setup of these reaction conditions.
  • 100 liquid column array device, 101: first substrate, 102: second substrate, 103, 103': hydrophilic regions, 104, 104': hydrophobic regions, 105: peripheral member, 106: inlet, 107 : outlet, 108: tube, 109: liquid feeding means, 110: first solution, 111: second solution, 112: liquid column, 113: droplet, 114, 114': resistor, 200: nanopore device, 201 : membrane, 202: substrate with membrane, 203: chamber, 204: electrolyte solution, 205a: electrode, 205b: electrode, 206: wiring, 207: power supply and control/detection data acquisition unit, 208: pores, 209, 209' : temperature control mechanism, D: representative lengths of hydrophilic region H, H': distance between first substrate, hydrophilic surface and second substrate A: cross-sectional aspect ratio.

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Abstract

ソリッド式のナノポアシーケンサのアレイ化を簡便に行う。第１基材と第２基材があり、二つの基材の間に、２つ以上の流体を供給する送液手段を備える流柱分離デバイスであって、第２基材の表面に親水性、疎水性の領域があり、その中の親水性領域は、第１基材には計測したい物質を通過したい所定位置の対面にある。また、流路空間に流体が出入りできる、少なくとも１つ以上の入口と出口があり、親水性領域の代表長さを第１基材と第２基材の間隔より大きくすることにより、送液手段により２つ以上の非相溶流体を流すことで、第１基材と第２基材を連結できる液柱を生成する。

Description

液柱分離デバイス、システム、及び方法
　本発明は、液柱生成方法、特にバイオ計測に関連する技術である液柱分離デバイス、システム、及び方法に関する。
　ＤＮＡ（deoxyribonucleic acid）やタンパク質などの生体分子を分析する生体試料分析装置シーケンスにおける新規技術として、生体分子と同程度の大きさの細孔を利用したナノポアＤＮＡシーケンサの開発が進められている。
　ナノポアＤＮＡシーケンサは、細孔を有するメンブレンと、メンブレンの上下に配置された電極を有するチャンバから構成される。メンブレン上の細孔であるナノポアは、メンブレンにより二層に分かれているチャンバを連結する唯一の流路である。この構成にて電極により電圧が印加されると、電気力線が細孔を通過するような電場がチャンバ内に生じるため、生体分子は電場から力を受け、ナノポアを通過する。生体分子がナノポアを通過する際に、生体分子の構造に由来するインピーダンスの変化が生じるため、両電極間に流れる電流値の変化を計測することで生体分子の構造特定が可能になる。
　このナノポアＤＮＡシーケンサの読み取りのスループットを向上するためには、複数のナノポアで並行して計測することが重要となる。そのため、各ナノポア間は電気的に絶縁する必要があるが、ナノポア間を電気的に絶縁する隔壁の他、電極や配線などの周辺構成を備えた構造を微細化することは非常に困難である。
　そのため、発明者らは、チャンバの代わりに、ナノポアを備えたメンブレンに電極を備えた基板を対向させ、ナノポアと電極間に柱状の液滴（以下、液柱と称す）を構成することで、各ナノポアを電気的に絶縁するデバイスを検討している。
　デバイス内で微小な液滴を作製する技術として、特許文献１に、生体分子解析用のデバイスで、デバイス内に複数の微小液滴をアレイ化する方法が開示されている。特許文献１のデバイスは、蛍光色素の一分子観測を行うためのデバイスである。本デバイスは、疎水性表面の中に複数の微小親水性ウェルを備える第一の基板に、第二の基板を平行に対向させた構造である。基板間に蛍光色素を含む試料液を送液した後、油性封止液を送液すると、基板間は油性封止液で満たされるが、複数のウェル内に試料が残るため、第一の基板上のウェルは独立した反応室となる。１つの反応室に入る蛍光色素分子が１つ以下になるような試料液を用いると、シグナルが得られた反応室の数をカウントすることで、検出分子の濃度を正確に調べることが可能である。
　特許文献２には、電極に電位を印加するとその表面の濡れ性が変化する現象であるエレクトロウェッティングを利用し、２つの基板間に挟まれた液滴を動作させることができるデバイスが開示されている。電極がある基板側は、撥水膜だが、対面する基板には親水膜があり、親水膜の位置で液滴が保持できる。
特開２０１８－１２１６３４号公報 特表２０１６－５３９３４３
　上述したように、発明者らは、ナノポアと電極間に液柱を構成することで、各ナノポアを電気的に絶縁するデバイスを検討している。しかしながら、これまで報告されてきた方法は、デバイス内で、液柱を生成する条件についての検討が不十分である。特許文献１は、蛍光色素の一分子観測が目的であるため、観察領域である反応室以外に蛍光色素を含む試料液が残らないようにする必要がある。反応室の外に試料液が残った場合、反応室内の蛍光色素の一分子観察する際に、反応室の外に残った試料液からの蛍光が背景光となるため、蛍光色素の一分子観察は阻害される。したがって、試料液がウェルを含む基板と、対向する基板に接する液柱状になることは好ましくない。そのため、液柱状にならない条件を検討する必要があるが、特許文献１ではその条件について言及されていない。また、ウェルのみに試料液が残るデバイスでは、液滴はナノポアもしくは電極に接触できないため、ナノポアＤＮＡシーケンサに使用することはできない。
　また、特許文献２のエレクトロウェッティングを利用したデバイスでは、多数の電極及び配線を設ける必要があるため、複雑な工程が必要になる。さらに、液滴の移動には、デバイス内の電極に電位を印加する必要があるため、微小電流の変化を測定するナノポアＤＮＡシーケンサにすること不向きと考える。
　本発明の目的は、上述のような課題を解決し、高密度の液柱アレイを生成する液柱分離デバイス、システム、及び方法を提供することである。
　上記の目的を達成するため、本発明においては、液柱分離デバイスであって、第１基材と、第１基材と所定の間隔を隔てて対向するように配置された第２基材と、第１基材と第２基材の間に２つ以上の流体を供給する送液手段と、を備え、第１基材の第２基材と対向する表面は、疎水性の疎水性領域の中に、複数の親水性の親水性領域が配列したパターンを有し、親水性領域の代表長さが上記の所定の間隔より大きく、第１基材と第２基材の間に、送液手段により２つ以上の非相溶流体を流すことにより、第１基材及び第２基材と接する液柱を作製する液柱分離デバイスを提供する。
　また、上記の目的を達成するため、本発明においては、第１基材と、第１基材と所定の間隔を隔てて対向するように配置された第２基材と、第１基材と第２基材の間に２つ以上の流体を供給する送液手段と、を備え、第１基材の第２基材と対向する表面は、疎水性の疎水性領域の中に、複数の親水性の親水性領域が配列したパターンを有し、親水性領域の代表長さが上記所定の間隔より大きく、第１基材と第２基材の間に、送液手段により２つ以上の非相溶流体を流すことにより、第１基材及び第２基材と接する液柱を作製し、第１基材は親水性領域に電気的に独立した第１電極を有し、第２基材は液柱に接するナノポアを有するメンブレンを有する液柱分離デバイスと、メンブレンに接する電解質溶液を含むチャンバと、チャンバに接する第２電極と、当該第２電極に接続される測定部と、測定部の測定結果に従い、両電極に印加する電圧を制御する制御部と、を備え、液柱には、生体分子が導入され、ナノポアを通過させ、両電極間に流れるイオン電流の時間変化を計測することで、生体分子 の通過を検出し、生体分子の構造的な特徴を解析する液柱分離システムを提供する。
　更にまた、上記の目的を達成するため、本発明においては、液柱分離方法であって、第１基材と、第１基材と所定の間隔を隔てて対向するように配置された第２基材と、第１基材と第２基材の間に２つ以上の流体を供給する送液手段と、を備え、第１基材の第２基材と対向する表面は、疎水性の疎水性領域の中に、複数の親水性の親水性領域が配列したパターンを有し、親水性領域の代表長さが所定の間隔より大きい液柱分離デバイスの第１基材と第２基材の間に、送液手段により２つ以上の非相溶流体を流すことにより、第１基材及び第２基材と接する液柱を作製する液柱分離方法を提供する。
　本発明によれば、２つ以上非相溶流体以上を送液することで、第１基材の親水性領域に対向な第２基材に接する独立液柱を生成することができる。上記した以外の課題、構成及び効果は、以下の実施形態の説明により明らかにされる。
実施例１の液柱分離デバイスの一構成例を示す説明図である。 実施例１に係る、液柱の生成過程を示す説明図である。 実施例１に係る、液滴と液柱生成条件の解析結果を示すグラフ図である。 実施例１に係る、液滴と液柱を示す図である。 実施例１の液柱分離デバイスの変形例を示す図である。 実施例１の液柱分離デバイスの変形例を示す図である。 実施例１の液柱分離デバイスの変形例であって、親水性領域に抵抗体を入れた構造を示す図である。 変形例に係る、第１基材の親水性領域の上に疎水性領域を作製するプロセスを示す図である。 変形例に係る第２基材にピラーを作製するプロセスを示す図である。(レジストとは、樹脂（ポリマー）、感光剤、添加剤、溶剤を主成分とする混合物) 実施例２に係る、ナノポアデバイスの構成を示す模式図である。 実施例３に係る、ナノポアデバイスの構成を示す模式図である。
　以下図面に従い順次、本発明を実施するための形態について説明する。
　実施例１は、第１基材と第２基材を連結する液柱を分離する液柱分離デバイス、システム、及び方法の実施例である。まず、液柱分離デバイス１００の構成について、図１を用いて説明する。図１（a）は液柱分離デバイス１００の斜視図であり、同図（b）は斜視図のＡ－Ａ’断面での断面図である。液柱分離デバイス１００は、第１基材１０１と第２基材１０２で、周縁部材１０５を挟むように構成され、液柱分離デバイス１００内に液体を注入するための注入口１０６と液体を排出するための排出口１０７を備える。
　また、第１基材１０１は親水性領域１０３と疎水性領域１０４を備える。本実施例では、第１基材１０１は親水性領域１０３の表面に疎水性領域１０４の膜が構成されている。
　親水性領域１０３は、親水性の固体材料であり、例えばガラス、酸化シリコンを用いる。疎水性領域１０４は疎水性の物質で構成される。例えば、シラン化合物、フッ素樹脂、炭化水素化合物である。フッ素系高分子樹脂としては、例えばアモルファスフッ素樹脂等が挙げられる。アモルファスフッ素樹脂は、高い疎水性を有し、かつ、生体試料に対する毒性が、低いという利点がある。
　第1基材１０１において、疎水性領域１０４に覆われていない部分は親水性領域１０３が露出しているため、親水性になる。疎水性領域１０４に覆われていない親水性領域１０３の形状は、例えば円形状、多角形形状等であってもよい。本実施例では親水性領域１０３の上に疎水性領域１０４を作製したが、反対に疎水性領域の上に親水性領域を設けても良い。
　第２基材１０２は親水性の基材を使用した。例えば、ガラス、酸化膜を持つシリコンウェハであり、また親水化の表面処理した疎水性材料や、親水シートを張り合わせた樹脂を使用してもよい。第１基材１０１と第２基材１０２との間の隙間は周縁部材１０５で支持する。周縁部材１０５の材質に特に制限はないが、例えばテフロン（登録商標）シート、シリコンシート、両面粘着テープ、ジメチルポリシロキサン（dimethylpolysiloxane、ＰＤＭＳ）等が挙げられる。
　図1（ｃ）では液柱分離デバイスの使用方式の一例を示した。チューブ１０８を用いて、注入口１０６と送液手段１０９を繋ぎ、送液手段１０９から溶液を送液する。送液手段はシリンジポンプやダイアフラムポンプなどのポンプの他、シリンジやピペッターを用い手操作で送液してもよい。
　図２は本実施例の液柱分離デバイス１００で液柱１１２を作製するプロセスを示す。親水性第１溶液１１０を分散相、疎水性の第２溶液１１１を連続相とする 。始めに、注入口１０６から親水性の第１溶液１１０を液柱分離デバイス１００内に流す。余分な第一溶液１１０は排出口１０７より流出する。次に、疎水性の第２溶液１１１を注入口１０６から液柱分離デバイス１００内に流す。この時に後述する条件を満たすとき、疎水性領域１０４に覆われていない親水性領域１０３上に液柱１１２が生成される。
　本実施例で使用する親水性の液体は、検出対象である生体分子を含有する電解質溶液であるが、液柱の作製の観点では、生体分子の有無は関係無く、親水性の液体であることが重要である。また、親水性の液体中は界面活性剤などを含んでもよいが、例えば、生体分子の構造を破壊しない非イオン性の界面活性剤であるＴｗｅｅｎ２０、Ｔｒｉｒｏｎ－Ｘ１００が好ましい。また、本実施例で使用する疎水性液体はシリコーンオイル、ミネラルオイル、またはフッ素系オイルが好ましい。例えば、フッ素系液体としてはＮｏｖｅｃ(登録商標)、パーフルオロカーボン構造を有するポリマー、フロリナート(登録商標)ＦＣ－４０、フロリナート(登録商標)ＦＣ－４３等を使用する。
　上記液柱１１２の生成原理を説明する。微小流路内では、体積に対し、界面積の占める割合が大きくなるので、流速による慣性力（体積力）に比べ、親水性溶液である第一溶液１１０と疎水性溶液である第二溶液１１１の界面に働くせん断力や界面張力（面積力）が支配的となる。二液の界面にはせん断力が発生し、疎水性領域１０４に覆われていない親水性領域１０３上の第一溶液１１０のみ液柱分離デバイス１００内に留まる。次に、疎水性領域１０４に覆われていない親水性領域１０３上の第一溶液１１０が液柱１１２となる条件について説明する。
　図３は、親水性領域の代表長さをＤ、第１基材の親水性表面と第２基材の間隔、すなわち本実施例では周縁部材１０５の高さをＨとしたときの液柱生成条件を示すグラフ図であり、作成には流体解析を用いた。グラフは、断面アスペクト比Ａ（＝Ｄ/Ｈ）をＸ軸に、送液流速と親水性領域の中心距離(ピッチ)の比率をＹ軸にする。
　図３に示すように、（i）断面アスペクト比Ａが１未満は、基材に接する液柱ができない条件である。次に、（ii）断面アスペクト比Ａが１以上、２未満の条件は液柱の生成が不安定な条件である。最後に、（iii）Ａが２以上の条件は、液柱が安定的に生成される条件である。したがって、液柱１１２が生成される必要条件は、断面アスペクト比（Ａ＝Ｄ/Ｈ）が、１以上になることである。
　図４(a)、(b)は生成された液柱１１２、あるいは液滴１１３のイメージ図である。次に、液柱分離デバイス１００より、液柱が生成しやすいデバイス構造を示す。
　図５は本実施例の液柱分離デバイスのその他の形状例である。図１に示した第２基材１０２の親水性表面１０３は、液体が表面に広がるため、隣接する液柱と分離できない可能性がある。そこで図５に示すように、第２基材１０２の表面に接する液柱の範囲を拘束するため、第１基材１０１のように第２基材１０２の表面も疎水性領域１０４‘を作製する。この疎水性領域の形状は必ず第１基材の疎水性領域と同じとは限らない。
　また、先述したように、液柱ができる十分条件は、断面アスペクト比Ａ(＝Ｄ/Ｈ）が２以上であるため、親水性領域が小さいほど、周縁部材１０５の高さも小さくする必要がある。しかしながら、その場合は２つの基板の間隔が狭くなるため、第１溶液や第２溶液を流す際の圧力損失が高くなり、液体が流れにくくなる。
　図６で示すデバイス構造で、この問題を解決することができる。すなわち、基材表面の凸構造１０３‘の部分を親水性領域にした構造を備える。凸構造１０３‘の親水性領域の表面と対向の基材との間隔は狭くなるが、凸構造以外の親水性領域の表面と対向する基材の間隔は大きくすることが可能なため、圧力損失の増加を抑制することができる。凸構造１０３‘のの親水性領域の製作方法は、例えば、シリコンウェハに熱処理して、親水性シリコン酸化物層を生成し、前記微細加工技術のフォトリソグラフィー、エッチングなどの技術を用いて、親水性領域を作製することができる。親水性シリコン酸化物層をエッチングした部分はシリコンが露出するため疎水性となる。
　また隣り合う液柱は結合する可能性があるので、図７(a)に示したように親水性領域の間に抵抗体１１４を入れることで、液柱の結合を防止することが可能になる。また、流路内では、管の壁面近くの流速は低く、流路中央付近の流速は高い。そのため、図７(b)のように、第１基材と第２基材を組み合わせによって、親水性領域の間に抵抗体１１４‘を入れることで、流速を均一化することができる。
　抵抗体114´の微細構造パターンは、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）をはじめとするシリコンゴム、天然ゴム、フッ素ゴムなどのゴム材料、各種プラスチック類を用いることができる。また、石英ガラス、フロートガラス、フッ化カルシウム、シリコンカーバイド、ポリメタクリル酸メチル樹脂、ダイヤモンド等の透明材料、または、セラミックス、アルミニウム、ステンレスなどの金属を含む不透明な硬質材料を用いることができる。
　図８、図９に本変形例に係る、第１基材の親水性領域の上に疎水性領域を作製するプロセス、及びを第２基材にピラーを作製するプロセスの一例を示した。図８(a)～(h)に示すように、第１基材の親水性領域の上に疎水性領域を作製するプロセスは、第１基材１０１上で、シランカップリングコーティング、疎水性コーティング、表面処理、レジストコーティング、露光、現像、ドライエッチング、レジスト除去を行い、親水性領域を形成する。
　また、図９(a)～(e)に示すように、第２基板１０２上にレジストをコーティングし（同図(a)、(b)）、露光（同図(c)）の後、レジスト除去（同図(d)）を行って抵抗体１１４を形成し、図８の第１基板１０１と組み合わせることにより（同図(e)）、図７に示した親水性領域に抵抗体を入れることができる。ここで、レジストとは、樹脂（ポリマー）、感光剤、添加剤、溶剤を主成分とする混合物である。
　以上説明したように、本実施例は、表面に特定の物質を計測するための機能を備えた第一基板と、表面に親水、疎水性のパターンを備えた第２基材を対向させた液柱分離デバイスであり、基板間に流体を供給するための供給孔と、流体を排出するための排出口を備え、第一基板上の特定物質を計測するための機能と、第二基板上の親水性のパターンは対面位置にあり、親水性領域の代表長さは第１基材と第２基材の間隔より大きくすることにより、第１基材の親水性領域に対向な第２基材に接する独立液柱を生成することができる。
　実施例２は、ナノポアデバイスと液柱分離デバイスを組み合わせたナノポアＤＮＡシーケンサを用いた測定工程の実施例である。図１０を用いて実施例２の概略を説明する。図１０は、液柱分離デバイス１００とナノポアデバイス２００の構成を示す模式図である。
　本実施例における液柱分離デバイス１００は実施例１と同様のデバイスを使用し、第２基材として、ガラス基板の代わりにナノポアデバイス２００を用いた。ナノポアデバイス２００は、メンブレン２０１、メンブレン付き基板２０２を備える。メンブレン２０１は絶縁体としての性質が必要であり、本実施例ではシリコン窒化膜を用いたが、シリコン酸化膜、有機物質、又は高分子材料などを用いてもよい。電極は銀－塩化銀を用いたが、白金、金などであってもよい。チャンバ２０３は、その内部に電解質溶液２０４を満たすことが可能に構成されている。本実施例の測定装置は、第２電極２０５a、ナノポアデバイス２００の対向位置に第１基材の各親水性領域の中、独立する第１電極２０５ｂが設置され、配線２０６、並びに電源及び制御・検出データ取得ユニット２０７を有する。電源及び制御・検出データ取得ユニット２０７は、図示を省略した高出力電源と、プロセッサと、メモリと、記憶部を備える。
　次に、測定工程について説明する。測定工程はナノポア形成、試料分析の２つの工程からなる。はじめに、ナノポアの形成は以下の流れで行われる。チャンバ２０３内には電解質溶液２０４が充填される。次に、液柱分離デバイス１００で、実施例１に示す手順でメンブレン２０１と第１電極２０５ｂと接する水溶液の液柱を生成する。
　液柱生成する際に使用した第１溶液１１０とチャンバ内の電解質溶液２０４には、ＫＣｌ水溶液を用いた。ＫＣｌ水溶液の他に、ＬｉＣｌ、ＮａＣｌ、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２、ＣｓＣｌ等の水溶液でもよい。このとき第１電極２０５ｂは第１溶液１１０に接触し、第２電極２０５ａは電解質溶液２０４に接触する。電極２０５ａ及び２０５ｂに電圧を印加するとメンブレン２０１にナノメートルサイズの細孔（ナノポア）２０８が形成される。
　次に、試料分析工程について説明する。液柱分離デバイス１００内に再度液柱を作製する前に、洗浄液で液柱分離デバイス１００内を洗浄し、チャンバ２０３と共に電解質溶液で充填される。次に、実施例１の手順に沿って、生体分子（ＤＮＡ鎖等）を含む電解質溶液の液柱を作製する。チャンバ２０３内の第２電極２０５ａと液柱と接する独立する第１電極２０５ｂの間に電圧を印加する。電圧を印加することにより、ナノポアの周辺に電場が発生し、生体分子は電場によって静電力を受ける。静電力により、生体分子はナノポアを通過する。生体分子がナノポアを通過する際に、生体分子により、ナノポアが一部封鎖され、ナノポアの抵抗値が変化するため、両電極２０５ａ、２０５ｂ間で検出される電流値は変化する。電流値の変化量から、生体分子の構造を分析する。以上の工程により、ナノポア形成、及び生体試料分析が実現される。
　液柱分離デバイスと温調機構を組み合わせた実施例を示す。図１１（ａ）は、実施例２のデバイスをもとに、第１基材の外側にペルチェ素子、ヒートブロック等の温度サイクルの制御ができる温調機構２０９を設けたデバイスである。温調機構を入れることで、液柱分離デバイス１００で生成した生体分子を含む液柱に温度制御ができ、ＰＣＲ反応（ポリメラーゼ連鎖反応、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）で必要な３温度域の変化を素早く加熱・冷却し、既定温度を保持し、さらに規定数までの反復を繰り返すことができる。また、図１１(ｂ)に示すデバイスのように、第１基材の親水性ウェルごとに温調機構２０９‘を分けることで、液柱毎に温度制御をおこなってもよい。本実施例のデバイスを用いることで、ＰＣＲ反応で増幅された遺伝子を直接にナノポアで計測することが可能である。
　続いて、上述した既定温度、規定数の一具体例を示す。ＰＣＲによるＤＮＡ合成の各サイクルは、熱変性（denaturation）、アニーリング（annealing）、伸長（extention）の３ステップで構成される。この３ステップによるＰＣＲサイクルを何度か繰り返すことにより、ターゲットＤＮＡ配列が合成される。ここで、ＤＮＡポリメラーゼの特性、ＰＣＲ緩衝液の種類、およびテンプレートＤＮＡの複雑性は、これら反応条件のセットアップにすべて影響を与える。
　下記にＰＣＲ反応の一例を示した。
  (0)最初の熱変性：95 °C　5分。加熱することにより、テンプレートの2本鎖DNAが分かれて1本鎖になる。
  (1)熱変性：95 °C、30秒。
  (2)アニーリング：60 °C、 60秒。プライマーがテンプレートに結合する。
  (3)伸長：72 °C 、60秒。DNAポリメラーゼによって結合したプライマー部分からDNAが伸長する。
  (1)(2)(3)の三つのステップを４０サイクルで繰り返すことにより、目的領域のターゲットは指数的に増加する。
　本発明は上記した実施例に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。例えば、上記した実施例は本発明のより良い理解のために詳細に説明したのであり、必ずしも説明の全ての構成を備えるものに限定されるものではない。
１００：液柱アレイデバイス、１０１：第１基材、１０２：第２基材、１０３、１０３‘：親水性領域、１０４、１０４‘：疎水性領域、１０５：周縁部材、１０６：注入口、１０７：排出口、１０８：チューブ、１０９：送液手段、１１０：第１溶液、１１１：第２溶液、１１２：液柱、１１３：液滴、１１４、１１４’：抵抗体、２００：ナノポアデバイス、２０１：メンブレン、２０２：メンブレン付き基板、２０３：チャンバ、２０４：電解質溶液、２０５a：電極、２０５b：電極、２０６：配線、２０７：電源及び制御・検出データ取得ユニット、２０８：細孔、２０９、２０９‘：温調機構、
Ｄ：親水性領域の代表長さ
Ｈ、Ｈ‘：第１基材と親水性表面と第２基材の間隔
Ａ：断面アスペクト比。

Claims (12)

  1. 液柱分離デバイスであって、
    第１基材と、前記第１基材と所定の間隔を隔てて対向するように配置された第２基材と、前記第１基材と前記第２基材の間に２つ以上の流体を供給する送液手段と、を備え、
    前記第１基材の前記第２基材と対向する表面は、疎水性の疎水性領域の中に、複数の親水性の親水性領域が配列したパターンを有し、前記親水性領域の代表長さが前記所定の間隔より大きく、
    　前記第１基材と前記第２基材の間に、前記送液手段により２つ以上の非相溶流体を流すことにより、前記第１基材及び前記第２基材と接する液柱を作製する、
    ことを特徴とする液柱分離デバイス。
  2. 請求項１に記載の液柱分離デバイスあって、
    前記第１基材の前記親水性領域は前記疎水性領域より前記第２基材との距離が近い、
    ことを特徴とする液柱分離デバイス。
  3. 請求項１に記載の液柱分離デバイスあって、
    前記第１基材の、任意の隣り合う前記親水性領域の間に、前記第１基材と前記第２基材と連結する柱状物がある、
    ことを特徴とする液柱分離デバイス。
  4. 請求項１に記載の液柱分離デバイスあって、
    前記第１基材は、前記親水性領域内に配置された複数の独立電極を有する、
    ことを特徴とする液柱分離デバイス。
  5. 請求項１に記載の液柱分離デバイスあって、
    前記第２基材は、前記第１基材の前記親水性領域との対向位置に、親水性領域を持つ、
    ことを特徴とする液柱分離デバイス。
  6. 請求項１に記載の液柱分離デバイスあって、
    前記第１基材の前記親水性領域は、シリコン酸化物、またはガラスである、
    ことを特徴とする液柱分離デバイス。
  7. 請求項１に記載の液柱分離デバイスあって、
    前記第１基材の前記親水性領域に温調機構を備える、
    ことを特徴とする液柱分離デバイス。
  8. 第１基材と、前記第１基材と所定の間隔を隔てて対向するように配置された第２基材と、前記第１基材と前記第２基材の間に２つ以上の流体を供給する送液手段と、を備え、前記第１基材の前記第２基材と対向する表面は、疎水性の疎水性領域の中に、複数の親水性の親水性領域が配列したパターンを有し、前記親水性領域の代表長さが前記所定の間隔より大きく、前記第１基材と前記第２基材の間に、前記送液手段により２つ以上の非相溶流体を流すことにより、前記第１基材及び前記第２基材と接する液柱を作製し、前記第１基材は前記親水性領域に電気的に独立した第１電極を有し、前記第２基材は前記液柱に接するナノポアを有するメンブレンを有する液柱分離デバイスと、
    前記メンブレンに接する電解質溶液を含むチャンバと、 
    前記チャンバに接する第２電極と、 
    前記第２電極に接続される測定部と、 
    前記測定部の測定結果に従い、両電極に印加する電圧を制御する制御部と 
    を備え、
    前記液柱には、生体分子が導入され、前記ナノポアを通過させ、両電極間に流れるイオン電流の時間変化を計測することで、前記生体分子 の通過を検出し、前記生体分子の構造的な特徴を解析する、
    ことを特徴とする液柱分離システム。
  9. 請求項８に記載の液柱分離システムあって、
    前記第１基材の前記親水性領域は前記疎水性領域より前記第２基材との距離が近い、
    ことを特徴とする液柱分離システム。
  10. 請求項８に記載の液柱分離システムあって、
    前記第１基材の、任意の隣り合う前記親水性領域の間に、前記第１基材と前記第２基材と連結する柱状物がある、
    ことを特徴とする液柱分離システム。
  11. 液柱分離方法であって、
    第１基材と、前記第１基材と所定の間隔を隔てて対向するように配置された第２基材と、前記第１基材と前記第２基材の間に２つ以上の流体を供給する送液手段と、を備え、前記第１基材の前記第２基材と対向する表面は、疎水性の疎水性領域の中に、複数の親水性の親水性領域が配列したパターンを有し、前記親水性領域の代表長さが前記所定の間隔より大きい構成の液柱分離デバイスの前記第１基材と前記第２基材の間に、前記送液手段により２つ以上の非相溶流体を流すことにより、前記第１基材及び前記第２基材と接する液柱を作製する、
    ことを特徴とする液柱分離方法。
  12. 請求項１１に記載の液柱分離方法あって、
    前記第１基材の前記親水性領域は前記疎水性領域より前記第２基材との距離が近い、
    ことを特徴とする液柱分離方法。
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