JP4336567B2 - 細胞培養器 - Google Patents

Description

本発明は平面状あるいはシート状の細胞培養担体（Scaffold）を用いて細胞を培養するための装置に関するものであり、更に詳しくは、細胞培養担体の外縁部が固定され、評価に用いた細胞数をあますことなく細胞培養担体に固定することができる培養器に関するものである。

近年の再生医療技術に関する技術革新が進むに伴い、細胞が増殖、分化、組織化するための足場となる細胞培養用担体を用いた培養が重要になってきている。細胞培養担体に細胞を固定あるいは内包させる技術としては、コラーゲンやアルギン酸などのゲルを用いて細胞培養担体に内包させる方法や、細胞を含む培地を毛管現象で吸収させて、その過程で細胞を固定化させる方法、また単純に、細胞培養のための容器の底に置く方法、適当なおもりで固定化する方法が知られている。

細胞が成育し、分化・組織化を行うことで、上記の培養方法では、播種あるいは増殖した細胞が培養担体の外部へ漏れたり、あるいは培養担体の裏側に入り込んだりするため、培養した細胞を効率良く取り出すことが難しかった。

また、細胞が培養担体上あるいは担体中で増殖、分化していく各々の過程に関して、細胞の成育状態や、細胞が産生する細胞外マトリクスの種類や量、組織化の様子などを詳細に観察あるいは評価する必要性が高まってきている。

フィルム状のマテリアルの上で細胞を培養する容器については、たとえば特開昭５２−３８０８２号公報（特許文献１）には、気体透過性のフィルムが底にぴんと張られた培養容器について記載されている。このフィルムとしては、気体は透過するが液体は透過しない極めて薄いフィルムしか用いることが出来ず、例えば凍結乾燥スポンジなど凹凸の多い成型体や不織布状の細胞培養担体で液体を透過するような細胞培養担体を用いる培養には用いることが出来ない。
特開昭５２−３８０８２号公報

本発明が解決しようとする課題は、播種した細胞を余すことなく細胞培養担体の表面あるいは内部に固定することができる培養容器を開示することであり、さらには平面状あるいは三次元状の培養担体が細胞の足場材としてどれくらい優れているかについての定量的な評価が容易に実施できるように、外側から細胞が生育していく過程をそのまま観察することが容易な細胞培養器を開示することである。

本発明の培養容器は、円筒状の外筒（１）と、内腔を有し該外筒に嵌合可能な円筒状の内筒（２）からなり、該外筒の内腔に挿入可能な底板（４）と該底板と外筒の間の液漏れを防ぐパッキン（３）を有する培養器である。

また、該内筒（２）の底部と底板（４）の間に細胞培養担体（５）を有する細胞培養器である。

本発明で開示した細胞培養器を用いることにより、播種した細胞をあますことなく細胞培養担体内部に内包あるいは表面に固定することができるため、定量性に優れた細胞特性評価あるいは細胞培養担体特性の評価が可能となる。またその際の細胞の成育状態を直接観察することが可能となる。

以下、本発明について詳述する。なお、これらの実施例等および説明は本発明を例示するものであり、本発明の範疇に属し得ることは言うまでもない。

本発明の構成を、図を用いて説明する。
図１において、円筒状の外筒（１）および内筒（２）は、樹脂製であっても金属製であってもガラス製であってもよく、中央部に観測用の内腔（６）および液体培地を保持するための内腔（７）が開いている。外筒は液体培地が漏洩するのを防ぐためのパッキン（３）を置く段部を有し、外筒（１）と内筒（２）はねじ溝を有することで、内筒を外筒にねじ込むことができ、内筒の端部が細胞培養担体（５）および底板（４）を圧着し、固定することができる。

また外筒（１）と底板（４）の間には液体培地の漏洩防止のためにパッキン（３）が挿入されている。該液漏れ防止のためのパッキン（３）は、ゴム製のものならいずれのものを用いてもかまわないが、好ましくは細胞毒性の少ないシリコン製あるいはフッ素ゴム製のパッキンが用いられる。

液体培地の底部となる平板すなわち底板（４）は透明であるものがよく、ガラス製あるいは透明樹脂製の平板が好ましく用いられる。この底板（４）の上に、細胞培養担体（５）を設置し、内筒（２）を用いて上から圧着する。内筒（２）は液体培地を保持するための内腔を有しており、この内腔から細胞観察することも可能である。

細胞培養担体（５）はその円周部の端を上部から圧着されることで、上から細胞を播種したときに生じる担体横側からの細胞の漏れを防ぐことができ、さらには上部より均等にその端部が押えられるため、内腔（７）に面した細胞培養担体表面は水平状に近似することが可能で、特に凍結乾燥スポンジなど凹凸の多い成型体の表面を水平に保つことが可能である。

外筒（１）および内筒（２）の材質は、樹脂製であっても金属製であってもガラス製であってもよいが、入手・加工のしやすさや滅菌の容易さから、ステンレス製やテフロン（登録商標）樹脂が好ましい。その中でオーステナイト系ステンレスは、研究開発業務で多用されるオートクレーブ（蒸気加熱）滅菌に適しているため、好ましい。ステンレスの具体例としてはＳＵＳ３０４やＳＵＳ３１６製のステンレスが好ましく用いられる。

ステンレス成型体を用いて細胞を培養する際は、ステンレスの表面を不動態化処理するのが好ましい。不動態化処理は、公知のいかなる方法を用いても良いが、好ましくは、０．０１〜１Ｎ程度の酸水溶液で洗浄するのがよく、更に好ましくはリン酸や亜リン酸を含む酸性水溶液を洗浄剤として用いるのがよい。

本発明で用いられる細胞培養担体は、平面状あるいはシート状、スポンジ状であるのが好ましく、より具体的には厚さ１０ｍｍ以下のものが好ましく、さらに好ましくは３ｍｍ以下のものが用いられる。これよりも細胞培養担体が厚いと、圧着による気密性を維持するのが難しいため好ましくない。また、圧着をより確実なものにするために、シリコンゴムなどのシーリング材やパッキンは適宜使用する。

またフィルム状の培養担体も好ましく利用できる。フィルムの表面は凹凸があっても平滑でも良い。発泡体やシート状成型体も好ましく用いられる。また、連続孔を有する多孔体であっても、不織布のような繊維質より成るシートであっても、モノフィラメントでできたメッシュであっても本発明の培養器を用いて評価することができる。

外筒の内腔は窓穴として、細胞の生育状況を観察するものであり、倒立型の顕微鏡を用いて細胞の成育を観察することができる。

図２で本願発明の培養容器のもう一つの態様を説明する。円筒状の外筒（１’）および内筒（２’）は、樹脂製であっても金属製であってもガラス製であってもよく、中央部に観測用および液体培地を保持するための内腔（７’）が開いている。外筒（１’）は増殖した細胞が底板の裏面に回りこむのを防ぐためのパッキン（３’）を置く底部を有し、外筒（１’）と内筒（２’）はねじ溝を有することで、内筒を外筒にねじ込むことができ、内筒の端部が細胞培養担体（５’）および底板（４’）を圧着し、固定することができる。

また外筒と底板の間には液体培地の漏洩防止のためにパッキン（３’）が挿入されている。該液漏れ防止のためのパッキン（３’）は、ゴム製のものならいずれのものを用いてもかまわないが、好ましくは細胞毒性の少ないシリコン製あるいはフッ素ゴム製のパッキンが用いられる。

液体培地の底部となる平板すなわち底板（４’）は透明であるものがよく、ガラス製あるいは透明樹脂製の平板が好ましく用いられる。この底板（４’）の上に、細胞培養担体を設置し、内筒（２’）を用いて上から圧着する。内筒（２’）は液体培地を保持するための内腔を有しており、この内腔から細胞観察することも可能である。

細胞培養担体（５’）はその円周部の端を上部から圧着されることで、上から細胞を播種したときに生じる担体横側からの細胞の漏れを防ぐことができ、さらには上部より均等にその端部が押えられるため、内腔（７’）に面した細胞培養担体表面は水平状に近似することが可能で、特に凍結乾燥スポンジなど凹凸の多い成型体の表面を水平に保つことが可能である。

外筒（１’）および外筒（２’）の材質は、樹脂製であっても金属製であってもガラス製であってもよいが、外側からの観察とりわけ外筒の底部から観察することを可能にするためには透明な樹脂あるいはガラスが望ましい。入手・加工のしやすさや滅菌の容易さからは、ステンレス製やテフロン(登録商標)樹脂が好ましい。その中でオーステナイト系ステンレスは、研究開発業務で多用されるオートクレーブ（蒸気加熱）滅菌に適しているため、好ましい。ステンレスの具体例としてはＳＵＳ３０４やＳＵＳ３１６製のステンレスが好ましく用いられる。

ステンレス製の培養容器を用いて細胞を培養する際は、ステンレスの表面を不動態化処理するのが好ましい。不動態化処理は、公知のいかなる方法を用いても良いが、好ましくは、０．０１〜１Ｎ程度の酸水溶液で洗浄するのがよく、更に好ましくはリン酸や亜リン酸を含む酸性水溶液を洗浄剤として用いるのがよい。

培養容器が透明な樹脂あるいはガラス製である場合は、倒立型の顕微鏡を用いて細胞の成育を観察することができ、ステンレス製の培養容器である場合は内筒の内腔から観察することができる。

図１、図２何れの場合も内筒の上部は塞がっていても構わないし、あるいは蓋によって塞がれても良い。

以下の実施例により、本発明の詳細をより具体的に説明する。しかし、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

[実施例１]
図１に示すごとく、観察用の窓穴としての内腔（６）を有する円筒状の外筒（１）の段部上に、フッ素ゴム製のパッキン（３）、ガラス板製の底板（４）を置き、さらにポリ乳酸のキャストフィルムすなわち細胞培養担体（５）を置いた。観察用の窓穴すなわち内腔（７）を有し、外周部にネジ溝を有する円筒状の内筒（２）を挿入し、細胞培養担体であるキャストフィルムを上から圧着した。円筒状の内筒（２）の内径は２４ｍｍであった。

ウサギ軟骨より採集した初代軟骨細胞と、液体培地を内腔（７）に５分目となるように入れ軟骨細胞を培養した。培養に用いた細胞数は、約２×１０^５個であった。培養は５％二酸化炭素濃度、３７℃での条件で実施し、液体培地は適宜交換した。２週間後、細胞数の増殖および細胞外マトリクスの産出を観察することができた。細胞培養担体であるキャストフィルムの下部すなわち底板（４）に面した側には細胞は認められず、細胞がもれなく細胞培養担体であるキャストフィルムの表面に固定化されたことを確認した。

本発明で開示した培養器は、平面状あるいはシート状の細胞培養担体の評価や、細胞培養担体中での細胞の生育状況を確認する上で有益な培養器であり、細胞の定量的な評価や細胞が算出する細胞外マトリックスについて定量的に評価することが可能である。本培養器は再生医療分野において、細胞培養のための培養担体（Scaffold）の評価や、Scaffold中での細胞の生育状況、生育過程を評価する上で重要なツールとなりえる。

実施例１の培養容器の断面図。 実施例１の培養容器とは別態様の培養容器の断面図。

符号の説明

１ 外筒
２ 内筒
３ パッキン
４ 底板
５ 細胞培養担体
６ 外筒の内腔
７ 内筒の内腔
１’ 外筒
２’ 内筒
３’ パッキン
４’ 底板
５’ 細胞培養担体
７’ 内筒の内腔

Claims (4)

1. 円筒状の外筒（１）と、液体培地を保持でき、それを通して細胞観察ができる内腔を有し該外筒に嵌合または螺合可能な円筒状の内筒（２）と、該外筒の内腔に挿入されている底板（４）とを有し、該内筒（２）の底部と底板（４）の間に細胞培養担体（５）をおいたときに該細胞培養担体中での細胞の生育状況をそのまま観察できる構造の培養器。
2. 培養中に倒立型の顕微鏡を用いて細胞観察が可能な請求項１に記載の培養器。
3. 該内筒（１）および外筒（２）が不動態化処理されたオーステナイト系のステンレスよりなる請求項１または２に記載の培養器。
4. 請求項１〜３のいずれかに記載の培養器を用いて細胞培養を行い、該細胞培養担体中での細胞の生育状況をそのまま観察することからなる該細胞培養担体特性の評価方法。

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