JP4337986B2

JP4337986B2 - ウイルス関連悪性腫瘍治療剤

Info

Publication number: JP4337986B2
Application number: JP2006190076A
Authority: JP
Inventors: 直樹森
Original assignee: 株式会社トロピカルテクノセンター; 国立大学法人琉球大学
Priority date: 2006-07-11
Filing date: 2006-07-11
Publication date: 2009-09-30
Anticipated expiration: 2026-07-11
Also published as: US20080015252A1; US20100197782A1; JP2008019174A

Description

本発明は、ウイルス関連悪性腫瘍治療剤に関し、更に詳細には、成人Ｔ細胞白血病、バーキットリンパ腫等、ウイルス感染を起源として発生する悪性腫瘍の治療や予防に有効なウイルス関連悪性腫瘍治療剤に関する。

本明細書において、ウイルス関連悪性腫瘍とは、成人Ｔ細胞白血病（adult T-cell leukemia；以下、「ＡＴＬ」と略す）やバーキットリンパ腫（Burkitt's lymphoma；以下、「ＢＬ」と略す）等のウイルス感染を起源として発生する悪性腫瘍を指す。

このうち、ＡＴＬはヒトレトロウイルス（human retrovirus）であるヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（human T-cell leukemia virus type Ｉ；以下、「ＨＴＬＶ−Ｉ」と略す）感染を原因とし、ＣＤ４＋Ｔ細胞を起源とする予後不良の白血病・リンパ腫である。日本全国でそのＨＴＬＶ−Ｉ感染者（ＨＴＬＶ−Ｉキャリア）は約１２０万人（人口の約１％）と推定されており、日本の中でも南西日本（九州、沖縄、四国地方）に多いことが知られ、また、海外に於いては、カリブ海地域、南アメリカなどの熱帯地方に多いという地域特異性がある。

ＡＴＬに由来する白血病細胞の多くは、ＣＤ４陽性ＣＤ８陰性のヘルパーＴ細胞の表現型を持ち、特異な核変形を伴う。そして、ＡＴＬは、Ｃ型レトロウイルスであるＨＴＬＶ−Ｉ（当初は、ＡＴＬＶと呼ばれていた。）が、原因ウイルスであることが明らかにされているが、ＨＴＬＶ−Ｉキャリアは、ＡＴＬだけでなく、悪性腫瘍の発生頻度が高いこと、更には、ＨＡＭ（HTLV-Ｉ-associated myelopathy）と呼ばれる神経疾患及び免疫疾患を引き起こすことが疫学的な調査によって明らかにされ、ＨＴＬＶ−ＩはＡＴＬのみならず、他の疾患にも関与していることが明らかにされつつある。

この他、リウマチ様の慢性関節炎やシェーグレン症候群、目の葡萄膜炎などへの関与も指摘されている。ＨＴＬＶ−Ｉ感染によるＡＴＬは、一旦発症すると、病状は急激に悪化し、その治療は困難を極めているのが現状である。従来の治療法としては、悪性リンパ腫に準じた化学療法或いは放射線療法などがあるが、それらは一時的な対症療法に過ぎず、残念ながら本質的な治療法とはなっていない。

一方、バーキットリンパ腫（ＢＬ）はヘルペスウイルスの１種であるエプスタイン・バーウイルス（Epstein-Barr virus：以下、「ＥＢＶ」という）感染が１つの原因としてあげられる血液腫瘍である。免疫不全患者に発症する日和見リンパ腫では、ＥＢＶ関連のＢＬが多く、やはり予後不良である。ＥＢＶは若年成人の伝染性単核症の原因ウイルスでもあり、その他、上咽頭癌、一部の胃癌やホジキン病との関連も知られている。

しかしながら、これらウイルス感染を起源とするウイルス関連悪性腫瘍には、臨床上有効性が高く、かつ安全性にも優れた薬剤がないのが現状であり、新規な医薬品の開発が強く望まれていた。

従って本発明は、ウイルス関連悪性腫瘍の治療や予防に有効な物質を見出し、これを利用する臨床上有用性の高いウイルス関連悪性腫瘍治療剤を開発することをその課題とするものである。

本発明者は、永年ＨＴＬＶ−ＩやＥＢＶの研究に取り組み、臨床上有用なＡＴＬやＢＬの治療薬についても探索してきた。そしてその結果、海藻中に含まれるフコキサンチンおよびフコキサンチノールが、これらのウイルス関連悪性腫瘍に対し特異的に作用し、治療薬としての目的を達成できることを見い出し本発明を完成した。

すなわち本発明は、フコキサンチンまたはフコキサンチノールを有効成分とするウイルス関連悪性腫瘍治療剤である。

また本発明は、ウイルス関連悪性腫瘍患者にフコキサンチンまたはフコキサンチノールを投与することを特徴とするウイルス関連悪性腫瘍治療方法である。

更に本発明は、ウイルス関連悪性腫瘍治療剤製造のための、フコキサンチンまたはフコキサンチノールの使用である。

本発明のウイルス関連悪性腫瘍治療剤（以下、「悪性腫瘍治療剤」という）の有効成分であるフコキサンチンやフコキサンチノールは、ＨＴＬＶ−１感染細胞や、ＡＴＬ細胞に対して選択的に作用し、正常細胞には実質的に作用しないものである。すなわち、フコキサンチンやフコキサンチノールが上記細胞等に対してアポトーシスを引き起こす濃度は、β−カロチンやアスタキサンチンのアポトーシス惹起濃度を遙かに下回るものであり、特に、フコキサンチノールは１マイクロモル以下の濃度でアポトーシスを引き起こし、しかも上記細胞の生存率は、ほぼ０である。

このように、フコキサンチンやフコキサンチノールは、ウイルス関連悪性腫瘍について特異的に、極めて高い割合でアポトーシスを引き起こすものであるため、これを有効成分とする悪性腫瘍治療剤は、ＡＴＬやＢＬ等のウイルス感染を起源として発生する悪性腫瘍の治療、予防に極めて有用なものである。

本発明の悪性腫瘍治療剤の有効成分は、フコキサンチンまたはフコキサンチノールである。このうち、フコキサンチンは、我々が日常摂取している海藻、例えば、ワカメ、コンブ、ヒジキ等の褐藻類に含まれる化合物であり、下記式（Ｉ）で示される低毒性のカロテノイドである。また、フコキサンチノールは、このフコキサンチンの加水分解により得られる脱アセチル化物であり下記式（II）で示されるものである。

ところで、上記のフコキサンチンには、インビトロ（in vitro）での神経芽細胞腫、前立腺癌、悪性黒色腫、大腸癌、急性前骨髄球性白血病細胞への増殖抑制活性や大腸癌や十二指腸腫瘍の発癌抑制活性があることは知られていたが、これらの癌とは異なるウイルス関連白血病・リンパ腫等のウイルス関連悪性腫瘍に対する優れた抗腫瘍活性を有することは全く知られていない。更に、フコキサンチンの脱アセチル化物であるフコキサンチノールが、フコキサンチンに比べ、更に優れたウイルス関連悪性腫瘍に対する優れた抗腫瘍活性を有することは、全く知られていないことであった。

このように、フコキサンチンや、フコキサンチノールが、ウイルス関連悪性腫瘍に対する治療剤等として、ＡＴＬやＢＬの予防及び治療に効果的に使用されるということは、本発明者の新知見によるものである。

上記のように、フコキサンチンは、ワカメ、コンブ、ヒジキ等の褐藻類に含まれる化合物であるが、本発明で使用するフコキサンチンとして好ましいものの一例としては、ホンダワラ科の海藻や乾燥ワカメ等の褐藻をメタノールやアセトンなどの有機溶媒に浸し、１８時間程度、室温、遮光条件で抽出し、得られた抽出液を濃縮後、ダイヤイオンＨＰ２０（三菱化学）、Ｔｏｙｏｐｅａｒ１ＨＷ４０Ｆ（東ソー）、ＯＤＳ（和光純薬、Ｗａｋｏｇｅｌ５０Ｃ１８）などを用いた液体クロマトグラフィーによる分離を行い、さらに再結晶操作を繰り返すことにより得られるフコキサンチン精製品が挙げられる。

また、フコキサンチノールは、上記フコキサンチンを加水分解することにより得られた脱アセチル化物であり、例えば、フコキサンチンに、種々の加水分解酵素を作用させることにより得られる。

より具体的に、本発明で用いられるフコキサンチノールの一例としては、公知文献（Ｔ．Ｍａｔｓｕｎｏ，Ｍ．Ｏｏｋｕｂｏ，Ｔ．ＮｉｓｈｉｚａｗａａｎｄＩ．Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．：３２，４３０９−４３１５，１９８４）に記載の方法を一部改変したリパーゼ分解法によって得られるフコキサンチノールを挙げることができる。

上記したフコキサンチンあるいはフコキサンチノールは、必要により、公知の精製手段により精製した後、本発明の悪性腫瘍治療剤の有効成分として使用することができる。

すなわち、本発明の悪性腫瘍治療剤を製造するに当たっては、フコキサンチンあるいはフコキサンチノール（以下、「フコキサンチン類」ということがある）を公知の医薬担体と組み合わせることにより、悪性腫瘍治療剤とすることができる。

この悪性腫瘍治療剤は、錠剤、カプセル剤、粉剤、顆粒剤等や、液剤、シロップ剤等の経口剤や、注射剤、点滴用剤、外用剤、坐剤、貼付剤等の非経口剤とすることができる。

上記の各製剤の製造において使用しうる医薬担体の例としては、デンプン、乳糖、ショ糖、マンニトール、コーンスターチ、結晶セルロース、カルボキシメチルセルロース、ケイ酸糖の賦形剤、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルエーテル、エチルセルロース、アラビアゴム、トラガント、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、デキストリン、ペクチン等結合剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール等の滑沢剤、崩壊剤、崩壊助剤、安定剤の公知の固形剤用担体や、水、エチルアルコール、エチレングリコール、グリセリン等の液剤成分、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル等の界面活性剤、ブドウ糖、アミノ酸等の呈味成分、溶解補助剤、着色料、保存料等の液剤用担体を挙げることができる。また、外用剤、坐剤、貼付剤については、これらの剤型に応じた公知の担体を使用することができる。

本発明の悪性腫瘍治療剤に配合されるフコキサンチン類の量は、対象疾患、疾患程度、患者年齢等によっても相違するが、例えば、フコキサンチンを有効成分とする経口製剤の場合は、大人一人当たり一日量として、０.１ｍｇないし３００ｍｇ程度とすることが好ましく、血管内投与の場合は、その１０／１程度とすることが好ましい。

また、フコキサンチノールを有効成分とする経口製剤の場合は、大人一人当たり一日量として、０.０５ｍｇないし１００ｍｇ程度とすることが好ましく、血管内投与の場合は、その１０／１程度とすることが好ましい。

以下、参考例および実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例等に何ら制約されるものではない。

参考例１
フコキサンチンの調製：
細切した乾燥ホンダワラ３.１５Ｋｇを、メタノール２０Ｌを用い、室温、１８時間の条件で２回抽出した、抽出液を１Ｌまで濃縮し、ヘキサン８００ｍＬで２回分配した。メタノール層を濃縮し、ＨＰ２０カラム（φ５５×１５０ｍｍ）に添加し、メタノール１.５Ｌおよびアセトン６００ｍＬで溶出した。メタノール溶出液を濃縮し、ＨＷ４０Ｆカラム（φ３０×５００ｍｍ）に添加し、メタノールで溶出した。フコキサンチン画分を濃縮し、９０％メタノールからの再結晶操作を２回行い、精製フコキサンチンを２００ｍｇ得た。ＨＰＬＣおよび^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルにより９５％以上の純度であること確認し、ＮＭＲおよびＭＳスペクトルによりその化学構造を確認した。以下の実施例では、この精製フコキサンチンをフコキサンチンとして用いた。

参考例２
フコキサンチノールの調製：
参考例１で得たフコキサンチン精製品１００ｍｇをアセトン２ｍＬに溶解した。一方、リパーゼとして、Ｃａｎｄｉｄａｒｕｇｏｓａ由来のリパーゼ（Ｓｉｇｍａ社）２ｇを用い、これを０.１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７.０）２２.５ｍＬに溶解した。両溶液を混ぜ合わせ、３７℃で１８時間加温した。反応液をろ過し、溶媒除去した後、残渣をアセトン５０ｍＬで抽出し、フコキサンチン反応物を回収した。反応物について再度、上記のリパーゼ反応を行った。フコキサンチン反応物をＨＰＬＣ（ナカライテスク製ＣｏｓｍｏｓｉｌＯＤＳ５Ｃ１８−ＡＲ−II２０×２５０ｍｍ、８０％ＭｅＯＨ、５ｍＬ／ｍｉｎ）により分離・精製を行い、フコキサンチノール精製物を得た。ＨＰＬＣおよび¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルにより９５％以上の純度であること確認し、ＮＭＲおよびＭＳスペクトルにより化学構造を確認した。以下の実施例では、この精製フコキサンチノールをフコキサンチノールとして用いた。

実施例１
ウイルス感染細胞株増殖能の測定：
（方法）
それぞれ、１０％牛胎児血清加ＲＰＭＩ１６４０培地により２×１０^５個／ｍＬに調整したＨＴＬＶ−Ｉ感染Ｔ細胞株（ＭＴ−２、ＭＴ−４、ＨＵＴ−１０２、ＥＤ−４０５１５（−））、ＥＢＶ感染Ｂ細胞株（Ｒａｊｉ、Ｄａｕｄｉ、Ｂ９５−８／ＢＪＡＢ、Ｂ９５−８／Ｒａｍｏｓ、ＬＣＬ−Ｋａ、ＬＣＬ−Ｋｕ）、子宮頚癌細胞株（ＨｅＬａ）、慢性骨髄性白血病細胞株（Ｋ−５６２）を、細胞数が１×１０^４個／穴となるように、９６穴プレートに蒔いた。

次いで、最終濃度が１０、５、２.５、１.２５、０.６２５μＭ（フコキサンチン、フコキサンチノール）あるいは１０、５、２.５μＭ（β−カロテン、アスタキサンチン）になるように、フコキサンチン、フコキサンチノール、β−カロテン、アスタキサンチンを５０μＬ／穴添加し、３７℃で、２４時間培養した。その後、発色基質としてＷＳＴ−８（和光純薬工業社製）を５μＬ／穴添加し、３７℃で４時間培養した。培養後、マイクロプレートリーダーを用いて、４５０ｎｍの吸光度を測定し、下式により細胞の生存率を求めた。

[数１]

細胞生存率（％）＝ [ １ − （Ａ − Ｂ）／Ａ ] × １００

Ａ：薬剤無処理時の吸光度
Ｂ：薬剤処理時の吸光度

（結果）
フコキサンチンおよびフコキサンチノールが、ＨＴＬＶ−Ｉ感染Ｔ細胞株やＥＢＶ感染Ｂ細胞株の増殖能に与える影響を図１および図２に示した。この結果から明らかなように、フコキサンチンおよびフコキサンチノールは、濃度依存性にすべてのＨＴＬＶ−Ｉ感染Ｔ細胞株とＥＢＶ感染ＢＬ細胞株の増殖を抑制した。また、これら細胞株の増殖抑制能は、フコキサンチンに比べ、フコキサンチノールのほうが有意に高かった。

一方、β−カロテンおよびアスタキサンチンが、ＨＴＬＶ−Ｉ感染Ｔ細胞株の増殖能に対する影響を同様な試験で調べた結果を図３に示す。この結果から明らかなように、他のキサンチン類は、ＨＴＬＶ−Ｉ感染Ｔ細胞株の増殖に軽微な影響を及ぼすのみであり、フコキサンチン類が優れた増殖抑制能を有することが示された。

実施例２
健常人および成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）患者末梢血単核球の増殖能の測定

（方法）
まず、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）をフィコール（Ｆｉｃｏｌ）遠心比重法により分離し、これを１０％牛胎児血清加ＲＰＭＩ１６４０培地を用いて２×１０^６／ｍＬに調整した後、細胞数が１×１０^５個／穴となるように、９６穴プレートに蒔いた。

次いで、最終濃度が１０、５、２.５、１.２５、０.６２５μＭ（フコキサンチン）あるいは２.５、１.２５、０.６２５μＭ（フコキサンチノール）になるように、フコキサンチンおよびフコキサンチノールを５０μＬ／穴添加し、３７℃で２４時間培養した。その後、ＷＳＴ−８を５μＬ／穴添加し、３７℃で４時間培養した。培養後、マイクロプレートリーダーを用い、４５０ｎｍの吸光度を測定し、前記の式により、細胞の生存率を求めた。

（結果）
フコキサンチンおよびフコキサンチノールが、健常人（１名）のＰＢＭＣおよび成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ、５名）患者のＰＢＭＣの増殖能に与える影響を図４に示した。この結果から明らかなように、フコキサンチンおよびフコキサンチノールはＡＴＬ患者白血病細胞に対しても濃度依存性に増殖抑制効果を認めたが、健常人のＰＢＭＣに対する毒性は認められなかった。また、フコキサンチンに比べ、フコキサンチノールのほうが増殖能に及ぼす影響は強かった。

実施例３
ＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞株の細胞周期測定
（方法）
ＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞株（ＭＴ−２、ＭＴ−４、ＨＵＴ−１０２、ＥＤ−４０５１５（−））を、１×１０^６細胞でセルカルチャープレートに蒔き、これにフコキサンチンを５μＭで添加し、３７℃で２４時間培養した。２４時間後に細胞を回収し、これをヨウ化プロピジウムで染色後、フローサイトメーターにてＤＮＡ含量を測定した。このＤＮＡ含量の結果から、各細胞周期の細胞群の分布を算出することにより、各細胞の細胞周期を判定した。

（結果）
フコキサンチンが、ＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞株の細胞周期に与える影響を図５に示した。
この結果、ＧＩ期の細胞群が増加していたことから、フコキサンチンはすべてのＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞株の細胞周期をＧ１期で停止させたことが示された。

実施例４
ＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞株のアポトーシス測定
（方法）
ＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞株（ＭＴ−２、ＭＴ−４、ＨＵＴ−１０２、ＥＤ−４０５１５（−））を、１×１０^６細胞でセルカルチャープレートに蒔き、これに、種々の濃度のフコキサンチン（１０、５、２.５μＭ）あるいはフコキサンチノール（１０、５、２.５、１.２５、０.６２５μＭ）を添加し、３７℃で２４時間培養した。２４時間後に細胞を回収し、アネキシンＶで染色後、フローサイトメーターを用い、アポトーシス陽性細胞率（％）を測定した。

（結果）
フコキサンチノールが、ＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞株のアポトーシスに与える影響を図６に、フコキサンチンおよびフコキサンチノールの濃度と、ＭＴ−２のアポトーシスの関係を図７および図８に示した。この結果からフコキサンチンはすべてのＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞株にアポトーシスを誘導し（図６）、その作用は濃度依存性であることが示された（図７）。また、フコキサンチノールもＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞株であるＭＴ−２にアポトーシスを誘導し、その効果はフコキサンチンに比べ強いことが示された（図８）。

以上の、実施例で示すように、フコキサンチンおよびフコキサンチノールはＨＴＬＶ−Ｉ感染Ｔ細胞株、ＥＢＶ感染ＢＬ細胞株、ＥＢＶ感染Ｂ細胞株、ＡＴＬ細胞等のウイルス関連悪性腫瘍の生存率を濃度依存性に低下させるものであり、しかも、健常人末梢血単核球に対しては、何の影響も与えるものでなかった。

従って、本発明のウイルス関連悪性腫瘍治療剤は、ウイルス感染リンパ球に選択的な抗腫瘍効果を有するものであり、実用性のある新しいＡＴＬあるいはバーキットリンパ腫等の治療ないし予防剤として、有利に使用することができるものである。

フコキサンチンおよびフコキサンチノールが、ＨＴＬＶ−Ｉ感染Ｔ細胞株の増殖能に与える影響を示した図である。Ａはフコキサンチン、Ｂはフコキサンチノールについてのものである。フコキサンチンおよびフコキサンチノールが、ＥＢＶ感染Ｂ細胞株の増殖能に与える影響を示した図である。Ａはフコキサンチン、Ｂはフコキサンチノールについてのものである。 β−カロテンおよびアスタキサンチンが、ＨＴＬＶ−Ｉ感染Ｔ細胞株の増殖能に与える影響を示した図である。Ａはβ−カロテン、Ｂはアスタキサンチンについてのものである。フコキサンチンおよびフコキサンチノールが、健常人およびＡＴＬ患者末梢血単核球の生存に与える影響を示した図である。Ａはフコキサンチン、Ｂはフコキサンチノールについてのものである。フコキサンチンが、ＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞株の細胞周期に与える影響を示した図である。フコキサンチンが、ＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞株のアポトーシスに与える影響を示した図である。フコキサンチンが、濃度依存性にＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞株であるＭＴ−２のアポトーシスに与える影響を示した図である。フコキサンチノールが、濃度依存性にＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞株であるＭＴ−２のアポトーシスに与える影響を示した図である。以上

Claims

フコキサンチノールを有効成分とし、経口投与形態であるウイルス関連悪性腫瘍治療剤。
成人Ｔ細胞白血病またはバーキットリンパ腫を治療するものである請求項第１項記載のウイルス関連悪性腫瘍治療剤。
フコキサンチノールを大人一人当たり一日量として、０.０５ｍｇないし１００ｍｇ投与する形態の請求項第１項または第２項記載のウイルス関連悪性腫瘍治療剤。